PT91027B - Processo para a preparacao de derivados peptidicos - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS PEPTÍDICOS

Ãmbi to da Invenção

A presente invenção refere-se ã síntese de uma serie de polipêptidos cuja sequência não está relacionada com as sequências das proteínas no agente tensioactivo do pulmão dos mamíferos, ã preparação de misturas destes polipêtidos com lípidos, ao processo para a sua produção e ãs composições farmacêuticas que sejam eficazes no tratamento do sindroma da angustia respiratória dos mamíferos.

Antecedentes da Invenção sindroma da angustia respiratória infantil (SAR) e uma das causas principais de morte nos primeiros 28 dias de vida. Atinge um em cada 100 bêbes em todo o mundo morrendo cerca de 10%.

sindroma raramente ocorre em crianças desenvolvidas no prazo normal, encontrando-se geralmente associado à imaturidade e aos nacituros de fraco peso (menos de 2 Kg). 0 SAR dos adultos apresenta uma patofi si ol ogi a e caracterís ti cas clínicas idênticas ãs da Ho ença infantil e ê tratado na instalação de cuidados intensivos por um processo idêntico. A doença nos adultos possui diversas etiologias e resulta de diversos danos pulmonares tais como as infecções difusas, aspiração de conteúdo gástrico ou de ãgua , inalação de produtos irritantes e de toxinas e do edema pulmonar que advêm de fontes tais como as sobredoses de narcóticos. 0 SAR

-2estã correiacionado com a ausência ou disfunção do agente tensioactivo do pulmão, o qual reveste os alvéolos dos pulmões onde se da a troca gasosa.

agente tensioactivo pulmonar e constituído essencialmen te por lípidos (90%) e contêm uma quantidade menor de diversas proteínas (10%). 0 tipo de lípido principal ê um fosfolípido que representa 97% do lípido. Deste fosfoliDido 80% e fosfatidi1-c£ ina (PC) e 10% e fosfatidi1-glicerol (PG). Das cadeias acílicas dos fosfolípidos 70-80% são saturadas e 85-90% possui uma extensão de 16 ãtomos de carbono. 0 lípido principal e dipalmitoil-fosfatidi1-colina (DPPC). 0 componente proteico do agente tensioactivo pulmonar ê também heterogéneo mas caracterizado mais fracamente. A proteína principal e de aproximadamente 32Kd e a sua sequência foi prevista a partir do seu cADN (White et al., Nature, 317, 1985, 361-363) e foi clonada (Floros, et al., Journal of Biological Chemístry, 260, 1985, 495-5Q0). Também foram isoladas proteínas menores de mais fraco peso molecular tendo sj_ do descritas diversas sequências (Warr, et al. Proceedings of the Nhtional Academy of Sciences USA, 82, 1987, 7915-7919); G1 a£ ser, et al., Journal of Biological Chemístry, 263, 1988, 9; Johans^ son, et al., FEBS Letter$. , 232, 1988, 61-64; Glasser, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84, 1987, 4007; Revak, et al., Journal of Clinicai Inves ti gati on , 81 , 1988, 826-833).

SAR infantil tem sido tratado com produtos de lavagem de pulmões de animais (Smith et al.,, Pediatrics, 71, 1983, 913-917; McCord, et al., Arch. Dis. Child, 63, 1988, 10-16) e com o

-3agente tensioactivo pulmonar humano obtido a partir do fluido amniõtico humano (Hallman, et al., Pedi atri cs, 71 , 1983, 473-482 ;

J. P e d i a t r., 106, 963-969 ; Merritt, et al., N. Engl. J. Med. 13, 1986, 785-790), com um sucesso considerável. Os produtos de lavagem dos pulmões das vacas extraídos com dissolventes orgânicos e misturados com lípidos sintéticos são também eficazes fFujiwara, et al., Lancet, I , 1 980 , 55-59 ; Noach, et al., Eur. J. Resp.

Dis., 69 , 1986 , 321 -335 ; Kwong, et al., Pedi atri cs, 76 , 1985 , 585592; Enhoring, et al . , Pedi atri cs, 76 , 1985 , 1 45-153; Shapiro , et al., Pediatrics, 76, 1985 , 593-599 ; Gitlin, et al., Pedi atrics, 79, 1987 , 31-37; Raju, et al., Lancet, 1 , 1987, 651-656 ; Haj_ liday, et al , Lancet, 1 , 1984, 476-478). Todavia, ainda não se demonstrou consistentemente que as misturas sintéticas fossem activas (Morley et al., Lancet, 1, 1981 , 64-68; Ten Center Study Group, Br. Med. J., 294, 1987, 991-996 ; Milner et al., Arch. Dis. Child, , 58, 1983, 458-460; Milner et al., ibid, 59, 1983, 369-371; e Wilkinson et al., Lancet, 2, 1985, 287-291). Apenas temos conhecimento de um único estudo clínico utilizando agentes tensioactivos para o SAR nos adultos fLochman, et al., Adv. Exp. Med. Biol., 222, 1988, 511-517), e o valor potencial dessa terapia encontra-se descrito na literatura (van Golde et al., Phys i ol . Rev. , 68, 374-355).

A preparação preferida de agente tensioactivo pulmonar é constituída por componentes completamente definidos. Uma vez que apenas foi observado um sucesso limitado com misturas de líoidos puros, admite-se que seja necessário um componente proteico do agente tensioactivo pulmonar. Uma abordagem consiste em utilizar proteínas concebidas pela engenharia genética com consequências

-4baseadas nas sequências de aminoácidos orevisíveis a partir do cADN das proteinas tensioactivas pulmonares. Um processo alternativo, o qual constitui o objectivo da presente invenção, consiste em sintetizar peptidos com propriedades físicas adequadas a função do agente tqnsioactivo pulmonar quando em combinação com componentes 1ipídicos definidos, mas com sequências não relacionadas com as sequências das proteínas isoladas a partir do agente tensioactivo pulmonar.

A presente invenção estã amplamente relacionada cora as composições de agentes tensioactivos pulmonares sintéticas e mais especificamente com composições tensioactivas constituídas por uma mistura de polipeptidos sintéticos e de lípidos, eficazes pa_ ra o tratamento do SAR. Os polipeptidos sintéticos possuem sequ ências únicas que não se encontrara nas sequências das proteínas dos mamíferos isoladas a partir dos produtos de lavagem dos pulmões. Os polipeptidos podem ser utilizados isoladamente em misturas com lípidos ou em combinação em misturas de lípidos. 0 p£ lipeptido constitui um componente menor da mistura tensioactiva.

