FI95914B - Polypeptidijohdannaisia ja menetelmä niiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 95914

Polypeptidijohdannaisia ja menetelmä niiden valmistamiseksi Tämä keksintö koskee polypeptidien synteesiä, jol-5 loin polypeptidien aminohappojärjestys ei vastaa nisäkkäi den keuhkojen pinta-aktiivisissa aineissa olevien proteiinien aminohappojärjestyksiä, tällaisia polypeptidejä sekä tällaisten polypeptidien käyttöä valmistettaessa farmaseuttisia koostumuksia, jotka ovat tehokkaita hoidettaessa 10 nisäkkään hengityshäiriöoireyhtymää.

Pikkulasten hengityshäiriöoireyhtymä (RDS) on johtava kuolinsyy elämän 28 ensimmäisen päivän aikana. Sen saa yksi sadasta vauvasta maailmassa, ja noin 10 % näistä kuolee. Oireyhtymää ilmenee harvoin täysiaikaisina synty-15 neissä lapsissa, mutta sen sijaan se liittyy tavallisesti ennenaikaisuuteen ja alhaiseen syntymäpainoon (alle 2 kg). Aikuisiän RDS:ssä esiintyy samanlaisia kliinisiä ominaisuuksia ja patologisia piirteitä kuin pikkulasten taudissa, ja sitä hoidetaan intensiivisellä hoidolla samalla ta-20 valla. Aikuisiän sairaudella on erilainen syyoppi, ja se syntyy keuhkoon kohdistuvien vahingoittavien tekijöiden, kuten hajanaisten infektioiden, vatsan sisällyksen tai veden henkeenvetämisen, ärsyttävien tai myrkyllisten aineiden sisäänhengittämisen ja esimerkiksi huumausaineiden 25 yliannostuksesta seuraavan keuhkopöhön tuloksena. RDS korreloi keuhkojen pinta-aktiivisen aineen, joka peittää keuhkojen keuhkorakkuloita, joissa kaasunvaihto tapahtuu, puuttumiseen tai toimintahäiriöön.

Keuhkojen pinta-aktiivinen aine koostuu pääasiassa 30 lipidistä (90 %), ja se sisältää pienen komponentin, jossa on erilaisia proteiineja (10 %). Ensisijainen lipidityyppi on fosfolipidi, joka muodostaa 97 % lipidistä. 80 % tästä fosfolipidistä on fosfatidyylikoliinia (PC) ja 10 % fosfa-tidyyliglyserolia (PG). 70 - 80 % fosfolipidiasyyliket-35 juista on tyydyttyneitä, ja 85 - 90 % näistä on pituudel- 2 - 95914 taan 16-hiilisiä. Päälipidi on dipalmitoyylifosfatidyyli-koliini (DPPC). Keuhkojen pinta-aktiivisen aineen prote-iinikomponentti on myös heterogeeninen mutta heikommin karakterisoitu. Pääproteiini on noin 32 kD, ja sen amino-5 happojärjestys on ennustettu sen cDNA:sta [White et ai., Nature 317 (1985) 361 - 363], ja se on kloonattu [Floros, et ai., Journal of Biological Chemistry 260 (1985) 495 -500]. Pienempiä proteiineja, joilla on alhaisempi molekyy-lipaino, on myös eristetty, ja useita aminohappojärjestyk-10 siä raportoitu [Warr et ai., Proceedings of the National Academy of Scienses USA 82 (1987) 7 915 - 7 919; Glasser et ai., Journal of Biological Chemistry 263 (1988) 9; Johansson et ai., FEBS Letters 232 (1988) 61 - 64; Glasser et ai., Proceedings of the National Academy of Sciences 15 USA 84 (1987) 4 007; Revak et ai. Journal of Clinical Investigation 81 (1988) 826 - 833].

Pikkulasten RDS:ä on hoidettu eläinten keuhkojen huuhteluliuoksilla [Smyth et ai., Pediatrics 71 (1983) 913 - 917; McCord et ai., Arch. Dis. Child. 63 (1988) 10 - 16] 20 ja ihmiskeuhkojen pinta-aktiivisella aineella, joka on saatu ihmisen amnionkalvonesteestä [Haliman et ai., Pediatrics 71 (1983) 473 - 482; J. Pediatr. 106 (1985) 963 - 969; Merritt et ai., N. Engl. J. Med. 13 (1986) 785 - 790] » merkittävällä menestyksellä. Lehmän keuhkojen huuhteluli-25 uokset, jotka on uutettu orgaanisilla liuottimilla ja sekoitettu synteettisten lipidien kanssa, ovat myös tehokkaita [Fujiwara et ai., Lancet 1 (1980) 55 - 59; Noach et ai., Eur. J. Respir. Dis. 69 (1986) 321 - 335; Kwong et ai., Pediatrics 76 (1985) 585 - 592; Enhorning et ai., 30 Pediatrics 76 (1985) 145 - 153; Shapiro et ai., Pediatrics 76 (1985) 593 - 599; Gitlin et ai., Pediatrics 79 (1987) 31 - 37; Raju et ai., Lancet 1 (1987) 651 - 656; Halliday et ai., Lancet 1 (1984) 476 - 478]. Puhtaasti synteettisten seosten ei kuitenkaan ole todettu johdonmukaisesti 35 olevan aktiivisia [Morley et ai.. Lancet 1 (1981) 64 - 68; • · « 3 · 95914

Ten Centre Study Group, Br. Med. J. 294 (1987) 991 - 996; Milner et al., Arch. Dis. Child. 58 (1983) 458 - 460; Milner et al., ibid 59 (1983) 369 - 371; ja Wilkinson et al., Lancet 2 (1985) 287 - 291]. Tiedämme vain yksittäisestä 5 kliinisestä tutkimuksesta, jossa käytetään pinta-aktiivi-sia aineita aikuisiän RDS:ssä [Lochman et al., Adv. Exp. Med. Biol. 222 (1988) 511 - 517], ja tällaisen hoidon potentiaalinen arvo on osoitettu kirjallisuudessa [van Golde et al., Physiol. Rev. 68, 374 - 455).

10 Edullinen keuhkojen pinta-aktiivinen ainevalmiste koostuu täydellisesti määritellyistä komponenteista. Koska puhtailla lipidiseoksilla on raportoitu saadun vain osittaista menestystä, on ilmeistä, että keuhkojen pinta-ak-tiivisen aineen proteiinikomponenttia tarvitaan. Eräs lä-15 hestymistapa on käyttää geneettisesti tuotettuja proteiineja, joiden sekvenssit perustuvat aminohappojärjestyksiin, jotka on ennustettu keuhkojen pinta-aktiivisten proteiinien cDNA:sta. Vaihtoehtoisena menetelmänä, joka on esillä olevan keksinnön aiheena, syntetisoidaan peptidejä, 20 joiden fysikaaliset ominaisuudet sopivat keuhkojen pinta-aktiivisen aineen toimintaan, kun peptidit ovat yhdistelmänä määritettyjen lipidikomponenttien kanssa, mutta joiden aminohappojärjestykset eivät vastaa keuhkojen pinta-aktiivisesta aineesta eristettyjen proteiinien aminohappo-25 järjestyksiä.

