KR100279059B1 - 공유결합된항산화제를갖는합성펩티드폐계면활성제 - Google Patents

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Abstract

황산화제 부분을 갖는 3 내지 4 아미노산 잔기의 폴리펩티드, 및 천연 폐계면활성제와 회합된 하나 이상의 지질로 이루어지는 지질과의 복합체로 이루어지는, 항산화적 특성을 갖는 합성 폐 계면활성제를 제조하였다. 이들 계면활성제는 호흡 곤란 증후군의 치료에 유용하다.

Description

공유결합된 항산화제를 갖는 합성 펩티드 폐 계면활성제
[발명의 분야]
본 발명은 1992년 7월 31일에 출원된 미합중국 특허 출원 제 07/923,092호의 일부 계속 출원이다.
본 발명은 펩티드에 직접 또는 링커 영역을 통해 공유결합된 항산화제를 갖는 일련의 3 내지 4개 아미노산의 폴리펩티드의 합성에 관한 것이다. 이들 개질된 펩티드는 구조적으로 유용한 항산화제를 펩티드의 일부분으로 갖는 합성 폐 계면활성제로서 유용하다. 또한, 이들 폴리펩티드 및 지질과의 혼합물의 제제, 그의 제조 방법, 및 포유류의 호흡 곤란 증후군의 치료에 효과적인 제약학적 조성물도 기재하였다.
[발명의 배경]
폐에는 독성 산화제 및 항산화제 방어 시스템의 보호 작용 사이의 민감한 균형이 이루어지고 있다. 산화제의 증가 또는 보호성 항산화제 방어 시스템의 기능장애로 인해 이 시스템이 균형을 잃게 되면 폐 기능장애를 유발하는 병리생리학적 현상이 폐에서 일어날 수 있다. 산화제의 증가가 일으킬 수 있는 폐 기능장애의 유형 중 하나가 호흡 곤란 증후군(RDS)이다.
신생아 혼흡 곤란 증후군에 걸리면 생후 첫 28일 내에 사망하게 된다. 세계적으로 100명 중 1명의 유아가 신생아 RDS에 걸리며 약 10%가 사망한다. 이 증후군은 신생아에게는 거의 발생하지 않으나 일반적으로 미숙아 및 출생시 저체중(2㎏ 미만)과 관련이 있다. 성인 RDS는 신생아의 질환과 유사한 임상 특성 및 병리생리학을 나타내며, 일반적으로 강력한 치료 장치로 다루어진다. 성인 질환에는 다양한 병인이 있으며 대부분이 미만성 감염, 위 내용물의 흡인, 자극제 및 독물의 흡입과 같은 폐 손상, 및 마약 과다복용과 같은 원인으로 발생되는 폐부종으로부터 유발된다.
RDS는 기체 교환이 일어나는 폐의 폐포를 피복하는 폐 계면활성제의 부재 또는 기능장애와 관련되어 있으며, 세포 손상에 관련되는, 수퍼옥시드 라디칼, 히드록실 라디칼, 히드록실 라디칼을 생성할 수 있는 과산화수소, 및 지질 과산화물과 같은 산화제로 공지된 폐 또는 폐 공동 내의 산소 중심 유리 라디칼과 관련되어 있다(Heffner, et al., Am. Rev. Respir. Dis. 104: 531-554 1989, 및 Halliwell, FASEBJ. 1: 358-364 1987).
항산화제 잔기를 갖는 보다 큰 폴리펩티드인 합성 폐 계면활성제가 1991년 11월 4일 출원된 미합중국 특허 출원 번호 제07/789,918호에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 이를 참고로 인용한다. 그러나, 본 발명은 3 내지 4개 아미노산의 짧아진 펩티드에 항산화제 특성을 가지고 있어서 민감한 화합물이 산화제로 산화되는 것을 억제할 수 있는 효과적인 합성 폐 계면활성제를 제공한다. 짧아진 폐 계면활성제는 치료제의 제조에 있어서 보다 효율적이며 비용이 절감되는 수단을 제공한다. 본 발명의 신규성은 펩티드를 계면활성적 특성을 보유하면서 3 내지 4개의 아미노산으로 효과적으로 축소시키며, 공유결합된 항산화제에 부착된 펩티드를 효과적으로 전달할 수 있음에 있다.
일부의 합성 폐 계면활성 제제에서는 비타민 E와 같은 치료제를 계면활성제제에 별개의 성분으로서 첨가시켰다(미합중국 특허 제4,765,987호, PCT 공개번호 제 WO 90/11768호, 동 제 WO 90/07469호). 그러나, 본 발명에서는 항산화제가 별개의 성분이 아니라 실제로 폴리펩티드 내에 혼입된다. 항산화제가 폴리펩티드내에 혼입되는 것의 잇점은 3성분 혼합물(지질, 폴리펩티드 및 항산화제) 대신 2성분 혼합물을 사용할 수 있다는 것이다. 이것은 다양한 투약량 및 제제가 각각의 성분에 대해 시험되어야만 하는 시판용 약제의 효과를 시험하는데에 있어 중대한 잇점이 될 수 있다. 더우기, 2 성분 제제는 제조가 더욱 용이하다.
본 발명의 폴리펩티드는 지질과 혼합하여 단독으로 또는 폴리펩티드가 계면활성제 혼합물의 소량 성분이 경우 지질과 혼합하여 배합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 합성 성분들의 정의된 혼합물이므로 고순도 및 표준 형태로 제조될 수 있다. 또한, 성분들은 동물원으로부터 얻어지는 것이 아니므로 바이러스 및 박테리아에 의한 감염의 위험을 최소화시킨다.
양쪽성 α-나선 10개 잔기 펩티드의 나선형 휠 형태(양성 α-나선 펩티드의 기술에 대해 문헌 [McLean, L.R. et al. Biochem., 1991, 30, 31]을 참조)은 3 내지 4개 잔기의 펩티드에 대한 모델을 개발하는데에 사용된다. α-나선의 원통을 관찰해 내려갈 때 잔기의 곁사슬들은 나선 상에 소수성 측면 및 친수성 측면을 나타낸다. 4개 잔기 펩티드는 필요한 소수성 및 친수성 측면을 갖는 α-나선의 단일 회전으로 나타난다. 3개 잔기 펩티드도 역시 소수성 및 친수성 측면을 갖는 α-나선의 축소된 회전으로 나타난다.
[발명의 개요]
본 발명은 하기 식 1의 폴리펩티드 또는 그의 광학 활성 이성질체 또는 제약적으로 허용가능한 염 및 지질의 복합체로 이루어지는 합성 폐 계면활성제로 이루어진다.
X-A1-A2-A3-A4-Y 1
여기서, A1은 결합이거나 Glu 또는 Asp에서 선택된 음으로 하전된 아미노산이고,
A2는 Trp, Tyr, Phe, His, Val, Leu 또는 Ile에서 선택된 소수성 아미노산이며,
A3는 Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, Orn 또는 결합이고,
A4는 Lys, Arg 또는 His에서 선택된 양으로 하전된 아미노산이며,
X는 식 Da 또는 Db이고,
(여기서, B1은 B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)-이고,
B는 결합, C1-16알킬렌, 또는 C2-16알케닐렌이며,
각 R1,R2,R3,R4,R5,R6및 R7는 독립적으로 C1-6알킬임)
Y는 히드록시, 아미노, 알킬아미노 및 알콕시기에서 선택된 A4의 카르복시 치환체이며,
A3가 결합일 때 A1및 A2는 상호교체될 수 있다.
추가로, 본 발명은 하기 식 2의 폴리펩티드 또는 그의 광학 활성 이성질체 또는 제약적으로 허용가능한 염 및 지질의 복합체로 이루어지는 합성 폐 계면활성제로 이루어진다.
X-A1-A2-A3-A4-Y 2
여기서, A1은 결합 또는 Glu이고,
A2는 Trp 또는 Glu이며,
A3는 Aib, Glu, Gln, Leu, Ala 또는 Orn이고,
A4는 Lys이며,
X는 식 Da 또는 Db이고,
(여기서, B1은 B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)-이고,
B는 결합, C1-16알킬렌, 또는 C2-16알케닐렌이며,
각 R1,R2,R3,R4,R5,R6및 R7는 독립적으로 C1-6알킬임)
Y는 히드록시, 아미노, 알킬아미노 및 알콕시기에서 선택된 A4의 카르복시 치환체이다.
추가로, 본 발명의 펩티드는 천연 폐 계면활성제와 회합되는 유형의 하나 이상의종류로 이루어진 지질과 회합될 수도 있다.
이들 폴리펩티드-지질 복합체 및 그의 제약학적 조성물은 포유류의 호흡 곤란 증후군의 치료에 유용하다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 짧은 펩티드의 모델을 개발하는데에 사용된 10개 잔기 펩티드 계면활성제의 나선형 휠 형태이다. 나선형의 원통을 위에서 바라본 것이며, 잔기의 곁사슬들은 나선의 축과 관련하여 그들의 위치에서 표시되었다. 소수성 측면은 Trp8, Leu1, Leu5, Leu9, Leu2및 Leu6인 도면 우측 잔기들을 포함한다. 친수성 측면은 하전된 잔기인 Lys4, Glu7, Glu3및 Lys10을 포함한다.