A composição química da presente invenção ê nova no que diz respeito ao componente peptídico e a associação desses peot_£ dos com lípidos num agente tensioactivo pulmonar sintético, o qual é medicinalmente eficaz para o tratamento do síndroma da ajn gústia respiratõria. A composição da presente invenção oode ser preparada com elevado grau de pureza e por um processo normaliz^a do uma vez que se trata de uma mistura definida de comoonentes sintéticos. Refere-se ainda o facto de os componentes não derivarem de fontes animais, o que minimiza o risco de contaminação

-5por virus e por bactérias. Refere-se ainda o facto de os componentes serem do tipo biológico e o facto de as vias metabólicas se encontrarem disponíveis nos mamíferos para a eventual eliminação dos componentes da mistura. Refere-se finalmente o facto de não se introduzirem moléculas não biológicas.

Breve Descrição dos Desenhos

Em relação aos desenhos temos:

A FIG. 1 representa uma curva pressão/volume para as referências I e II no modelo de pulmão do rato adulto.

A FIG. 2 representa uma curva pressão/volume demonstrando a eficácia dos Exemplos 1 e 2 no modelo de pulmão de rato aduj to.

Sumario da Invenção

Considera-se um agente tensioactivo pulmonar sintético constituído por um complexo de um polipeptido e de lípídos em que o polipeptido possui a seguinte formula geral

Χ-Υ-Ζ-Υ'-Q 1 na qual

X representa um atomo de hidrogénio, um grupo alquilo

C-|-Cg, ou um grupo acilo Cz-C·^;

-6Y e Y¹ representam, cada um, independentemente , uma ligação ou um radical de formula geral -(Ser)_n na qual n representa um numero inteiro compreendjk do entre 1 e 3;

Q representa um grupo hidróxi, amino, alquilamino ou a 1coxi ;

Z representa um resto peptídico com 8 a 25 ;aminoãcidos, constituído por um fragmento do oligÕmero que possui a sequência

-Al-A2·A3-A4-A5-A6A7-A8-A9·Alo-All-Al’-A2^,·A3^,-A4^,·A5^,·A6^,· Α7’·Α8’-Α9’-Αιο’-Αιι’-ΑΓ.Α2”-Α3”·Α4”·Α5”-Αβ”-Α7”-Α8”·Α9”Αιο”-Αι Γ- A i^m-A2’”e que pode começar com qualquer dos restos aminoácidos ^A1 '^A1T ι ι ₍ em que os restos A_] , A_] , A^', A^', A₄ , , λ ,

Αθ, ^A8*’ ^{e A}8 representam cada um, independent£ mente, um radical escolhido no grupo de aminoãci_ dos hidrofílicos, constituído por Glu, Asp, Ala, Gin, Asn, Gly, Ser, Thr, Lys, Arg, Orn e hArg;.

os restos A?, A₂', A₂, A₂'

II

-7Ag , Ag , Ay, * A ί q * AjQ ® A -j q re p re s 6 n tam, cada um, independentemente, am radical escolhido no grupo de aminoácidos lipofTlicos const^ tuído por Leu, Nle, Met, Ala, Vai, Phe, Nva, Ile e Tyr;

os restos Ag, Ag', Ag, A^, A^' e A^ represeji tam, cada um, independentemente, am radical escolhido no grupo de aminoácidos básicos, constituído por Lys, Orn, Arg, hArg;

os res tos'Ag , - Ag¹ , Ag, representam, cada um, iri dependentemente, um radical escohHdo no grapo de aminoácidos lipofTlicos neutros ou básicos constj_ tuTdo por Leu, Nle, Met, Ala, Vál, Phe, Nva, He, Tyr, Thr, Ser, Gin, Asn, Gly, Lys, Arg, hArg, Trp, Orn, Trp(For), ou um seu sal farmacêuticamente aceitável, e em que o lTpido e constituído por um ou vários dos do tiDO associado com o agente tensioactivo pulmonar natural.

Estes complexos polipeptido/1ípido e as suas composições farmacêuticas são úteis para o tratamento do sindroma da angústia respiratoria.nos mamíferos.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Em toda a presente memória descritiva utiliza-se as se-8-

guintes abreviaturas	comuns para os aminoácidos de ocorrência na
tural:

Ala ou A	• alanina
Vai ou V	• valina
Leu ou L	leucina
Ile ou I	• isoleucina
Phe ou F	• fenil-alanina
Trp ou W	triptofano
Met ou M	• metionina
Ser ou S	serina
Tyr ou Y	tirosina
Asp ou D	acido aspártico
Glu ou E	ácido glutáintco
Lys ou K	lisina
Arg ou R	arginina
Nle	norleuci na

-9Orn - orni ti na hArg - homoarginina

Nva - norvalina

Trp(For) - ⁿ-formi1-Trp

Os aminoácidos naturais, com excepçao da glicina, tem um átomo de carbono quirálico. Salvo indicação em contrario, os am_T noãcidos opticamente activos agora referidos encontram-se na configuração L. Tal como é vulgar, a estrutura dos· pepttdos adiante descrita ê tal que a extremidade amino-termi nal se encontra no la^ do esquerdo da cadeia e a extremidade carboxi-terminal se encontra do lado direito da cadeia.

Alguns polipeptidos de formula geral 1 são preferidos no método de tratamento do síndroma da angustia respiratória da presente invenção. São preferidos os polipeptidos de fórmula geral 1 na qual pelo menos um de Ap A^¹ , A-|, e Ai' representa um radical Glu; em que pelo menos um de A^, A^* e A^ representa um radical Glu; e em que pelo menos um de Αθ, Αθ’ e Αθ representa um radical Glu. Também são preferidos os polipeptidos de fórm£ la geral 1 na qual pelo menos um de Ag, Ag‘, Ag, e Ag' represer^ ta um radical Leu; em que pelo menos um de Ag, Ag', e Ag representa um radical Leu; em que pelo menos um de Ag, Ag' , e Ag representa um radical Leu; em que pelo menos um de Ay, Ay', e Ay representa um radical Leu; e em que pelo menos um de A^, Α^θ' , e Αιθ representa um radical Leu. Também são preferidos os· po-101ipeptidos de formula geral 1 em que pelo menos um de A^, A^¹ e A representa um radical Lys; em que pelo menos um de Ag, Ag', e Ag representa um radical Phe; e em que pelo menos um de A^,

A i -j ' , e Αη-j representa um radical Lys. Adi ci onal mente a Requerente prefere os polipeptidos de formula geral 1 em que Q representa um grupo amino.