Esillä oleva keksintö koskee synteettisiä polypeptide jä, jotka yhdistettäessä lipideihin muodostavat koostumuksen, joka on tehokas hoidettaessa RDS:ää. Synteettisillä polypeptideillä on ainutlaatuiset aminohappojärjes- 30 tykset, jollaisia ei tavata nisäkkäiden keuhkojen huuhte- luliuoksista eristettyjen proteiinien aminohappojärjestyksistä. Polypeptidejä voidaan käyttää yksinään seoksissa lipidien kanssa tai yhdistelminä lipidien seoksissa. Poly-peptidi käsittää hyvin pienen pinta-aktiivisen aineseoksen 35 komponentin.

4 95914

Julkaisusta J. Biol. Chem. 255(23) (1980) 11 464 -11 472 tunnetaan amfipaattisia peptidejä, joissa on 18 tai 19 aminohaposta muodostuva ydin ja 1 - 3 seriinistä tai alaniinista muodostuvat reuna-alueet. Symposiumjulkaisu 5 Proceedings of the 9th American Peptide Symposium (1985) s. 903 - 906 käsittelee dimyristoyylifosfatidyylikoliinin (DMPC) ja kuuden synteettisen, 18 - 26 aminohappoa sisältävän apolipoproteiini A-I:n (Apo-A-I) peptidianalogin muodostamien kompleksien rakenteellisia ominaisuuksia. US-10 patentti 4 705 684, kohdistuu synteettisiin, immunogeeni-siin peptideihin, jotka on kytketty tyypin IV streptokok-keille sopivaan kantajaan.

Näistä julkaisuista tunnetut peptidit ovat kaikki amfipaattisia peptidejä, joissa on 18 tai useampia amino-15 happoja. Esillä olevilta uusilta kaavan I mukaisilta peptideiltä edellytetään kuitenkin, että ne ovat muutakin kuin vain amfipaattisia peptidejä: niiden täytyy toimia yhteistyössä lipidien kanssa, jotta saadaan aikaan yhdistelmä, jolla saadaan aikaan merkittävä terapeuttinen vai-20 kutus hengityshäiriöitä hoidettaessa.

Esillä olevan keksinnön mukainen peptidikomponentti tekee mahdolliseksi valmistaa erittäin puhdas ja standardoitu, koostumus, joka on lääketieteellisesti tehokas hoidettaessa hengityshäiriöoireyhtymää. Komponentteja ei joh- I · * 25 deta eläimistä, millä minimoidaan viruksien ja bakteerien aiheuttaman kontaminaation riski. Komponentit ovat tyypiltään biologisia, ja seoksen komponentit voivat poistua lopulta nisäkkäissä metaboliateitä pitkin. Lisäksi ei käytetä lainkaan ei-biologisia molekyylejä.

; 30 Piirroksissa:

Kuvio 1 on paine-tilavuus -käyrä vertailumalleille I ja II täysikasvuisen rotan keuhkomallissa.

Kuvio 2 on paine-tilavuus -käyrä, joka kuvaa esimerkkien 1 ja 2 peptidien tehokkuuden täysikasvuisen rotan 35 keuhkomallissa.

5 95914

Esillä oleva keksintö koskee peptidijohdannaisia, joilla on kaava

X-Y-Z-Y’ -Q

jossa 5 X on vety, aminohappo, dipeptidi tai tripeptidi, tai alifaattinen, aromaattinen tai syklinen orgaaninen happo, jossa on 1 - 10 hiiliatomia; Y ja Y' ovat kumpikin itsenäisesti sidos tai -(Ser)n~, jossa n on kokonaisluku 1-3; 10 Q on hydroksi-, amino-, alkyyliamino- tai alkoksi- ryhmä; Z on peptiditähde, jossa on 8 - 17 aminohappoa, ja se koostuu aminohappojärjestyksen —Aj—Aj—A3—A4—Aj—Ag—A7—Ae—Ag—A10—Aj^j—Aj 1 —A2 1 —A3 ' —A4 1 — As ' — 1 C A ’-Ä (-A ’-A f—A '—A f-A M-A M-Ä M-Ä 1 1-A M-A M- AJ λ6 **7 ^ **9 Λ10 Λ11 Λ1 λ2 λ3 λ4 λ5 λ6 A ff-A f,-A ff-A *'-Α * f _A * * * _A ,f* — n7 **9 Λ10 Λ11 Λ1 η2 omaavan oligomeerin fragmentista, joka voi alkaa millä tahansa aminohappotähteistä - An, jolloin • A A f A f 1 A f * 1 A A'Af'A A 1 H a A 1 1 * Λ19 Λ1 9 $ “i / λ4 9 λ4 9 *4 f λ8 r Λθ J ® λ8 20 ovat kukin itsenäisesti hydrofiilinen aminohappo Glu tai Asp, A Λ f Ά I » . Ά 1 I I Ä Ä» A,f A Ar Atf A 2 9 λ2 ' λ2 / λ2 ' λ3 9 λ3 / λ3 ' Λ6' Λ6 / Λ6 ' Λ7 ' Α7', A·/', Α10, Α10' ja Α10'' ovat kukin itsenäisesti lipofii-linen aminohappo Leu, Ala, Vai, Phe tai Tyr; 25 As, A5', As' ', An, Au' ja Au * ' ovat kukin itsenäi sesti emäksinen aminohappo Lys tai Arg; A,, A,’ ja A," ovat kukin itsenäisesti emäksinen aminohappo Trp, Lys, Phe, Ala tai Trp(For), jolloin X, Y, Y' ja Z merkitsevät yhdessä alle 18 aminohappoa sisältävää 30 peptidiä, ja niiden fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja.

Kaavan I mukainen peptidi yhdistettäessä lipidiin, joka koostuu yhdestä tai useammasta luonnollisen keuhkojen pinta-aktiivisen aineen tyyppisestä aineesta, muodostaa koostumuksen, joka on käyttökelpoinen hoidettaessa nisäk-35 kään hengityshäiriöoireyhtymää.