제2도는 제1도에 나타낸 10개 잔기 펩티드의 나선형 휠 평면의 단일 회전을 기초로 한 테트라펩티드 항산화제의 한 예이다. 제1도 펩티드의 소수성 측면이 펩티드를 지질에 고착시키기에 충분한 소수성 측면을 제공하는 Trp2, Ala3, HBB-Aoc로 대체되었다. 친수성의 하전된 측면은 Glu1및 Lys4로 대체되었다.
[표의 간단한 설명]
표 I은 합성된 펩티드의 아미노산 분석 결과를 나타낸 것이다.
표 II는 성장 쥐 폐 모델에서의 화합물의 효과를 보여주는 압력-부피 실험의 결과를 나타낸 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 명세서에서는 천연 발생 아미노산의 하기 일반적 약어를 사용한다.
Ala 또는 A - 알라닌
Val 또는 V - 발린
Leu 또는 L - 로이신
Ile 또는 I - 이소로이신
Phe 또는 F - 페닐알라닌
Trp 또는 W - 트립토판
Met 또는 M - 메티오닌
Ser 또는 S - 세린
Tyr 또는 Y - 티로신
Asp 또는 D - 아스파라진산
Glu 또는 E - 글루탐산
Gln 또는 Q - 글루타민
Thr 또는 T - 트레오닌
Gly 또는 G - 글리신
Lys 또는 K - 리신
Arg 또는 R - 아르기닌
Asn 또는 N - 아스파라진
Nle - 노르로이신
Orn - 오르니틴
hArg - 호모아르기닌
Nva - 노르발린
Aib - 아미노-이소부티르산
글리신을 제외한 천연 아미노산은 키랄(chiral) 탄소 원자를 함유한다. 달리 언급하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 추가의 활성 아미노산은 L-배치이다. 본 발명의 항산화제 잔기가 펩티드에 첨가되면 입체 이성질체가 생성될 수 있다. 본 발명 이러한 입체 이성질체의 혼합물은 물론 단리된 입체 이성질체로도 이루어진다. 관례에 따라, 본 명세서에 기재된 펩티드의 구조는 아미노 말단 부분이 사슬의 좌측에, 카르복시 말단 부분이 사슬의 우측에 오도록 하였다.
두개의 아미노산이 전형적인 아미드 결합을 통해 결합하여 펩티드를 형성할때, 물 분자가 방출되며, 각 아미노산의 나머지 부분을 "잔기"라 일컫는다. 아미드 결합은 X가 다음의 아미노산 또는 아미드 결합 이소스터(isoster)에 연결될 때에도 생길 수 있다. 따라서, 잔기는 말단 아미노기의 수소 원자가 결여되고 말단 카르복시기의 히드록시기가 결여된 아미노산이다. 통상의 용어를 사용하여, 아미노산 또는 아미노산 유도체의 3개 문자 부호 앞에 있는 대시(-)는(물의 손실을 의미) 잔기의 아민 결합을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "알킬"이란 명시된 탄소 원자 수에 따라 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, t-부틸, s-부틸, 이소펜틸, 1-메틸부틸 등과 같은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 "아실"이란 유기산으로부터 히드록실기를 제거하여 형성한 라디칼을 의미하며, 일반식은 RCO-이고, 여기서 R은 지방족, 지환족, 방향족 탄화수소 또는 수소(포르밀기)이다. R기는 치환 가능하다. 아실기의 한 예로는 숙시닐이 있다.
본 명세서에서 사용되는 "소수성 아미노산"이란 Val, Leu 또는 Ile과 같은 지방족 탄화수소 곁사슬을 갖는 비극성 잔기, 또는 Phe, Tyr, Trp 또는 His과 같은 방향족기를 갖는 비극성 잔기를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "음으로 하전된 아미노산"이란 Glu 또는 Asp과 같은 산성 친수성 곁사슬을 갖는 극성 잔기를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "양으로 하전된 아미노산"이란 Lys, Arg 또는 His과 같은 염기성 친수성 곁사슬을 갖는 극성 잔기를 의미한다.
X가 상기의 항산화제에 의해 기능적으로 개질되지 않은 펩티드는 후술하는 고체 상 연속 공정과 같은 적당한 방법에 의해 합성될 수 있다. 바람직한 마커쉬(Markush)군은 R1, R2, R6및 R7이 각각 t-부틸이고, R3, R4및 R5가 각각 메틸인 것이다. Da가 Db보다 바람직하고, B는 바람직하게는 -C(O)-NH-B-C(O)-이며, 여기서 B는 바람직하게는 C8알칸이다.
X는 폴리펩티드에 항산화제 특성을 부여하는 부분이므로 본 명세서에서는 이를 "항산화제 잔기"라 일컫는다. 그러나, X는 폴리펩티드에 링커를 가질 수 있어서 폴리펩티드에 부착된 항산화제 잔기를 기술 할 때에는 적당한 링커, 예를 들면 B, -C(O)-, B-C(O)-, C(O)-NH-B-C(O)- 등도 포함되는 것으로 이해된다.
X를 형성하는 방법에는 여러가지가 있다. 예를 들면, 항산화제 화합물로부터 형성된 아실화제를 사용하여 아미노산 유도체를 아실화할 수 있다. 항산화제 화합물은 아실화제가 되기 위해 예를 들면 대칭 무수물 또는 활성 에스테르, 예를 들면 N-히드록시벤조트리아졸 에스테르(HOBt 에스테르)를 형성할 수 있다. 이어서, 아실화제는 반응을 일으키기 위해 보호되지 않은 관능성 친핵성 화합물에 노출된다. 이것은 항산화제 잔기를 수용할 아미노산이 수지에 부착된 펩티드의 일부분인 경우로서,바람직하게는 고체 상 펩티드 합성으로 수행된다.
개별 아미노산은 펩티드에 혼입되기 전 예를 들면 에스테르화, 환원적 알킬화 등에 의해 변형될 수도 있다. 관능기를 함유하는 아미노산 및 아미노산 유도체의 기타 변형은 종래 기술에 주지되어 있다.
본 발명에서 아미노산 또는 아미노산 유도체와의 반응에 유용한 것으로 알려진 항산화제 화합물의 바람직한 예로는 하기의 것들이 있다.
1) HBB = 3,5-디-t-부틸-4-히드록시벤조산
2) HBP = 3-(3',5'-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-프로피온산
3) HBC = 3,5-디-t-부틸-4-히드록시신남산
4) HBA = 2-(3',5'-디-t-부틸-4-히드록시페닐)아세트산
5) 디-HAB = 2,2-디-(3',5'-디-t-부틸-4-히드록시페닐) 아세트산
6) Trl = 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산
(트롤록스(Trolox)로도 공지)
바람직하게는 HBB, HBP, HBC, HBA, 디-HBA, 및 Trl은 관능기가 알코올기 또는 아미노기일 때 사용된다. 연관된 계면활성제 군내에서 HBB 및 Trl과 같이 보다 바람직한 그룹핑은 형성하기 위해 바람직한 그룹핑을 선택할 수 있다.
상기 항산화성 화합물은 시판중이거나 그의 합성이 종래 기술에 공지되어 있는데, 예를 들면 3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐아세트산이 문헌[Izv. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim., 358 (1965)]에 기재되어 있고, 3,5-디-t-부틸-4-히드록시-벤즈알데히드가 문헌[J. Org. Chem., 22, 1333 (1957)]에 기재되어 있다. 일반적으로, (1) 본 발명의 폴리펩티드에 부착될 수 있고, (2) 폴리펩티드에 부착되어 있는 동안 항산화 활성을 나타내며, (3) 폴리펩티드가 본 명세서에 기재된 대로 작용하도록 하는 어느 항산화성 화합물이라도 본 발명에 사용될 수 있다.
Trl-Glu-은 트롤록스 및 글루타밀 잔기 사이에서 형성된 펩티드 결합을 갖는 분자를 의미하며, 여기서 트롤록스는 하기에 나타낸 바와 같이 글루탐산 잔기의 α-아미노기에 부착된다.
Trl-Glu의 예에서 본 바와 같이, 항산화제 잔기(이 경우, X = Db 및 B = 결합)과 카르보닐기(C(O)-)는 폴리펩티드의 α-아미노 말단에 부착되어 Db-C(O)-A1-A2-A3-A4-Y를 형성할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 용액상 화학과 같이 당업자에 숙지된 여러가지 방법으로 제조될 수 있다. 바람직한 방법은 ABI 펩티드 합성장치와 같은 자동화된 방법을 사용할 수 있는 고체상 연속 공정이다. 고체상 연속 공정에서는 (1) 보호된 α-아미노기를 갖는 첫번째 아미노산을 수지 지지체에 결합시키고, (2) 보호된 α-아미노기를 갖는 두번째 아미노산의 카르복실기를 활성화시키며, (3) 첫번째 아미노산을 그것이 수지에 계속 부착되어 있도록 하는 시약으로 탈보호화시키고, (4) 첫번째 아미노산의 α-아미노기 및 두번째 아미노산의 활성화된 카르복실기를 커플링시키는 단계가 수행된다. 이들 단계는 새로운 아미노산 잔기에서도 반복되어 펩티드가 형성되게 한다. 목적하는 길이의 펩티드가 형성되었을 때, 펩티드는 적당히 커플링된 항산화제 부분으로 개질된 후, 수지로부터 절단, 탈보호화 및 단리될 수 있다. 또한, 보호된 펩티드를 수지로부터 선택적으로 제거하고, 항산화제 부분을 펩티드에 커플링시킨 후 보호기를 제거 및 단리할 수도 있다.