Os polipeptidos da presente invenção podem ser preparados de acordo com vários procedimento facilmente conhecidos pelos especialistas na matéria. Esses procedimentos englobam as sínteses de blocos e sequencial em fase solida, a clonagem de ge nes e combinações destas técnicas. 0 procedimento sequencial em fase sólida pode ser realizado utilizando métodos automáticos co nhecidos, tais como a utilização do sintetizador de peptidos ABI. De acordo com este procedimento, liga-se um aminoácido protegido na posição amino a um suporte de resina. 0 suporte de resina utilizado pode ser qualquer resina adequada utilizada convencionalmente na especialidade para a preparação de polipeptidos em fase sólida, de preferência polistireno, que tenha sido reticulada com uma quantidade compreendida entre 0,5 e 3% de divi ni 1-benzeno ,que tenha sido clorometilado ou hidroximetilado oara proporcionar sí tios para a formação de éster com o aminoácido protegido na posj. ção Qt-aminoi nicialmente introduzido.

Um exemplo de uma resina hi droxi metil i ca foi descrito por Bodanszky et al. Chem. Ind, ÇLondon), 38, 1966, 1597-98. Encoji tra-se comercialmente disponível uma resina clorometi 1ada fornecida por Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia e a prepa^ ração dessa resina foi descrita por Stuart, et al., Solid Phase

-11Peptide Synthesis, San Francisco, Freeman & Co,, 1969, Capítulo 1, pp. 1-6. 0 aminoãcido protegido pode ser ligado 5 resina de acordo com o procedimento de Gisin, Helv. Chem, Ac ta,,56 , 1 973 , 1476. Encontram-se comercialmente disponíveis muitos aminoacidos protegidos ligados a resina. A título de exemplo, Dara se preparar um polipeptido da presente invenção em que a extremidade do terminal carboxi é um resíduo Thr, pode utilizar-se um resíduo Thr protegido por tert-buti1oxi-carboni1 o (Soc] ligado a uma resina de feni1-acetamido-meti1 o (PAM] benzilada e hidroxime tilada, encontrando-se comereialmente disponível.

Apõs o acoplamento do aminoãcido protegido na posição ^ó-amino ao suporte de resina, reraove-se o grupo protector util_i_ zando qualquer procedimento adequado, por exemplo, utilizando acido trif1uoroacético em cloreto de metileno, ãcido trifluoroacêtico isolado ou ãcido clorídrico em dioxano. A desprotecção efectua-se a uma temperatura compreendida entre 0°C e a temperatura ambiente. E possível utilizar outras condições e reagentes de clivagem normalizados para a remoção de grupos de protecção

-arai no específicos. Apõs a remoção do grupo protector do gru po C<-amino, os outros aminoãcidos com o grupo amino protegido são acoplados passo a passo pela ordem desejada. Em alternativa, e possível acoplar grupos de aminoãcidos múltiplos pelo método de solução antes do acoplamento a sequência de aminoãcido suportado por resina.

grupo protector do grupo ^-ami no utilizado com cada amj_ noãcido introduzido na sequência polipeptídica pode ser qualquer grupo protector conhecido na especialidade. Entre as classes de

-12grupos protectores do grupo ^-amino contemplados temos (1) grupos protectores do tipo acilo tais como: formilo, trifluoroace tilo, ftalilo, tolueno-sulfoni1 o (tosilo), benzi 1o-$ulfoni1 o , nj_ tro-feni1-sulfenilo, triti 1-sulfeni1 o, o-nitro-fenoxi-acetilo e ^-cl oro-buti ri 1 o ; (2) grupos protectores do tipo uretano aromático tais como benziloxi-carbonilo e benziloxi-carbonilo substituído, por exemplo, jp-cloro-benzi 1 oxi-carboni 1 o , £-nitro-benzilo xi-carboni1 o , £-bromo-benzi 1oxi-carboni1 o, £-metoxi-benzi 1oxi-ca£ boni 1 ο, 1 - (£-bi feni 1) -1 -meti 1 -etoxi - carboni 1 ο dimeti 1 - 3,5-di metoxi-benzi 1oxi-carboni1 o e benzidriloxi-carbonilo; f3) grupos protectores uretano alifáticos tais como tert-butiloxi-carboni1 o (Boc), diisopropi1-metoxi-carboni1 o, isopropiloxi-carbonilo, etoxi-carboni1 o e ali1oxi-carboni1 o; (4) grupos protectores do tipo cicloalqui1-uretano, tais coroo ciclopenti1oxt-carbont1 o , ad£ manti1oxi-carboni1 o e ciclo-hexi1oxt-carboni1 o; f5) grupos prote£ tores do tipo tio-uretano tais como feni1-tio-carbonilo; (6) gr£ pos protectores do tipo alquilo tais como trifeni1-meti 1 o (trit£ lo) e benzilo; (7) grupos tri a Iqui 1-s i 1 ano tais como trimetil-s_T lano. 0 grupo protector do grupo &<-amino preferido é tert-buti_

1oxi-carboni1 o.

