JPH07509713A - 共有結合された酸化防止剤をもつ合成ペプチド肺表面活性剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　共有結合された酸化防止剤をもつ合成ペプチド肺表面活性剤 発明の分野 これは１９９２年７月３１日に出願された米国特許出願番号第０７／９２３．０ ９２号の一部継続出願である。

本発明は、直接又はリンカ−領域を通して酸化防止剤をペプチドに共有的に結合 させた一連の３−４個のアミノ酸のポリペプチド類の合成に関する。これらの変 更されたペプチド類は、ペプチドの一部に有用な酸化防止剤を構造的にもった合 成肺表面活性剤として有用である。また、これらのペプチド類と脂質との混合物 のｍｌ！、それらの製法、及び哺乳類の呼吸困難症候群の治療に有効な製剤組成 物類も記載されている。

肺は有毒な酸化体と、酸化防止剤防衛系の保護活性との微妙な均衡の上に存在し ている。１！化体の増加や保護的な酸化防止剤防衛系の機能不全によるこの系の 不均衡は、肺の病理生理学的な症状を生し、肺機能不全を起こす、１ヒ体の増加 が寄与している肺機能不全の一つのタイプが呼吸困難症候群（ＲＤＳ）である。

乳幼児呼吸困Ｂ症候群は、生後２８日間の主要な死因である。これは世界で乳児 １００名当たり１名の割合で生し、約ｌＯ％が死亡している。症候群は予定日を 迎えた出生児にはまれにしか起こらないが、一般に胎児の発育不全や出生時の低 体重（２ｋｇ以下）に関連している。成人のＲＤＳは乳幼児のものと同様な臨床 特徴および病理生理学を示し、同様なやり方で集中強化治療施設において管理さ れる。成人の病気は多様な病因をもち、散在性感染、胃内容物の吸引、刺激物や 毒物の吸入なとの肺傷害と、過剰投与の麻酔薬などの給源から生ずる肺水腫の結 果として生ずる。

呼吸用Ｒ症候群（ＲＤＳ）は、ガス交換が起こる場所の肺胞を被覆する肺表面活 性剤がないことまたは機能不全と関係しており、スーパーオキシドラジカル、ヒ ドロキシルラジカル、ヒドロキシルラジカルを発生させうる過酸化水素、および 細胞損傷に関係があるとされている過酸化脂質のような酸化体として知られる、 肺又は肺空所中のＭｌを中心としたフリーラジカルに関連があるとされたくヘフ ナー（Ｈｅｆｆｎｅｒ）ら、　Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ。

１０４巻５３１−５５４頁、１９８９年：ハリエル（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ）、Ｆ 　Ａ　Ｓ　ＥＢＪ、１巻３５８−３６４頁、１９８７年）。

酸化防止剤部分をもったより大きなポリペプチド類の合成肺表面活性剤は、１９ ９１年１１月４日に出願された米国特許出願番号第０７／７８９．９１８号に記 載された。こらは参照によって本明細書に取り入れられている。しかし、本発明 は感受性化合物のオキシダントへの酸化を抑制する能力をもった３−４個のアミ ノ酸の短縮ベブチＦ’　Ｂに酸化防止性状をもたせた、有効な合成肺表面活性剤 を提供している。短縮肺表面活性剤は、より有効でより費用効果的な治療法を提 供している。本発明の新規性は、表面活性性状を保有しながら、ペプチドを３− ４個のアミノ酸まで効果的に減らし、共有結合された酸化防止剤に結合されたペ プチドを効果的に送り出す能力にある。

幾つかの合成肺表面活性剤製剤では、ビタミンＥのような治療剤を、別包の成分 として表面活性剤製剤に加えテイル（米国特許第４．７６５，９８７号；　ＰＣ Ｔ公間番号＊ＷＯ９０／１１７６８号：　ＰＣＴ公間番号第−０９０１０７４６ ９号）、シかし、本発明では、酸化防止剤は別個の成分でなく、ポリペプチド内 に実際に入れられている。酸化防止剤をポリペプチドに入れることの利点は、３ 成分混合物（脂質、ポリペプチド、および酸化防止剤）をもつ代わりに、２成分 混合物が利用できることである。これは、市販可能な薬剤の効力を試験する場合 に、各成分について種々の用量と処方剤を試験しなければならないため、試験上 の著しい利点となりうる。さらに、２成分処方剤は、製造がより容易である。

本発明のポリペプチド類は、脂質との混合物中で単独で、またはポリペプチドが 表面活性剤混合物の少量成分をなす脂質混合物中と朝み合わせて使用できる０本 発明の組成物類は、合成成分の定義された混合物であるから、高純度で、標準化 されたやり方で：ＡＩ！できる。また、成分は動物給源に由来するものでなく、 これはウィルスや細菌による汚染の危険を最小限化する。

α−らせん形で１０残基の両性ペプチド（両性のα−らせん形ペプチドの記載に ついては、マクリーン・エル・アール（ＭｃＬｅａｎ、　１．、Ｒ，）　ら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、１９９１年、３０巻３１頁を参照）のらせん杉ホイール表示が、 ３及Ｕ４残基のペプチド類のモデルを開発するのに使用される。α−らせんの胴 部を見下ろすと、残基の側鎖はらせん上で疎水性の面と親水性の面を示す、４残 基のペプチドは、必要な疎水面と親水面を存在させたこのα−らせんの１回転を 表わす、３残基のペプチドは、なおも疎水面と親水面を備えたα−らせんの締付 けられた１回転を表わす。

発明のまとめ 本発明は、ポリペプチドが次の式Ｉ Ｘ−Ａ、−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｙ　１ ［式中　Ａ、は結合であるか、又はＧｌｕ又はＡｓｐから選ばれる負に荷電され たアミノ酸である。

Ａ２はＴｒｐ、　Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、　Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はｌｌｅから 選ばれる疎水性アミノ酸である。

Ａ３はＡｉｂ、Ｇｌｕ、　Ｇｌｎ、　Ｌｅｕ、　Ａｌａ、　Ｏｒｎ、又は結合で ある。

またＡ４はＬｙｓ、　Ａｒｇ、又はＨｉ　ｓ　ｂ）ら選ばれる正に荷電されたア ミノ酸である。

Ｘは式Ｄａ又はＤｂ 又は であって、ここでＢ、はＢ、−Ｃ（０）−１−Ｂ−Ｃ（０）−１−Ｃ（０）−Ｎ Ｈ−Ｂ−Ｃ（０）−であり；Ｂは結合、ｃ　＋−ｔｅアルキレン、又ζよＣ２− ＋ｅアルケニレンてあり、また各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ ７は独立にＣｌ−８アルキルである。

Ｙはヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から遍ばれる、Ａ ４のカルボキシＪＬ、置換基てあり、ここてＡ３が結合である時には、Ａ、とＡ ２Ｌ！相互りこ取り替えることができる。コのもの、又はその光学活性異性体又 は製薬上受は入れられるその塩である場合の、ポリペプチドと脂質との複合体か らなる合成肺表面７古性剤を含めてなる。

更に本発明は、ポリペプチドか次の式２％式％ ［式中　Ａ、は結合叉はＧ　ｌ　ｕである。

Ａ２はＴｒｐ又はＧｌｕである。

Ａ３はＡｉｂ＋Ｇｌｕ、Ｇ１ｎ＝　Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｏｒｎである。

またＡ４はｌｙｓである。

Ｘは式Ｄａ又はＤｂ 又は であって、ここでＢ、はＢ、−Ｃ（０）−１−Ｂ−Ｃ（０）−１−Ｃ（０）−Ｎ Ｈ−Ｂ−Ｃ（０）−であり；Ｂは結合、Ｃ１−Ｉ６アルキレン、又はＣ２−１８ アルケニレンであり、また各Ｒ０、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は 独立にＣ０−６アルキルである。

Ｙはヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から選ばれる、Ａ ４のカルボキシル置換基である］のもの、又はその光学活性異性体又は製薬上受 は入れられるその塩である場合の、ポリペプチドと脂質との複合体からなる合成 肺表面活性剤を含めてなる。

更に、本発明のペプチド類を、天然の肺表面活性剤と一緒にされた一つ以上のタ イプからなる脂質と一緒にすることができる。

これらのポリペプチド−脂質複合体とその製剤組成物類は、哺乳類の呼吸困難症 候群の処置に有用である。

図面の簡単な記載 図１は、短いペプチド用のモデルを開発するのに使用された１０残基のペプチド 表面活性剤のらせん形ホイール表示である。図は、らせんの胴部を見下ろしたも ので、残基のａｌｌ鎖はらせん軸との関係で位置を表示しである。

疎水面は図面の右側の残基を包含し、これらはＴｒｐ’、しｃＬｌ’、Ｌｅｕ５ 、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ”、Ｌｅｕ６である。親水面は荷電された残基のＬｙｓ’、 Ｇｌｕ７、Ｇｌｕ３、Ｌｙｓ’°を包含している。

図２は、図１に示す１ｏ残基のペプチドのらせん形ホイール投影像の１回転に基 づいて設計された４ペプチドの酸化防止剤の一例である。図１ペプチドの疎水面 はＴｒｐ２、Ａｌａ３、ＨｔｌＢ−Ａｏｃて澤き換えられており、これらはペプ チドを脂質に固着させるのに十分な疎水面を表わす。荷電された親水面は、Ｇｌ ｕ’としｙ　ｓ　４に置き換えられた。

表の簡単な記載 表１は、合成ペプチドのアミノ酸分析からの結果を示す。

表２は、成熟ラットの肺モデルにおける化合物類の有効性を示す圧力−容積実験 の結果を示す。

天然のアミノ酸の次の一般的な省略形が明細書を通じて使用される。

Ｐｈｅ又はＦ　−フェニルアラニン Ｔｒｐ又は−−トリプトファン Ｍｅｔ又は門　−メチオニン Ａｓｐ又はＤ　−アスパラギン酸 Ｇｌｕ又はＥ　−グルタミン酸 Ｇｌｎ又はＱ　−グルタミン Ａｓｎ又はＮ　−アスパラギン Ａｉｂ　−アミノ−イソ酪酸 グリシジを例外として、天然アミノ酸はキラル炭素原子を含有している。他で特 定してそうでないと示されなければ、本明細書で述べられる光学活性アミノｍ類 はＬ立体配置のものである０本発明の酸化防止剤部分がペプチドに付加されたら 、立体異性体類が形成されうる０本発明はこのような立体異性体の混合物類、並 びに単離された立体異性体類を含む、慣習どおり、木明ｍｗで描かれているペプ チド類の構造は、アミノ末端が鎖の左側にあり、カルボキン末端が鎖の右側にあ る構造°Ｃある。