사용하는 수지 지지체는 0.5 내지 약 3%의 디비닐벤젠과 가교결합되어 있으며, 처음 도입된 α-아미노 보호된 아미노산과의 에스테르 형성을 위한 부위를 제공하기 위해 클로로메틸화 또는 히드록시메틸화된 폴리스티렌과 같은, 폴리펩티드의 고체상 제조용으로 종래 기술에서 통상적으로 사용되는 어느 적당한 수지라도 가능하다. 다른 적당한 수지 지지체로는 pMHBA(펩티드 인터내셔널(Peptide Interntional)사 제품, 켄터키주 루이즈빌 소재), 링크(RINK: 칼비오켐(Calbiochem)사 제품, 캘리포니아주 라졸라 소재), 및 사스린(Sasrin: 비오켐(Biochem)사 제품, 펜실바니아주 필라델피아 소재)이 있다. 사스린 수지는 ABI 펩티드 합성 장치 사용자 매뉴얼에 기재되어 있는 첫번째 아미노산을 도입하기 위한 특정 ABI 사이클을 필요로 한다. 보호된 α-아미노기를 갖는 첫번째 아미노산은 본 명세서에서 참고로 인용하는 어플라이드 바이오시스템스 모델 430A 펩티드 합성장치 사용자 매뉴얼에 기재되어 있는 대로 수지에 부착된다.
결합 펩티드 사슬에 첨가된 각각의 아미노산을 활성화시키기 위한 바람직한 방법은 적절하게 보호된 각각의 첨가된 α-아미노산의 대칭 무수물 또는 활성 에스테르를 형성하는 것이다. 예를 들면, α-아미노 보호된 아미노산은 디클로로메탄(DCM)의 존재하에 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)와 반응하여 대칭 무수물을 형성할 수 있다. 또한, HOBt 활성 에스테르는 Boc-아미노산(t-부틸옥시카르보닐-아미노산) 및 HOBt를 DCC 중에 용해시키고 냉각하며, DCC를 추가로 첨가하고, 용액을 실온으로 가온함으로써 형성할 수 있다. 이어서, 이 용액은 아미노산 결합수지에 첨가된다. 아실화제를 형성하기 위한 이 활성화 방법은 항산화제 화합물에 대해서도 사용할 수 있다.
α-아미노기 이외에 다른 관능기가 존재하는 경우에는 일반적으로 이들 관능기들을 보호시켜야 한다. 일반적으로, α-아미노기 및 각각의 곁사슬 관능기는 상이한 보호기들에 의해 보호될 수 있어서 어느 보호기의 제거없이 다른 보호기를 제거할 수 있다.
본 발명에 사용될 것으로 여겨지는 α-아미노 보호기의 종류 중에는 (1) 포르밀, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 톨루엔술포닐(토실), 벤젠술포닐, 니트로페닐술페닐, 트리틸술페닐, o-니트로페녹시아세틸 및 γ-클로로부티릴과 같은 아실 형태 보호기, (2) 벤질옥시카르보닐 및 p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p-메톡시벤질옥시카르보닐, 1-(p-비페닐)-1-메틸에톡시카르보닐, a,a-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐 및 벤질히드릴옥시카르보닐과 같은 치환된 벤질옥시카르보닐과 같은 방향족 우레탄 형태 보호기, (3) t-부틸옥시카르보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프르필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐과 같은 지방족 우레탄 보호기, (4) 시클로펜틸옥시카르보닐 또는 9-플루오르에틸메톡시카르보닐(Fmoc)과 같은 시클로알킬 우레탄 형태 보호기, (6) 트리페닐메틸(트리틸) 및 벤질과 같은 알킬 형태 보호기, (7) 트리메틸실란과 같은 트리알킬실란기가 있다.
그러나, α-아미노 보호기의 선택은 사용되는 수지, 표적 부위 관능기, 폴리펩티드내에 존재하는 기타 관능기 및 아미노산 유도체가 X가 절단제에 의한 수지로 부터의절단을 견딜 수 있는지의 여부에 의존한다. 예를 들면, HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 1)를 제조하기 위해서는 C 말단 아미노기를 생성하는 pMBHA 수지가 사용되고, 펩티드는 ABI430A 아미노산 합성장치 상의 표준 t-Boc 화학을 사용하여 제조된다. 글루탐산의 표적 부위인 N-α-아미노기에 HBB를 부착시키기 위해 HBB 부분은 HOBT 활성 에스테르로서 도입될 수 있다. 무수히드로플루오르산(HF)은 펩티드를 수지로부터 절단하고 동시에 남은 보호기를 제거하기 위해 사용된다.
보호기 및 보호기를 선택적으로 제거하기 위한 시료의 적당한 조합의 선택은 종래의 기술에 주지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [M. Bodanszky, PEPTIDE CHEMISTRY, A PRACTICAL TEXTBOOK, Springer-Verlag (1988)], 및 문헌 [J. Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 제2판, Pierce Chemical Co. (1984)]을 참조한다.
각각의 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열을 고체 상 반응기에 도입하고, 디메틸포름아미드:염화메틸렌(1:1)의 매체 또는 단독의 디메틸포름아미드 또는 단독의 염화메틸렌과 같은 커플링제의 존재하여 커플링을 수행한다. 커플링이 완전하지 않은 경우에는 α-아미노 보호기를 제거하기 전에 커플링 과정을 반복한 후, 고체상 반응기내에서 다음 아미노산을 커플링한다. 합성의 각 단계에서 커플링 반응의 완성은 문헌 [E. Kaiser, et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970)]에 기재된 닌히드린 반응으로 확인한다.
목적하는 아미노산 서열이 얻어진 후, 펩티드는 폴리펩티드에 역효과를 주지 않는 적당한 시료를 사용하여 수지로부터 제거된다. 예를 들면, 0.1% 트리플루오로아세트산 중 무수 HF 함유 5% 아니솔 및 5% 아세토니트릴이 pMBHA 수지로 부터 폴리펩티드를 절단하기 위해 사용된다.
식 1의 폴리펩티드는 무독성 유기 또는 무기 산과 제약적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 적합한 염을 형성하는 무기 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산 및 오르토인산일수소나트륨 및 황산수소칼륨과 같은 산 금속염이 있다. 적합한 염을 형성하는 유기 산의 예로는 모노, 디 및 트리카르복실산이 있다. 이러한 산의 예로는 예를 들면, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 히드록시말레산, 벤조산, 히드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시벤조산 및 메탄술폰산 및 2-히드록시에탄 술폰산과 같은 술폰산이 있다. 카르복시 말단 아미노산 부분의 염은 어느 적합한 무기 또는 유기 염기와 함께 형성된 무독성 카르복실산 염을 포함한다. 예를 들면, 이들 염으로는 나트륨 및 칼륨과 같은 알칼리 금속, 칼륨 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속, 알루미늄을 포함하는 IIIA 그룹의 경금속, 유기 1급, 2급 및 3급 아민, 예를 들면 트리에틸아민을 포함하는 트리알킬아민, 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디히드로아비에틸아민, N-(저급)알킬피페리딘, 및 다른 적합한 아민이 있다.