A escolha de um reagente de acoplamento apropriado e da competência de um especialista na matéria. Um reagente de acoplamento particularmente adequado em que o aminoácido se adiciona é Gin, Asp ou Arg é a N,N’-diisopropi1-carbodiimida e o 1-hidroxi-benzotriazol. A utilização deste reagente evita a formação de nitrilo e de lactama. Os outros agentes de acoDlamento são (1) carbodiimi das (por exemplo, N,N¹-diciclo-hexi1-carbodiimida e N-e ti 1-N ¹ - ()r-di me ti 1 ami no-propi 1 - ca rbodi imi da ) ; (2) cianamidas

-13(por exemplo Ν,Ν-dibenzi1-cianamida) ; [3] ceteniminas; (4) sais de isoxazõlio (por exemplo, isoxazõli0-3'-salfonato de N-etil-5-fenilo; (5) amidas heterocíclicas de caracter aromático conteji do azoto monocíclico, designadamente entre um e quatro átomos de azoto no anel, tais como as imidazo1idas , pirazolidas e 1, 2,4-triazolidas. As amidas heterocíclicas específicas úteis englobam N ,N '-carboni1-diimidazol e N,N'-carboni1-di-1,2,4-triazol;

(6) acetileno alcoxilado (por exemplo, etoxi-acetileno); (7) re£ gentes que formem ura anidrido misto com o radical carboxilo do aminoácido (por exemplo, cloroforroato de etilo e cloroformato de isobutilo) ou que formem um anidrido simétrico do aminoácido que se pretende acoplar /por exemplo, fBoc-Arg)2Q7 ^e C⁸I compostos heterocíclicos contendo azoto, que possuam um grupo hidroxi ligado a um dos átomos de azoto do anel (por exemplo, N^hidroxi-ftalimida, N-hidroxi-succinimida e 1-hidroxi-benzotriazol). Fo rara descritos outros reagentes activadores e a sua utilização no acoplamento de peptidos por Kapoor, J. Pharm. Sei,, 59, 197Q, pp. 1-27. A Requerente prefere a utilização de anidrido siraétrf co como reagente de acoplamento.

Cada aminoácido protegido ou cada sequência de aminoãci_ dos é introduzido no reactor de fase solida numa quantidade apro ximadamente quatro vezes em excesso e efectua-se o acoplamento num meio constituído por uma mistura de dimeti1formamida/cloreto de metileno a 1:1 ou constituído apenas por dimetilformamida ou, de preferência, constituído apenas por cloreto de metileno. Nos casos em que ocorra um acoplamento incompleto, repete-se o proce dimento de acoplamento antes da remoção do grupo protector do gru po O(.-amino, e antes também do acoplamento do aminoácido seguin-14te no reactor de fase solida. 0 sucesso da reacçao de acoplamejn to em cada fase de síntese e controlado pela reacção de ninidrina conforme descrito por E. Kaiser et al., Analyt. Biochem., 34,

1970, 595.

Depois de se ter obtido a desejada sequência de aminoScj dos remove-se o peptido da resina. Isto pode ser feito oor meta^ nolise, por exemplo, tratando o oolipeptido ligado ã resina com uma solução de sulfureto de dimetilo, £-cresol e tiocresol em acido fluorídrico diluído com agua.

Conforme se sabe na especialidade da síntese de peptidos em fase solida, muitos dos aminoácidos comportam grupos funcionais que exigem protecção durante a preparação da cadeia. A ott lização e escolha do grupo protector apropriado ê da competência de um especialista na matéria e dependera do aminoácido que se pretende proteger e da presença de outros resíduos a-minoãcídos protegidos no peptido. A escolha desse grupo protector de cadeia lateral e crítica uma vez que ele não deve ser removido por:clivagem durante a reacção de clivagem do grupo protector do radical ^í-amino. Por exemplo, os grupos protectores de cadeia lateral adequados para a lisina são benziloxi-carbonilo e benzi 1oxi-carbonilo substituído, sendo o referido substituinte escolhido entre Stomos de halogéneo CP^or exemplo, cloro, bromo ou fluor( e grupos nitro (por exemplo, 2-cloro-benzi1oxi-carboni1 o, £-nitro-benzil£ xi-carboni1 o, 3,4-dicl oro-benzi1oxi-carboni1 o), tosilo, _t-amiloxi-carboni 1 o, _t-buti 1 oxi-carboni 1 o e diisopropi1-metoxi-carbonilo. 0 grupo hidroxilo alcoólico da treonina e da serina pode ser protegido com um grupo acetilo, benzoilo, tert-butilo, tritilo ,

-15benzilo, 2,6-dicloro-benzi1 ο oa benzi 1oxi-carboni1 o . 0 grupo pr£ tector preferido e o benzilo.

Estes grupos são removidos de acordo com procedimentos bem conhecidos na especialidade. Tipicamente, faz-se a remoção dos grupos de protecção depois de estar completa a síntese da ca_ deia peptídica, mas os grupos de protecção podem ser removidos em qualquer outro momento apropriado.

Os polipeptidos de formula geral 1 podem formar sais far maceuticamente aceitáveis com quaisquer ácidos orgânicos- ou tnoj* ganicos não tóxicos. Os exemplos ilustrativos de ácidos inorgânicos que formam sais adequados englobam os ácidos clorídrico , bromídrico, sulfórico e fosfórico e sais de metais- ácidos tais como o ortofosfato de mono-hidrogênio e sodio e o sulfato de hidrogénio e potássio. Os exemplos ilustrativos de ácidos- orgânicos que formara sais adequados englobam os ácidos mono-, di- e tri-carboxí1icos. São exemplos ilustrativos desses ácidos, por exemplo, os ácidos acético, glteõltco, láctico, pirúvico, malÓnj. co, succínico, glutarico, fumárico, malico, tartãrico, cítrico , ascõrbico, maleico, hidroximaleico, benzõico, hidroxibenzoico , feni1acetico, cinâmico, saltcílico, 2-fenoxi-benzoico e sulfÕnico e ácidos sulfonicos tais como o acido metano-s-ul fónico e o ãc_t do 2-hidroxi-etano-sulfõnico. Qs sais do radical aminoacido do terminal carboxi englobam os sais de ácidos carboxílicos nao tÕ xicos formados com quaisquer bases inorgânicas ou orgânicas adequadas. Os exemplos ilustrativos desses sais- englobam os de metais alcalinos, por exemplo, sódio e potássio; os de metais alc£

1ino-terrosos, tais como o cálcio e o magnésio; os de metais le-16ves do grupo IIIA incluindo o alumínio; e os de aminas Drimãrias, secundarias e terciárias orgânicas, por exemolo as tria 1qui1aminas incluindo a trietilamina , procaína, di benzi 1ami na, 1-etenamina, Ν,Ν'-dibenzil-etilenodiamina, di-hidro-abietilamina, N- (a 1 quil inferior)-piperidina e qualquer outra amina adequada.