6 95914

Seuraavia yleisiä lyhenteitä käytetään luonnollisesti esiintyvistä aminohapoista kaikkialla tässä hakemuksessa:

Ala tai A - alaniini 5 Vai tai V - väliini

Leu tai L - leusiini Ile tai I - isoleusiini Phe tai F - fenyylialaniini Trp tai W - tryptofaani 10 Met tai M - metioniini

Ser tai S - seriini Tyr tai Y - tyrosiini Asp tai D - asparagiinihappo Glu tai E - glutamiinihappo 15 Lys tai K - lysiini

Arg tai R - arginiini Nle - norleusiini Orn - ornitiini hArg - homoarginiini 20 Nva - norvaliini

Trp(For) - Nin-formyyli-Trp

Luonnollisissa aminohapoissa, glysiiniä lukuun ottamatta, on kiraalinen hiiliatomi. Ellei toisin ole mainittu, optisesti aktiivisilla aminohapoilla, joihin tässä < » 25 viitataan, on L-konfiguraatio. Kuten tapana on, peptidien rakenteet on tässä kirjoitettu siten, että aminoterminaa-lipää on ketjun vasemmalla puolella ja karboksiterminaali-pää ketjun oikealla puolella.

Tietyt kaavan I mukaiset polypeptidit ovat edulli-30 siä. Kaavan I mukaiset polypeptidit, joissa ainakin yksi A1:stä, Ax’:stä, A^’.-sta ja A1',,:stä on Glu; joissa ainakin yksi A4:stä, A4':stä ja A4* ’:stä on Glu; ja joissa ainakin yksi Ae:sta, Ae' :sta ja Ae' ' :sta on Glu, ovat edullisia. Edullisia ovat myös ne kaavan I mukaiset polypeptidit, 35 joissa jokin seuraavista: A2, A2', A2' ’ ja A2' ' ’ on Leu; • < 7 95914 joissa ainakin yksi seuraaavista: A3, A3' ja A3' ' on Leu: joissa ainakin yksi sauraavista: A6, A6' ja A6" on Leu; joissa ainakin yksi seuraavista: A7, A7' ja A7' ' on Leu; ja joissa ainakin yksi seuraavista; A10, A10' ja A10' ' on Leu.

5 Edullisia ovat myös sellaiset kaavan I mukaiset polypepti-dit, joissa ainakin yksi seuraavista: A5, A5' ja A," on Lys; joissa ainakin yksi seuraavista; A9, A,' ja A," on Phe; ja joissa ainakin yksi seuraavista: A1X, Au' ja Au'' on Lys. Hakijat pitävät edullisina lisäksi sellaisia kaa-10 van I mukaisia polypeptidejä, joissa Q on aminoryhxnä.

Tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä voidaan valmistaa monilla erilaisilla, asiantuntijoiden tuntemilla menetelmillä. Tällaisia menetelmiä ovat mm. peräkkäis- tai segmenttikiinteäfaasisynteesi, geenikloonaus ja tällaisten 15 menetelmien yhdistelmät. Peräkkäiskiinteäfaasimenetelmä voidaan suorittaa käyttäen julkaistuja automatisoituja menetelmiä, kuten ABI-peptidisyntetisoijaa käyttäen. Tässä menetelmässä α-aminosuojattu aminohappo sidotaan hartsi-alustaan. Käytettävä hartsialusta voi olla mikä tahansa 20 sopiva, tavanomaisesti polypeptidien kiinteäfaasivalmis- tuksessa käytettävä hartsi, edullisesti polystyreeni, joka on ristiinsidottu 0,5 - noin 3 % divinyylibentseenillä, joka hartsi on joko kloorimetyloitu tai hydroksimetyloitu, ja näin saadaan paikkoja, jossa esterin muodostuminen voi 25 tapahtua alussa mukaan tuodun α-aminosuojatun aminohapon kanssa.

Esimerkki hydroksimetyylihartsista kuvataan julkaisussa Bodanszky et ai., Chem. Ind. (London) 38 (1966) 1597 - 98. Kloorimetyloitua hartsia on kaupallisesti saatavissa ;· 30 Bio Rad Laboratories'ta, Richmond, Kalifornia, ja tällai- ’ sen hartsin valmistus kuvataan Stewart et ai.:n kirjassa "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Osa 1, ss. 1 - 6. Suojattu aminohappo voidaan sitoa hartsiin menetelmällä, jonka on kuvannut Gisin Jul-35 kaisussa Helv. Chem. Acta 56 (1973) 1476. Monia hartsiin

• I

8 95914 sidottuja, suojattuja aminohappoja on kaupallisesti saatavissa. Esimerkkinä, kun valmistetaan polypeptidiä, jossa karboksiterminaalipää on Thr-tähde, voidaan käyttää tert-butyylioksikarbonyyli(Boc)-suojattua Thr:ä, joka on sidot-5 tu bentsyloituun, hydroksimetyloituun fenyyliasetamidome-tyyli (PAM) -hartsiin, ja tämä on kaupallisesti saatavissa.

Kun α-aminosuojattu aminohappo on liitetty hartsi-alustaan, suojaryhmä poistetaan, käyttäen mitä tahansa 10 sopivaa menetelmää, kuten käyttäen trifluorietikkahappoa metyleenikloridissä, trifluorietikkahappoa yksinään tai HCl:a dioksaanissa. Suojauksen poisto suoritetaan lämpötilassa, joka on 0 °C:n ja huoneen lämpötilan välillä. Muita standardilohkaisureagensseja ja -olosuhteita voidaan käyt-15 tää tiettyjen a-aminosuojaryhmien poistamiseen. Kun a-ami-nosuojaryhmä on poistettu, muut aminosuojatut aminohapot liitetään vaiheittain halutussa järjestyksessä. Vaihtoehtoisesti voidaan liittää moniaminohapporyhmiä liuosmene-telmän avulla ennen kuin ne liitetään hartsiin sidotun 20 aminohapposekvenssiin.

a-aminosuojaryhmä, jota käytetään kunkin polypepti-disekvenssiin liitettävän aminohapon kanssa, voi olla mikä tahansa tunnettu suojaryhmä. Mahdollisia a-aminosuojaryh-miä ovat 1) asyylityyppiset suojaryhmät, kuten formyyli, 25 trifluoriasetyyli, ftalyyli, tolueenisulfonyyli (tosyyli), bentseenisulfonyyli, nitrofenyylisulfenyyli, trityylisul-fenyyli, o-nitrofenoksiasetyyli ja v-klooributyryyli; 2) aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmät, kuten bentsyy-lioksikarbonyyli ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, 30 kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyyliok- . . : sikarboyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli, p-metoksi- bentsyylioksikarbonyyli, l-(p-bifenyyli Jl-metyylietoksi-karbonyyli, a,a-dimetyyli-3,5-dimetoksibentsyylioksikar-bonyyli ja bentshydryylioksikarbonyyli; 3) alifaattiset 35 uretaanisuojaryhmät, kuten tert-butyylioksikarbonyyli 9 95914 (Boc), di-isopropyylimetoksiksrbonyyli, isopropyylioksi-karbonyyli, etoksikarbonyyli ja allyylioksikarbonyyli; 4) sykloalkyyliuretaanityyppiset suojaryhmät, kuten syklopen-tyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja syklo-5 heksyylioksikarbonyyli; 5) tiouretaanityyppiset suojaryhmät, kuten fenyylitiokarbonyyli; 6) alkyylityyppiset suo-jaryhmät, kuten trifenyylimetyyli (trityyli) ja bentsyyli; 7) trialkyylisilaaniryhmät, kuten trimetyylisilaani. Edullinen α-aminosuojaryhmä on tert-butyylioksikarbonyyli.