본 발명의 단백질-인지질 복합체의 인지질은 어느 인지질이라도 가능하며, 본 명세서에서는 포스포글리세리드 및 스핑고리피드도 포함한다. 포스포글리세리드는 글리세롤 부분의 잔여 히드록시기인 말단 히드록시기가 인산과 에스테르를 형성한 글리세롤의 디-지방산 에스테르이다. 일반적으로 포스포글리세리드의 인산 부분은 에탄올아민, 세린, 콜린, 또는 글리세롤과 같은 알코올과 제2의 에스테르를 형성한다. 스핑고리피드는 스핑고신 또는 디히드로스핑고신의 1-위치의 히드록시기가 인산의 콜린 에스테르와 에스테를 형성한 단일 지방산 에스테르이다. 본 발명의 단백질-인지질 복합체의 바람직한 지질로는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 길이 및 포화 정도가 다른 아실 사슬들을 함유하는 포스파티딜콜린 분자(PC), 카르디올리핀(CL), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜세린(PS), 지방산(FA), 및 트리아실글리세롤(TG)이 있다. DPPC는 폐 계면활성제 혼합물의 주요 성분을 구성하는 반면 PC, CL, PG, PS, FA 및 TG는 소량 성분을 구성한다. 본 발명의 인지질에 사용하기에 적합한 지방산은 일반적으로는 분지되지 않은 긴 사슬의 카르복실산(일반적으로 8개 이상의 탄소 원자를 가짐)이다. 지방산은 포화 또는 불포화될 수 있다. 대표적인 지방산은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 및 올레산이다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질-인지질 복합체의 제약학적 제제는 몇몇 경우에서는 예를 들면 에탄올 또는 트리플루오로에탄올과 같은 소량의 유기 용매, 예를 들면 도데실황산나트륨 또는 소듐 데옥시콜레이트와 같은 세정제, 염화칼슘 또는 염화나트륨과 같은 염, 글루코오스, 덱스트로스 또는 만니톨과 같은 탄수화물, 글리신 및 알라닌과 같은 아미노산을 함유하는 건조 혼합물 또는 수성 현탁액으로 제조될 수 있다. 제약학적 조성물이 액체 형태로 제조될 경우에는 액체의 안정화제, 방부제, 삼투압 조절제, 완충제, 및 현탁제를 첨가할 수 있다. 필요한 경우, 적당한 살균제를 첨가할 수도 있다. 수성 현탁액의 pH는 2 내지 10일 수 있으며, 예를 들면 염산, 인산나트륨, 또는 수산화나트륨과 같은 산 및 염기로 조절할 수 있다. 건조 혼합물은 제약적으로 허용가능한 염, 유기 용매, 및 세정제를 함유하는 수용액중에 희석시킬 수 있다. 수성 제제는 사용에 앞서 현탁 매체를 제약적으로 허용가능한 매체로 만들기 위해 투석, 여과, 또는 크로마토그래피할 수 있다. 제제는 건조분말, 수성 현탁액, 또는 에어로졸로서 환자의 폐내로 직접 투여할 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물은 소형 유리병 및 앰풀과 같은 용접 밀봉 용기에 넣어져 살균 보존될 수 있다. 조성물은 현탁액 완충제를 담은 소형 유리병 또는 앰풀과 별도로 소형 유리병 또는 앰풀에 저장될 수 있으며, 건조 또는 수화된 조성물은 사용에 앞서 현탁액 완충제와 혼합될 수 있다.
지질은 폐 계면활성제 제제의 50 내지 99.9%를 구성한다. 적합한 지질로는 DPPC, PC, CL, PG, PS, FA, 및 TG가 있다. DPPC가 주요 지질 종류를 구성하며 전체 지질 중량의 60 내지 100% 농도로 존재한다. 나머지 지질은 적은 농도로 존재한다. PC, CL, PG 및 PS는 지질의 30% 이하를 구성할 수 있으며, FA 및 TG는 지질 중량의 10% 이하를 구성할 수 있다. 소량 지질 성분의 지방 아실 사슬은 포화 또는 불포화될 수 있으며 사슬 길이는 무관하다. 12 내지 16개 탄소 원자 및 2개 이하의 불포화 결합의 사슬 길이가 바람직하다. 바람직한 지질의 조성은 85 내지 100%의 DPPC 및 0 내지 15%의 PG이다. 가장 바람직하기로는 순수한 DPPC이다.
합성 폐 계면활성제의 지질 성분은 일반적으로 포유류 폐 계면활성제에서 발견되면, 통상의 산업원으로부터 고순도로 얻을 수 있다. 폴리펩티드 성분은 당업자에게 공지된 방법으로 고체상 펩티드 합성하여 제조된다. 본 발명의 지질 및 포유류 폐 세척물에서 단리한 단백질과의 혼합물은 신생아 RDS의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 그러나, 폐 계면활성제 제조에 있어서 이들 지질 및 합성 펩티드와의 혼합물은 단지 최근에 발표된 것이다(맥린(Mclean) 등).
지질은 당업자에 공지된 방법으로 리포좀으로서 현탁시키는데, 즉, 먼저 지질들은 휘발성 유기 용매 또는 클로로포름 및 메탄올 또는 트리플루오로에탄올의 혼합물과 같은 용매의 혼합물 중에서 혼합시킨다. 유기 용매는 질소, 아르곤, 또는 진공하에서 증발시켜 제거한다. 유기 및 무기 산, 염기, 염, 및 덱스트로스와 같은 사카라이드를 함유하는 수용액을 건조 지질 혼합물에 첨가하여 1㎖당 DPPC 0.1 내지 100㎎의 최종 농도가 되게 한다. 일반적으로, 혼합물을 35 내지 50℃로 가온하고 격렬하게 혼합하며, 25 내지 50℃에서 2시간 이하 동안 배양하는 것이 바람직하나 필수적인 것은 아니다. 이어서, 펩티드 또는 펩티드의 혼합물은 일부의 경우 에탄올 또는 트리플루오르에탄올과 같은 적당한 유기 용매, 또는 수성 현탁액내 펩티드의 용해도를 향상시키는 구아니디늄 히드로클로라이드 또는 우레아와 같은 변성제를 함유하는 적당한 수용액 중에 건조 분말로서 첨가 또는 현탁시킨다. 펩티드 및 지질의 회합은 특정 pH에서 증진될 수 있으므로 수용액의 pH는 2 내지 10에서 변화시킬 수 있다. 펩티드 및 지질을 혼합하는 바람직한 방법은 건조 펩티드를 45내지 50℃에서 물 중 지질에 첨가하고, 45 내지 50℃에서 30 내지 90분간 욕조 초음파에 의해 혼합한 후, 동결 건조시키고 -20℃에서 저장하는 것이다.
지질은 임의로 1 내지 100㎎ DPPC/㎖ 농도의 물, 수성 완충액, 또는 염용액 중에서 DPPC 1부당 1 내지 20부의 중량비로 옥틸글루코시드 또는 소듐 데옥시콜레이트와 같은 적당한 세정제와 혼합될 수 있다. 이어서, 펩티드는 건조 분말 또는 유기 용매, 변성제, 또는 세정제를 함유하거나 함유하지 않는 수용액 중 현탁된 형태로 첨가한다. 그런 다음 혼합물을 투석, 여과, 원심분리 또는 크로마토그래피하여 세정제를 제거한다.
바람직하게, 지질 및 펩티드는 소량의 물을 함유하거나 함유하지 않는 휘발성 유기 용매 중에서 혼합된다. 휘발성 용매는 질소 또는 아르곤의 기류하에 진공 오븐내에서, 또는 수성 용매를 첨가하기 전 또는 후에 회전 증발에 의해 증발시킨다.
상술한 방법 중 하나로 제조된 지질 및 펩티드의 혼합물은 바람직하게는 35 내지 50℃에서 음파 조사로 2시간 이하 동안 배양된다. 이어서 혼합물은 수성 매체를 제약적으로 허용가능한 매체로 대체하기 위해 투석, 여과, 또는 크로마토그래피하나, 이는 필수적인 것은 아니다. 일부의 경우에서는 초원심분리, 여과, 또는 크로마토그래피에 의해 반응하지 않은 지질 또는 펩티드를 회합된 지질 및 펩티드로부터 분리시킴으로써 효율이 향상된다. 이어서, 혼합물을 동결 건조 또는 에어로졸화 시킨다.
본 발명의 폴리펩티드-인지질 복합체는 조산아의 폐의 폐 계면활성제를 생성하는 기능 장애로부터 유발된 생리적 상태인 신생아 호흡 곤란 증후군을 치료하는데에 사용될 때, 항산화제 및 합성 폐 계면활성제로서 작용하며, 손실된 천연 계면활성제를 대체하거나 부족한 천연 계면활성제를 충분히 증가시킨다. 치료는 유아의 폐가 충분한 양의 천연 폐 계면활성제를 생성하여 추가의 치료가 불필요해질 때까지 계속한다.
제제는 액체 현탁액, 건조 분말, 또는 에어로졸로서 기관지내 투여에 적합한 것이 바람직하다. 액체 현탁액을 위해서는 건조 혼합물 또는 수성 현탁액 중의 혼합물을 물, 염용액, 덱스트로스, 및 글리세롤과 같은 적당한 시료와 혼합하여 제약적으로 효과적인 조성물을 생성한다. 바람직한 액체 현탁액은 0.8 내지 1.0중량%의 염화나트륨을 함유할 것이며, 바람직하게는 칼슘 이온 중 1 내지 20mM가 될 것이다. 이어서 제제를 살균 여과한다. 일반적으로, 제제는 1㎖당 DPPC 1 내지 100㎎으로 이루어지며, 0.2 내지 5㎖/㎏의 투여량으로 투여된다. 건조 혼합물을 제조하기 위해서는 수성 현탁액을 동결건조한다. 에어로졸은 추진제, 예를 들면 저급 알칸 및 프레온과 같은 플루오르화된 알칸 중에 현탁된 미분 건조 분말로부터 제조된다. 에어로졸은 압축 용기내에 저장된다.
예를 들면, 계면활성제(본 발명의 폴리펩티드 및 지질 복합체)는 기관지내 튜브, 에어로졸 투여, 또는 현탁액 또는 건조 혼합물의 흡입 기체내로의 분무에 의해 적당한 투약량 형태로 투여된다. 계면활성제는 10 내지 200㎎/㎏의 투여량을 1회 또는 수회 투여한다. 바람직한 투여 방법은 기관지내 튜브를 통해 생리 식염수중의 펩티드 및 지질 현탁액을 1㎖당 계면활성제 5 내지 10㎎의 농도로 50 내지 100㎎/㎏의 투여량이 되게 투여하는 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 환자를 치료하기 위해 투여된다. "환라"라함은 포유류, 예를 들면 사람을 의미하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
하기의 실시예는 본 발명의 폴리펩티드, 폴리펩티드/지질 복합체 및 출발 물질의 몇가지 제조 방법을 보여준다. 본 발명은 하기의 실시예 및 이들 제조 방법에 한정되는 것을 아니다.