Os fosfolípidos dos complexos oroteína/fosfolípido da pr£ sente invenção podem ser quaisquer fosfolípidos e utiliza-se este termo para significar fosfoglicéridos e esfingolípidos. Os fosfoglicéridos são os ésteres de glicerol de diacidos gordos nos· quais o grupo hidroxi restante, um grupo hidroxi terminal, do r_a dical glicerol forma um éster com o acido fosfórico. Normalmente, o radical acido fosfórico dos fosfoglicéridos formam um segu;i do éster com um álcool, tal como etanolamina, serina, colina ou glicerol. Os esfingolípidos são os ésteres de esfingosina ou de di-hidroesfingosina de monoãcidos gordos, nos quais o grupo hidr£ xi na posição 1 forma um éster com o ester colina do ácido fosfó rico. Os lípidos preferidos dos complexos proteína/fosfolípidos da presente invenção englobam dipalmitoi1-fosfatidtlcolina (DPPC), moléculas de fos fati di 1-col i na contendo cadeias- acilo de outros comprimentos e graus de saturação (PC), cardiolipina ÇCL), fosf£ tidi1-glicerois (PG), fosfatidi1-serinas fPSJ, ácidos gordos (FA) ou (AG) e triaci1-gliceróis (TG). A DPPC incorpora um componente principal da mistura tensioactiva pulmonar ao passo que os compostos PC, CL, PG, PS, FA e TG incorooram componentes menores. Os ácidos gordos adequados para utilização nos fosfolípidos- da presente invenção são os ácidos carboxílicos de cadeia longa fcom geralmente oito ou mais átomos de carbono), tipicamente não ramj ficados. Os ácidos gordos podem ser saturados ou insaturados .

-17Os exemplos representa ti vos de ácidos grdos são os ácidos laurico, mirístico, palmítico e oleico.

E possível preparar as composições farmacêuticas de complexos de proteína/fosfolíptdos da presente invenção sob a forma de uma mistura seca ou de uma suspensão aquosa, contendo em alguns casos pequenas quantidadds de dissolventes orgânicos tais como, por exemplo, etanol ou trif1uoro-etanol, detergentes tais como, por exemplo, dodeci1 sul fato de sódio ou desoxicolato de sõ dio, sais como o cloreto de cálcio ou o cloreto de sodio, hidratos de carbono como a glucose, dextrose ou manitol, e aminoácidos como a glicina e a alanina. Quando a composição farmacêutica for preparada numa forma líquida, pode adicionar-se estabilizadores, conservantes, reguladores da pressão osmótica, agentes tampão e agentes de suspensão. Se desejado também se pode adicionar gerraicidas adequados. 0 pH de suspensão aquosa pode variar entre 2 e 10 e pode ser ajustado com ácidos e com bases tais como, por exemplo, ãcido clorídrico, fosfato de sódio ou hidróxido de sódio. A mistura seca pode ser reconstituída numa solução aquosa contendo sais farmaceuticamente aceitáveis, dissolventes orgânicos e detergentes. A preparação aquosa pode ser submetida a diã lise, filtração ou cromatografia para permutar o meio de suspensão com um meio farmaceuticamente aceitável, antes da utilização. A preparação pode ser administrada como põ seco, como suspensão aquosa ou como aerossol, directamente sobre os pulmões do pacieji te angustiado. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser embalada em recipientes vedados hermeticamente tais como frascos e ampolas, conservando-se por esterilização. A comp£ sição pode ser armazenada num frasco ou numa ampola separadamen-18te de outro frasco ou ampola contendo o tampão de suspensão, podendo a composição seca ou hidratada ser misturada com o tampão de suspensão antes da utilização.

Os lípidos constituem entre 50 e 99,9% da preparação te_n sioactiva pulmonar. Os lTpidos adequados englobam DPPC, PC, CL,

PG, PS, FA e TG. A DPPC incorpora a espécie iTpidica principal e encontra-se presente em concentrações compreendidas entre 60 e 100 % do peso total de lTpidos. Os lTpidos restantes encontram»se presentes em concentrações menores. As PC, CL, PG e PS podem constituir ate 30% dos lTpidos e os FA e TG podem constituirate 10% do peso dos lTpidos. As cadeias acTlicas gordas dos com ponentes ITpTdicos secundãrios podem ser saturadas ou insaturadas e ter qualquer comprimento. São preferidas as cadeias com o· compri mento de 12 a 16 átomos de carbono e possuindo ate ligações insaturadas. A composição lipTdica preferida e constituTda por 85-100 % de DPPC mais 0-15% de PG.

Os componentes lipTdicos do agente tensio-activo pulmonar sintético encontram-se normalmente no agente tensioactivo pulmonar de mamTferos encontrando-se disponTveis, com elevado grau de pureza, a partir de fontes Industriais vulgares. Os componentes polipeptTdicos são preparados por sTntese neptTdica em fase sõli_ da por processos familiares aos especialistas na matéria. Tem sido utilizadas sequências idênticas às sequências dos oolipepti_ dos da nresente invenção como modelos para a região de ligação 15pídica de apo1ipoproteTnas do plasma, mas não tem sido utilizadas em preparações de agente tens i oa<~ti «o pulmonar sintético . Demonstrou-se que misturas de lípidos da presente invenção com

-19proteínas isoladas a partir de produtos da lavagem dos Dulmões de mamíferos são eficazes para o tratamento do SAR neonatal·.· To davia, nunca foram descritas as misturas destes lípido* com oeD tidos sintéticos em preparações tensioactivas pulmonares.

Os lípidos são misturados com um dissolvente orgânico vo lãtíl ou com misturas de dissolventes, por exemplo, misturas de cloroformio e de metanol. Elimina-se o dissolvente orgânico por evaporação sob atmosfera de azoto, argon ou sob vazio. Adiciona-se ã mistura lipídica seca uma solução aquosa que possa conter ácidos, bases e sais orgânicos e inorgânicos e sacaridos tais como a dextrose, até se atingir uma concentração final compreendida entre 0,1 e 100 mg de DPPC nor mililitro. Em geral, ê preferível, mas não é necessário, aquecer a mistura a uma temperatura compreendida entre 35° e 50°C misturar vigorosamente e incubã-la durante 2 h£ ras a 25-50°C. Depois, adiciona-se o peptido ou a mistura de pe£ tidos sob a forma de po seco ou em suspensão numa solução aquosa, contendo em alguns casos um dissolvente orgânico adequado, por exemplo, etanol ou trif1uoroetanol, ou um agente de desnaturação tal como o cloridrato de guanidínio ou ureia, o qual melhora a solubilidade do peptido na suspensão aquosa. A associação do pe£ tido e do lípido node ser conseguida para um determinado valor de pH, podendo esse valor de pH da solução aquosa estar compree£ dido entre 2 e 10. 0 método preferido para misturar o peptido e o lípido consiste em adicionar o peptido seco ao lípido em ãgua, a uma temperatura compreendida entre 45° e 50°C e proceder ã mi£ tura em ambiente de ultra-sons ã temperatura de 45° a 50°c dura£ te 30 a 90 minutos e depois liofilisar e armazenar ã temperatura de -20°C.