二つのアミノ酸が一緒になって典型的アミド結合を通し−Ｃペプチドを形成する 時は、水分子は放出され、各アミノ酸の残りの部分は残基と呼ばれる。アミド結 合はＸが続くアミノ酸に又はアミド結合アイソスターに結合されたときも生し得 る。従って、「残基」は末端アミノ基の水素原子を欠いており、そして末端カル ボキシ基のヒドロキシル基を欠いたアミノ酸である。受は入れられた用語を使用 して、アミノ酸又はアミノ酸誘導体に対する３文字コートの前にあるダッシュ（ −）〈水素の欠如を示す）は、残基のアミド結合を示している。

本明細書で使用される「アルキル」は、特定された炭素原子の数に応して、メチ ル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、第ニブチル、イソペ ンチル、１−メチルブチルのような直鎖又は分枝鎖炭化水素基を意味している８ 本明細書で使用される「アシル」は、ヒドロキシル基の除去によって有機酸から 形成される基である。一般式はＲＣＯ−であって、ここてＲは脂肪族、脂環式、 芳香族炭化水素、又は氷嚢（ホルミル基）でありうる、Ｒ基はｆｆｉ　ＩＩ基を もちうる。アシル基の一例はスクシニルである。

本明細書で使用される用語の「疎水性アミノ酸」は、Ｖａｔ、　Ｌｅｕ、又はｌ ｌｅのような脂肪族炭化水素側鎖をもった非極性残基、又はＰｈｅ、　Ｔｙｒ、 Ｔｒｐ、又はＨｉｓのような芳香族基をもった非極性残基を意味している。

本明細書で使用される用語の「負に荷電されたアミノ酸」は、Ｇｌｕ又はＡｓｐ のような酸性の親水性側鎖をもった極性残基を意味している。

本明細書で使用される用語の「正に荷電されたアミノ酸」は、Ｌｙｓ、　Ａｒｇ 、又はＨｉｓのような塩基性の親水性側鎖をもった極性残基を意味している。

Ｘが指定の酸化防止剤によって機能的に変更されていない場合のペプチド類は、 下記の固相配列手順のような任意適当な方法によって合成できる。好ましいマー カッシュ群は、Ｒ，、Ｒ２、Ｒ６、及びＲ７が各々第三ブチルてあり、Ｒ３、Ｒ ４、及びＲ５の各々がメチルである場合のものである。ＤａはＤｂより好ましく 、Ｂは好ましくは−Ｃ（０）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（０）−てあり、その場合にＢはＣ ８アルカンである。

Ｘはポリペプチドに酸化防止性を付与する部分であると考太られるため、本明１ ！１Ｆで「酸化防止剤部分」と述べる。しかし、Ｘがポリペプチドとの連結器（ リンカ−）を有することが出来、従ってポリ・ペプチドζこ結合される酸化防止 剤部分を記載する時には、その部分が適当なリンカ−１例えばＢ、−ｃ＜ｏ＞− １Ｂ−Ｃ（０）−１Ｃ（０）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（０）−等をも包含することは理解 されよう。

Ｘを形成させるには、多くの方法がある。例えζＸ、酸化防止剤化合物から形成 されるアシル化剤によって、アミノ酸誘導体をアシル化てきる。アシル化剤であ るためには、酸化防止剤化合物類は対称的漸水物や活性エステル、例えばＮ−ヒ ドロキシヘンシトリアゾールエステル（）ｌＯＢｔエステル）を形成できる０次 にアシル化剤を未保護官能性！１核基に対して露出させて、反応が起こるように させる。これは、酸化防止剤部分を受け取るアミノ酸が樹脂に結合されたペプチ ドの一部である場合の、同相ペプチド合成で行なわれるのが好ましい。

エステル化、還元性アルキル化等によってペプチドζこ取り入れるに先立って、 個々のアミノ酸類を変更することもてきる。官能基を含有するアミノ酸及びアミ ノ酸誘導体類のその他の変更は、この技術で周知である。

本発明でアミノ酸類やアミノ酸誘導体類との反応りこ有用であることがわかった 酸化防止剤化合物類の好まし０例は、以下のとおりである。

１）　ＨＢＢ　３．５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸 ２）　ＨＢＰ　３−（３’、５’−ジー第三ブチル−４−ヒドロキシフェニル） −プロピオン酸 ３）　ＨＢＣ３，５−ジー第三ブチル−４−ヒドロキシ珪皮酸 ４）　）ＩＯＡ　２−（３’、５’−ジー第三ブチル−４−ヒドロキシフェニル ）酢酸 ５）　ジーＨＢＡ　２，２−ジー（３’　、５’−ジー第三ブチル−４−ヒドロ キシフェニル）酢酸 ６）　Ｔｒｌ　６−ヒトロキシー２，５．７．８−テトラメチルクロマン−２− カルボン酸（トロロクスとしても知られている） 官能基がアルコール基又はアミノ基の時に８８８．８ＢＰ、＋＋　Ｂ　Ｃ、ｌ− Ｉ　Ｂ　Ａ、ジー１＋ＢＡ、及びＴｒｌを使用するのが好まし％ｓ　。

リンクした表面活性剤のグループ内で、より好まし０グループ、例えば）ＩＢＢ 及びＴｒｉを選択てきる。

上の酸化防止剤化合物類は市販されているか、又くえその合成はこの技術で知ら れている０例えば、３．５−ジー第三ブチル−４−ヒドロキシフェニル酢酸はｌ 　ｚｖ　、　Ａｋａｄ　、　ＮａｕｋＳＳＳＲ，Ｓｅｒ、にｈｉ＋ｇ、、　３５ ８　（１９６５年）に記載され、また３、５−ジー第三ブチル−４−ヒトロキシ ヘンズアルデヒドはＪ、Ｏｒ３゜Ｃｈｅｗ、、　２２巻１３３３頁（１９５７年 ）に記載されて（する。一般に、酸化防止剤化合物は、（１）本発明のポリペプ チドζこ結合できるもの、（２）ポリペプチドに結合されてｔｌて酸化防止剤活 性を示すもの、及び（３）ポリペプチドが本明細書に記載される性能を示すこと が出来るようにするものてあればとんなものても本発明で使用できる。

Ｔｒｌ−Ｇｌｕ−とは、下記に示すようにトロロクスがグルタミン酸残基のσ− アミノ基に結合している、トロロクスとグルタミル残基の閑に形成されたペプチ ド結合を有する分子を意味する。

Ｔｒｌ・Ｇｌｕの例て示されるように、酸化防止剤部分（この場合Ｘ＝Ｄｂｈ） っＢ−結合）は、カルボニル基（Ｃ（０）−）と−緒にポリへブチトのα−７ミ ノ末端に結合出来、Ｄｂ−Ｃ（０）　Ａ、１−Ａ２　Ａ３　Ａａ−’ｌ’を形成 する。

本発明のポリペプチド類は、溶液相の化学法なと、当業者に容易に知られる種々 の手順によって調製できる。

好ましい方法は、ＡＢＩペプチド合成合成法うな自動化方法を使用できる同相配 列手順である。固相配列手順では、次のステップが生しる。（１）保護α−アミ ノ基をもった第一アミノ酸を樹脂支持体に結合する。（２）保護α−アミノ基を もフた第二アミノ酸のカルボキシ基を活性化する。

（３）第一アミノ酸が樹脂に結合したままであることを可能にする試薬で、第一 アミノ酸を脱保護する。そして（４）第一アミノ酸のα−アミノ基と第二アミノ 酸の活性化カルボキシ基との間でカップリングが起こる。これらの段階は、新し いアミノ酸残基で繰り返され、これによりペプチド形成が可能となる。所望の長 さのペプチドが形成されたとき、ペプチドは、樹脂から切り離し、脱保護し、単 離するに先立って、適当に結合した抗酸化剤部分て修飾出来る。別の方法として 、保護されたペプチドを樹脂から選択的に除去し、保護基の除去と単離に先立っ て抗酸化部分をペプチドに結合する。

使用の樹脂支持体は、ポリペプチド類の固相ｖ４Ｉ！のためにこの技術で慣用的 に使用される任意適当な樹脂、例えば、初期に導入されるα−アミノ保護アミノ 酸とのエステル形成の場を提供するためにクロロメチル化又はヒドロキシメチル 化した０、５〜＆′１３％のジビニルヘンゼンで架橋されたポリスチレンである 。その他適当な樹脂支持体はｐＭＨＢＡ（ケンタンキー州ルイスビル、ペプチド ・インターナショナル社）　、　ＲＩＮＫ　（カリフォルニア州ラボイヤ、カル バイオヶへ社）及びサスリン（ペンシルベニア州フィラデルフィア、バイオケム 社）である。サスリン（Ｓａｓ日ｎ）　Ｆｉｌ脂は、へＢ１ペプチド合成機ユー ザーマニュアルに記載されている第一アミノ酸を乗せるために特別なＡＢＩサイ クルを必要としている。全体を本明細書に取り入れるアプライド・バイオシステ ムズ・モデル４３０Ａペプチド合成機ユーザーマニコアルに記載されたとおりに 、侃謹α−アミノ基をもった第一アミノ酸を樹脂に結合する。

ペプチド鎖を結合する為に加えられた各アミノ酸を活性化する好ましい方法は、 適当に侃謹されている各加えられたα−アミノ保護アミノ酸の対称無水物又は活 性エステルの形成を包含する。例えば、ジクロロメタン（ＤＣＭ）の存在下にα −アミノ保護アミノ酸をジシクロへキシルカルボジイミＦ（ＤＣＣ）と反応させ て、対称無水物を生成出来る。その代わりに、８ｏｃ−アミノ酸（第三ブチロキ シカルＡでニル−アミノ酸）とＨＯａ　ｔをＤＣＣ中に溶解し、冷却し、追加の ＤＣＣを加え、溶液を室温まで暖めることによって、ＨＯＢ＋活性エステルが形 成できる。次に、この溶液をアミノ酸結合樹脂に加える。アシル化剤を形成させ るこの活性化法は、酸化防止剤化合物にとっても使用できる。