실시예에서 사용되는 앞서 정의하지 않았던 약어는 다음과 같다.
TBDMS 테트라부틸디메틸실릴
SEt 에틸티오
Suc 숙시닐
TFA 트리플루오로아세트산
Bzl 벤질
Ot-Bu t-부틸 에테르
이것은 각각 Boc 사이클 및 Fmoc 사이클을 위해 ABI 펩티드 합성장치에 사용되는 표준 Boc 화학 및 표준 Fmoc 화학에 따른 것이다.
실험적 화학 공정
[실시예 1]
펩티드 및 기타 화학약품의 합성. 펩티드는 어플라이드 바이오시스템스사(Applied Biosystems Inc., 캘리포니아주 포스터시 소재) 모델 430-A 펩티드 합성 장치로 고체-상 방법에 의해 0.5 mmole 규모로 합성하였다. p-메틸벤족시히드릴아민(pMBHA) 수지가 절단시 C-말단 아미드를 제공하기 위해 사용되었다. 펩티즈 인터내셔널사(Peptides International)의 제품인 곁사슬 보호된 N α-t-Boc(t-부틸옥시카르보닐) 아미노산 Cys(에틸티오), Glu(벤질), Lys(2-클로로벤질옥시카르보닐)은 미리형성된 그들의 대칭 무수물을 거쳐 이중 커플링시켰다. 항산화기는 항산화제의 산을 활성화함으로써 커플링시켜 대칭 무수물을 형성하였다. HBB(3,5-디-t-부틸-4-히드록시벤조산)와 같은 항산화제는 HBB 산을 미리활성화하여 상응하는 대칭무수물을 형성함으로써 펩티드의 아미노 말단에 위치시켰다. 일반적으로 완전한 반응을 보장하기 위해 항산화제를 이중 또는 삼중 커플링시켰다. 예를 들면, HBB는 완전하게 혼입되기 위해서는 3개의 커플링을 필요로 한다. 닌히드린 시험을 근거로 측정한 바 추가의 커플링이 이루어졌다. N α-t-Boc기는 염화메틸렌 중 50% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 제거하였고, 디메틸 포름아미드 중 10% 디이소프로필에틸아민(DEA)으로 중화하였다. 펩티드를 수지로부터 절단하고, -5℃에서 45분간 5%의 아니솔 및 5%의 디메틸술파이드를 함유하는 무수 HF로 탈보호화시켰다. HF는 진공중에서 제거하고, 펩티드는 50% 수성 아세토니트릴을 사용하여 수지로부터 추출하였다. 혼합된 추출액을 냉동 및 동결 건조시키고, 레이닌 다이나맥스(Rainin Dynamax: 21.4 x 250㎜) C18컬럼 상에서 40㎖/분으로 0.1% 수성 TFA(pH2)중 아세토니트릴 구배를 사용하여 역상 제조용 HPLC하고 214㎚에서 관찰함으로써 정제하였다. 주요 피이크를 모으고 동결 건조하였다. 합성 펩티드의 순도(>97%) 및 동정은 분석용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 단일 피이크, 모세관 영역 전기영동, 정(正) 서열과 일치하는 단일 분자 이온을 제공하는 VG 어낼리티칼(Analytical) ZAB2-SE 상의 고속원자 포격 질량 분광 분석(FAB-MS), 및 각각의 잔기에 대한 추정값의 10% 이내인 아미노산 분석으로 확인하였다. L-α-디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)(순도 >90%)은 애번티 폴라 리피드스사(Avanti Polar Lipids, 앨라배마주 버밍검 소재)의 제품을 사용하였다. 이들 방법을 사용하여 하기 펩티드들을 합성하였으며, 이들의 분석 특성을 표 1에 기재하였다.
1(A). 폴리펩티드의 제조: HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 1)(HBB-Aoc = Nα-히드록시-디-t-부틸-벤조일-아미노옥타노일-)
먼저 ABI430A 펩티드 합성 장치내에서 표준 t-Boc 화학을 사용하여 합성된 Lys(Nε-2ClZ)-pMBHA 수지를 사용하여 Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(Nζ-2ClZ)-pMBHA를 제조하였다. 펩티드 1A를 합성하기 위해, Nα-히드록시-디-t-부틸-벤조산(HBB)(501㎎), 디메틸포름아미드(4㎖) 및 염화메틸렌(4㎖)을 혼합하고, 디시클로헥실카르보디이미드 용액(염화메틸렌 중 0.5M 용액 8㎖)을 첨가하고 5분간 교반하여 HBB의 대칭 무수물을 얻었으며, 이어서 이것을 Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(Nζ-2ClZ)-pMBHA에 각 2개 커플링당 10배 이상으로 커플링시켰다. 보호된 펩티드 HBB-Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(Nζ-2ClZ)-pMBHA를 수지로부터 절단하고, 결사슬 보호기는 HBB-펩티드-수지를 -5℃에서 1시간 동안 무수 HF 함유 5% 아니솔 및 5% 디메틸술파이드 중에서 처리함으로써 제거하였다. 이어서, 펩티드를 0.1%의 트리플루오로아세트산 중 50% 아세토니트릴을 사용하여 수지로부터 제거하고, 동결 및 동결건조시켰다. 이어서, 펩티드를 역상 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
1(B). 실시예 1(A)에 기재한 폴리펩티드 및 DPPC 복합체의 제조
펩티드 1(A)를 상술한 바와 같이 제조하였다. 1㎖의 클로로포름 중 DPPC(25㎎)을 질소의 기류하에서 건조시키고, 미량의 유기 용매를 제거하기 위해 진공하에서 건조시켰다. 액체 혼합물을 건조하기 위해 3㎖의 물을 첨가하였다. 제제를 45℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 건조 펩티드 1(A) 0.5㎎을 수성 제제에 첨가하였다. 제제를 45℃에서 2시간 동안 욕조 초음파 장치내에서 음파 분해하였다. 그 결과 얻어진 지질-펩티드 혼합물을 동결건조하고 4℃에서 1개월 이하동안 저장하였다. 시험에 앞서, 0.9% NaCl 9㎖, 20mM의 헤페스(HEPES) 완충액(pH 7.40)을 첨가하였다. 제제를 45℃에서 1시간 동안 주기적으로 혼합하면서 배양하였다.
[실시예 2]
2(A). 폴리펩티드의 제조: HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 2)(HBB-Aoc = Nα-히드록시-디-t-부틸-벤조일-아미노옥타노일-)
ABI430A 펩티드 합성 장치내에서 표준 t-Boc 화학을 사용하여 합성한 Lys(Nζ-2ClZ)-pMBHA 수지를 사용하여 Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Glu(OBzl)-Lys(N-2ClZ)-pMBHA를 제조하였다. 펩티드 2A를 합성하기 위해, Nα-히드록시-디-t-부틸-벤조산(HBB)(501㎎), 디메틸포름아미드(4㎖) 및 염화메틸렌(4㎖)을 혼합하고, 디시클로헥실카르보디이미드 용액(염화메틸렌 중 0.5M 용액 8㎖)을 첨가하고 5분간 교반하여 HBB의 대칭 무수물을 얻었으며, 이어서 이것을 Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Glu(OBzl)-Lys(Nζ-2ClZ)-pMBHA에 각 2개 커플링당 4배 이상으로 커플링시켰다. HBB-Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Glu(OBzl)-Lys(Nζ-2ClZ)-pMBHA 보호된 펩티드를 수지로부터 절단하고, 곁사슬 보호기는 HBB-펩티드-수지를 -5℃에서 1시간 동안 무수 HF 함유 5% 아니솔 및 5% 디메틸술파이드 중에서 처리함으로써 제거하였다. 이어서, 펩티드를 0.1%의 트리플루오로아세트산 중 50% 아세토니트릴을 사용하여 수지로부터 제거하고, 동결 및 동결건조시켰다. 이어서, 펩티드를 역상 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
2(B). 실시예 2(A)에 기재한 폴리펩티드 및 DPPC 복합체의 제조
펩티드 2(A)를 본질적으로 실시예 1에 기재한 바와 같이 DPPC와 혼합하였다.
[실시예 3]
3(A). 폴리펩티드의 제조: Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(Trl-Aoc = Nα-히드록시-디-t-부틸-벤조일-아미노옥타노일-) (서열 동정 번호: 3)
ABI430A 펩티드 합성 장치내에서 표준 t-Boc 화학 합성법을 사용하여 합성한다.
Lys(Nα-2ClZ)-pMBHA 수지를 사용하여 Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(N-2ClZ)-pMBHA를 제조하였다.
펩티드 3A를 합성하기 위해, 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산(트롤록스)(501㎎), 디메틸포름아미드(4㎖) 및 염화메틸렌(2.5㎖)를 혼합하고, 디시클로헥실카르보디이미드 용액(염화메틸렌 중 0.5M 용액 8㎖)을 첨가하고 5분간 교반하여 HBB의 대칭 무수물을 얻은 후, 이것을 Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(Nζ-2ClZ)-pMBHA에 각 2개 커플링당 10배 이상으로 커플링시켰다.