10 Sopivan kytkentä valinta on asiantuntijoiden pää tettävissä. Erityisesti edullinen kytkentäreagenssi, kun liitettävä aminohappo on Gin, Asp tai Arg, on Ν,Ν'-di-iso-propyylikarbodi-imidi ja 1-hydroksibentsotriatsoli. Käytettäessä näitä reagensseja, estetään nitriilin ja laktaa-15 min muodostuminen. Muita kytkentäaineita ovat 1) karbodi-imidit (esim. N,N*-disykloheksyylikarbodi-imidi ja N-etyy-li-N1-(v-dimetyyliaminopropyylikarbodi-imidi); 2) syanami-dit (esim. N,N-dibentsyylisyanamidi); 3) keteeni-imiinit; 4) iso-oksatsoliumsuolat (esim. N-etyyli-5-fenyyli-iso-20 oksatsolium-3'-sulfonaatti; 5) monosykliset, typpeä sisäl tävät heterosykliset amidit, joilla on aromaattinen luonne ja joissa on yhdestä neljään typpeä renkaassa, kuten imi-datsolit, pyratsolit ja 1,2,4-triatsolidit. Erityisiä he-. terosyklisiä amideja, jotka ovat käyttökelpoisia, ovat mm.

25 N,N’-karbonyylidi-imidatsoli ja N,N'-karbonyyli-di-1,2,4- triatsoli; 6) alkoksyloitu asetyleeni (esim. etoksiasety-leeni); 7) reagenssit, jotka muodostavat seosanhydridejä aminohapon karboksyyliryhmän kanssa (esim. etyylikloori-formiaatti) tai liitettävien aminohappojen symmetriset an-*:· 30 hydridit (esim. Boc-Arg)2-0 ja 8) typpeä sisältävät hete- “ rosykliset yhdisteet, joiden yhdessä rengastypessä on hyd- roksiryhmä (esim. N-hydroksiftaali-imidi, N-hydroksisuk-kinimidi ja 1-hydroksibentsotriatsoli). Muita aktivoivia reagensseja ja niiden käyttöä peptidien liittämisreakti-35 oissa kuvaa Kapoor julkaisussa J. Pharm. Sei. 59 (1970) 1 — · ίο 95914 - 27. Hakijoiden mielestä on edullista käyttää symmetristä anhydridiä kytkentäaineena.

Kukin suojattu aminohappo tai aminohapposekvenssi tuodaan kiinteäfaasireaktoriin noin nelinkertaisena ylimääränä, ja 5 kytkentä suoritetaan dimetyyliformamidiimetyleenikloridi- väliaineessa (1:1) tai dimetyyliformamidissa yksistään, tai edullisesti metyleenikloridissa yksistään. Tapauksissa, joissa ilmenee epätäydellistä kiinnittymistä, kytken-täreaktio toistetaan ennen α-aminosuojaryhmän poistamista, 10 ennen kuin seuraava aminohappo liitetään kiinteäfaasireak- torissa. Kytkentäreaktion onnistumista synteesin kussakin vaiheessa seurataan ninhydridiinireaktion avulla, ja tämä on kuvattu julkaisussa E. Kaiser et ai., Analyt. Biochem.

34 (1970) 595.

15 Kun haluttu aminohappojärjestys on saatu, peptidi poistetaan hartsista. Tämä voidaan suorittaa metanolyysin avulla, kuten käsittelemällä hartsiin sidottua polypepti-diä liuoksella, jossa on dimetyylisulfidia, p-kresolia ja tiokresolia laimeassa fluorivetyhapon vesiliuoksessa.

20 Kuten kiinteäfaasipeptidisynteesikemiassa tiede tään, monissa aminohapoissa on funktionaalisia ryhmiä, jotka on suojattava ketjun valmistuksen aikana. Sopivan suojaryhmän käyttö ja valinta on asiantuntijan päätettä-. vissä, ja se riippuu suojattavasta aminohaposta sekä muis- 25 ta peptidissä läsnä olevista suojatuista aminohappotähteistä. Tällaisen sivuketjun suojaryhmän valinta on tarkkaa, sillä sen on oltava sellainen, ettei se irtoa lohkaisemalla, kun α-amino-osan suojaryhmää lohkaistaan. Esimerkiksi sopivia sivuketjusuojaryhmiä lysiinille ovat 30 bentsyylioksikarbonyyli ja substituoitu bentsyylioksikar- bonyyli, ja mainittu substituentti on jokin seuraavista: halogeeni (esim. kloori, bromi, fluori) ja nitro (esim. 2-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbo-nyyli, 3,4-diklooribentsyylioksikarbonyyli), tosyyli, t-35 amyylioksikarbonyyli, t-butyylioksikarbonyyli ja di-iso- # 11 95914 propyylimetoksikarbonyyli. Treoniinin ja seriinin alkoholi hydr ok syy li ryhmä voidaan suojata asetyyli-, bentsoyyli-, tert-butyyli-, trityyli-, bentsyyli-, 2,6-diklooribentsyy-li- tai bentsyylioksikarbonyyliryhmällä. Edullinen suoja-5 ryhmä on bentsyyli.

Nämä ryhmät poistetaan kemiassa hyvin tunnetuilla menetelmillä. Tavallisesti suojaryhmän poisto suoritetaan sen jälkeen, kun peptidiketjusynteesi on päättynyt, mutta suojaryhmät voidaan poistaa missä tahansa muussa vaihees-10 sa.

Kaavan I mukaiset polypeptidit voivat muodostaa fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja kaikkien myrkyttömien, orgaanisten tai epäorgaanisten happojen kanssa. Esimerkkeinä epäorgaanisista hapoista, jotka muodostavat so-15 pivia suoloja, ovat kloorivety-, bromivety-, rikki- ja fosforihappo, ja happometallisuoloja, kuten natriummonove-tyortofosfaatti ja kaliumvetysulfaatti. Esimerkkeinä orgaanisista hapoista, jotka muodostavat sopivia suoloja, ovat mono-, di- ja trikarboksyylihapot. Esimerkkeinä täl-20 laisista hapoista ovat etikka-, glykoli-, maito-, palory- päle-, maloni-, meripihka-, glutaari-, fumaari-, omena-, viini-, sitruuna-, askorbiini-, maleiini-, hydroksimaleii-ni-, bentsoe-, hydroksibentsoe-, fenyylietikka-, kaneli-, salisyyli-, 2-fenoksibentsoe- ja sulfonihpaot, kuten me-“ ' 25 taanisulfonihappo ja 2-hydroksietaanisulfonihappo. Karbok- sipääteaminohappo-osan suoloja ovat myrkyttömät karboksyy-lihapposuolat, jotka ovat muodostuneet minkä tahansa sopivan epäorgaanisen tai orgaanisen emäksen kanssa. Esimerkkeinä tällaisista suoloista ovat alkalimetallisuolat, ku-30 ten esimerkiksi natrium- ja kalium-; maa-alkalimetallisuo-lat, kuten kalsium- ja magnesium-; ryhmän IIIA kevytmetallien suolat, kuten aluminium-; orgaanisten primaaristen, sekundaaristen ja tertiaaristen amiinien suolat, kuten esimerkiksi trialkyyliamiinit, mukaan lukien trietyy-35 liamiini, prokaiini, dibentsyyliamiini, 1-etenamiini, 12 95914 N, N'-dibentsyylietyleenidiamiini, dihydrobietyyliamiini, N-(alempi)-alkyylipiperidiini ja muut sopivat amiinit.