-2QMistura-se os lípidos com um detergente adequado tal como octil-glicõsido ou desozi col ato de sódio numa prooorção em pe*o compreendida entre 1 e 20 partes de detergente por parte de DPPC em água, em tampão aquoso ou em solução salina em concentrações com preendidas entre 1 e 100 mg de DPPC/ml. Depois adiciona-se n pep. pt.ido sob a forma de po seco ou em suspensão numa solução aquosa com ou sem um dissolvente orgânico, agente de desnaturação ou detergente* Depois submete-se a mistura a dialise, filtração , centrifugação ou cromatografia para se remover o detergente.

Em alternativa, mistura-se os lípidos e os péptidos num dissolvente orgânico vnlãtil com ou sem uma pequena quantidade de agua. Evapora-se o solvente vnlãtil sob uma corrente de azoto ou de ãrgon, numa estufa sob vazio, ou por evaporação rotativa antes ou apos a adição de um dissolvente aauoso.

A mistura de lípidos e de péptidos nreparada de acordo com um dos processos anteriormente descritos é incubada durante o roãximo de 2 horas, de preferência a uma temperatura compreendj_ da entre 35° e 50°C com irradiação de ultra-sons. A mistura pode ser depois submetida a dialise- filtração ou cromatograf 1 a pa^ ra substituir o meio aquoso por »m meio farmaceuticamente aceitã vel, embora isto não seia necessário. Em alguns casos, aumenta-se a eficiência separando do lípido e do peptido associados o lípido ou o peptido que não reagiu, utilizando meios de ultrace^ trifugaçãn, filtração ou cromatografia. Depois a mistura node ser liofilizada ou preparada sob a forma de aerossol.

Os complexos de polip^pptido/fos foiípido d? presente inven.

-21ção podem ser utilizados para o tratamento do sindroma da angustia respiratória neonatal, que e um estado fisiológico que resuj_ ta da incapacidade dos pulmões das crianças prematuras para produzirem agente tensioactivo pulmonar. Os complexos da oresent.e invenção, quando administrados a pacientes que sofram de SAR, a£ tuam como agentes tensioacti«os pulmonares sintéticos e substituem o agente tensioactivo natural inexistente ou aumentam o aqe£ te tens i oacti vo natural insuficiente. Mantem-se o tratamento ate que os pulmões da criança produzam uma quantidade suficiente de agente tensioactivo pulmonar natural de modo a tornar desnecessã rio n tratamento adicional.

De preferência, as composições são as adequadas para administração endotraqueal, ou seja, sob a forma de uma suspensão líquida, de po seco ou de um aerossol. Para se preoarar uma su£ pensão líauida mistura-se a mistura seca ou a mistura em suspensão aquosa com agentes adeauados tais como a ãgna, soluções- salt nas, dextrose e glicerol para proporcionar uma composição farmaceuticaraente eficaz. As suspensões líquidas preferidas conterão entre 0,8 e l,0t% em peso de cloreto de sódio e terão uma concentração molar 1 - 2Q mM de iões de rãlcio. Depois, es teri 1 i za-se a composição mediante filtração. Em geral, a composição ê constituída por 1 a 100 rog de DPPC por mililitro e administra-se numa dose compreendida entre 0,2 e 5 ml/Kg. Para se preparar nma mistura seca liofiliza-se a suspensão aquosa. Prepara-se o aero£ sol a partir de um do seco finamente dividido em suspensão num propulsor tal como os alcanos inferiores e os alcanos fluorados, por exemplo, o Freon.. 0 aerossol ê armazenado num recipiente pressuri zado.

-220 agente tensioactivo e administrado, conforme for apropriado de acordo com a forma de dosagem, através de um tubo endo traaueal, por administração por aerossol, on nehalizando a suspensão ou a mistura seca no gás insoirado. 0 agente t^nsioactivo é administrado numa dose ou em doses múltiplas compreendidas entre 10 e 200 mg/Kg. 0 método preferido de administração consistp numa suspensão de peptido e de lípido numa solução salina fisiológica numa concentração compreendida entre 5 e 10 mg de agente tensioactivo por mililitro, através de um tubo endotraqueal, proporeionando uma dose compreendida entre 50 e 100 mg/Kg,

EXEMPLO 1

Preparação do complexo de DPPC de H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-G1u-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH (Peptido 1)

Preparou-se o peDtido 1 por síntese em fase sólida. A DPPC (25 mg) em 1 ml de clorofórmio fo1 submetida a secagem sob uma corrente de azoto e 1iof11izou-se para se removerem os vestT gins de dissolvente nrgânico. Â mistura 1ipídica seca adicionou-se 3 ml de agua. Incubou-se a preparação durante I hora a 45°C. Depois-, adicionou-se ã preparação aquosa 0,5 mg de peptido 1 seco. Tratou-se a preparação em ambiente de ultra-sons a 45°C du?.rante 2 horas. Li ofi 1 i zo u-se a mistura 11pido/peptido resultante e armazenou-se a 4°C durante 1 més. Antes do ensaio adicionou -se 9 ml de NaCl a 0,9 %, e tampão HEPES 20 mM, a pH 7,40. Incubou-se a composição durante 1 hora a 45°C com agitação periódica. A composição apresentou-se com um aspecto branco translúcido e

-23ê menos turva do que λ OPPC isolada.

EXEMPLO 2

Preparação do Complexo de DPPC de Suc-Lys-Leu-Lêu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Léu-Leu-NH₂ (Péptido 2)

Preparou-se o PeDtido 2 por síntese em fase sólida e mí_s turou-se com DPPC conforme descrito no Exemplo 1, com a excepcão de o tampão de suspensão final conter CaCl? 5 raM alem de NaCl a 0,9 % e de tampão HEPES 20 mM, a pH 7,40.