Trl-Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(Nζ-2ClZ)-pMBHA를 수지로부터 절단하고, 곁사슬 보호기를 제거하기 위해, 펩티드를 -5℃에서 1시간 동안 무수 HF, 5% 아니솔 및 5% 디메틸술파이드로 처리하였다. Trl-펩티드를 0.1%의 트리플루오로아세트산 중 50% 아세토니트릴을 사용하여 수지로부터 제거하고, 동결 및 동결건조시켰다. Trl-펩티드를 역상 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
3(B). 실시예 3(A)에 기재한 폴리펩티드 및 DPPC 복합체의 제조
펩티드 3(A)를 본질적으로 실시예 1b에 기재한 바와 같이 DPPC와 혼합하였다.
[실시예 4]
4(A). 폴리펩티드의 제조: HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 4)(HBB = Nα-히드록시-디-t-부틸-벤조일)
펩티드 4(A)는 본질적으로 펩티드 1(A)의 제조법과 유사한 방법으로 제조하였다.
4(B). 실시예 4(A)에 기재한 폴리펩티드 및 DPPC 복합체의 제조
펩티드 4(A)를 본질적으로 실시예 1에 기재한 바와 같이 DPPC와 혼합하였다.
[실시예 5]
5(A). 폴리펩티드의 제조: HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NH2(서열 동정 번호: 5)(HBB-Aoc = Nα-히드록시-디-t-부틸-벤조일-아미노옥타노일-)
펩티드 5(A)는 본질적으로 펩티드 1(A)의 제조법과 유사한 방법으로 제조하였다.
5(B). 실시예 5(A)에 기재한 폴리펩티드 및 DPPC 복합체의 제조
펩티드 5(A)를 본질적으로 실시예 1에 기재한 바와 같이 DPPC와 혼합하였다.
항산화제 부분의 제조
하기의 항산화제 출발 물질은 상기의 실시예에 기재한 바와 같이 사용할 수 있다.
[실시예 6]
항산화제 화합물 출발 물질의 제조: 3-t-부틸-5-메틸-4-히드록시벤조산
반응 용기에 무수 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르(150㎖) 중의 수소화나트륨(4.74g, 0.198mol) 현탁액을 취하였다. 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르(150㎖) 중의 2-t-부틸-6-메틸페놀(0.1mol) 용액을 적가하였다. 1.5시간 동안 50 내지 60℃로 가온한 후, 이산화탄소를 반응 혼합물의 표면 아래로 기체 분산 튜브를 통해 20시간 동안 주입하였다. 5℃로 냉각하고, 초과된 수소화나트륨을 메틸 알코올(30㎖)로 조심스럽게 분해시켰다. 수소의 배출이 멈춘 후, 1N 염산을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 2로 조절하였다. 물(1.6ℓ)로 희석하고 회수하여 표제 화합물을 얻었다.
[실시예 7]
항산화제 화합물 출발 물질의 제조: (6-히드록시-7-t-부틸-5-이소프로필-8-프로필크로만-2-)아세트산
마그네슘 터어닝(turnings)(45㎎, 1.85mmol) 및 1-클로로-2,2-디메틸프로판(74.6㎎, 0.7mmol)을 무수 에테르(9㎖) 중 혼합하였다. 가열 및 격렬하게 교반시킨 후 무수 에테르(1.5㎖) 중 1,2-디브로모에탄(156㎎, 0.839mmol)을 적가하였다. 12시간 동안 환류시킨 후 아르곤 분위기 하에 방치하고 0 내지 5℃로 냉각하였다. 무수 디에틸 에테르(.15㎖) 중 염화이소부티릴(0.533mmol) 용액을 적가하였다. 0 내지 5℃에서 1.5시간 동안 교반한 후, 얼음 및 진한 염산(0.15㎖)의 혼합물 내에 붓고 유기상을 분리하였다. 에틸 아세테이트, 5% 수성 탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 건조(MgSO4) 시키고 진공내에서 용매를 증발시켜 2,2-6-트리메틸-4-헵타논을 얻었다.
염화비닐마그네슘(0.7mmol)을 무수 디에틸에테르(1㎖) 중에 용해시키고, 아르곤 분위기에서 방치하고 1 내지 5℃로 냉각하였다. 무수 디에틸에테르(1.5㎖) 중 염화부티릴(0.533mmol)용액을 적가하였다. 0 내지 5℃에서 1.5시간 동안 교반하고, 얼음 및 진한 염산(0.15㎖)의 혼합물에 붓고 유기상을 분리하였다. 물, 5% 수성 탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 건조(MgSO4)시키고 진공내에서 용매를 증발시켜 프로필 비닐 케톤을 얻었다.
2,2-6-트리메틸-4-헵타논(0.4mol)을 메탄올(10㎖) 중에 용해시키고, t-부톡시드칼륨(12g, 0.1mol)을 첨가하였다. 메탄올(10㎖) 중의 프로필 비닐 케톤(0.2mol)의 용액을 적가하였다. 10분간 교반하고 에틸에테르 및 염수 사이에 분배시켰다. 유기상을 분리하고 중성이 될 때까지 염수로 세척하였다. 건조(Na2SO4)시키고 진공내에서 용매를 증발시켜 2-프로필-3-t-부틸-5-이소프로필벤조퀴논을 얻었다.
2-프로필-3-t-부틸-5-이소프로필벤조퀴논(10mmol), 1,1,3,3-테트라메틸디실록산(1.79㎖, 100mmol) 및 요오드(0.05g)를 염화메틸렌(30㎖) 중에 용해시켰다. 30분간 교반 환류시키고, 1N 수산화나트륨(30㎖)으로 추출하였다. 진한 염산으로 수상을 산성화하고 에틸아세테이트(4x10㎖)로 추출하고, 건조(Na2SO4)시키고 진공내에서 용매를 증발시켜 2-프로필-3-t-부틸-4-히드록시-5-이소프로필페놀을 얻었다.
2-프로필-3-t-부틸-4-히드록시-5-이소프로필페놀(2.0mol) 및 오르토포름산트리메틸(0.3ℓ)을 메탄올(1.2ℓ)중에 용해시키고 탈기하였다. 질소 분위기하에서 방치하고 3℃로 냉각하고 진한 황산(5㎖)를 첨가하였다. 메틸 비닐 케톤(340㎖, 4.0mol)을 적가하고 44시간 동안 냉각없이 교반하였다. 수성 탄산수소나트륨내에 붓고, 에틸에테르로 추출하였다. 건조(MgSO4)시키고 진공내에서 용매를 증발시켜 2-메톡시-2-메틸-7-t-부틸-5-이소프로필-8-프로필-크로만-6-올을 얻었다.
2-메톡시-2-메틸-7-t-부틸-5-이소프로필-8-프로필-크로만-6-올(2mol)을 피리딘(600㎖)중에 용해시키고 아세트산 무수물(900㎖)을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 18시간 동안 탈기 및 교반하였다. 얼음/물 중에 붓고 3시간 동안 교반하였다. 에틸에테르로 추출시키고, 건조(MgSO4)시키고 진공내에서 용매를 증발시키며 크로마토그래프로 정제하여 2-메톡시-2-메틸-7-t-부틸-5-이소프로필-8-프로필-크로만-6-일-아세테이트를 얻었다.
2-메톡시-2-메틸-7-t-부틸-5-이소프로필-8-프로필-크로만-6-일-아세테이트(2mol)를 아세톤(2.5ℓ)중에 용해시키고 물(2ℓ), 이어서 진한 염산(16.6㎖)을 첨가하였다. 압출구 온도가 90℃에 도달할 때까지 교반된 혼합물로부터 용매를 증류시켰다. 현탁액을 냉각시키고, 에틸에테르로 희석하고 수성 탄산수소나트륨으로 세척하였다. 건조(MgSO4)시키고 진공내에서 용매를 증발시키고 크로마토그래프로 정제하여 2-히드록시-2-메틸-7-t-부틸-5-이소프로필-8-프로필-크로만-6-일-아세테이트를 얻었다.
수소화나트륨(미네랄 오일 중 56%, 47.2g, 1.10moL)을 무수 테트라히드로푸란(1ℓ)중에 현탁시켰다. 질소 분위기하에 방치시키고, 트리메틸 포스포노에세테이트(209.4g, 1.15mol)를 적가하였다. 25분간 교반하고 테트라히드로푸란(1ℓ) 중의 2-히드록시-2-메틸-7-t-부틸-5-이소프로필-8-프로필-크로만-6-일-아세테이트(0.5mol)용액을 첨가하였다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후 4시간 동안 가열 환류시켰다. 냉각시키고 진공중에서 용매를 증발시키고, 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
생물학
합성 계면활성제 제제의 효율에 대한 시험법은 종래 기술에 주지되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 합성 계면활성제 제제는 성장 쥐 폐 모델(Ikegami, et al., (1979) Pediatr. Res. 13, 777-780)과 같은 어느 적당한 방법에 의해서도 시험가능하다.