Keksinnön mukaista polypeptidiä sisältävien prote-iini-fosfolipidikompleksien fosfolipidit voivat olla mitä 5 tahansa fosfolipidejä, ja tällä tässä käytettävällä termillä tarkoitetaan fosfoglyseridejä ja sfingolipidejä. Fosfoglyseridit ovat glyserolin dirasvahappoestereitä, joissa glyseroliosan jäljelle jäänyt hydroksiryhmä, ter-minaali-hydroksiryhmä muodostaa esterin fosforihapon kansio sa. Tavallisesti fosfoglyseridien fosforihappo-osa muodostaa toisen esterin alkoholin, kuten etanoliamiinin, serii-nin, koliinin tai glyserolin kanssa. Sfingolipidit ovat sfingosiinin tai dihydrosfingosiinin monorasvahappoeste-reitä, joissa 1-asemassa oleva hydroksiryhmä muodostaa es-15 terin fosforihapon koliiniesterin kanssa. Edullisia lipidejä ovat dipalmitoyylifosfatidyylikoliini (DPPC), fosfa-tidyylikoliinimolekyylejä sisältävät eripituiset ja eri tyydyttyneisyysastetta olevat asyyliketjut (PC), kardioli-piini (CL), fosfatidyyliglyserolit (PG), fosfatidyylise-20 riinit (PS), rasvahapot (FA) ja triasyyliglyserolit (TG). DPPC muodostaa keuhkojen pinta-aktiivisen aineseoksen pää-komponentin, kun taas PC, CL, PG, PS, FA ja TG muodostavat pienemmät komponentit. Sopivia rasvahappoja, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisissa fosfolipideissä, ovat ·' 25 pitkäketjuiset karboksyylihapot (joissa on tavallisesti kahdeksan tai useampia hiiliatomeja), jotka ovat yleensä haaroittumattomia. Rasvahapot voivat olla tyydyttyneitä tai tyydyttymättömiä. Esimerkkeinä rasvahapoista ovat lau-riini-, myristiini-, palmitiini- ja oleiinihapot.

30 Proteiini-fosfolipidikompleksien farmaseuttisia v valmisteita voidaan valmistaa kuivana seoksena tai vesi- suspensioihin, jotka joissakin tapauksissa sisältävät pieniä määriä orgaanisia liuottimia, kuten esimerkiksi etanolia tai trifluorietanolia, detergenttejä, kuten esimerkik-35 si natriumdodesyylisulfaattia tai natriumdeoksikolaattia, 13 95914 suoloja, kuten kalsiumkloridia tai natriumkloridia, hiilihydraatteja, kuten glukoosia, dekstroosia tai mannitolia, ja aminohappoja, kuten glysiiniä ja alaniinia. Kun farmaseuttinen koostumus tehdään nestemuotoon, voidaan lisätäs-5 tabilaattoreita, säilöntäaineita, osmoottista painetta sääteleviä aineita, puskureita ja suspendoivia aineita. Haluttaessa voidaan lisätä myös sopivia germisidejä. Vesi-suspension pH voi vaihdella arvosta 2 arvoon 10, ja sitä voidaan säätää hapoilla tai emäksillä, kuten esimerkiksi 10 suolahapolla, natriumfosfaatilla tai natriumhydroksidilla. Kuiva seos voidaan muodostaa uudelleen vesiliuoksessa, joka sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, orgaanisia liuottimia ja detergenttejä. Vesivalmiste voidaan dialysoida, suodattaa tai kromatografoida suspensoivan vä-15 liaineen vaihtamiseksi farmaseuttisesti hyväksyttävään vä liaineeseen ennen käyttöä. Valmiste voidaan antaa kuivana jauheena, vesisuspensiona tai aerosolina suoraan toiminnaltaan häiriytyneisiin keuhkoihin. Koostumus voidaan laittaa ilmatiiviisti suljettuihin säilytysastioihin, ku-20 ten lääkepulloihin tai ampulleihin, ja ne voidaan säilyttää steriilisti. Koostumus voidaan säilyttää lääkepullossa tai ampullissa erillään lääkepullosta tai ampullista, joka sisältää suspensiopuskurin, ja kuiva tai hydratoitu koostumus voidaan sekoittaa suspensiopuskurin kanssa ennen 25 käyttöä.

Lipidi muodostaa 50 - 99,9 % keuhkojen pinta-aktii-visesta valmisteesta. Sopivia lipidejä ovat DPPC, PC, CL, PG, PS, FA ja TG. DPPC käsittää päälipidilajit, ja sitä on mukana konsentraationa, joka on 60 - 100 % lipidin koko-30 naispainosta. Jäljelle jääviä lipidejä on mukana pienempi-• nä konsentraatioina. PC, CL, PG ja PS voivat käsittää kor keintaan 30 % lipidejä, ja FA:ta ja TG:ta voi olla korkeintaan 10 % lipidin painosta. Pienempien lipidikompo-nenttien rasva-asyyliketjut voivat olla tyydyttyneitä tai 35 tyydyttymättömiä, ja ne voivat olla minkä pituisia tähän- 14 95914 sa. Ketjut, jotka ovat pituudeltaan 12 - 16 hiiliatomia ja joissa on korkeintaan kaksi tyydyttymätöntä sidosta, ovat edullisia. Edullinen lipidikoostumus on 85 - 100 % DPPCrtä plus 0 - 15 % PG:tä.

5 Synteettisen keuhkojen pinta-aktiivisen aineen li- pidikomponentteja tavataan yleisesti nisäkkäiden keuhkojen pinta-aktiivisista aineista, ja niitä on saatavissa yleisistä teollisista lähteistä erittäin puhtaina. Polypepti-dikomponentit valmistetaan kiinteäfaasipeptidisynteesillä 10 asiantuntijoiden tietämillä menetelmillä. Sekvenssejä, jotka ovat samanlaisia kuin tämän keksinnön polypeptidien sekvenssit, on käytetty malleina plasman apolipoproteii-nien lipidin sitoutumisalueelle, mutta niitä ei ole käytetty synteettisissä keuhkojen pinta-aktiivisissa valmis-15 teissä. Seokset, joissa on lipidejä ja proteiineja ja jotka on eristetty nisäkkään keuhkojen huuhteluliuoksesta, on todettu tehokkaiksi hoidettaessa vastasyntyneiden RDS:ää. Seoksia, joissa on näitä lipidejä ja synteettisiä peptidejä keuhkojen pinta-aktiivisissa valmisteissa, ei kuiten-20 kaan ole raportoitu.

Lipidit sekoitetaan haihtuvaan orgaaniseen liuotti-meen tai liuottimien seoksiin, kuten kloroformin ja me-tanolin seoksiin. Orgaaninen liuotin poistetaan haihduttamalla typpi- tai argonatmosfäärissä tai tyhjössä. Vesi-25 liuos, joka voi sisältää orgaanisia ja epäorgaanisia happoja, emäksiä ja suoloja, ja sakkarideja, kuten dekstroo-sia, lisätään kuivaan lipidiseokseen, jolloin saadaan lopullinen konsentraatio, joka on 0,1 - 100 mg DPPC:tä mil-lilitrassa. Tavallisesti on edullista, joskaan ei välttä-30 mätöntä, lämmittää seos 35 - 50 °C:seen, sekoittaa voimakkaasti ja inkuboida korkeintaan kaksi tuntia 25 - 50 “C:-ssa. Sitten peptidi tai peptidien seos lisätään kuivana jauheena tai suspensoituna vesiliuokseen, joka voi joissakin tapauksissa sisältää sopivaa orgaanista liuotinta, ku-35 ten etanolia tai trifluorietanolia, tai denaturoivaa ai- • is 95914 netta, kuten guanidiumhydrokloridia tai ureaa, mikä parantaa peptidin liukoisuutta vesisuspensiossa. Peptidin ja lipidin yhdistymistä voidaan edistää tietyssä pH:ssa, ja . siten vesiliuoksen pH voi vaihdella välillä 2 - 10. Edul- 5 linen menetelmä peptidin ja lipidin sekoittamiseksi keskenään on lisätä kuivaa peptidiä lipidiin vedessä 45 - 50 *C:ssa ja sekoittaa ultraäänihauteessa 45 - 50 *C:ssa 30 -90 minuuttia, sitten kylmäkuivattaa ja säilyttää -20 °C:-ssa.

10 Lipidit sekoitetaan sopivan detergentin, kuten oktyyliglukosidin tai natriumdeoksikolaatin, kanssa painosuhteessa 1-20 osaa detergenttiä yhtä DPPC-osaa kohden, DPPC:n ollessa vedessä, vesipuskurissa tai suolaliuoksessa, jonka konsentraatio on 1 - 100 mg DPPC/ml. Sit-15 ten peptidi lisätään kuivana jauheena tai suspensoituna vesiliuokseen, jossa on tai ei ole orgaanista liuotinta, denaturoivaa ainetta tai detergenttiä. Sitten seos dia-lysoidaan, suodatetaan, sentrifugoidaan tai kromatografoi-daan detergentin poistamiseksi.

20 Vaihtoehtoisesti lipidit ja peptidit sekoitetaan haihtuvaan, orgaaniseen liuottimeen, jossa on tai ei ole pieni määrä vettä. Haihtuva liuotin haihdutetaan typpi-tai argonvirrassa tai tyhjduunissa, tai pyörivässä haihduttimessa joko ennen tai jälkeen vesipitoisen liuottimen * * 25 lisäämisen.

Seosta, jossa on lipidiä ja peptidiä, ja joka on valmistettu jollakin edellä kuvatuista menetelmistä, inku-boidaan korkeintaan kaksi tuntia, edullisesti 35 - 50 eC:-ssa, samanaikaisesti ultraäänellä säteilyttäen. Seos voi-30 daan sitten dialysoida, suodattaa tai kromatografoida vesipitoisen väliaineen korvaamiseksi farmaseuttisesti hyväksyttävällä väliaineella, joskaan tämä ei ole välttämätöntä. Joissakin tapauksissa tehokkuutta parannetaan siten, että erotetaan reagoimaton lipidi tai peptidi liitty-35 neestä lipidistä ja peptidistä ultrasentrifugoimalla, suo- 16 95914 dattamalla tai kromatografoimalla. Seos voidaan sitten ly-ofilisoida tai saattaa aerosolimuotoon.

Polypeptidi-fosfolipidikomplekseja voidaan käyttää hoidettaessa vastasyntyneiden hengityshäiriöoireyhtymää, 5 fysiologista tilaa, joka syntyy siitä, etteivät ennenaikaisten vauvojen keuhkot pysty tuottamaan keuhkojen pinta-aktiivista ainetta. Nämä kompleksit, kun ne annetaan RDS-potilaille, toimivat synteettisinä keuhkojen pinta-aktii-visina aineina ja joko korvaavat luonnollisen, puuttuvan 10 pinta-aktiivisen aineen tai vaikuttavat parantavasti riittävän luonnollisen pinta-aktiivisen aineen puutteeseen. Hoitoa jatketaan, kunnes vauvan keuhkot tuottavat riittävän määrän luonnollista keuhkojen pinta-aktiivista ainetta siten, ettei jatkohoito ole enää välttämätöntä.

15 Valmisteet ovat edullisesti sellaisia, että ne so pivat annettaviksi sisälle henkitorveen, jolloin ne ovat nestemäisiä suspensioita, kuivia jauheita tai aerosoleja. Nestemäisen suspension tapauksessa kuiva seos tai seos, joka on vesisuspensiossa, sekoitetaan sopivien aineiden, 20 kuten veden, suolaliuoksien, destroosin ja glyseroli kanssa, jolloin saadaan farmaseuttisesti tehokas koostumus. Edulliset nestemäiset suspensiot sisältävät 0,8 - 1,0 pai-no-% natriumkloridia, ja kalsiumionin määrä on 1 - 20 mM. Valmiste steriloidaan sitten suodattamalla. Tavallisesti ·· 25 valmiste sisältää 1 - 100 mg DPPC:tä millilitrassa, ja se annetaan annoksena, joka on 0,2 - 5 mg/kg. Valmistettaessa kuivaa seosta, vesisuspensio lyofilisoidaan. Aerosoli valmistetaan hienoksi jaetusta kuivasta jauheesta, joka on suspensoitu ponneaineeseen, jollaisia ovat alemmat alkaa-30 nit ja fluoratut alkaanit, kuten freoni. Aerosoli säilyte-tään paineastiassa.

Pinta-aktiivinen aine annetaan kunkin annostusmuo-don mukaan henkitorven sisäisellä putkella, aerosolina tai sumuttamalla suspensio tai kuiva seos sisäänhengitettävään 35 kaasuun. Pinta-aktiivinen aine annetaan yhtenä tai monena 17 95914 annoksena, joiden määrä on 10 — 200 mg/kg. Edullinen antamistapa on antaa lääke suspensiona, jossa on peptidiä ja lipidiä fysiologisessa suolaliuoksessa, konsentraationa, joka on 5 - 10 mg pinta-aktiivista ainetta millilitrassa, 5 henkitorvensisäisen putken kautta, jolloin annettava annos on 50 - 100 mg/kg.

Esimerkki 1 H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Äla-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Äla-Phe-Ser-Ser-Ser-10 OH:n (peptidi 1) ja DPPC:n kompleksin valmistus

Peptidi 1 valmistettiin kiinteäfaasisynteesin avulla. DPPCrtä (25 mg), joka oli 1 mlrssa kloroformia, kuivattiin typpivirrassa, ja se lyofilisoitiin orgaanisten liuotintähteiden poistamiseksi. Kuivaan lipidiseokseen lisättiin 3 ml vettä. Valmistetta inkuboitiin yksi tunti 45 eC:ssa. Sitten lisättiin 0,5 g kuivaa Peptidi l:tä vesipitoiseen valmisteeseen. Valmistetta sonikoitiin ultra-äänihauteessa 45 *C:ssa kaksi tuntia. Syntynyt lipidi-pep-tidiseos lyofilisoitiin ja varastoitiin 4 eC:seen korkeinko taan yhdeksi kuukaudeksi. Ennen testausta lisättiin 9 ml 0, 9-%:ista NaCl:a, 20 mM HEPES-puskuria, pH 7,40. Valmistetta inkuboitiin yksi tunti 45 °C:ssa sekoittaen ajoit-taisesti. Valmiste oli läpikuultavan valkoista ja jonkin verran vähemmän sameata kuin DPPC yksinään.

25 Esimerkki 2

Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2:n (peptidi 2) ja DPPC:n kompleksin valmistus Peptidi valmistettiin kiinteäfaasisynteesin avulla ja sekoitettiin DPPC:n kanssa esimerkissä 1 kuvatulla ta-30 valla, paitsi että lopullisessa suspensoivassa puskurissa • oli 5 mM CaCl2:a 0,9-%:isen NaCl:n, 20 mM HEPES-puskurin, pH 7,40 lisäksi.

18 95914

Esimerkki 3

Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2:n (peptidi 3) ja DPPC:n kompleksin valmistus Vastaavalla tavalla valmistettiin peptidi 3 ja muo-5 dostettiin sen kompleksi DPPC:n kanssa.

Vastaavalla tavalla mutta käyttäen seosta, jossa oli 25 paino-% DUPG:ta ja 75 paino-% DPPC:tä, saatiin peptidin 2 DUPG/DPPC-kompleksi.

Esimerkki 4 10 Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-

Trp-Leu-Lys-NH.2:n (peptidi 4) ja DPPC:n kompleksin valmistus

Vastaavalla tavalla valmistettiin peptidi 4 ja muodostettiin sen kompleksi DPPC:n kanssa.

15 Esimerkki 5

Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2 Vastaavalla tavalla valmistettiin peptidi 4 ja muodostettiin sen kompleksi DPPC:n kanssa.

Esimerkki 6 20 Sue-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2

Vastaavalla tavalla valmistettiin peptidi 4 ja muodostettiin sen kompleksi DPPC:n kanssa.

Esimerkki 7

Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2 25 Vastaavalla tavalla valmistettiin peptidi 4 ja muo dostettiin sen kompleksi DPPC:n kanssa.

Esimerkki 8

Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2 Vastaavalla tavalla valmistettiin peptidi 4 ja muo-30 dostettiin sen kompleksi DPPC:n kanssa, ί Esimerkki 9

Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2

Vastaavalla tavalla valmistettiin peptidi 4 ja muo-35 dostettiin sen kompleksi DPPC:n kanssa.

19 95914

Esimerkki 10 H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-

Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-

Ser-OH

5 Vastaavalla tavalla valmistettiin peptidi 4 ja muo dostettiin sen kompleksi DPPC:n kanssa.

Taulukko 1

Fysikaaliset ominaisuudet ja peptidien 1-10 aminohappo-10 analyysi

Aminohappoanalyysi__ ,“„“S Ejm #BS2AVLFYK *1mu 15 T” 1,99 4,94 2,07 3,90 1,03 2,03 2.04 1.04 3,98 2707 7040 “5 1*03 "ij98 2,00 1383 S924 "1 1,97 5,09 1,94 1384 , 8218 ~4 3,06 6,01 3,93 1883 6857 T 2,02 5,10 2,88 1326 20 ~ 2t08 5,00 1f96 1345 ~7~ 2,06 _ 0,99 _ 4,98____1,96 1268 ΊΓ 2,07 4,99 2,94 1326 ΊΠ 3,13 6,00 3,89 1909 "ΐ(Γ~2~0Γ 4,53 "yiT 4,08 0.95 2,02 ~2^ÖÖ~ 0,98 3,95 1734 ~ 25 Esimerkki 11

Peptidien 1 ja 2 keuhkojen pinta-aktiivisen aineen arvioiminen

Synteettiset pinta-aktiiviset ainevalmisteet testattiin täysikasvuisten rottien keuhkomallilla (Ikegami et 30 ai., Pediatr. Res. 13 (1979) 777 - 780). Vertailunäyte I \ ja vertailunäyte II koostuivat DPPCrstä yksistään ja koi ran keuhkojen pinta-aktiivisesta aineesta, tässä järjestyksessä, ja niitä käytettiin vertailustandardeina. Kolme millilitraa sekä esimerkin 1 että 2 valmistetta testattiin 35 täysikasvuisen rotan keuhkomallilla. Esimerkkien 1 ja 2 20 95914 valmisteet palauttivat lähes täydellisesti rotan keuhko-toiminnan. Tulokset on kuvattu kaavioissa 1 ja 2.

Vertailunäyte I

Vertailumalli I valmistettiin seuraavasti. DPPC 5 hankittiin Avanti Polar Lipids'stä. 25 mg DPPD:tä kloroformissa kuivattiin typpivirrassa ja lyofilisoitiin orgaanisten liuotintähteiden poistamiseksi. Kuivaan lipi-diseokseen lisättiin 3 ml vettä. Valmistetta inkuboitiin 45 °C:ssa yksi tunti sonikoimalla samanaikaisesti ultraää-10 nihauteessa. Lipidi lyofilisoitiin, sitä säilytettiin 4 eC:ssa korkeintaan yksi viikko, ja se sekoitettiin 9 ml:n kanssa 0,9-%:ista NaClra, 20 mM HEPES-puskuria, pH 7,40. Kun vertailumailla I oli sekoitettu ajoittaisesti samalla, kun sitä inkuboitiin 45 eC:ssa tunnin ajan, se testattiin 15 täysikasvuisen rotan keuhkomallissa (kaavio la). Vertailunäyte I ei vaikuttanut parantavasti rotan keuhkojen toimintaan, ja se on tehoton keuhkojen pinta-aktiivisena aineena .

Vertailunäyte II

20 Vertailunäyte II valmistettiin seuraavasti. Koiran keuhkojen pinta-aktiivinen aine valmistettiin tunnetulla tavalla. Vertailunäyte palauttaa keuhkotilavuuden arvossa 5 cm vettä - > 75 % täydellisesti toimintakykyistä rotan keuhkoa.

*# «

Claims (12)

21 95914

1. Peptidijohdannaiset, tunnetut siitä, että niillä on kaava

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidijohdannainen, tunnettu siitä, että sillä on rakenne 35 Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2. 22 95914

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidijohdannainen, tunnettu siitä, että sillä on rakenne Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidijohdan- 5 nainen, tunnettu siitä, että sillä on rakenne Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidijohdan nainen, tunnettu siitä, että sillä on rakenne

5 X-Y-Z-Y' -Q jossa X on vety, aminohappo, dipeptidi tai tripeptidi, tai alifaattinen, aromaattinen tai syklinen orgaaninen happo, jossa on 1 - 10 hiiliatomia; 10. ja Y' ovat kumpikin itsenäisesti sidos tai -(Ser)n~, jossa n on kokonaisluku 1-3; Q on hydroksi-, amino-, alkyyliamino- tai alkoksi- ryhmä; Z on peptiditähde, jossa on 8 - 17 aminohappoa, ja 15 se koostuu aminohappojärjestyksen —Aj—A2~A3_A^—Aj—Ag—A?—Ag—Aj—Aiq—A11~“A2 1 — A3 — A4 — A» I * * . A » __ Λ t «A » 1 .Ä 1 I _Ä ··—Δ » » - Δ Ä 1 f - 6 **7 **8 Λ10 Λ11 Λ1 λ2 λ3 λ4 λ5 λ6 At » _ a » » _Δ ft—Ä M 1 -Δ * · · . 7 λ8 λ9 λ10 λ11 λ1 λ2 : omaavan oligomeerin fragmentista, joka voi alkaa millä 20 tahansa aminohappotähteistä Ax - Au, jolloin ΑΔ » Δ 1 1 A t f ? A Δ 1 Ali Δ Ä* ia Ά f · 1 / Λ1 / Λ1 / Λ1 / λ4 r λ4 r λ4 ' Λ8 / Λβ Jα Λ8 ovat kukin itsenäisesti hydrofiilinen aminohappo Glu tai Asp, Aa * a*· a ι ι i a a» aff a a1 a|f a 2/ λ2 / Λ2 / n2 / λ3 t λ3 ' λ3 / λ6# λ6 ' Λ6 / Λ7 * 25 Α7', Α7'', Αιο, Α10' ja Α10'' ovat kukin itsenäisesti lipofii- linen aminohappo Leu, Ala, Vai, Phe tai Tyr; As, Ag', Α,'', AX1, Au' ja An' ' ovat kukin itsenäisesti emäksinen aminohappo Lys tai Arg; A,, A9' ja A,’' ovat kukin itsenäisesti emäksinen 30 aminohappo Trp, Lys, Phe, Ala tai Trp(For), jolloin X, Y, Y' ja Z merkitsevät yhdessä alle 18 aminohappoa sisältävää peptidiä, ja niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidijohdan nainen, tunnettu siitä, että sillä on rakenne Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidijohdan- 15 nainen, tunnettu siitä, että sillä on rakenne Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidijohdan nainen, tunnettu siitä, että sillä on rakenne . Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidijohdan nainen, tunnettu siitä, että sillä on rakenne Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NHj.

10. Menetelmä peptidijohdannaisen valmistamiseksi, 25 jolla on kaava X-Y-Z-Y' -Q jossa X on vety, aminohappo, dipeptidi tai tripeptidi, tai alifaattinen, aromaattinen tai syklinen orgaaninen 30 happo, jossa on 1 - 10 hiiliatomia; . Y ja Y' ovat kumpikin itsenäisesti sidos tai -(Ser)n-, jossa n on kokonaisluku 1-3; Q on hydroksi-, amino-, alkyyliamino- tai alkoksi- ryhmä; 35 23 95914 Z on peptiditähde, jossa on 8 - 17 aminohappoa, ja koostuu aminohappoj är j estyksen —A^ A7 A^—A^—A^ A^ A7—Ag—A7 A^ q ^iiA^ *"A^ ""A3 ~*A^ A5 Ai _ λ i _* i _ n » _a i_» ' _ a 1 l.j '*_Ä ’’-A 1 1 _a ''-A ' ' - 6 ^7 rta λ9 λ10 λ11 nl rt2 λ3 V4 λ5 λ6 5 a ’ ' -A ' ' -A · * _A * ' -A ' ' -A 1 1 1 -A ' ' ' _ Λ 7 Λβ λ9 λ10 λ11 η1 η2 omaavan oligomeerin fragmentista, joka voi alkaa millä tahansa aminohappotähteistä hx - Au, jolloin Aa' a*' a''' a a’ a'1 a a' s» a »* 1. r Λχ / Λ1 / r «4 / Λ31 «j J β Λβ ovat kukin itsenäisesti hydrofiilinen aminohappo Glu tai 10 Asp, AA * A » ' A 1 ’ * A A1 A1* A A1 A 1 * A 2 9 λ2 ' λ2 ' ft2 9 λ3 9 λ3 9 λ3 9 Λ69 **6 ' ^*6 / ^»7 r A7' , A7' ', Al0, A10' ja A10' ' ovat kukin itsenäisesti lipofii-linen aminohappo Leu, Ala, Vai, Phe tai Tyr; As, A5', A5' ', Au, Au' ja A11’’ ovat kukin itsenäi-15 sesti emäksinen aminohappo Lys tai Arg; A9, Ag' ja A,' ' ovat kukin itsenäisesti emäksinen aminohappo Trp, Lys, Phe, Ala tai Trp(For), jolloin X, Y, Y' ja Z merkitsevät yhdessä alle 18 aminohappoa sisältävää • # '· peptidiä, tai sen fysiologisesti hyväksyttävän suolan val-20 mistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään pe- räkkäis- tai segmenttikiinteäfaasisynteesiä tai näiden yhdistelmää.

10 Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sidotaan sopivasti suojattu • < 25 aminohappo, joka vastaa aminoterminaalista aminohappoa, aktivoituun hartsialustaan, ja tämän jälkeen sidotaan toiset α-aminosuojatut aminohapot järjestyksessä aminopäästä karboksipäähän kasvavan peptidiketjun terminaaliseen ami-noryhmään, ja ketjusta samanaikaisesti poistetaan sen ami-30 nosuojaryhmä- ...

12. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten peptidijohdan naisten tai sen fysiologisesti hyväksyttävän suolan käyttö valmistettaessa farmaseuttisia koostumuksia, joilla hoidetaan RDS:ää. 24 95914