α−７ミノ基のほかに池の官能基が存在する場合は、それらの基も一般に保護し なければならない。一般に、α−アミノ基と各（ｊ１鎖官能基は、一方の保護基 を除くことなく他方の保護基な除去できるように、異なる保護基て償謹てきる。

本発明での使用に考えられるα−アミノｆ＾謹基の部類には、（１）ポルミル、 トリフルオロアセチル、フタリル、トルエンスルホニル（トンル）、ヘンゼンス ルボニル、ニトロフェニルスルフェニル、トリチルスルフェニル、０−ニトロフ ェノキシアセチル、及びγ−クロロブチリルのようなアノル型の保護基；　（２ ）ｆｉンジロキシ力ルボニル及び置換ヘンシロキシカルボニル、例えばｐ−クロ ロヘンシロキンカルボニル、ｐ−ニトロヘンシロキシカルボニル、ｐ−ブロモヘ ンシロキシカルボニル、ｐ−メトキシヘンシロキシカルボニル、１−（ｐ−ビフ ェニルＬｌ−メチルエトキシカルボニル、α、α−ジメチルー３．５−ジメトキ シベンシロキンカルボニル、及びヘンズヒトロキシ力ルボニルのような芳香族ウ レタン型保護基；（３）第三ブチルオキシ力ルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピ ルメトキシカルボニル、イソプロビロキシカルボニル、エトキシカルボニル、及 びアリロキシカルボニルのような脂肪族ウレタンＸ護基；（４）シクロベンチロ キシカルボニル又は９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような シクロアルキルウレタン型保護基：（６））リフェニルメチル（トリチル）のよ うなアルキル型保護基；（７））リメチルシランのようなトリアルキルシラン基 がある。

しかし、α−アミン保護基の選択は、使用の樹脂、目標位置の官能基、ポリペプ チド中に存在する他方の官能基、及びアミノ酸誘導体Ｘが切断試薬による樹脂か らの切り離しに耐えるかどうかに依存している。例えばＨ８Ｂ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ −Ｔｒｐ−Ａ＋ｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ，、（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：ｌ）を製造するに は、ｐＭＢＨＡ樹脂を使用し、これはＣ末端アミノ基を造り、そしてペプチドが ＡＢ１４３ＯＡペプチドシンセサイザー上で標準のｔ−Ｂｏｃ化学法を用いて構 成されてい＜、）１８８部分は、グルタミン酸の標的部分Ｎ−α−アミノ基にＨ ＢＢを付ける為に、ＨＯＢＴ活性エステルとして導入できる。樹脂からペプチド を切り離すと同時に、残りの保護基を除くためには、篭水フッ化水素酸（ＨＦ） が使用できる。

保護基を選択的に除くための試薬と保護基の適当な組み合わせの選択は、この技 術で周知である０例えば、エム・ボダンズキー（Ｍ、　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）　 、ｒペプチドの化学：　実用テキスト（ＰＥＰＴＩＤＥ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、 　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＴＥＸＴＢＯＯに）」（スプリング・フェアラグ社 、１９８８）　；ジエイ・スチュアート（Ｊ、　Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、「固相ペ プチド合成」　（第２版、ピアース・ケミカル社、１９８４年）を参照のこと。

各保護アミノ酸又はアミノ酸配列は、約４倍過剰量で同相反応器に導入され、ジ メチルホルムアミド：塩化メチレン（１：ｌ）又はジメチルホルムアミドのみ、 又は塩化メチレンのみの媒体なとの中でカップリング剤の存在下にカップリング が行なわれる。不完全なカップリングが起こる場合は、同相反応器での次のアミ ノ酸のカップリングに先立って、α−アミノ保護基の除去前に、カップリング手 順を繰り返す０合成の各段階におけるカップリング反応の成功は、イー・カイザ ー（Ｅ、にａｉｓｅｒ）ら、Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３４巻５９５ 頁（１９７０年）に記載されるように、ニンヒドリン反応によってモニターされ る。

所望のアミノ酸配列が得られた後、ペプチドはポリペプチドに悪杉饗しない任意 適当な試薬を使用して、樹脂から除去される。例えば、０．１％トリフルオロ酢 酸中に５％アニソールと５％アセトニトリルを含有する無水）ＩＦを使用すると 、ポリペプチドがｐＭＢｌｌＡ樹脂から切り離される。

式ｌのポリペプチド類は、任意の無毒性有機又は無機酸と製薬上受は入れられる 塩類を形成できる。適当な塩類を形成する憲法ｗ１類の例は塩酸、臭化水素酸、 硫酸及び燐酸、並びにオルト燐酸−水素ナトリウムと硫酸水素カリウムのような 酸金属塩類を包含する。適当な塩類を形成する有機１ｉ１１類の例は、モノ−、 ジー、及びトリカルボン酸類を包含する。このような酸類の例は、例えば酢酸、 グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマール 酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマ レイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安忘香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸 、２−フェノキシ安息香酸、及びメタンスルホン酸と２−ヒドロキシエタンスル ホン酸のようなスルホン酸類を包含する。カルボキシ末端アミノ酸部分の塩類は 、任意適当な無機又は有機塩基類と形成される無毒性のカルボン酸塩類を包含す る０例として、これらの塩類はアルカリ金属、例えばナトリウムとカリウム；ア ルカリ土類金属、例えばカルシウムとマグネシウム；アルミニウムを含めた第ｍ Ａ族の軽金属類；及び有機第一級、第二級、及び第三級アミン類、例えばトリエ チルアミンを含めたトリアルキルアミンや、プロ力イン、ジヘンジルアミン、Ｉ −エテナミン、Ｎ、Ｎ’−ジヘンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルア ミン、Ｎ−（低級）アルキルピペリジン、及びその他任意適当なアミンとの塩類 を包含する。

本発明のタンパクトリン脂質複合体のリン脂質は任意のリン脂質でよく、本明細 書で使用されるこの用語は、ホスホグリセリド類とスフィンゴ脂質類を包含する 。ホスホグリセリＦ’　ＫＭは、グリセロールの二指肪酸エステルであって、こ こでグリセロール部分の残りのヒドロキシ基、すなわち末端ヒドロキシ基はリン 酸とエステルを形成する。一般に、ホスホグリセリド類のリン酸部分は、エタノ ールアミン、セリン、コリン、又はグリセロールのようなアルコールと第二のエ ステルを形成する。スフィンゴ脂質はスフィンゴシンやジヒドロスフィンゴシン の一脂肪酸エステルであり、ここで１−位置のヒドロキシ基はリン酸のコリンエ ステルとエステルを形成する０本発明のタンパクトリン脂質複合体の好ましい脂 質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、他の鎖長と飽和度の アンル鎖を含有するホスファチジルコリン分子（ＰＣ）、カージオリピン（ＣＬ ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）フォスファチジルセリン１１１（ＰＳ ）、脂肪酸類（ＦＡ）、及びトリアジルグリセロール類（ＴＧ）を含む、　ＤＰ ＰＣは肺表面活性剤混合物の主要な成分をなすが、ＰＣ，ＣＬ、ＰＧ、　ＰＳ、 　ＦＡ、及びＴＧは少量成分である０本発明のリン脂質用に適した脂肪ＭＯは、 典型的には分枝していない、長鎖カルボン酸類（一般に８個以上の炭素原子をも つもの）である、脂肪酸類は飽和又は不飽和でありうる０代表的な脂肪酸類はラ ウリン酸、ミリスチン酸、バルミチン酸、及びオレイン酸である。

本発明のポリペプチド又はタンパク質−リン脂質複合体の製剤は乾燥混合物又は 水性懸ＩＩＩ液として製造できるが、場合によっては水性懸濁液は、例えばエタ ノール又はトリプルオロエタノールのような少量の有機溶媒、ドデシル硫酸ナト リウムやナトリウムデオキシコレートのような洗剤、塩化カルシウムや塩化ナト リウムのような塩類、ブドウ糖、デキストロース、又はマンニトールのような炭 水化物、及びグリシンやアラニンのようなアミノＷＩｉ類を含有する。！！剤組 成物を液体型につくる時は、その液体の、安定剤、防腐剤、浸透圧調整剤、緩衝 剤、及び！！１剤を添加できる。所望により、適当な殺菌剤も添加できる。水性 懸濁液のｐ）ｌは、２ないしＩＯの閏で変わり、酸と塩基、例えば塩酸、リン酸 ナトリウム、又は水酸化ナトリウムで調整できる。乾燥混合物は、製薬上受は入 れられる塩類、有機溶媒、及び洗剤を含有する水溶液にもどすことができる。水 性製剤は、使用前に製薬上受は入れられる媒体と！！濁媒体を交換するために、 透析、濾過、又はクロマトグラフィ処理できる。！１剤は乾燥粉末、水性ｌ！！ 濁液、又はアエロゾルとして、呼吸困難患者の肺に直接投与できる０本発明の製 剤組成物は、バイアルやアンプルのような気密密閉容器に仕込み、蝿菌的に保存 てきる。懸濁緩衝液を含有するバイアル又はアンプルとは別に、組成物をバイア ル又はアンプルに保存し、乾燥又は水和組成物を使用前に懸濁緩衝液と混合でき る。

脂質は肺表面活性剤製剤の５０〜９９．９％を構成している。

！　当すＩ’ｌｉ　Ｉｔ　ハ、ＤＰＰＣ，ＰＣ，ＣＬ、　ＰＧ、　ＰＳＳＦＡ、 及Ｕ　ＴＧヲ包含する。　ＤＰＰＣは主要な脂質種をなしており、全脂質重量の ６０−１００％の濃度で存在する。残りの脂質は低濃度で存在する。ＰＣ，ＣＬ 、　ＰＧ、及びＰＳは、脂質の３０％までをなし得、ＦＡとＴＧは脂１１重量の １０％までをなし得る。少量脂質成分の脂肪アシル鎖は、飽和又は不飽和であり 得、任意の鎖長てありうる。１２１６個の炭素原子の鎖長と２個までの不飽和結 合が好ましい。好ましい脂質組成物はＤＰＰＣが８５−１００％、それにプラス ＰＧが０−１５％である。純粋なり　Ｐ　ＰＣが最も好ましい。