계면활성제가 결여된 쥐 폐의 압력-부피 특성은 히알린 막 질환이 있는 유아의 폐의 것과 유사하며, 폐의 압력-부피 관계의 정상 회복은 투약량 의존 방식으로 주입된 계면활성제의 양과 관련이 있다(Bermel, M.S, et al., 계면활성제 결여 모델인 세척 적출된 쥐 폐, Lung 162: 99-113 (1984)).
[실시예 8]
단리된 취 세척 폐 모델
동물 준비, 압력-부피 곡선 표시 및 폐 세척에 대한 실험 과정은 문헌[Ikegami et al., Pediatr. Res. 11: 178-182 (1977) 및 Pediatr. Res. 13: 777-780 (1979), 및 Bermel et al, Lung 162: 99-113 (1984)]에 기재된 대로 수행하였다. 수컷 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 쥐(200 내지 250g)를 펜토바비탈 나트륨으로 마취시키고 사혈시켰다. 기관(氣管)을 카눌라삽입하고 흉부 기관을 한번에 제거하였다. 외막 조직을 제거한 후, 기관 및 폐(~2g)를 염수(0.9%) 중에 현탁시키고 진공 챔버내에 위치시킨 다음, 스텐길(Stengel)등의 방법에 따라 탈기시켰다. 탈기된 폐를 37℃에서 염수 중에 현탁시키고, 재킷 저장기 및 기관 카눌라를 수압계 및 유리 주사기에 티(T)-튜브로 연결하였다. 유리 주사기를 주입/제거 펌프내에 넣었다. 폐는 공기 포집을 최소화하기 위해 10㎖/분의 속도로 공기를 사용하여 30㎝ H2O 압력까지 신속하게 팽창시키고, 간헐적으로 폐에 공기를 첨가시켜 10분간 이 압력을 유기하였다. 주입된 공기의 전체 부피를 전체 폐 용량(TLC)으로 기록하였으며 일반적으로 14 내지 15㎖이었다. 이어서, 압력이 0이 될 때까지 2.5㎖/분의 속도로 폐를 수축시켰다. 수축 과정 중, 수압계로부터 1㎝간격으로 압력을 읽고 기록하였다. 이들 데이타는 장치의 압력-부피(P-V) 곡선에 대한 보정 후 P-V 또는 준정적(quasistatic) 상응 곡선을 제작하는데에 사용하였다. 탈기 및 평형화한 후, 폐를 5㎖/g의 세척 완충액(0.9% NaCl, 10mM 헤페스, pH 7.4)으로 반복 세척하여 계면 활성제 결여 상태로 만들었다. 압력-부피 곡선이 뚜렷하게 S자형이 되고 폐에 잔류한 공기의 부피가 5㎝ H2O 압력에서 3㎖ 이하가 될 때까지 탈기, 평형화, 및 세척과정을 반복하였다(15 내지 20회). 이 때, 폐는 계면활성제 결여된 것으로 간주하였다. 시험을 위해, 2㎖의 완충액(0.9% NaCl, 10mM 헤페스, pH 7.4)을 건조 폐 계면활성제(인지질 25㎎; 100 내지 125㎎/㎏)에 첨가하고 혼합물을 보텍싱(vortex)한 후, 질소로 플러싱하고 45℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 혼합물을 다시 보텍싱하고, 거품이 생길 경우 탈기시키며, 주사기를 사용하여 2㎖의 시험 혼합물을 폐에 4회 주입 및 제거하였다. 시험 혼합물을 5회째 주입했을 때, 폐에 잔류하게 하였다. 이 과정은 폐를 통해 물질을 고르게 분포시키는데에 적용하였다. 폐를 탈기시키고 37℃에서 5분간 평형화시켰으며, P-V 측정을 수행하였다. 계면활성제의 물리적 특성은 온도에 따라 다를 수 있으므로, 폐는 주위 온도에 대해 37℃에서 염수중에 보존하면서 시험하였다. 카닌(Canine) 폐 계면활성제를 유사한 방법으로 투여하였으나 계면활성제는 5분 동안만 가열하였다. 데이타는 TLC의 백분률로서 나타내었다. 성장 쥐 폐에서의 압력-부피(P-V) 곡선의 수축 부분은 5 내지 10㎝ H2O 압력(PC5및 PC10)에서 전체 폐 용량(TLC의 백분률)을 계산하여분석하였다. 비교는 식[회복% = (PC5(풍부)-PC5(시험용)) x 100 / (PC5(풍부)-PC5(결여))]을 기초로 하고, 특히 상반되는 평균을 갖는 일반 선형 모델 방법을 사용하여 편차를 한 방향(one-way) 분석함으로써 이루어졌다(에스에이에스 인스티튜트 인크.(SAS Institute Inc.), 노쓰캐롤리나주 캐리 소재). 시험 혼합물의 세척 및 처리는 절대 TLC에서 6% 이상 변화시키지 않는다.
결과
쥐에 투여된 제제는 투명한 외관을 가졌다. 성장 쥐 폐에서 압력-부피(P-V)곡선의 수축 부분은 5㎝ H2O 압력(PC5)에서의 전체 폐 용량(TLC) 및 10㎝ H2O 압력(PC10)에서의 TLC의 백분률을 산출하여 분석하였다. PC5값에 기초한 회복은 시험 혼합물들을 비교하는데에 사용되었다. 단독의 DPPC는 세척된 폐의 압력-부피(P-V) 곡선에 뚜렷한 영향을 미치지 못했다. 펩티드-DPPC 혼합물의 활성을 표 2에 나타내었다.
서열 목록
(1) 일반적 정보
(i) 출원인: 맥린, 래리 알
에드워즈, 주드슨 브이
(ii) 발명의 명칭: 공유결합된 항산화제를 갖는 합성 펩티드 폐 계면활성제
(iii) 서열의 수: 5
(iv) 주소:
(A) 수신: 매리언 메렐 다우 인크.
(B) 시가: 이스트 갈브레이스 로드 2110
(C) 도시: 신시내티 피.오.박스 156300
(D) 주: 오하이오
(E) 국가: 미합중국
(F) 우편 번호: 45215-6300
(v) 컴퓨터 판독가능 형태:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 겸용
(C) 운영 체제: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: Patent In Release # 1.0, 버젼 #1.25
(vi) 출원 자료:
(A) 출원 번호: US
(B) 출원 일자:
(C) 분류 번호:
(vii) 우선권 자료:
(A) 출원 번호: US 07/923,092
(B) 출원 일자: 1992년 7월 31일
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: 콜리어, 케네쓰 제이
(B) 등록 번호: 34,982
(C) 참조/사건 번호: MO1582 US
(ix) 원거리 통신 정보:
(A) 전화: (513) 948-7834
(B) 텔레팩스: (513) 948-7961
(C) 텔렉스: 214320
(2) 서열 동정 번호:1에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 4 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 위상: 직쇄상
(ii) 분자 형태: 펩티드
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 1
(C) 그 외의 정보: /각주 = "Xaa = N-알파-[N-(8-히드록시-디-t-부틸-벤조일)-아미노 옥탄]-글루탐산 (HBB-Aoc-Glu)"
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 3
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "Xaa = 2-아미노-이소부티르산 (Aib)"
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 4
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "Xaa = 리신-1-아미드"
(xi) 서열 기재: 서열 동정 번호:1:
Xaa Trp Xaa Xaa
1
(2) 서열 동정 번호:2에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 4 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 위상: 직쇄상
(ii) 분자 형태: 펩티드
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 1
(C) 그 외의 정보: /각주 = "Xaa = N-알파-[N-(8-히드록시-디-t-부틸-벤조일)-아미노 옥탄]-글루탐산 (HBB-Aoc-Glu)"
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 4
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "Xaa = 리신-1-아미드"
(xi) 서열 기재: 서열 동정 번호:2:
Xaa Trp Glu Xaa
1
(2) 서열 동정 번호:3에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 위상: 직쇄상
(ii) 분자 형태: 펩티드
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 1
(C) 그 외의 정보: /각주 = "Xaa = N-알파-[N-(6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸-크로만-2-카르복실산)-아미노 옥탄]"
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 1
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "(계속) = 글루탐산 (Trl-Aoc-Glu)"
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 4
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "Xaa = 2-아미노-이소부티르산(Aib)"
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 5
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "Xaa = 리신-1-아미드"
(xi) 서열 기재: 서열 동정 번호:3:
Xaa Glu Trp Xaa Xaa
1 5
(2) 서열 동정 번호:4에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 4 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 위상: 직쇄상
(ii) 분자 형태: 펩티드
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 1
(C) 그 외의 정보: /각주 = "Xaa = N-알파-[N-(8-히드록시-디-t-부틸-벤조일)-글루탐산 (HBB-G..."
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 3
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "Xaa = 2-아미노-이소부티르산 (Aib)"
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 4
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "Xaa = 리신-1-아미드"
(xi) 서열 기재: 서열 동정 번호:4:
Xaa Trp Xaa Xaa
1
(2) 서열 동정 번호:5에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 4 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 위상: 직쇄상
(ii) 분자 형태: 펩티드
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 1
(C) 그 외의 정보: /각주 = "Xaa = N-알파-[N-(8-히드록시-디-t-부틸-벤조일)-아미노 옥탄-글루탐산 (HBB-Aoc-Glu)"
(ix) 특징:
(A) 동정기호(NAME/KEY): 개질 부위
(B) 존재위치: 4
(C) 그 외의 정보: / 각주 = "Xaa = 리신-1-아미드"
(xi) 서열 기재: 서열 동정 번호:5:
Xaa Trp Ala Xaa
1

Claims (38)

  1. 하기 식의 폴리펩티드 또는 그의 광학 활성 이성질체 또는 제약적으로 허용 가능한 염.
    X-A1-A2-A3-A4-Y
    여기서, A1은 결합이거나 Glu 또는 Asp에서 선택된 음으로 하전된 아미노산이고,
    A2는 Trp, Tyr, Phe, His, Val, Leu 또는 Ile에서 선택된 소수성 아미노산이며,
    A3는 Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, Orn 또는 결합이고,
    A4는 Lys, Arg 또는 His에서 선택된 양으로 하전된 아미노산이며,
    X는 식 Da 또는 Db이고,
    (여기서, B1은 B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)-이고,
    B는 결합, C1-16알킬렌, 또는 C2-16알케닐렌이며,
    각 R1,R2,R3,R4,R5,R6및 R7은 독립적으로 C1-6알킬임)
    Y는 히드록시, 아미노, 알킬아미노 및 알콕시기에서 선택된 A4의 카르복실 치환체이며,
    A3가 결합일 때 A1및 A2는 상호교체될 수 있다.
  2. 하기 식의 폴리펩티드 또는 그의 광학 활성 이성질체 또는 제약적으로 허용 가능한 염.
    X-A1-A2-A3-A4-Y
    여기서, A1은 결합이거나 Glu 또는 Asp에서 선택된 음으로 하전된 아미노산이고,
    A2는 Trp, Tyr, Phe, His, Val, Leu 또는 Ile에서 선택된 소수성 아미노산이며,
    A3는 Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, Orn 또는 결합이고,
    A4는 Lys, Arg 또는 His에서 선택된 양으로 하전된 아미노산이며,
    X는 식 Da 또는 Db이고,
    (여기서, B1은 B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)-이고,
    B는 결합, C1-16알킬렌, 또는 C2-16알케닐렌이며,
    각 R1,R2,R3,R4,R5,R6및 R7은 독립적으로 C1-6알킬임)
    Y는 히드록시, 아미노, 알킬아미노 및 알콕시기에서 선택된 A4의 카르복실 치환체이다.
  3. 하기 식의 폴리펩티드 또는 그의 광학 활성 이성질체 또는 제약적으로 허용 가능한 염.
    X-A1-A2-A3-A4-Y
    여기서, A1은 결합 또는 Glu이고,
    A2는 Trp 또는 Glu이며,
    A3는 Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, 또는 Orn이고,
    A4는 Lys이며,
    X는 식 Da 또는 Db이고,
    (여기서, B1은 B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)-이고,
    B는 결합, C1-16알킬렌, 또는 C2-16알케닐렌이며,
    각 R1,R2,R3,R4,R5,R6및 R7은 독립적으로 C1-6알킬임)
    Y는 히드록시, 아미노, 알킬아미노 및 알콕시기에서 선택된 A4의 카르복실 치환체이다.
  4. 제1항에 있어서, A1이 Glu인 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, A2가 Trp인 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, A3이 Aib인 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, A3이 Ala인 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, A4가 Lys인 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, Y가 아미노인 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, X가 Da인 폴리펩티드.
  11. 제1항에 있어서, 각기 R1및 R2가 t-부틸인 폴리펩티드.
  12. 제1항에 있어서, HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 1)인 폴리펩티드.
  13. 제1항에 있어서, HBB-Aoc-Glu-Trp-Glu-Lys-NH2(서열 동정 번호: 2)인 폴리펩티드.
  14. 제1항에 있어서, Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 3)인 폴리펩티드.
  15. 제1항에 있어서, HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 4)인 폴리펩티드.
  16. 제1항에 있어서, HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NH2(서열 동정 번호: 5)인 폴리펩티드.
  17. 하기 식의 폴리펩티드 또는 그의 광학 활성 이성질체 또는 제약적으로 허용 가능한 염, 및 DPPC, PC, CL, PG, PS, FA 및 TG로 이루어진 군에서 선택된 지질 또는 지질 혼합물의 복합체.
    X-A1-A2-A3-A4-Y
    여기서, A1은 결합이거나 Glu 또는 Asp에서 선택된 음으로 하전된 아미노산이고,
    A2는 Trp, Tyr, Phe, His, Val, Leu 또는 Ile에서 선택된 소수성 아미노산이며,
    A3는 Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, Orn 또는 결합이고,
    A4는 Lys, Arg 또는 His에서 선택된 양으로 하전된 아미노산이며,
    X는 식 Da 또는 Db이고,
    (여기서, B1은 B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)-이고,
    B는 결합, C1-16알킬렌, 또는 C2-16알케닐렌이며,
    각 R1,R2,R3,R4,R5,R6및 R7은 독립적으로 C1-6알킬임)
    Y는 히드록시, 아미노, 알킬아미노 및 알콕시기에서 선택된 A4의 카르복실 치환체이며,
    A3가 결합일 때 A1및 A2는 상호교체될 수 있다.
  18. 하기 식의 폴리펩티드 또는 그의 광학 활성 이성질체 또는 제약적으로 허용가능한 염, 및 DPPC, PC, CL, PG, PS, FA 및 TG로 이루어진 군에서 선택된 지질 또는 지질 혼합물의 복합체.
    X-A1-A2-A3-A4-Y
    여기서, A1은 결합이거나 Glu 또는 Asp에서 선택된 음으로 하전된 아미노산이고,
    A2는 Trp, Tyr, Phe, His, Val, Leu 또는 Ile에서 선택된 소수성 아미노산이며,
    A3는 Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, Orn 또는 결합이고,
    A4는 Lys, Arg 또는 His에서 선택된 양으로 하전된 아미노산이며,
    X는 식 Da 또는 Db이고,
    (여기서, B1은 B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)-이고,
    B는 결합, C1-16알킬렌, 또는 C2-16알케닐렌이며,
    각 R1,R2,R3,R4,R5,R6및 R7은 독립적으로 C1-6알킬임)
    Y는 히드록시, 아미노, 알킬아미노 및 알콕시기에서 선택된 A4의 카르복실 치환체이다.
  19. 제17항에 있어서, DPPC가 지질의 주요 성분을 이루는 복합체.
  20. 제17항에 있어서, 지질이 DPPC 및 PG의 혼합물인 복합체.
  21. 제17항에 있어서, 지질이 DPPC 약 85 내지 100% 및 PG 약 0 내지 15%로 이루어지는 복합체.
  22. 제17항에 있어서, 폴리펩티드가 HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 1)인 복합체.
  23. 제17항에 있어서, 폴리펩티드가 HBB-Aoc-Glu-Trp-Glu-Lys-NH2(서열 동정 번호: 2)인 복합체.
  24. 제17항에 있어서, 폴리펩티드가 Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 3)인 복합체.
  25. 제17항에 있어서, 폴리펩티드가 HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 4)인 복합체.
  26. 제17항에 있어서, 폴리펩티드가 HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NH2(서열 동정 번호: 5)인 복합체.
  27. 제17항에 따른 복합체 및 제약적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 환자의 호흡 곤란 증후군 치료용 제약 조성물.
  28. 제18항에 따른 복합체 및 제약적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 환자의 호흡 곤란 증후군 치료용 제약 조성물.
  29. 제27항에 있어서, DPPC가 상기 복합체의 지질의 주요 성분을 이루는 제약 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 복합체의 지질이 DPPC 및 PG의 혼합물인 제약 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 복합체의 지질이 DPPC 약 85 내지 100% 및 PG 약 0 내지 15%로 이루어지는 제약 조성물.
  32. 제27항에 있어서, 상기 복합체의 폴리펩티드가 HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 1)인 제약 조성물.
  33. 제27항에 있어서, 상기 복합체의 폴리펩티드가 HBB-Aoc-Glu-Trp-Glu-Lys-NH2(서열 동정 번호: 2)인 제약 조성물.
  34. 제27항에 있어서, 상기 복합체의 폴리펩티드가 Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 3)인 제약 조성물.
  35. 제27항에 있어서, 상기 복합체의 폴리펩티드가 HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호: 4)인 제약 조성물.
  36. 제27항에 있어서, 상기 복합체의 폴리펩티드가 HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NH2(서열 동정 번호: 5)인 제약 조성물.
  37. (1) 식 A1-A2-A3-A4-Y의 적절하게 보호된 폴리펩티드를 합성하는 단계, 및
    (2) A1-A2-A3-A4-Y의 적절하게 제조된 알파 아미노 말단을 아실화시키기 위해 식 X의 B1의 활성 카르보닐기와 반응시켜 식 X-A1-A2-A3-A4-Y의 폴리펩티드를 형성하는 단계로 이루어지는 제1항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호 1), HBB-Aoc-Glu-Trp-glu-Lys-NH2(서열 동정 번호 2), Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호 3), HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2(서열 동정 번호 4) 또는 HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NH2(서열 동정 번호 5)인 폴리펩티드인 방법.
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