EXEMPLO 3

Preparação do Complexo de DPPC de Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Blu-Trp-Leu-Lys-NF^ (Péptido3 )

Por um processo idêntico preparou-se o Péptido 3 e formou-se o seu complexo com DPPC.

Por um processo idêntico, mas utilizando uma mistura de 25% de DUPG e de 75% em peso de DPPC, obtém-se um complexo DUPG/ /DPPC do péptido 2.

EXEMPLO 4

Preparação do Complexo de DPPC de Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Gln -Trp-Leu-Lys-NHg (Péptido 4)

-24Por um Drocesso idêntico preparou-se o péptido 4 mou-se o seu complexo com DPPC.

e forEXEMPLO 5

Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-N^

Por um processo idêntico preparou-s* o péptido 4 mnu-se o seu completo com DPPC.

EXEMPLO 6 e forSuc-Leu-Leu-Glu-Lys-l eu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NHz

Por um Drocesso idêntico preparou-se o péptido 4 mou-se o seu complexo com DPPCe forEXFMPLO 7

Suc-Leu-Leu-Gl u-Lys-l eu-Leu-Gl u-Al a-LetJ-Lys-NH^

Por um processo idêntico preparou-se o péptido 4 mou-se o seu comolexo com DPPC.

EXEMPLO 8 e forSuc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH₂

Por um processo idêntico preoarou-se o Deptido 4 e formou-se o seu comDlexo com DPPC.

EXEMPLO 9

Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-TrpfForJ-Leu-Lys-NH2

Por um processo idêntico preparou-se 0 peptido 4 e for mou-se 0 seu complexo com DPPC.

EXEMPLO 10

H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For]-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Vai-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Gla-41a-Phe-Ser-Ser- Ser-OH

Por um processo idêntico preparou-se 0 peptido 4 e for mou-se 0 seu complexo com DPPC.

-26QUADRO 1

PROPRIEDADES FÍSICAS E ANÁLISE DOS AMINOÁCIDOS DOS PÉPTIDOS 1-10

		Analise dos aminoácidos	BAR - EM	~280
					/ M | U > +
				( r! l Π )
B	S Z	A V L	F	Y K +	lm.u
1	1,99	4,94 2,07	3,90 1,03 2,03	2,04	1,04 3,98	2707	7040
2		2,03	4,98		2,00	1383	5924
3		1,97	5,09		1,94	1384	8218
4		3,06	6,01		3,9?	1383	6857
.5	2,02		5,10		2,88	1326	-
;6	2,08		5,00	0,96	1,96	1345	-
7	2,06		0,9? 4,98		1,96	1268	-
8	2,07		4,99		2,94	1326	-
9	3,13		6,00		3,8?	1909	-

2,03 4,53 1,53 4,08 0,95 2,02 2,00 0,98 3,95 1734

-27EXEMPLO Π

Avaliação Tensioactiva Pulmonar dos Peptidos 1 e 2

Fez-se o ensaio de composições tensioactivas sintéticas num modelo de pulmão de r^ato adulto (Ikeganr* et al., Pedi atr.

Res. , 13, 1979, 777-780). Como padres de referência utilizou-se a Referência 1 e a Referência 2 constituídas, respectivamente , por DPPC isolada e por agente ten«ioactivo de pulmão de cão. Fez-se o ensaco com 3 ml das composições de cada um dos Exemplos 1 e 2 num modelo de pulmão de rato adulto. As composições dos Exemplos 1 e 2 restabeleceram quase completamente o funcionamento do pulmão do rato. Os resultados são Ilustrados nas Figuras 1 e 2.

Referência I. Preparou-se a Referência Γ do modo a seguir descrito. Adquiriu-se a DPPC em Avantt Polar Lipids. Secou-se 25 mg de DPPC em clorofórmio sob uma corrente de azoto e 1i£ filizou-se para se removerem os vestToios do dissolvente orgânico. Ã mistura lípidica seca adicionou-se 3 ml de ãgua Incubou-se a composição a 45°C durante 1 hora com tratamento em ambiente de ultra-sons. L1ofi1izou-se o iTpido, armazenou-se a 4°C du rante uma semana e misturou-se com 9 ml de NaCl a 0,9%, e com tam não HEPES 20 mM, a pH 7..40. Após agitação periódica durante a incubação a 45°C durante 1 hora, testou-se a Referência I num mo delo de pulmão de rato adulto (Figura la). A Referência I não proporciona qualquer efeito sobre a melhoria do funcionamento do pulmão do rato e ê ineficaz como aaente tensioactivo pulmonar,

-28Referência II. Preparou-se a Referência II do modo a seguir des_ crito. PreDarou-se agente tensioactivo do pulmão do cão por métodos familiares aos especialistas na matéria. A Referência II restabelece a capacidade do pulmão a 5 cm de ãgua em mais de 75$ da suficiência total do pulmão do rato.

Claims (23)

1.- Processo para a preparação de um derivado peptídico de fórmula geral

X-Y-Z-Y'-Q na qual X representa um átomo de hidrogénio, um aminoácido, dipeptido, ou tripeptido, ou um ácido orgânico cíclico, aromático ou alifático possuindo entre 1 e 10 átomos de carbono;

Y e Y’ representam, cada um, independentemente, uma ligação ou um radical de fórmula geral -(Ser) -, na qual n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 3;

Q representa um grupo hidroxi-amino, alquilamino ou alcóxi;

Z representa um resto peptídico com 8 a 25 amino-30·Λι·Α2·Α3-Α4·Α5-Α6* A7’-A8’-Ag’-Aio’-Ai ι ãcidos, constituído por um fragmento do oligõmero que possui a sequência

A7-A8-Ag-Aio-Ai i-Ai’·/ ’-Ai”.A₂”-A3”-A₄”-A5”· Aio”-Ah”.Ai”’.A2”·· ^2 ·Α3’·Α4’·Α5’·Α6’· Α6”·Α7”·Α₈·’·Α9’’.

e que pode começar com qualquer dos resíduos de amino-ãcidos ^Ai“^An' ^em 3^{ue A}j/ ^A*l* A'’^,A' A^, A'^, ^A'4'