合成肺表面活性剤の脂質成分は、哺乳類の肺表面活性剤中に一般的に見い出され 、一般的な工業的供給源から高純度で入手できる。ポリペプチド成分は、当業者 になじみ深い方法により、固相ペプチド合成によって調製される０本発明の脂質 と哺乳類の肺洗浄法から単離されるタンパク質との混合物は、新生児呼吸困難症 候群（ＲＤＳ）の処置に有効であることが示された。しかし、肺表面活性剤製剤 中のこれらの脂質と合成ペプチドとの混合物は、最近になって報告されたにすぎ ない（マクリーン等）。

脂質は、当業者に知られた方法でリポソームとして懸濁され、ここで、最初に脂 質は揮発性有機溶媒又は溶媒混合物、例えばクロロホルムとメタノール又はトリ フルオロエタノールとの混合物中で混合される。有機溶媒は、窒素、アルゴン下 、又は真空下に原発によって除去される。有機及び無機酸類、塩基、及び塩類、 並びにデキストロースのような１１１類を含有しろろ水溶液を、乾燥脂質混合物 に、■１当たり０．１１００　ＢのＤＰＰＣ最終濃度が達成されように添加する 。概して、混合物を３５−５０℃に暖め、激しく混合し、２５−５０℃で２時閏 まで培養するのが好ましいが、必ずしも必要ではない０次に、ペプチド又はペプ チド混合物を乾燥粉末として加えるか、又はエタノールやトリフルオロエタノー ルのような適当な有機溶媒、又は水性懸濁液中でペプチドの溶解度を改良するグ アニジニウム塩酸塩や尿素のような変性剤を場合によっては含有する水溶液中に 懸濁する。ペプチドと脂質との会合は特定ｐｌ＋で促進されるため、水溶液のｐ Ｈは２−１Ｏの範囲にありうる。ペプチドと脂質を混合する好ましい方法は、４ ５−５０℃の水中で乾燥ペプチドを脂質に加え、４５−５０℃で３０−９０分、 浴超音波処理によって混合し、次に凍結乾燥し、−２０℃で保存することである 。

任意付加的に、１当たりｌ−１００ｍｇのＤＰＰＣ濃度で水、水性緩衝液、又は 食塩溶液中に、ＤＰ’ＰＣの１部当たり洗剤１−２０部の重量比で、オクチルグ ルコシドやナトリウムデオキシコレートのような適当な洗剤と脂質とを混合する ことも出来る。次にペプチドを乾燥粉末として加えるか、又は有Ｉｌ溶媒、変性 剤、又は洗剤を伴った、又は伴わない水溶液に懸濁する。次に、洗剤を除くため に、混合物を透析、濾過、遠心分離、又はクロマトグラフィ処理する。

少量の水を加えた、又は加えない揮発性有機溶媒中で脂質とペプチドを混合する のが好ましい。揮発性溶媒を水性溶媒の添加前、又は後に、窒素又はアルゴン流 下に真空炉内で、又は回転蒸発によって蒸発させる。

上記の方法の一つによって調製される脂質とペプチドの混合物を、好ましくは３ ５−５０℃で、音波照射しながら２時閏まて培養する。次に、水性媒体を製薬上 受は入れられる媒体と置き換えるために、混合物を透析、濾過、又はクロマトグ ラフィ処理できるが、これは必要ではない、ある場合には、超遠心分離、濾過、 又はクロマトグラフィによって、未反応の脂質やペプチドを会合した脂質及びペ プチドから分離することて、効力は改善される。

次りこ、１；合物を凍結乾燥又はアエロゾル化する。

本発明のポリペプチド−リン脂質複合体を、未熟な乳幼児の肺で肺表面活性剤を つくれないことから生ずる生理学的症状である新生児呼吸困難症候群の治療に使 用するとき、複合体は酸化防止剤及び合成肺表面活性剤として作用し、失われて いる天然の表面活性剤と置き喚わり、また十分な天然の表面活性剤の不足を改善 する。乳幼児の肺が十分量の天然の肺表面活性剤をつくるようになり、それ以上 の処置が不要となるまで、治療は継続される。

製剤は、気管内投与に適したもの、すなわち液体懸濁液、乾燥粉末、又はアエロ ゾルが好ましい、液体墾Ｊぞαには、乾燥混合物又は水性懸ａｉ液中の混合物を 水、食塩ｍＭ１、デキストロース、及びグリセロールのような適当な試薬と混合 すると、製薬上有効な組成物が生ずる。好ましい液体懸ＪＩｉ液は０．８−１． ０重量％の塩化ナトリウムを含有し、好ましくはカルシウムイオンとして１２０ ｍＭであろう０次に製剤をフィルター１１ｉ６ｉ苗する。一般に、製剤は１１０ ０＋ｍｇ／ｍｌのＤＰＰＣを含めてなり、０．２−５　ｍｌ／ｋｇの投与量で投 与される。乾燥粉末の調製には、水性懸Ｊ液を凍結乾燥する。アエロゾルは、低 級アルカン類や、フレオンのようなフッ化アルカン類のような推進剤中に懸濁さ れた微粉砕乾燥粉末から調製される。アエロゾルは加圧容器内で保存される。

例えば、表面活性剤（本発明のポリペプチドと脂質複合体）は適量形式に適する ように、気管チューブにより、アエロツル投与により、又は吸入ガスへの懸濁液 又は乾燥粉末の噴霧化によって投与される０表面活性剤は　１０−２００偏ｌ＋ ／ｋｇの単−回又は複数回投与量で投与される。好ましい投与法は、生理食塩溶 液中のペプチドと脂質の懸濁液として、閘１当たり表面活性剤５−　ｌｏｎｇの 濃度で、気管チｌ−ブを通して５０−１００ｍｇ／に３の投与ｔを達成するもの である。

本発明のポリペプチドは、対象の処置のために投与される。「対象」とは哺乳類 、例えばヒトを指すが、これに限定はされない。

以下の実施例は、本発明のポリペプチド、ポリペプチド／脂質複合体、及び出発 材料の幾つかの製法を示す。

本発明は以下の実施例に、又はこれらの製法に限定されない。

Ｌに定義されていないで実施例中に使用される略字は、以下のとおりである。

ＴＦＩＤＭＳ　テトラアチルンメチルシリルＴＦＡ　）リフルオロ酢酸 これらは、標準のＢ　ｏ　ｃ化学方法及び標準のＦｍｏｃ化学方法を伴い、それ らの化学方法はＢｏｃサイクル及びＦｍｏｃサイクルについてそれぞれＡＢ＋ペ ブチトシンセリイザーと共に使用される。

実施例１　実験的化学手順 ペプチド合成とその他の化成品、ペプチド類は、アプライド・バイオシステムズ 社（カリフォルニア州フォスター市）のモデル４３０−Ａペプチド合成機で、固 体相方法により、０．５１Ｉａｏｌ規模で合成された。開裂時にＣ−末端アミド を生じさせるために、ｐ−メチルヘンジキシヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）樹脂 を使用した。ペプチド・インターナショナル社からのＣｙｓ　（エチルチオ）、 ＧＩｕ（ベンジル）及びＬｙｓ　（２−クロロヘンシロキシカルボニル）の側鎖 保護されたＮａ−ｔ−Ｂｏｃ（ｔ−ブチロキシカルボニル）アミノ酸類を、事前 形成ずみの対称無水物を経由して二重にカップリングさせた。対称篇水物をつく るために、酸化防止剤の酸を活性化することによって、酸化防止基をカップリン グさせた。　１８Ｂ酸を予備活性化することによりＨＢＢ（３，５−ジ第三ブチ ルー４−ヒドロキシ安息香Ｍ）なとの酸化防止剤をペプチドのアミノ末端に入れ 、対応する対称無水物を生成した。完全な反応完結を確保するために、酸化防止 剤は一般に二重又は三重にカップリングされた。

例えば完全に入れるのにＨＢＢは３回のカップリングを要する。ニンヒドリン試 験に基づいて決定されるように追加のカップリングを実施した。Ｎａ−ｔ−Ｂｏ ｃ基を塩化メチレン中の５０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって除去し、ジ メチルホルムアミド中の１０％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＥＡ）で中和し た。ペプチドを樹脂から切り離し、５％アニソールと５％硫化ジメチルを含有す る蝿水ＨＦ中で、−５℃で４５分間、脱保護した。ＨＦを真空中で除き、ペプチ ドを５０％アセトニトリル水溶液で樹脂から抽出した。−緒にした抽出液を凍ら せ、凍結乾燥し、２１４ｎｍてモニターされた０、１％ＴＦＡ水ｍ　液（ｐＨ２ ）中でのアセトニトリル勾配、毎分４０　ｍＬのレイニン・ダイナミックス社の （２＋、４ｘ２５０　＋１Ｉａ）　ＣＩ８カラム上の逆相分離用＋１　Ｐ　Ｌ　 Ｃにより精製した。主ピークを集め、凍結乾燥した。合成ペプチド類の純度（） ９７％）と同定は、分析用高性能液体クロマトグラム（１−ＩＰＬｃ）での単一 ピーク、毛細管ゾーンミス泳動、正確な配列と一致した単一分子イオンを与える Ｖ　Ｇ分析用ＺＡＢ２−５Ｅ上の高速原子衝撃Ｍｊｉ分析（ＦＡＢ−ＭＳ）、及 び各残基ζこついて予測値の１０％以内であったアミノ酸分析によった。Ｌ−α −ジパルミトイルホスファチジルコリン＜　［）ｌ’Ｐｃ）　（純度〉９９％） はアヴアンティ・ポーラ−・リピノト社（アラバマ州バーミンガム）から得た。

これらの手順を用いて、以下のペプチド類を合成した。その分析性質を表１に示 す。

＋（Ａ）、ポリへブチトの調！！　：　ＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉ ｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥＱ　ＩＤ　１１０：　ｌ）　（ＨＢＢ−Ａｏｃ　＝　 Ｎａ−ヒドロキシージ第三ブチルーヘンシイルーアミノオクタノイル−）始めに 、ＡＢ１４３０Ａペプチド合成機内に入れて、標準的なｔ−Ｂｏｃ化学を用いて 合成されたＬｙｓ（Ｎｃ−２ＣＩＺ）−ｐＭＢ）ＩＡ樹脂を使用することにより 、Ａｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ（Ｎｃ−２ＣＩＺ）− ｐＭＢＨＡを調製した。ペプチドＩＡを合成するために、Ｎａ−ヒトロキシージ 第三ブチルー安息香酸（１１８８）（５０１ｍｇ）−ジメチルホルムアミｌ”（ ４ｍＬ）及び塩化メチレン（４ｍＬ）を−緒にし、ジシクロへキシルカルボジイ ミド溶液（塩化メチレン中０．５Ｍ溶液、８　ｍ　１．　）を加え、５分かきま ぜると、ＨＢＢの対称無水物を生し、次にこれを二つのカップリングの各々につ き１０倍過剰量のＡｏｃ−Ｇｌｕ（０８ｚｌ）−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ（Ｎｃ −２ＣＩＺ）−ｐＭＢＨＡにカップリングさせた。ＨＢ　Ｂ−ペプチド−樹脂を 、５％アニソール及び５％硫化ジメチルを含有する無水ＨＦ中で、−５℃で１時 閉処理することにより、　ＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ−Ａｉ ｂ−Ｌｙｓ（Ｎｃ−２ＣＩＺ）−ｐＭＢＨＡ保護されたペプチドを樹脂から切り 離し、かつ側鎖侃謹基を除去した。次に、ペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸 中の５０％アセトニトリルで１７ＭＮから抽出し、凍らせ、凍結乾燥した。次に 、ペプチドを逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃて精製すると、表題化合物を生した。

１（Ｂ）、実Ｇ’ｇ例１（Ａ）で述べたポリペプチドによるＤＰＰＣ複合体の： Ａ！！ ペプチド１（Ａ）は上み己のように調製される。クロロホルム（１１）中のＤＰ ＰＣ（２５ｇ）を窒素流下に乾燥し、また真空下に乾燥すると、有機溶媒の痕跡 量が除かれる。乾燥脂質混合物に水３１を加える。調製物を４５℃で１時間培養 する０次に、乾燥ペプチド１（Ａ）０．５■ｇを水性５ＩＩＩ製物に加える。調 製物を浴つルトラソニケーター中で４５℃で２時間音波処理する。生ずる脂質− ペプチド混合物を凍結乾燥し、４℃でｌか月まで貯蔵する。試験に先立って、０ ．９％ＮａＣ１，２０＋＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝ｎ　（ｐｌ　７．４０）　９　ｍ ｌを加える。

：＋！Ｉ製物を定期的に混合しながら、４５℃で１時間培養する。

実施例２ ２（Ａ）、ポリペプチドの講Ｎ　：　ＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２）　（ＨＢＢ−Ａｏｃ　＝　Ｎａ −ヒドロキシーノ第ニブチル−へンゾイルーアミノオクタノイルー）ＡＢ１４３ ０Ａペプチド合成機内に入れて、標準的なｔ−Ｂｏｃ化学を用いて合成されたＬ ｙｓ（Ｎｃ−２Ｃ１７，）−ｐＭＢＨＡ樹脂を使用することにより、　Ａｏｃ− Ｇｌｕ（０８ｚｌ）−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｎｃ−２ＣＩＺ） −ｐＭ旧（Ａを調製した。ペプチド２Ａを合成するために、Ｎａ−ヒトロキシー ジ第ニブチルー安息香酸（１−１８８）　（５０１ｍｇ）　、ジメチルホルムア ミド（４＊Ｌ）及び塩化メチレン（４＊Ｌ）を−緒にし、ジシクロへキシルカル ボジイミド溶液（０，５Ｍ塩化メチレン溶液８ｍＬ）を加え、５分かきまぜると 、８８Ｂの対称簾水物を生し、次にこれを二つのカップリングの各々につき４倍 過剰量のＡｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（ Ｎｃ−２ＣＩＺ）−ｐＭＢ）ＩＡにカップリングさせた。　ＨＢＢ−ペプチド− 樹脂を、５％アニソール及び５％硫化ジメチルを含有する職水ＨＦ中で、−５℃ で１時間処理することにより、　ＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）４ｒｐ− Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｎｃ−２ＣＩＺ）−ｐＭＢＨＡ保護されたペプチ ドを樹脂から切り離し、かつ側鎖保護基を除去した。次に、ペプチドを０．１％ トリフルオロ酢酸中の５０％アセトニトリルで樹脂から抽出し、凍らせ、凍結乾 燥した０次に、ペプチドを逆相ＨＰＬｃで精製すると、表題化合物を生じた。

２（Ｂ）、実施例２（Ａ）で述べたポリペプチドにょるＤＰＰＣ複合体の調製 本質的に実施例１て述べたとおりに、ペプチド２（Ａ）をｏｐｐｃとｆＨ合した 。

実施例３ ３（Ａ）、ポリペプチドのＦＡ　Ｕ　：　（Ｔｒｌ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ− Ａｉｂ−Ｌ！ｌｌ５−ＮＨ２）　（Ｔｒｌ−Ａｏｃ−＝　Ｈａ−ヒトロキシージ 第三ブチル−へンゾイルーアミノオクタノイル）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３） 標準的なｔ１３ｏ（化学を用いて、Ａ３１４３０Ａペプチド合成機内に入れたＬ ｙｓ（Ｎｃ−２ＣＩＺ）−ｐＭＢＨＡ樹脂を使用することにより、　Ａｏｃ−Ｇ ｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ（Ｎｃ　−２ＣＩＺ）−ｐＭＢＨＡ を調製した。

ペプチド３Ａを合成するために、６−ヒトロキシー２　、５　、７．８−テトラ メチルクロマン−２−カルボンｗＩ（トロロクス）（５０１＋＊ｇ）　、ジメチ ルホルムアミド（４＠Ｌ）及び塩化メチレン（２，５＊Ｌ）を−緒にし、ジシク ロへキシルカルボジイミド溶液（０，５Ｍ塩化メチレン溶ｉ＆８ｍＬ）を加え、 ５分かきまぜると、対称舞水物を生し、次にこれを二つのカップリングの各々に つき１０倍過剰量のＡｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ　）４ｒｐ−ＡＩｂ−Ｌｙｓ（Ｎ ｃ−２ＣＩＺ）−ｐＭＢＨＡＬ：カップリングさせた。

Ｔｒｌ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ（Ｎｃ　−２Ｃ ＩＺ）−ｐＭＢＨＡを樹脂から切り離し、側鎖保護基を除くために、其水ＨＦ、 ５％アニソール及び５％硫化ジメチルで、ペプチドを一５℃で１時間処理した。

Ｔｒｉ−ペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸中の５０％アセトニトリルて樹脂 から抽出し、凍らせ、凍結乾燥した。　Ｔｒｌ−ペプチドを逆相ＨＰＬＣて精製 すると、表題化合物を生した。

３（８）、実施例３（Ａ）で述べたポリペプチドによる［１ＰＰＣ複合体のＡ１ １ｉ１１ 本質的に実施例１ｂで述べたとおりに、ペプチド３（Ａ）をＤ　Ｐ　Ｐ　Ｃによ って調製した。

実施例４ ４（Ａ）　、ポリペプチドの調製：　ｔｌＢ８−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙ ｓ−ＮＨ２（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　４）（８８Ｂ　＝Ｎα−ヒトロキシージ第 三第三ブチル−ヘン用イ ルプチド４（Ａ）は、ベブチＦｌ（Ａ）の５ｌｌｌ製と本質的に同様な方法でｉ ｌＩ！ｌ製される。

４（Ｂ）、実施例４（Ａ〉て述べたポリペプチドによるｏｐＰｃ複合体の調製 ペブチｌ”４（Ａ）は、本質的に実施例１て述べたとおりにＤＰＰＣと混合され る。

実施例５ ５（Ａ）、ポリペプチドの調製：　ＩＩ　Ｂ　Ｂ　−Ａ　ｏ　ｃ　−Ｇ　ｌ　ｕ 　−Ｔ　ｒ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　５ ）（ＨＢＢ−Ａｏｃ　＝　Ｈａ−ヒドロキシージ第三ブチルーヘンシイルーアミ ノオクタノイル−）ベブチ）’　５（Ａ）は、ペプチド１（＾）の：ＡＩ！と本 質的に同様な方法で調製される。

５（Ｂ）、実施例４（Ａ）て述へたポリペプチドによるＤＰＰＣ複合体の調製 ペプチド５（Ａ）は、本質的に実施例１て述べたとおりに、ＤＰＰＣと混合され る。

表１１合成ペプチド類の分析性状 ベブチＦ１７のＦＡ８Ｓ質量スペクトル分析表１ 酸化防止剤部分のｙＡ製 以下の酸化防止剤出発材料は、先行実施例で述べたとおりに使用できる。

実施例６ 出発材料の酸化防止剤化合物＝３−第三ブチル−５−メチル−４−ヒドロキシ安 息香酸の調製 無水エチレングリコールジメチルエーテル中の水素化ナトリウム（　４．７４ｇ ，　０．１９Ｅ１ｗｏｌ）の懸，ｌｉ液を反応容器に仕込む．エチレングリコー ルジメチルエーテル（　１５０ｍＬ）中の２−第三ブチル−６−メチルフェノー ル（ｏ。

１ｍｏｌ）の溶液を潤油する。５０−６０℃に１．５時間暖めてから、反応混合 物表面下のガスディスバージ管（　ｇａｓ−ｄｉｓｐａｒｇｉＢ　ｔｕｂｃ）を 通して炭酸ガスを２０時間導入する．５℃に冷却し、メチルアルコール（　３０ ｍＬ）で過剰な水素化ナトリウムを注會深く分解する．水素発生が止まった後、 反応混合物のｐ）ｌをＩＮ塩酸によって２に調整する。水（１．６１）で希釈し 、表題化合物を濾過によって集める。

実施例７ 出発材料の酸化防止剤化合物（６−ヒトロキシー７−第三ブチル−５−イソプロ ピル−８−プロピルクロマン−２−イル）酢酸の調製 青水エーテル（９１、）中のマグネシウム削り屑（４５ｗ＋ｇ。

１　、８５ｍｍｏ　ｌ　）と１−クロＵｌ−２．２−ジメチルプロパン（７４． ６ｗ＋ｇ。

０、７ｍｍｏｌ）を混合する。加熱し、激しくかきまぜてから、筆水エーテル（ 　１．５＋ｉＬ）中の１．２−ノブロモエタン（１５６＋ａｇ。

０、８３９１＋ａｏｌ　）を潤油する．　１２時間還流し、アルゴン雰囲気下に 置き、０−５℃に冷却する．箇水ジエチルエーテル（１，５瓢し）中の塩化イソ ブチリル（　０．５３３ｍ＋ｓｏｌ）の溶液を潤油する．０−５℃で１．５時間 かきまぜ、氷と１塩酸（０．１５ｍＬ）との混合物中に注ぎ、有機相を分離する ．エチルアセテート、５％炭酸ナトリウム水溶液、及び塩水で洗う。

乾燥（　ＭｇＳＯａ）　Ｌ／、溶媒を真空中で蒸発させると、２　、　２　、６ −ドリメチルー４−ヘプタノンを生ずる。

塩化ビニルマグネシウム（　Ｑ．７Ｂ＋ａｏｌ）を無水ジエチルエーテル（　１ ａＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下に置き、Ｉ−５℃に冷却する．無水ジエチル エーテル（　＋．５ｍＬ）中の塩化ブチリル（　０．５３３ｍｍｏｌ）の溶液を 潤油する。Ｏ−５℃で１。

５時間かきまぜ、氷と１塩酸（０．＋５■Ｌ）の混合物中に注ぎ、有機相を分離 する。水、５％炭酸ナトリウム、及び塩水で洗う．乾燥（　ＭｇＳＯ４）　ｂ、 溶媒を真空中で蒸発させると、プロピルビニルケトンを生ずる。

２、２．６−　）リフチル−４−ヘプタノン（　０．４ｍｏｌ）をメタノール（ 　ｌｏｇ＋Ｌ）に溶解し、カリウム第三ブトキシド（１２ｇ。

０、１ｍｏｌ）を加える。メタノール（　１０＋ｗＬ）中のプロピルビニルケト ン（　０．２ｍｏｌ）の溶液を潤油する．１０分かきまぜ、エチルエーテルと塩 水の間で分配する．有機相を分離し、中性まで塩水で洗う。乾燥（　Ｎａ２ＳＯ ａ）　Ｌ／、溶媒を真空中で蒸発させると、２−プロピル−３−第三ブチル−５ −イソプロピルヘンゾキノンを生ずる。

２−プロピル−３−第三ブチル−５−イソプロピルヘンゾキノン（　ｌｏｍｍｏ ｌ）　、ｉｔ，３．３−テトラメチルジシロキサン（＋。

７９ｉｉ１−、　ｌｏ＋ｗｍｏｌ）及びヨウ素（　０．０５ｇ）を塩化メチレン （３０　ｍ　ｌ　）に溶解する．還流下に３０分かきまぜ、ＩＮ水酸化ナトリウ ム（　３０ｍｌ）で抽出する。水相を濃塩酸で酸性化し。

酢酸エチル（４λｌｏ＊Ｌ）で抽出し、乾燥（　Ｎａ２ＳＯ□）し、溶媒を真空 中で蒸発させると、２−プロピル−３−第三ブチル−４・ヒドロキシ−５−イソ プロピルフェノールを生ずる。

２−プロピル−３−第三ブチル−４−ヒドロキシ−５−イソプロピルフェノール （　２．Ｏｇｏｌ）とトリメチルオルトフォルメート（　０．３１）をメタノー ル（　１．２Ｌ）に溶解し、脱気する。

窒素雰囲気下に置き、３℃に冷却し、濃硫酸（　５ａＬ）を加λる。メチルビニ ルケトン（　３４０ａ＋Ｌ，　４．Ｏｇｏｌ）を潤油し、冷却せずに４４時間か きまぜる。炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ、エチルエーテルに抽出する。乾 燥（ＭｇＳＯ，Ｉ）し、溶媒を真空中で蒸発させると、２−メトキシ−２−メチ ル−７−第三ブチル−５−イソプロピル−８−プロピル−クロマン−６−オール を生ずる。

２−メトキン−２−メチル−７−第三ブチル−５−イソプロピル−８−プロピル −クロマン−６−オール（２ｗｏｌ）をピリジン（ＧＯＱ　ＩＩＩＩ−　）に溶 解し、蒸水酢酸（　りＯＯｍＬ）を加える。脱気し、窒素雰囲気下に１８時間か きまぜる。氷水に注ぎ、３時間かき′ｉぜる。エチルエーテルに抽出し、乾燥（ ＭｇＳＯ．）　シ、溶媒を真空中て蒸発さぜ、クロマ）・グラフィで精製すると 、２−メトキノ−２−メチル−７−１４三ブチル−５−イソプロピル−８−プロ ピル−クロマン−６−イル−アセテートを生ずる。

２−メトキシ−２−メチル−７−第三ブチル−５−イソプロピル−８−プロピル −クロマン−６−イル−アセテート（２＋＋ｏｌ）をア七トン（　２．ＳＬ）に 溶解し、水（２シ）に続いて濃塩酸（１６。

６−〇を加える．かきまぜた混合物から、頭上温度が９０℃に達するまで溶媒を 蒸留する。＋！！濁液を冷却し、エチルエーテルで希釈し、炭酸水素ナトリウム 水溶液で洗う。

乾燥（ＭｇＳＯ．）　ｔ，、溶媒を真空中で蒸発させ、クロマトグラフィで精製 すると、２−ヒドロキシ−２−メチル−７−第三ブチル−５−イソプロピル−８ −プロピル−クロマン・６−イル−アセテートを生ずる。

水素化ナトリウム（鉱油中５６％、４７．２ｇ，　１．ｌｏ＋ｗｏｌ）を無水テ トラヒドロフラン（　ＩＬ）中に９濁する。窒素雰囲気下に置き、トリメチルホ スホノアセテート（　２０９．４ｇ。

１、１５ｍｏｌ）を潤油する．２５分かきまぜ、テトラヒドロフラン（１シ）中 の２−ヒドロキシ−２−メチル−７−第三ブチル−５−イソプロピル−８−プロ ピル−クロマン−６−イル−アセテート（　０．５ｍｏｌ　）の溶液を加える。

室温で１８時間かきまぜ、次に還流下に４時間加熱する。冷却し、溶媒を真空中 で蒸発させ、クロマトグラフィで精製すると、表題化合物を合成表面活性製剤の 効力を試験する方法は、この技術で周知である．例えは、本発明の合成表面活性 製剤を成軌うット肺モデル［イケガミ（　ｌｋｅｇａ＋ｗｉ）ら、（　１９７９ 年）Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、　１３巻？？？−７８０頁］のような任意適当 な方法で試験できる。

表面活性剤をなくしたラット肺の圧力−容積特性は、ビアリン膜病の乳児の肺の それに似ており、肺の圧力−容積間係の正常状態への回復は、投与量依存的に注 入された表面活性剤の量に関連づけられる［バーメル・エム・ニス（Ｂｅｒｍｅ ｌ　、　Ｍ、Ｓ、）ら、「表面活性剤欠損のモデルとしての洗浄し切間したラッ ト肺Ｊ　Ｌｕｎｇ　１６２巻９９−１１３頁（１９８４年）コ。

実施例８　単離されたラットの洗浄ずみ肺モデル動物の準ト圧力ー容積曲線の登 録、及び肺洗浄の実験手順は、イケガミ（ｌｋｅｇａ＊ｉ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒ 、Ｒｅｓ、　１１巻＋７８−１８２頁　（１９７７年）及びＰｅｄｉａｔｒ、Ｒ ｅｓ、Ｉ３巻？？？−７８０頁（１９７９年）、及びバーメルら、Ｌｕｎｇ　１ ６２巻９９−１１３頁（１９８４年）に記載されたものから適合化された。スブ ラーグ＝ドーリ一種の雄ラット（２００−２５０ｇ）をナトリウムベンドパルビ タールて麻酔にかけ、出血死させる。気管にカニユーレを挿入し、胸郭器官を一 括除去する。外側組織（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ）の除去後、 気管と肺（〜２ｇ）を食塩水に！濁し、真空室に入れ、ステンゲルらの手順に従 って脱気する。脱気した肺を３７℃で食塩水に懸濁し、ジャケット付き貯水槽と 気管カヌーレを両方ともＴ管によって水マノメーター及びカラス注射器に連結す る。ガラス注射器を注入／抜出しポンプ内に入れる。空気の捕捉を最小限に抑え るため、毎分１０１の速度で３０ｃ−８２０の圧力まで空気で肺を急速膨張させ 、間欠的に肺に空気を加えることによって１００分間の圧力に保持する。注入空 気の全容積を肺全容量（ｔｏｔａｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ＋　ＴＬＣ） として記録する。これは一般に１４−１５■１である０次に、ゼロ圧に達するま で、毎分２．５ｍｌの速度で肺をしぼませる。

空気抜き中、ＩＣｍ間隔て圧力を水マノメーターから読取って記録する。これら のデータを使用して、装置のＰ−■曲線について補正後、圧力−容積（Ｐ−Ｖ） 曲線又は準静的コンプライアンス曲線を作成する。脱気と平衡化後、肺を５１／ ｇの洗４ｇ１衝液　（０，９％ＮａＣｌ、ｉｏ閘Ｍ　ＨＥＰＥＳ、ｐ　Ｈ７、４ ）での反復洗浄によって表面活性剤の不足状態にする。圧力−容積曲線が明白に Ｓ学歴になり、５ｃｍＨ２Ｏの圧力で肺に残る空気の容積が３１以下になるまで 、脱気、平衡化、及び洗浄手順を繰り返す（＋５−２０回）、この時点で肺は表 面活性剤不足と考えられる。試験には、０．９％ＮａＣｌと１０−Ｍ　ＨＥＰＥ Ｓの緩街液（ｐＨ７，４）　２ｍｌを乾燥肺表面活性剤（リン脂７！ｊ２５ｔｓ ｇ、ｔｏｏ−１２５−ｇ／ｋｇ）に加え、混合物をうす巻き処理し、窒素でフラ ッシュし、４５℃で１時間培養する。

次に、混合物を再びうす巻き処理し、あわ状の場合は脱気し、試験混合物２−１ を注射器から肺へ、４回注入し抜き出す、試験混合物を５回めに肺へ再導入する 時に、混合物を肺にととめておく、この手順が取られたのは、肺全体への物質の 均一な分布を促進させるためである。肺を脱気し、３７℃で５分間平衡化し、Ｐ −ｖ渕定を行なう。

表面活性剤の物理特性が温度に依存しているため、肺を周囲温度でなく３７℃の 食塩水中に支持して研究する。犬の肺表面活性剤を同様な方法で投与するが、但 し表面活性剤を５分間だけ加熱する。データは％ＴＬＣとして提示されている。

５及び１０　ｃ悶Ｈ２０の圧力（ＰＣ６とＰＣ，。）て肺全容ＩＩ（％ＴＬＣ） を計算することによって、成熟ラット肺の圧力−容積（ｒ’−ｖ）曲線のデフレ ーション・リム（ｄｅｆｔａｔｉｏｎ　ｌｉｍｂｓ）を分析する。比較は、回復 率＝　（ＰＣ！、（十分１：　）−ＰＣ５＜試験量））　ｘ　！００／　（ＰＣ ｓ（十分量）−ＰＣ５（不足ＩＩ））に基づいており、平均値の特定的なコント ラストをもつ一般線肝モデル手順を用いて、分散量の１方向分析によって行なう （５Ａ５研究所、ノースカロライナ州キャリー）。洗浄と試験混合物での処置は 、６％より大きい絶対ＴＬＣの変化を起こさなかった。

〔結果〕

ラットに投与された製剤は、半透明の外観をもっていた。　５　ｃｍ及び１０　 ｃｍの１１２０圧力（ｐｃ５とＰＣｔｏ）下に肺全容員の％（ｊ、ｏＬａｌ　ｆ ｕｎ）Ｈｃａｐａｃｉｔ、ｖ、％ＴＬＣ）を計算することにより、成軌うット肺 の圧力−容積（ｐ−ｖ）曲線のデフレーション・リムを分析した。ＰＣ５ＩＩＩ Ｉに基づく回復率を使用して、試験混合物を比較した。ＤＰＰＣのみては、洗浄 された肺の圧力−容積（、Ｐ−Ｃ）曲線に有音の効果をもたなかった。ベブチＦ −ＤＰＰＣ混合物の活性を表２に示す。

考−２ 成熱ラットの洗浄肺モデルでの合成表面活性剤の効力配列リスト （１）一般情報 （ｉ）出願人：マクリーン、ラリ−アール：ニドワード９ビンセント　ジエイ （１、発明の名称：共有結合された酸化防止剤をもつ合成ペプチド肺表面活性剤 （目１）配列数　：５ （１ｖ）通信先住所 （Ａ）住所：マリオン　メレル　ダウ　インコーホレイテント （Ｂ）街　：　２１１０イースト　カルプライス　ロート（Ｃ）市　：シンシナ チ　ビー、オー、ボックス＋５６３００（Ｄ）州　ニオバイオ （Ｅ）国　：アメリカ合衆国 （ｉｖ）コンピューター読取り形式 （Ａ）　媒体タイプ、フロッピーディスク（Ｂ）　コンピューター：　ＩＢＭ　 ＰＣ互換型（Ｃ）　＋１５：　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−［＋０５（Ｄ）　ソフトつ ｘ７：Ｐａｔｅｎｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０．Ｖｅｒ、ｌｔｌ、２５）（ ｖ）　現在の出願データ （Ａ）　出願番号：ＵＳ （Ｂ）　出願口　： （Ｃ）　分類 （ｖｌ）前の出願データ （Ａ）　出願番号：　Ｕ　Ｓ　０７／９２３，０９２（Ｂ）　出願口　：１９９ ２年７月３１日（ｖｉｉｉ）代理人情報： 氏名：コリアー、ケネス　ジエイ。

登録番号：　３４．９８２ 参照／書類番号：Ｍ０１５Ｂ２　ＵＳ （ＩＸ）電信電話情報 （Ａ）　電話：　（５１３）　９４８−７８３４（Ｂ）　ＦＡＸ　：　（５１３ ）　９４８−７９６１（Ｃ）　テレックス：　２１４３２０ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌに間する情報（１）配列の特徴 （Ａ）長さ１４個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）：ペプチド（１ｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：修飾位置 （６）位置　：１ （Ｄ）　その他の情報　二／注＝ ”Ｘａａ＝　Ｎ−α−［卜（８−ヒトロキシージ第三ブチルヘンゾイル）アミノ オクタノイソクコーグルタミン＠　（Ｈ１３９−Ａｏｃ−Ｇｌｕ）”（１ｘ）特 徴 （Ａ）　名前／キー：修飾位置 （Ｂ）　位置　：　３ （Ｄ）　その他の情報　：／ン主＝　”　Ｘ　ａ　ａ　＝　２−アミノ−イソ酪 酸（Ａｉｂ）” （＋×）特徴 （Ａ）　名前／キー、修飾位置 （８）　位置　、４ （Ｄ）その他の情報゛／注二“”Ｘａａ＝’／ジン−１−アミド９”（２）　Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌに関する情報（ｘｉ）配列（ＳＥＱＩＩＥＮＣＥ　ＤＥＳ ＣＲＩＰＴＩＯＮ）：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ：Ｘａａ　Ｔｒｐ　Ｘａａ　Ｘａ ａ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に関する情報（１）配列の特徴 （Ａ）長さ４個のアミノ酸 （８）種類、アミノ酸 （Ｄ）トボロンー：直鎖状 （１１）配列の種類（ＭＯＬＥ［１ｌＬＥ　ＴＹＰＥ）　：ペプチド（ロ）特徴 （Ａ）　名前／キー　（１飾位置 （Ｂ）　Ｇ’Ｚ　員　：　１ （［））　その他の情報　：／注： ゛＼ａａ”　Ｎ−α−［Ｎ−（８−ヒトロキシージ第三ブチルヘン゛ゾイノし） アミノオクタノイック］−グルタミンｖＩ（）１ＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ）“２（ １ｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：修飾位置 （Ｂ）　位置　：４ （Ｄ）その他の情報：ｌ注＝　”　Ｘ　ａ　ａ　＝リジンー１−アミド”（ｘｉ ）配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　０ＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ２：Ｘａａ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｘａａ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に関する情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：５個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）ｌ−ボロジー：直鎖状 （ＩＩ）配列の！ｉ類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）：ペプチド（ｉｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：修飾位置 （Ｂ）　位置　＝１ （Ｄ）　その他の情報　：／注： ”Ｘａａ＝　Ｎ−ａ−［Ｎ−（６−ヒトロキシー２．５，７．８−テトラメチル クロマン−２−カルボン酸）アミノオクタノイック］−グルタミンＭ　（Ｔｒｉ −Ａｏｃ−Ｇｌｕ）” （１ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：１１！飾位置 （Ｂ）位置　：４ （Ｄ）その他の情報：／注＝　”　Ｘ　ａ　ａ　＝　２−アミノ−イソ酪酸（Ａ ｉｂ）”（１χ）特徴 （Ａ）　名前／キー；修飾位置 （Ｂ）　位＠　：５ （０）その他の情報：／注＝”Ｘａａ＝リジン−１−アミド”（ｘｌ）配列（Ｓ ＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に間する情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長ざ４個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種Ｂ　（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）　：ペプチド（１λ）特 徴 （Ａ）　名前／キー：修飾位置 （Ｂ）　位置　：１ （Ｄ）　その他の情報　：／注＝ ″Ｘａａ：　Ｎ−α−［Ｎ−（８−ヒトロキシージ第三ブチルベンゾイル）−グ ルタミン酸（１１８８−Ｇ、、、）”（ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：１１飾位置 （Ｂ）位置　：　３ （Ｄ）その他の情報：／注＝”Ｘａａ＝２−アミノ−イソ酪酸（Ａ　ｉ　ｂ　） ”（１ｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：￥１飾位置 （Ｂ）　位置　：４ （Ｄ）その他の情報：／注：”Ｘａａ＝リジン−１−アミド”（ｘｉ）配列（Ｓ ＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５に間する情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ１４個のアミノ酸 （Ｂ）種ｇｌＪｉ二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二重鎖状 （ｉｉ）配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）：ペプチド（１ｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：修飾位置 （Ｂ）　位［ｔ：１ （Ｄ）　その他の情報　：／注＝ ”　Ｘ　ａ　ａ　＝　Ｎ−α−［Ｎ−（８−ヒトロキシージ第三ブチルベンゾイ ル）−アミノオクタノイソクコーグルタミン＠　（）ｌｅｅ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ） ”（ｉｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：修飾位置 （Ｂ）　位置　：４ （Ｄ）その他の情報：／注＝２“Ｘａａ＝リジン−１−アミド（ｘｉ）ＩＥ列（ ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：Ｆｉ ｇｕｒｅ　１ Ｆｉｇｕｒｅ　２ ＨＢＢ−ＡＯＣ−ＧＩＬＪ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌ）／５−ＮＨ２補正書の写しく Ｕ訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成７年１月３１１

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．式 Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｙ 〔式中Ａ１は結合であるか、又はＧｌｕ又はＡｓｐから選ばれる負に荷電された アミノ酸であり、 Ａ２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はｌｉｅから選ば れる疎水性アミノ酸であり、 Ａ３はＡｉｂ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、又は結合であり、 またＡ４はＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓから選ばれる正に荷電されたアミノ酸で あり、 Ｘは式Ｄａ又はＤｂ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｄａ又は ▲数式、化学式、表等があります▼；Ｄｂであって、ここでＢ１はＢ、−Ｃ（Ｏ ）、−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｂは結合、 Ｃ１−１６アルキレン、又はＣ２−１６アルケニレンであり、また各Ｒ１、Ｒ２ 、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立にＣ１−６アルキルであり、Ｙはヒ ドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から選ばれる、Ａ４のカ ルボキシ置換基であり、ここでＡ３が結合である時には、Ａ１とＡ２は相互に取 り替えることができる。］のポリペプチド、又はその光学活性異性体又は製薬上 受け入れられるその塩。
2. ２．式 Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｙ ［式中Ａ１は結合であるか、又はＧｉｕ又はＡｓｐから選ばれる負に荷電された アミノ酸であり、 Ａ２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はｌｉｅから選ば れる疎水性アミノ酸であり、 Ａ３はＡｉｂ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、又は結合であり、 またＡ４はＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓから選ばれる正に荷電されたアミノ酸で あり、 Ｘは式Ｄａ又はＤｂ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｄａ又は ▲数式、化学式、表等があります▼；Ｄｂであって、ここでＢ１はＢ、−Ｃ（Ｏ ）、−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（Ｏ）であり；Ｂは結合、Ｃ １−１６アルキレン、又はＣ２−１６アルケニレンであり、また各Ｒ１、Ｒ２、 Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立にＣ１−６アルキルであり、Ｙはヒド ロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から選ばれる、Ａ４のカル ボキシル置換基である〕のポリペプチド、又はその光学活性異性体又は製薬上受 け入れられるその塩。
3. ３．式 Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｙ ［式中Ａ１は結合又はＧｌｕであり、 Ａ２はＴｒｐ又はＧｌｕであり、 Ａ３はＡｉｂ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、又はＯｒｎであり、またＡ４ はＬｙｓであり、 Ｘは式Ｄａ又はＤｂ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｄａ又は ▲数式、化学式、表等があります▼；Ｄｂであって、ここでＢ１はＢ、−Ｃ（Ｏ ）、−Ｂ−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｂは結合、Ｃ １−１６アルキレン、又はＣ２−１６アルケニレンであり、また各Ｒ１、Ｒ２、 Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立にＣ１−６アルキルであり、Ｙはヒド ロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から選ばれる、Ａ４のカル ボキシル置換基である］のポリペプチド、又はその光学活性異性体又は製薬上受 け入れられるその塩。
4. ４．Ａ１がＧｌｕである、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
5. ５．Ａ２がＴｒｐである、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
6. ６．Ａ３がＡｉｂである、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
7. ７．Ａ３がＡｌａである、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
8. ８．Ａ４がＬｙｓである、請求項１〜２のいずれか一に記載のポリペプチド。
9. ９．Ｙがアミノである、請求項１〜１６のいずれか一に記載のポリペプチド。
10. １０．ＸがＤａである、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
11. １１．Ｒ１とＲ２の各々が第三ブチルである、請求項１７又は１８のいずれか一 に記載のポリペプチド。
12. １２．ＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−ＴｒＰ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）である、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
13. １３．ＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２）である、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
14. １４．Ｔｒｌ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３）である、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
15. １５．ＨＢＢ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４ ）である、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
16. １６．ＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：５）である、請求項１〜３のいずれか一に記載のポリペプチド。
17. １７．式 Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｙ ［式中Ａ１は結合であるか、又はＧｌｕ又はＡｓｐから選ばれる負に荷電された アミノ酸であり、 Ａ２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はｌｉｅから選ば れる疎水性アミノ酸であり、 Ａ３はＡｉｂ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、又は結合であり、 またＡ４はＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓから選ばれる正に荷電されたアミノ酸で あり、 Ｘは式Ｄａ又はＤｂ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｄａ又は ▲数式、化学式、表等があります▼；Ｄｂであって、ここでＢ１はＢ、−Ｃ（Ｏ ）、−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（Ｏ）一であり；Ｂは結合、 Ｃ１−１６アルキレン、又はＣ２−１６アルケニレンであり、また各Ｒ１、Ｒ２ 、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立にＣ１−６アルキルであり、Ｙはヒ ドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から選ばれる、Ａ４のカ ルボキシル置換基であり、ここでＡ３が結合である時には、Ａ１とＡ２は相互に 取り替えることができる。］のポリペプチド、又はその光学活性異性体又は製薬 上受け入れられるその塩と、ＤＰＰＣ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＧ、ＰＳ、ＦＡ、及びＴ Ｇからなる群から選ばれる脂質、又は脂質類の混合物との複合体。
18. １８．式 Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｙ ［式中、Ａ１は結合であるか、又はＧｌｕ又はＡｓｐから選ばれる負に荷電され たアミノ酸であり、 Ａ２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はｌｌｅから選ば れる疎水性アミノ酸であり、 Ａ３はＡｉｂ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、又は結合であり、 またＡ４はＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓから選ばれる正に荷電されたアミノ酸で あり、 Ｘは式Ｄａ又はＤｂ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｄａ又は ▲数式、化学式、表等があります▼；Ｄｂであって、ここでＢ１はＢ、−Ｃ（Ｏ ）、−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｂは結合、 Ｃ１−１６アルキレン、又はＣ２−１６アルケニレンであり、また各Ｒ１、Ｒ２ 、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立にＣ１−６アルキルであり、Ｙはヒ ドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から選ばれる、Ａ４のカ ルボキシル置換基である］のポリペプチド、又はその光学活性異性体又は製薬上 受け入れられるその塩と、ＤＰＰＣ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＧ、ＰＳ、ＦＡ、及びＴＧ からなる群から選ばれる脂質、又は脂質類の混合物との複合体。
19. １９．ＤＰＰＣが脂質の主要な成分を含めてなる、請求項１７又は１８に記載の 複合体。
20. ２０．脂質がＤＰＰＣとＰＧの混合物である、請求項１７又は１８に記載の複合 体。
21. ２１．脂質が、約８５−１００％のＤＰＰＣと約０−１５％のＰＧからなる、請 求項１７又は１８に記載の複合体。
22. ２２．ポリペプチドがＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）である、請求項１７又は１８に記載の複合体。
23. ２３．ポリペプチドがＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＮＨ ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）である、請求項１７又は１８に記載の複合体。
24. ２４．ポリペプチドがＴｒｌ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）である、請求項１７又は１８に記載の複合体。
25. ２５．ポリペプチドがＨＢＢ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥ ＱＩＤＮＯ：４）である、請求項１７又は１８に記載の複合体。
26. ２６．ポリペプチドがＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）である、請求項１７又は１８に記載の複合体。
27. ２７．式 Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｙ ［式中　Ａ１は結合であるか、又はＧｌｕ又はＡｓｐから選ばれる負に荷電され たアミノ酸であり、 Ａ２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はｌｌｅから選ば れる疎水性アミノ酸であり、 Ａ３はＡｉｂ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、又は結合であり、 またＡ４はＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓから選ばれる正に荷電されたアミノ酸で あり、 Ｘは式Ｄａ又はＤｂ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｄａ又は ▲数式、化学式、表等があります▼；Ｄｂであって、ここでＢ１はＢ、−Ｃ（Ｏ ）、−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｂは結合、 Ｃ１−１６アルキレン、又はＣ２−１６アルケニレンであり、また各Ｒ１、Ｒ２ 、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立にＣ１−６アルキルであり、Ｙはヒ ドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から選ばれる、Ａ４のカ ルボキシル置換基であり、ここでＡ３が結合である時には、ＡｔとＡ２は相互に 取り替えることができる。］のポリペプチド、又はその光学活性異性体又は製薬 上受け入れられるその塩と、ＤＰＰＣ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＧ、ＰＳ、ＦＡ、及びＴ Ｇからなる群から選ばれる脂質、又は脂質類の混合物、との複合体の有効量を必 要な対象に投与することを含めてなる、その対象の呼吸困難症候群を処置する方 法。
28. ２８．式 Ｘ−Ａｌ−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｙ ［式中Ａ１は結合であるか、又はＧｌｕ又はＡｓｐから選ばれる負に荷電された アミノ酸であり、 Ａ２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はｌｌｅから選ば れる疎水性アミノ酸であり、 Ａ３はＡｉｂ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、又は結合であり、 またＡ４はＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓから選ばれる正に荷電されたアミノ酸で あり、 Ｘは式Ｄａ又はＤｂ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｄａ又は ▲数式、化学式、表等があります▼；Ｄｂであって、ここでＢ１はＢ、−Ｃ（Ｏ ）、−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｂ−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｂは結合、 Ｃ１−１６アルキレン、又はＣ２−１６アルケニレンであり、また各Ｒ１、Ｒ２ 、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立にＣ１−６アルキルであり、Ｙはヒ ドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びアルコキシ基から選ばれる、Ａ４のカ ルボキシル置換基である］のポリペプチド、又はその光学活性異性体又は製薬上 受け入れられるその塩と、ＤＰＰＣ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＧ、ＰＳ、ＦＡ、及びＴＧ からなる群から選ばれる脂質、又は脂質類の混合物、との複合体の有効量を必要 な対象に投与することを含めてなる、その対象の呼吸困難症候群を処置する方法 。
29. ２９．ＤＰＰＣが脂質の主要な成分をなす、請求項２７又は２８に記載の方法。
30. ３０．脂質がＤＰＰＣとＰＣの混合物である、請求項２７又は２８に記載の方法 。
31. ３１．脂質が、約８５−１００％のＤＰＰＣと約０−１５％のＰＧからなる、請 求項２７又は２８に記載の方法。
32. ３２．ポリペプチドがＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）である、請求項２７又は２８に記載の方法。
33. ３３．ポリペプチドがＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＮＨ ２（ＳＥＯＩＤＮＯ：２）である、請求項２７又は２８に記載の方法。
34. ３４．ポリペプチドがＴｒｌ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）である、請求項２７又は２８に記載の方法。
35. ３５．ポリペプチドがＨＢＢ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＥ ＱＩＤＮＯ：４）である、請求項２７又は２８に記載の方法。
36. ３６．ポリペプチドがＨＢＢ−Ａｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）である、請求項２７又は２８に記載の方法。