Αθ, A'g e Ag representam, cada um, independentemente, um radical escolhido no grupo amino-ãcidos hidrofílicos constituído por Glu, Asp, Ala, Gin, Asn, Gly, Ser, Thr, Lys, Arg, Orn e hArg;

A₂, A'₂, A₂, A'₂ , Ag, A'g, Ag, Ag, A'_g, Ag, A_?, A'_?,

A” A A' ^Λ *' ^A10^z e ^A _lo representam, cada um, inde?, ~₁₀, - _1Q, pendentemente, um radical seleccionado no grupo de aminoãcidos lipofílicos constituído por Leu, Nle, Met, Ala, Vai, Phe, Nva e Tyr;

^Ag, A'g, Ag, A^, ^A'n ^{e A}ii' i’®P^resentam, cada um, independentemente um radical seleccionado no grupo de amino-ãcidos básicos constituído por Lys, Orn, Arg, hArg; Ag, A'g, ^Ag representam, cada um, independentemente um radical seleccionado no grupo de amino-ãcidos lipofílicos neutros ou básicos constituídos por Leu, Nle, Met, Ala,

Vai, Phe, Nva, Ile, Tyr, Thr, Ser, Gin, Asn, Gly, Lys,

Arg, hArg, Trp, Orn, Trp(For), ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, com

-31a condição de Z não poder ser:

-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Glu-Lys-Val-Leu-GluLys-Leu-Lys-Glu-Leu-Phe-;

-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-GluLys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe;

-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-AlaGlu-Lys-Leu-Lys-Glu-Na-Phe-; ou

Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Ser-Lys-Val-AlaGlu-Ala-Leu-Lys-Glu-Ala-Phecaracterizado pelo facto de efectuar uma síntese de bloco e sequencial de fase solida, clonagem de genes ou suas combinações.

2.- Síntese de bloco ou sequencial de fase sólida para a preparação de um derivado peptídico de fórmula geral

X-Y-Z-Y-Q na qual X representa um átomo de hidrogénio, um amino-ãcido, um dipeptido, ou um tripeptido, ou um ãcido orgânico cíclico, aromático ou alifático possuindo entre 1 e 10 átomos de carbono;

Y e Y' representam, cada um, independentemente, uma ligação ou um radical de fórmula geral -(Ser)_n- na qual n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 3;

Q representa um grupo hidroxi-amino, alquilamino ou alcóxi; Z representa um resíduo de péptido com 8 a 25 amino-ãcidos constituído por um fragmento do oligómero

-32possuindo a sequência ·Λι-Α2-Α3.Α4·Α5-Α6·Α7·Α8·Α9.Αιο-Αιι.Α₁’.Α2’·Α3’·Α₄’.Α5’-Α6’·

A7’-A8’.A9’-Aio’-Aif.Ai”.A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”.A₈”-Ag”Αιο”-ΑιΓ-Αι”’-Α2’”· e a qual pode começar com qualquer dos resíduos de amino-ácidos ^A1 “ ^A11 em que cada um de A^, Α'^, ^Al' ^A’l ' ^A4' ^A*4' ^A* 4' ^A8' ^A 8 ^{e A}8 é independentemente seleccionado entre o grupo de amino-ácidos hidrofílicos constituído por Glu, Asp, Ala, Gin, Asn, Gly,

Ser, Thr, Lys, Arg, Orn, e hArg;

cada um de Aj, A^/ A¹^/ ^A*2 · ^A3' ^A*3' ^A3' ^A6' ^Α'β' ^Αβ' A7, A’7, ^a7» ^aio' ^a’io ^{θ A}l0 ® independentemente seleccionado no grupo de amino-ácidos lipofllicos constituído por Leu, Nle, Met, Ala, Vai, Phe, Nva e Tyr; cada um de Ag, A’5, ^ah' ^A'll ^{e A}ll ® independentemente seleccionado de entre o grupo de amino-ácidos básicos constituído por Lys, Orn, Arg e hArg;

cada um de Ag, Λ'^, A’ é independentemente seleccionado de entre o grupo de aminoácidos lipofílicos neutros ou básicos constituído por Leu, Nle, Met, Ala, Vai, Phe, Nva, Ile,

Tyr, Thr, Ser, Gin, Asn, Gly, Lys, Arg, hArg, Trp, Orn,

Trp(For), ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico com a condição de Z não poder representar;

-33-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Glu-Lys-Val-Leu-GluLys-Leu-Lys-Glu-Leu-Phe-;

-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-GluLys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe;

-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-AiaGlu-Lys-Leu-Lys-Glu-Na-Phe-; ou

Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Ser-Lys-Val-AlaGlu-Ala-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe- , caracterizado pelo facto de se ligar um amino-ãcido protegido adequadamente correspondente ao amino-acido amino-terminal a um suporte de resina activada, e de se ligar subsequentemente os outros aminoácidos alfa-amino-protegidos, ordenadamente a partir da extremidade amino até ao carboxi terminal, ao grupo amino-terminal da cadeia peptldica em desenvolvimento que entretanto se expôs por remoção do seu grupo amino-protector.

3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de A^, A'A^ ou A’ , representar um resto Glu.

4, - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de A^, A’^ ou A^ representar um resto Glu.

5.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, carac-34terizado pelo facto de pelo menos um de Αθ, Α'θ ou Αθ representa um resto Glu.

6. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de Aj, A’A*^ ^{ou A}”' 2 representar um resto Leu.

7. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de A^, A'₃ ou A₃ representar um resto Leu.

8. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos un de Ag, A’g ou A’g _re_ presentar um resto Leu.

9. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de A^, A'? ou A? representar um resto Leu.

10. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de Α^θ, Α'^θ ou representar um resto Leu.

11. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de Ag, A'g ou Ag repre-35sentar um resto Lys.

12.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de Ag, A'^ ou A^ representar um resto Ala.

13.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de pelo menos um de A^, A'^ ou A^ representar um resto Lys.

14.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de Q representar um grupo amino.

15.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obtèr o derivado peptídico: H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-LysLeu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH.

16. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico: Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Nf^.

17. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico: Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NHj.

18. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico : Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NHj.

19. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico;

Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NI^ ·

20. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico;

Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NI^.

21. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico;

Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NHj.

22. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico;

Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NHj.

23. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico:

Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH₂.

-3724.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter o derivado peptídico:

H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH.