HU204288B - Process for producing polypeptides and pharmaceutical compositions containing them and lipides for treating deseases of the respiratory systhem - Google Patents

Description

Atalálmány tárgya eljárás olyan polipeptidek szintézisére, amelyek szekvenciája eltér az emlősök tüdejének felületére ható készítményekben alkalmazott fehérjék szekvenciájától, továbbá eljárás ilyen fehérjék és Iipidek keverékét tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek hatékonyan alkalmazhatók emlősök légzószervi elégtelenségének tünetegyüttese (RDS) kezelésére.

Az újszülöttkori RDS az élet első 28 napja során az egyik vezető elhalálozási ok Elmondható, hogy világszerte 100 csecsemő közülegyetmegtámad és abetegségek kb. 10%-a meghal. Érett újszülöttek esetében a tünet-együttes ritkán fordul elő, de általában társul az éretlenséggel és az alacsony születési testtömeggel (ez 2 kg-nál kisebb tömeget jelent). A felnőttkori RDS hasonló klinikai jellemzőket és patofiziológiát mutat, mint a csecsemőkori betegség, és az intenzív ellátás körülményei között, hasonló módon gyógyítható. A felnőttkori betegség etiológiája különböző. Ez a tüdősérülésének eredménye, amelynek oka pl. a diffúz fertőzés, a gyomor-tartalom vagy víz belégzése, izgató anyagok és toxinok belégzése és tüdő-ödéma, amely olyan forrásokra vezethető vissza, mint a narkotikumok túladagolása. Az RDS összefügg a tüdő felületaktív anyagának hiányával vagy hiányos működésével (ez azanyag borítja a tüdő alveolusokat, amelyekben a gázcserevégbemegy).

A tüdő felületén jelenlévő anyag alapvetően (90%) lipidekből áll és kisebb mennyiségben (10%) különböző fehérjéket tartalmaz. Aprimerlipid foszfolipid típusú: ez alkotja a lipid 97%-át. Ennek a foszfolipidnek a 80%-a foszfatidil-kolin (PC) és 10%-a foszfatídilglicerin (PG). A foszfolipid acil-Iáncamak 70-80%-a telített és ezek közül 85-90% esetében a lánc 16 szénatom hosszúságú. A lipid komponens főtömege a di- ^; palmitoil-foszfatídil-kolin (DPPQ. A tüdő felületi rétegénekfehérjekomponenseugyancsakheterogén,de jellemzői kevésbé ismertek. Anagyobb mennyiségben jelenlévőféhérjemolekulasúlyakb. 32kd; szekvenciája a cDNS alapján becsülhető meg (White et al., Natu- ² re 317, p. 361-363, 1985) és klónozása megtörtént (Horos et al., I. Bioi. Chem. 260, p. 495-500,1985).

Kisebb molekulatömegű fehérjéket ugyancsak elkülönítettekés több szekvenciát azonosítottak (Warr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 82, p. 7915-7919,1987; ² Glasser et al., J. BíoL Chem. 263, p. 9,1988; Johansson et al.,EEBS Letters,232, p. 61-64,1988. Glasser et al., Proc. NatLAcad. Sci. USA 84,p. 4007,1987;Revaket aL, J. Qin.Ihvestígation 81, p. 826-833,1988).

AcsecsemőkoriRDS-t jelentős sikerrel kezelték ál- 6 lati tüdő mosófolyadékaival (Smyth et al., Pediatrics 71, p. 913-917,1983,'McCord etal., Arch. Dis. Child.

63, p. 10-16,1988) és emberi magzatburok folyadékból előállított emberi tüdő felszíni anyaggal (Hallman etal.,Pediatrics 71,p.473-482,1983; J.Pediatr. 106, 5 p. 963-969,1985;MerrittetaL,N.Engl. J.Med. 13,p. 785-790,1986). Ugyancsak hatásosak a szarvasmarha tüdő mosófolyadékaiból szerves oldószeres extrakcióval előállított és szintetikus Iipidekkel kevert anyagok (Fujiwara et al., Láncét 1, p. 55-59,1980; Noach 6' et al., Eur. J. Respir. Dis. 69, p. 321-335,1986; Kwong et al., Pediatrics 76, p. 145-153,1985; Shapiro et al., Pediatrics 79, p. 31-37,1987; Raju et al., Láncét 1, p. 651-656,1987; Haüiday et al., Láncét 1, p. 476-478, 1984). A teljesen szintetikus keverékek azonban nem bizonyulnakállandó aktivitásúnak (Morley et al.,Láncét 1, p. 64-68,1981; Ten Centre Study Group, Br. Med. J. 294, p. 991-996,1987;Milneretal.,Arcb.Dis. Child. 58 p. 458-460,1983; Milner et al., ibid. 59, p. 369-371, 1983; Wilkinson et al., Láncét 2, p. 287291,1985). Csak egyetlen olyan klinikai vizsgálatról tudunk, amelynek során felnőttkori RDS kezelésére felületi anyagokat használtak fel (Lochman et al., Adv. Exp. Med. Bioi. 222, p. 511-517,1988) és az irodalomfoglalkozik egy ilyen terápiapotenciális értékelésével (van Golde et al., Physiol. Rév. 68, p. 374-455).

A kitüntetett — a tüdő felületére ható — készítmény teljesen meghatározott összetételű komponensekből áll. Művel a tiszta lipid-keverékkd csak mérsékelt eredményekről számolnak be, úgy tűnik, hogy szükség van a tüdőfelületérehatókészítményfehérjekomponensére is. Az egyik megközelítés géntechnológiai úton előállított fehérjék alkalmazása, amelyek szekvenciájaa tüdő felületén jelenlevőfehérjék cDNS összetétele alapján állítható be. Egy másik megoldás —és ez találmányunk tárgya — olyan peptidek szintetikus úton való előállítása, amelyek fizikai tulajdonságai (meghatározott lipid-komponensddcd való öszszekeverés után) alkalmasak a tüdő felületére ható anyag funkcióinak kifejtésére, de amelyek szekvenciája különbözik a tüdő felületéről izolált fehérjék szekvenciáitól.

Atalálmány tárgya tágmegfogalmazásban eljárás a tüdő felületére ható szintetikus készítmények előállítására, közelebbről olyan, a tüdő felületére ható készítmények előállítására, amelyek szintetikus polipeptidek és Iipidek elegyéből állnak és amelyek az RDS kezelésére használhatók fel. A szintetikus polipeptidek sajátos szekvenciákkal rendelkeznek, amelyek nem találhatók meg a tüdő mosófolyadékából elkülönített emlős fehérjékben. A polipeptidek egy-egy litók. A polipeptid a tüdő felületére ható készítmény kisebb mennyiségben alkalmazott komponensét képviseli. A taláhnány szerinti készítmény új, ami a peptid komponenst és ilyen peptideklipidekkel való kom. binálását illeti. A taláhnány olyan szintetikus, a tüdő felületére ható készítmény előállítására vonatkozik, amely a gyógyászatban hatékonyan alkalmazható az RDS kezelésére. Atalálmány szerinti készítménynagy tisztaságban és standard eljárással állítható dő; ez szintetikus komponensek meghatározott keveréke. Jellemző tulajdonsága ezenkívül,hogy akomponensek nem állati eredetűek; ez minimálissá teszi a vírusokkal és baktériumokkal való fertőződés veszélyét Továbbá a komponensek biológiai jellegűek és emlősökben megtalálhatók a lebomlási utak a keverék komponenseinek eltávolítására, nem-biológiai molekulákat tehát nem viszünk be a szervezetbe.

Arajzokrővid leírását a következőkben adjukmeg:

HU 204288 Β

Arajzokközül az

1. ábra nyomás-térfogat görbét mutat be azl ésEL hivatkozás szerinti készítmények patkánytüdő rendszerben való alkalmazásával kapcsolatban; a

2. ábra az 1. és 2. példa szerinti készítmény patkánytüdő kísérleti rendszerben felvett nyomás-térfogat görbéjét szemlélteti.

A találmány szerinti eljárással előállítható polipeptid olyan (I) általános képletű vegyület vagy gyógyászatilag elfogadható sója, ahol a képletben X jelentése hidrogénatom vagy olyan szukcinil-, maleü-, difenil-maleil- vagy ftaloü-csopört, amely az Y vagy Z csoport terminális N-atomjával együtt gyűrűs Imidet képez,

Y és Y’ jelentése egymástól függetlenül egy kötés vagy egy -Ser_n- általános képletű csoport, ahol n értéke 1-3,

Q jelentése hídroxil- vagy aminocsoport,

Z jelentése egy, az alábbi peptidek közül:

-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-LysVal-Ala-GluLys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-LeuGlu-Trp-Leu-Lys-Leu-Leu-Gly-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-LeuGlu-Trp(For)-Leu-Lys- és

-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-AspLys-Val-Ala-GIu-Lys-Leu-Lys-GIu-Alap-Phe-.

A készítményben a lipid komponens egy vagy több összetevőből áll. Ezek olyan típusúak, mint a tüdő felületén jelenlevő természetes anyaghoz kapcsolódó vegyületek.

Ezek a polipeptid-lipid komplexek és az ezekből előállított gyógyszerkészítmények emlősökben az RDS kezelésére használhatók fel.

A természetben előforduló aminosavak jelölésére a leírásban a következő, általánosan elterjedt rövidítéseket alkalmazzuk:

Ala vagy A - alanin

Val vagy V-valin

LeuvagyL-leucin

Hevagyl-izoleucin

PhevagyF-fenilalanin _e

Trp vagy W - triptofán

Met vagyM-metionin

Ser vagy S-szerin.

Tyr vagy Y - tirozin

Asp vagy D - aszparaginsav

Glu vagy E - glutaminsav

LysvagyK-lizin

Arg vagyR - arginin

Nva-norvalin

Trp(For) -N’H-formil-Trp

A természetes aminosavak—a glicinkivételével— egy királis szénatomot tartalmaznak. Hacsak másként nem jelezzük, a leírásban említett optikailag aktív aminosavakL-konfigurációjúak. Aleírásban szereplő peptidek szerkezete a szokásos módon olyan, hogy az aminot-terminális vég a lánc baloldalán, a karboxiterminális vég pedig a lánc jobboldalán helyezkedik el.

A találmány szerinti polipeptidek előállítására számos, a szakember által jól ismert eljárás alkalmazható. Ezen eljárások közé tartozik a szilárd fázisú szekvenciális és blokk szintézis, a génklónozás és ezeknek a technikáknak a kombinációi.

A szilárd fázisú szekvenciális eljárás standard automatizált eljárások segítségével —pl. azABIpeptidszintetizátor alkalmazásával—hajtható végre,Ebben az eljárásban egy alfa-aihino-védett aminosavat kapcsolunk egy gyanta-hordozóhoz. Gyanta-hordozóként bármilyen megfelelő gyantát felhasználhatunk, amelyet a szakterületen szokásosan alkalmaznak polipeptidek szilárd fázisú előállítására. Előnyösen olyan polistirolt alkalmazunk, amelyet 0,5-kb. 3% divinü-benzollal keresztkötéses termékké alakítottunk át és amelyet klórmetileztűnk vagy hidroximetileztűnk annak érdekében, hogy kötődésihelyekethozunklétre akiindulásként felvitt alfa-amino-védett aminosav észterének képzéséhez.

A hidroximetü-gyantára egy példát Bodánszky et a., írnak le (Chem. Ind. London, 38, p. 1597-1598, 1966). Egy klórmetüezett gyantát hoz forgalomba a kereskedelemben a Bio Rád Laboratories (Richmond, Kalifornia) és egy ilyen gyanta előállítását ismerteti Stewart et al.) Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., San Francico, 1969,1. Fejezet, p. 1-6). A védett aminosav Gisin eljárásával (Helv. Chim. Acta 56, p. 14-76,1973) módszerével köthető a gyantához. A kereskedelemben számos gyantához kötött, védett aminosav hozzáférhető. Egy találmány szerinti polipeptid előállításához pl., amelyben a karboxi-terminális vég egy Thr maradék, a kereskedelemben beszerezhető egy terc-butiloxikarbonil-(Boc)-védett Thr, egy benzilezett, hidroximetilezett fenü-acetamidometilgyantához (PAM) kötve.

Az alfa-amino-védett aminosavnak a hordozó gyantához való kapcsolása után a védőcsoportot valamilyen megfelelő eljárás alkalmazásával eltávolítjuk. Erre acélra alkalmazhatunk metilénldoridos trifluorecetsavat, trifluorecetsavat egyedül vagy dioxános sósavat. A védőcsoport eltávolítását 0 ‘C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten végezzük. Alkalmazhatunk más standard hasító reagenseket és reakciókörülményeket is a meghatározott alfa-amino-védőcsoportok eltávolítására. Az alfa-amino-védőcsoport eltávolítása után a többi védett aminosavat kapcsoljuk, lépcsőzetesen, a kívánt sorrendben. Egy másik megoldás szerint az oldat-képzésimódszerreltöbb aminosav csoport összekapcsolható, a hordozó gyantán kialakított aminosav-szekvenciához való kapcsolás előtt.

A peptid-szekvenciába bevitt egyes aminosavak esetében a szakember által ismert védó'csoportok bármelyike alkalmazható alfa-ammo-védőcsoportként.

HU 204288 Β

A számbavehető alfa-aminosav védőcsoportokközött a kvöetkező típusokatkülönböztethetjükmeg:

(1) acil típusú védőcsoportok, pl. a következők: fonnií, trifluor-acetil-, ftalil-, toluol-szulfonil- (tozü), benzol-szulfonil-, nitro-fenil-szulfenil-, tritil-szulfenil-, o-nitro-fenoxi-acetil- és gamma-klór-butiril-csoport;

(2) aromás uretán típusú védőcsoportok, mint a következők: benziloxi-karbonil- és helyettesített benziloxi-karbonil-, így p-ldór-benziloxi-karbonil-, pnitro-benzüoxi-karbonil-, p-bróm-benziloxi-karbonil-, p-metoxi-benziloxi-karbonil-, Ι-φ-bifenil)Ι-metil-etoxi-karbonil-, alfa,alfa-dimetil-3,5-dimetoxi-benziloxi-karbonil- és benzhídriloxi-karbonü-csoport;

(3) alif ás uretán védőcsoportok, pl. a következők: tercbutiIoxx-karbonil-(Boc)-, diizopropíl-metoxi-karbonil-, izopropüoxi-karbonü-, etoxi-karbonil- és alliloxi-karbonil-csoport;

(4) cüdoalkil-uretán típusú védőcsoportok, nuntcűdo- í pentiloxi-karbonil-, adamantiloxi-karbonil- és ciklohexüoxi-karbonil-csoport;

(5) tiouretán típusú védőcsoportok, mintfenil-tiokarbonil-csoport;

(6) alkü-típusú védőcsoportok, mint trifenil-metil- 2 (tritil-) és benzilcsoport;

(7) trialkíl-szilán csoportok, amilyen a trimetil-szílán csoport.

Kitüntetett alfa-amino-védőesoport a terc-butiloxi-karbonil csoport. 3

A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása a szakember tudásához tartozik. Abban az esetben, ha a kapcsolandó aminosav a Gin, Asp vagy Arg, különösen megfelelő kapcsoló reagens az NJí’-diizopropil-karbodiimid és az 1-hidroxi-benzotriazol. Ezeknek a reá- θ¹ genseknek az alkalmazása megakadályozza a nitril- és a laktám-képződést. Más kapcsoló reagensek:

(1) karbodiimidek (pL az N,N’-diciklohexil-karbodiimid és az N-etü-N’-gamma-dimetilamino-propilkarbodiimid); 4( (2) cíanamidok(pl. azNJQ'-dibenzü-ciánamid);

(3) ketén-iminek;

(4) izoxazólium-sók(pl. azN-etil-5-feml-izoxazóIium3’-szulfonát);

(5) monociklusos nitrogéntartalmú aromás jellegű he- 4f terociklusos amidok, amelyek a gyűrűben 1-4 nitrogénatomot tartalmaznak, amilyenek az imidazolidek, pirazolidek és az 1,2,4-triazolidek. A használható heterociklusos amidok közé tartozik pl. konkrétenazN,N’-karbonü-díimidazolésazN,N’- SC karbonií-di-l,2,4-triazol;

(6) alkoxilezettacetilén (pl. etoxi-acetilén);

(7) olyanreagensek, amelyekvegyes anhidridetképeznek a kapcsolandó aminosawal (pl. a klórhangyasav-etflészter és a klórhangyasav-izobutilészter) 55 vagy a kapcsolandó aminosav szimmetrikus anhidridjei (pl. a (Boc/-Arg/₂-O) és (8) nitrogéntartalmú heterociklusos vegyületek, amelyek az egyik gyűrű-nítrogénatomon egy hidroxilcsoportot tartalmaznak (pI.N-hidroxi-ftáIiinid,N- 50 hidroxi-szukcinimid és 1 hidroxi-benzotriazol). További aktiváló reagenseket és ezeknek a peptidkapcsolásban való alkalmazását Kapoor (J. Pharm.

Sci. 59, p. 1-27,1970) írja le. Kapcsoló reagensként 5 előnyben részesítjük a szimmetrikus anhidrid alkalmazását

Az egyes védett aminosavakat vagy aminosav-szekvenciákat kb. négyszeres feleslegben visszük be a szilárd fázisú reaktorba és a kapcsolást 1:1 metilénldo10 rid:dimetilformamid elegyben, dimetil-formamidban vagy előnyösen metilénkloridban mint közegben végezzük. Ha a kapcsolás nem megy teljesen végbe, a kapcsolási eljárást megismételjük, a alfa-amino-védőcsoport eltávolítása nélkül, mielőtt a szilárd fázisú re15 aktorban a következő aminosav kapcsolására sor kerülne. A kapcsolási reakció sikerét a szintézis egyes fázisaiban a ninhidrin reakcióval követjük, az E. Kaiser et al. (Anal. Biochem. 34, p. 595,1970) által leírt módon.

Ό Á keresett aminosav-szekvencia előállítása után a peptidet eltávolítjuka gyantáról. Ezmetanolírissel végezhető, pL olymódon, hogy a gyantához kötött polipeptidet híg vizes hidrogénfluoriddalmint oldószerrel elkészített dimetíl-szulfid, p-krezol és tiokrezol ddat5 talkezéljük.

Mint ez a szilárdfázisú peptid szintézissel foglalkozó szakember számára ismert, számos aminosav olyan funkciós csoportokat hordoz, amelyékalánc előállítása során megvédésre szorulnak. A megfelelő védŐcso0 port kiválasztása és alkalmazása a szakember tudásához tartozik és attól függ, hogy milyen aminosavat kell megvédenünk és jelen vannak-e más védett aminosav maradékok a pepiiden. Egy ilyen oldallánc védő csoport kiválasztása kritikus, mivel ennék olyannak kell 5 lennie, amely a védőcsoportnak az alfa-amino-maradékról való eltávolítása során nem hasad le. A lizin esetében pl. megfelelő oldallánc védő csoport a benziloxi-karbonil- és a helyettesített benziloxi-karbonil csoport. Az utóbbi helyettesítője lehet halogénatom ) (ilyen pl. a klór-, bróm-vagy fluoratom) és a nitrocsoport, ilyen helyettesített benziloxi-karboníl-csoport tehátpl.a2-klór-benziloxi-karbonil-,p-nitro-benziloxi-karbonil-, 3,4-diklór-benzüoxi-karbonfl-csoport. Alkalmazható továbbá a tozil-, terc-amlloxí-karbonlli , terc-butiloxi-karbonil- és a diizopropil-metoxi-karbonil-csoport is. A treonln és a szerűt alkoholos hldro. xilcsoportját acetil-, benzoil-, terc-butil-, tritil-, benzil-, 2,6-diklór-benzil- vagy benziloxi-karbonü-csoporttalvédhetjükmeg.Kitűntetettvédőcsoportabenzil-csoport.

Ezeket a csoportokat a szakember számára jól ismert eljárásokkal távolíthatjuk él. A védőcsoport éltávolítását jellegzetes esetben azt követően végezzük, amint a peptid lánc szintézisét befejeztük, de a védőcsoport bármilyen más megfelelő időben eltávolítható.

Az (I) általános képletű polipeptidek bármelyik nem-toxikus szerves vagy szervetlen savval győgykszati szempontból elfogadható sókat képeznek. Jellegzetes szervetlen savak, amelyek megfélélő sókat képeznek, pl. a kővetkezők* sósav, hidrogénbromid, kén4

HU 204288 Β sav és foszforsav, valamint a savas fémsók, mint a nátrium-monohidrogén-ortofoszfát és a kálium-hidrogénszulf át. Jellegzetes szerves savak, amelyek megfelelő sókat képeznek, pl. a mono-, di- és trikarbonsavak. Néhány példa az ilyen savakra: az ecetsav, glikolsav, tejsav, piroszőlősav, malonsav, borostyánkősav, glutársav, fumársav, almasav, borkősav, citromsav, aszkorbinsav, maleinsav, hidroxi-maleinsav, benzoesav, hidroxi-benzoesav, fenilecetsav, fahéjsav, szalicilsav,

2-fenoxi-benzoesav és szulfonsavak, mint metán-szulfonsavés 2-hidroxi-etán-szulfonsav. Akarboxi-terminális amínosav-maradék sói kifejezés azokat a nemtoxikus, karboxil-csoportot tartalmazó savval alkotott sókat foglalja magában, amelyek valamely megfelelő szervetlen vagy szerves bázissal képezhetők. Néhány példa ezekre a savakra: alkálifém- (pl. nátrium- vagy kálium-sók); alkáliföldfém (pl. kalcium vagy magnézium) sók; a ΙΠΑ csoport könnyűféméinek (amilyen az alumínium) sói; és a szerves primer, szekunder és tercier aminok — amilyen pl. a trietil-amin, prokain, dibenzil-amin, 1-etén-amin, N,N’-dibenzil-etilén-diamin, dihidro-abietil-amin, N-(rövidszénláncú)-alkilpiperidin és bármely más megfelelő amin — sói.

A találmány szerinti fehérje-foszfolipid komplex foszfolipid komponenseiként bármelyik foszfolipidet alkalmazhatja a foszfoglicerideket és a szfingolipideket. Afoszfogliceridek a glicerin olyan di-zsírsav-észterei, amelyekben a fennmaradó (terminális) hidroxilcsoport a foszforsavval képez észtert. Afoszfogliceridek foszforsav-maradéka általában egy második észtert képez egy alkohollal, mint etanolaminnal, szérűinél, kolinnal vagy glicerinnel. Aszfingolipideka szfingozin. vagy a dihidro-szfingozin olyan mono-zsírsavészterei, amelyekben az 1. helyzetű hidroxil-csoport a foszforsav kolin-észterével képez észtereket. A találmány szerinti fehérje-foszfolipid komplexekben alkalmazható lipidek a kővetkezők:

- dipalmitoil-foszfatidil-kolin (DPPC),

- a különböző hosszúságú és telítettségi fokú acilláncokat tartalmazó foszfatidü-kolin molekulák (PC),

- a kardiolipin (CL),

- foszfatidil-gHcerinek (PG), foszfatidil-szerinek (PS),

-zsírsavak (FA) és

- triacü-glicerinek (TG).

A tüdő felületére ható készítmény fő komponensét a DPPC képviseli, míg a PC, CL, PG, PS, FA és a TG a kisebb komponensek közé tartoznak. A találmány szerinti foszfolipidekben való alkalmazásra megfelelők az olyan zsírsavak, amelyek hosszú szénláncú (általában 8 vagy ennél több szénatomot tartalmazó), jellegzetes esetben el nem ágazó karbonsavak. A zsírsavak lehetnek telítettek vagy telítetlenek. Jellegzetes zsírsav a laurinsav, mirisztinsav, palmitinsav és az olajsav.

A találmány szerinti fehérje-foszfolipid komplexek száraz keverékek vagy vizes szuszpenziók alakjában készíthetők ki gyógyszerkészítményként. Egyes esetekben ezek tartalmazhatnak

- kismennyiségű szerves oldószert, pl. etanolt vagy trifluor-ecetsavat,

- detergenseket, pl. nátrium-dodecil-szulfát vagy nátrium-ezoxikolát, valamint a kővetkezőket:

- sók, pl. kalcium-klorid vagy nátrium-klorid,

- szénhidrátok, mint glukóz, dextróz vagy mannit és

- aminosavak, pl. glicűi és alanin.

Ha a gyógyszerkészítményt folyékony alakban készítjük ki, hozzáadhatunk stabilizálószereket, tartósítókat, ozmózisnyomás-szabályozó anyagokat, pufferkapacitású szereket és a folyékony fázist alkotó szuszpendálószereket. Kívánt esetben megfelelő germicideket is adagolhatunk. A vizes szuszpenzió pH-ja 2 és 10 között változhat és savakkal vagy bázisokkal (pl. sósavval, nátrium-foszfáttal vagy nátrium-hidroxiddal) állítjuk be ezt. A száraz keverék vizes oldattal alakítható át folyadékká, amely gyógyászati szempontból elfogadható sókat, szerves oldószereket és oldószereket tartalmaz. A vizes készítmény dializálható, szűrhető vagy kromatograf álható felhasználás előtt annak érdekében, hogy a szuszpendáló közeget gyógyászati szempontból elfogadható közeggel cseréljük ki. A készítmény száraz porként, vizes szuszpenzióként vagy aeroszolként közvetlenül bevihető a beteg tüdejébe. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény hermetikusan lezárható tartályokba (így fiolákba és ampullákba) tölthető és sterilen tárolható. A készítmény—egy fiolában vagy ampullában — a szuszpendáló puffertől (amelyet ugyancsak fiolákba vagy ampullákba töltünk) elkülönítve tárolható és a száraz vagy hidratált készítmény a szuszpendáló pufferrel felhasználás előtt keverhető össze.

A lipidek a tüdő felületére ható készítmény 5099,0%-át teszik ki. Megfelelő lipid pl. aDPPC, PC, CL, PG, PS, FA és a TG. A DPPC képviseli a fő lipid komponenst és a lipidek össztömegére vonatkoztatva 60100% koncentrációban van jelen. A többi lipid kisebb koncentrációban szerepel. A PC, CL, PG és PS a lipidek max. 30%-át teheti ki, míg az FA és a TG a lipid tömegének max. 10%-a lehet. A kisebb mennyiségben jelen levő zsírsav acil-láncai telítettek vagy telítetlenek lehetnek és lánchosszúságuk bármilyen lehet. Előnyben részesítjük a 12-16 szénatomos láncot és max. 2 telítetlen kötést. A kitüntetett lipid-összetétei: 85100%DPPC+0-15%PG.

A tüdő felületére ható szintetikus készítmény lipid komponensei általában megtalálhatók az emlősök tüdejénekfelületén előforduló anyagban és számos ipari forrásból nagy tisztaságban szerezhetők be. Apolipeptid komponenseket szilárdfázisú peptid-szintézissel állítjuk elő, a szakember számára ismert módszerekkel. A találmány szerinti polipeptidekéihez hasonló szekvenciákat modellként használjuk a plazma-apolipoproteinek lipid-kőtő tartománya szintéziséhez, de alkalmazzuk ezeket a szintetikus, a tüdő felületére ható készítményekben. Az emlős tüdő mosófolyadékából elkülönített fehérjék és a lipidek keverékei hatékonynak bizonyulnak a csecsemőkori RDS kezelésében. Nem írták le azonban eze nlipidek és szintetikus peptidek keverékének a tüdő felületére ható készítményekben való alkalmazását.

A lipideket illékony szerves oldószerekben vagy ol5

Ηϋ 204288 Β dószer-degyekben—mint kloroform és metanol degyeiben — keverjük össze, A szerves oldószert nitrogén-, argon-atmoszférában vagy vákuumban desztillációval távolítjuk éL A száraz lipid keverékhez vizes oldatot adunk—amely szerves és szervetlen savakat, bázisokat éssókat tartalmazhat —, valamint szacharidokat (így dextrózt), olyan mennyiségben, hogy 0,1100 mg/ml DPPC koncentrációt érjünk eh Általában előnyös, de nem szükséges a keverék35-50 ’C-ra való melegítése, amely3etkövetőenakeveréketerőteljesen kevertetjük ésmax. 2 órán át25-50 ’C-on inkubáljuk. Ezután száraz porként vagy vizes oldatban szuszpendálva (amelyet egyes esetekben megfelelő szerves oldószert —pl. etanoltvagy trifíuor-etanolt—vagy egy denaturálószert, ph guanidinium-hidrokloridot vagy karbamidot, tartalmaz) hozzáadjuk a pepiidet vagy a peptid-keveréket. A denaturálószer javíthatja a pepiidnek a vizes szuszpenzióban való oldhatóságát. A pepiid és a lipid összekapcsolódása elősegíthető a pH megfelelő értékre való beállításával; így a vizes oldat pH-ja 2 és 10 között váltakozhat.

A pepiid és a lipid összekeverésére egy kitüntetett módszer szerint úgy járunk el, hogy száraz pepiidet adunk a lipidhez vízben, 45-50 ’C-on és az elegyet a fürdő ultrahangos kezdése segítségévd 30-90 percen át45-50 ’C-onkevertetjük, majdfagyasztva szárítjuk és -20 ’C-on tároljuk.

Alipideketmegfelelő detergenssel—így oktil-glukoziddal vagy nátrium-dezoxikoláttal — keverjük össze 1-20 rész detergens) rész DPPC tömegarány mellett vízben, vizes pufferben vagy sóoldatban, 1100 DPPC/ml koncentrációk beállításával. Ezután adagoljuk be a pepiidet mint száraz port, vagy vizes szuszpenziót, amely adott esetben oldott alakban szerves oldószert, egy denaturálószert vagy detergenst tartalmaz. A keveréket ezután dializáljuk, szűrjük, centrifugáljukvagy kromatografáljuk, a detergens eltávolítására.

Eljárhatunk úgy is, hogy alipideket és a peptideket egy illékony szerves oldószerbenkeverjük össze, adott esetben kismennyiségű víz hozzáadásával. Az illékony oldószert nitrogén- Yagy argon-áramban, vákuumkemencében vagy forgó bepárlóban egy vizes oldószer hozzáadása dőlt vagyutánledesztilláljuk.

Az előbbi módszerek valamelyikévd előállított Iipid-peptidkeveréket ultrahangos kezdés közben max.

órán át—dőnyösen 35-50 ’C-on—inkubáljuk. A keveréket ezután dializálhatjuk, szűrhetjük vagy kromatografálhatjuk a vizes közegnek egy gyógyászati szempontból elfogadható kozeggd való kicserélésére, bár erre nincs szükség. Egyes esetekben ahatékonyság növelhetőazáltal,hogy anem-reagáltlipidetvagypeptidet ultracentrifugálással, szűréssel vagy kromatografálással elválasztjuk a lipid-peptid komplextől. A keveréket eztkövetőenliofilizálhatjukvagyaeroszóllá alakfthatjukát.

Atalálmány szerinti polipeptid-foszfolipidkomplexek felhasználhatók az újszülöttkor! RDS kezdésére.

Ez olyan fiziológiai állapot, amely annak eredményeként lép fel, hogy az éretlen csecsemő tüdeje nem képes a tüdő felületi anyagának képzésére. A találmány szerinti komlexekRDS-ben szenvedő betegeknek beadagolva szintetikus tüdő-felületi anyagként hatnak úgy, hogy helyettesítik a természetes, hiányzó fdűleti 5 anyagot vagy csökkentik a természetes felületi anyaghiányt. A kezdést addig folytatjuk, amíg a csecsemő tüdeje kellóő mennyiségben termeli a természetes tüdő-felületi anyagot. Ez szükségtelenné teszi a további kezelést

A készítményeket előnyösen olyan alakban készítjük ki, hogy azok alkalmasak legyenek az endotracheális bevitelre; ilyen alak egy folyékony szuszpenzió, egy száraz por vagy egy aeroszol. Folyékony szuszpenzió előállítására aszáraz keveréketvagy a vizes szusz15 penzió alakjában jelenlevő keveréket gyógyászati szempontból hatékony készítmény dőállítására megfelelő adalékanyagokkal, így vízzel, sóoldatokkal, dextrőzzal és glicerinnel keverjük össze. Akitüntetett folyékony szuszpenziók 0,8-1,0 tömeg% nátrium-klo20 ridot tartalmaznak és kalcium-ionra nézve 1-20 mM töménységűéit Akészítményt ezután szűréssel sterilizáljuk. Akészítmény általában 1-100 mg/ml DPPCCt tartalmaz és 0,2-5 ml/kg dózisban vihető be. Száraz keverék előállítására a vizes szuszpenziót liofilizáljuk.

Az aeroszolt finom eloszlású szárazporból állítjuk dő, amelyet egy hajtószerben, pl. rövidszénláncú alánokban és fluorozott alkánokban (így Freonban) szuszpendálunk. Az aeroszolt nyomásálló palackban tároljuk.

Afelületi anyagot—az adagolásiformátólfüggŐen —endotracheális csövön át, aeroszól bdélegeztetésével vagy olyan módon visszük be, hogy a szuszpenzióból vagy száraz keverékből és a belélegezendő gázból ködöt képezünk. A felületi anyagot 10-200 mg/kg egyszeri vagy többszörös dózisban adagoljuk. Egy kitüntetett beviteli módszer szerint a pepiidet és a lipidet fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk, 5-10 mg fdűleti anyag/ml koncentrációban, és endotracheális csövön keresztül visszük be. így 50-100 mg/kg-os dó40 zisok érhetők el.

1. példa

A H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Fhe-TyrAsp-Lys-Val-AIa-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe45 Ser-Ser-Ser-OH (1. pepiid) DPPC komplexének előállítása . Az 1 pepiidet szilárdfázisú szintézissel állítjuk dő.

mg DPPC-t 1 ml kloroformban nitrogén-áramban szárítunk és az oldatotliofilizáljuk, aszerves oldószert 50 nyomainak eltávolítására. A száraz lipid keverékhez 3 ml vizet adunk. Akészítményt 1 őrán át inkubáljuk, ‘C-on. Ezután 0,5 mg száraz 1 pepiidet adunk a vizes készítményhez. A készítményt ultrahang-fürdővel kezeljük, 2 óránát, 45 ’C-on. Akapott lipid-peptid 55 keveréket liofilizáljuk és max. 1 hónapon át 4 ’C-on tároljuk. Vizsgálata előtt 9 ml 0,9%-os NaCl oldatot — amely HEPES pufferre 20 mM töménységű, pH 7,40—adunk hozzá. A készítményt időnkénti összekeverés mellett 1 órán át 45 ’C-on inkubáljuk. A ké60 szítmény átlátszó, fehér színű és valamivd kevésbé za6

HU 204288 Β varos, mint a DPPC egyedül.

2. példa

A Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-LeuLeu-NH₂ (2 peptid) DPPC komplexének előállítása

A 2 peptidet szilárdfázisú szintézissel az 1. példa szerint állítjuk elő és keverjük össze DPPC-vel, azzal az eltéréssel, hogy a végső szuszpendáló puffer az ott megadottakon kívül 3 mM CaCl₂-t tartalmaz.

3. példa

A Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-LeuLys-NH₂ (3 peptid) DPPC komplexének előállítása

Hasonló módon állítjuk elő a 3 peptidet és DPPCvel képezett komplexét.

Hasonló módon eljárva, de 25 tömeg% DUPG és 75 tömeg% DPPC keverékét alkalmazva állítjuk elő a 2 peptid DUPG/DPPC komplexét.

4. példa

A Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-LeuLeu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH₂ (4 peptid) DPPC komplexének előállítása

Hasonló módon állítjuk elő a 4 peptidet és ennek a DPPC-vel alkotott komplexét.

5. példa

A Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-LeuLys-NH₂ előállítása

Hasonló módon állítjuk elő az 5. peptidet és ennek a DPPC-velképzett komplexét.

6. példa

A Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-LeuLys-NH₂ előállítása

Hasonló módon állítjuk elő a 6. peptidet és ennek a 5 DPPC-vel képzett komplexét.

7. példa

A Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-AJa-LeuLys-NH₂ előállítása

Hasonló módon állítjuk elő a 7. peptidet és ennek a

DPPC-vel képezett komplexét.

8. példa

A Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu15 Leu-NH₂ előállítása

Hasonló módon állítjuk elő a 8. peptidet és ennek a DPPC-vel képezett komplexét,

9. példa

A Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-LeuLeu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2 előállítása

Hasonló módon állítjuk elő a 9. peptidet és képezzük a DPPC-vel a komplexét.

lO.példa

AH-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-PheTyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-AlaPhe-Ser-Ser-Ser-OH előállítása

Hasonló módon állítjuk elő a 10. peptidet és ennek a 30 DPPC-vel képezett komplexét.

1. Táblázai

Az 1-10. peptid fizikai tulajdonságai és aminosav-elemzése

	B	S	z	Aminosav-elemzés A V	L	F	Y	K	FAB-MS (M+H)+ tel mm	£280
1	1,99	4,94	2,07	3,90	1,03	2,03	2,04	1,04	3,98	2707	7040
2			2,03			4,98			2,00	1383	5923
3			1,97			5,09			1,94	1384	8218
4			3,06			6,01			3,93	1883	6857
5	2,02					5,10			2,88	1326	—
6	2,08					5,00	0,96		1,96	1345	—
7	2,06			0,99		4,98			1,96	1268	—
8	2,07					4,99			2,94	1326	—
9	3,13					6,00			3,98	1909	—
10	2,03	4,53	1,53	4,08	0,95	2,02	2,00	0,98	3,95	1734	—

11. példa

Az 1 és a 2 peptid mint tüdő felületi készítmény értékelése

A szintetikus felületaktív készítményeket patkánymodellben vizsgáljuk (Ikegami et al., Pediatr.Res. 13, p. 777-780,1979). Vonatkozási standardként egyedül DPPC-t (Γ. hivatkozás) ill. kutya-tudő felületi anyagot (Π. hivatkozás) alkalmazunk. Apatkány-modellben 33 ml, 1. ill. 2. példa szerinti készítményt vizsgálunk. Az

1. és a 2. példa szerinti készítmény csaknem teljesen helyreállítja a patkány-tüdő működését. Az eredményeket az 1. és a 2. ábrán mutatjuk be.

I. hivatkozás

A vizsgálandó anyagot a következőképpen állítjuk elő. ADPPC-t az AvantiPolar Lipids cégtől szerezzük be. 25 mg, kloroformban oldott DPPC-t nitrogénáramban szárítunk és a szerves oldószer nyomainak eltávolítására liofilizálunk. A száraz lipid-keverékhez 3 ml vizet adunk. A készítményt 1 órán át 45 ’C-on inkubáljuk, ultrahang-fürdőben való kezelés mellett.

HU 204288 Β

A lipidet liofilizáljuk, max. 1 héten át 4 Ϊ és összekeverjük 9 ml pH 7,40 pufferrel, amely 0,9% NaCl-t és 20 mMHEEES-t tartalmaz. 45 °C-on 1 órá át végzett inkubálás után (amelynek során az elegyet időnként összekeverjük (a fenti anyagot a patkánytüdő-modellben vizsgáljukmeg (la. ábra). Ahivatkozott anyag hatástalan, ami a patkánytüdő teljesítményének növelését illeti és hatástalan tüdő felületére ható anyagként.

Π. hivatkozás

A vizsgálandó anyagot a következőképpen állítjuk elő. Aszakember számára ismertmódonfelületi anyagot állítunk elő kutyatüdőből. Ez a készítmény 5 cm YÍznyomás mellett a patkánytüdő teljesítőképességét a teljes kapacitás 75%-afelettimértékben állítjahelyre.

Claims (14)

1. Eljárás (0 általános képletű peptid-szánnazékok, valamint gyógyászati szempontból elfogadható sóik előállítására, eképletben

X jelentésehidrogénatom vagy olyan szukcimi-, maleil-, difenil-maleil- vagy ftaloü-csoport, amely az Y vagy Z csoport terminális N-atomjával együtt gyűrűs imidetképez,

Y és Y* jelentése egymástól függetlenül egy kötés vagy egy -Ser_n-általános képletű esoport, ahol n értéke 1-3,

Q jelentése hidroxü-vagy aminocsoport,

Z jelentése egy, azalábbipeptidekközül:

-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyf-Asp-LysVal-AIa-GluLys-Leu-Lys-GIu-AIa-Phe-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-GIu-Leu-Leu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-LeuGlu-Trp-Leu-Lys-Leu-Leu-Gly-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-LeuGlu-Tip(For)-Leu-Ly5- és

-Ala-Asp-Tip(For)-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-AspLys-Val-AIa-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Alap-Phe-, azzal jellemezve, hogy szilárdfázisú szekvenciális vagy blokkszintézist alkalmazunk, (Elsőbbsége: 1988. 07.01.)

2Az 1. igénypontszerinti eljárás (I) általános képletű peptid-szánnazékok és gyógyászati szempontból elfogadható sóikdőállítására—eképletben

X, Y, Y’, Q és Z jelentése az 1. igénypontban megadott —azzal jellemezve, hogy szilárd fázisú szekvenciális vagy blokk-szintézist alkalmazunk oly módon, hogy egy megfelelően védett aminosavat — amely a karboxi-terminális aminosavnakfelelmeg —, hozzákötünk egy aktivált gyanta-hordozóhoz, majd ezt követően felvisszük a gyantára a többi aminosavat—amelyekalfa-helyzetben védettek —akarboxitenninálistólazamino-terminálisvégfelé haladó sorrendben és ezeket hozzákapcsoljuk a növekvő peptid-lánc terminális amino-csoportjához, amelyet időközben amino-védőcsoportjának eltávdításá5 valszabaddá tettünk. (Elsőbbsége: 1988.07.01.)

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Q jelentése aminocsoport. (Elsőbbsége: 1988.07.01.)

4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás

10 H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-TyrAsp-Lys-Val-AIa-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-S er-Ser-Ser-OH képletű peptid-származék előállítására, azzal jelle· mezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkal15 mázzuk. (Elsőbbsége: 1988.07.01.)

5. Az l.vagy 2. igénypont szerinti eljárás

Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-LeuLeu-NH₂ képletű peptid-származék előállítására, azzal jelle20 mezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.07.01.)

6. Az l.vagy 2. igénypont szerinti eljárás

Suc-Leu-Leu-GIu-Lys-Leu-Leu-Glu-Tip-LeuLys-NH₂

25 képletű peptid-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.07.01.)

7. Az l.vagy 2. igénypont szerinti eljárás Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu30 Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH₂ képletű peptid-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.07.01.)

8. Az l,vagy2. igénypont szerinti eljárás

35 Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-LeuLys-NH₂ képletű peptid-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.12.09.)

40

9. Az l.vagy 2. igénypont szerinti eljárás

Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-LeuLys-NH₂ képletűpeptid-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkal45 mázzuk. (Elsőbbsége: 1988.12.09.)

10. Az l.vagy 2. igénypontszerinti eljárás . Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-LeuLys-NH₂ képletű peptid-származék előállítására, azzal jelle50 mezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.12.09.)

11. Az l.vagy2. igénypontszerinti eljárás

Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-LeuLeu-NH₂

55 képletű peptid-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.12.09.)

12. Az l.vagy 2. igénypontszerinti eljárás Suc-Lys-Leu-Lys-GIu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu60 Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH₂

HU 204288 Β képletű peptid-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.12.09.)

13. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás

H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-PheTyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-AlaPhe-Ser-Ser-Ser-OH képletű peptid-származék előállítására, azzal jellemezve, hqgy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.12.09.)

14. Eljárás az RDS kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hpgy egy, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I) álalános képletű peptid-származékot vagy egy gyógyászati 5 szempontból elfogadható sóját—e képletbenX, Y, Y’, Q és Z jelentése az 1. igénypontban meghatározott — 50-99 t%mennyiségűDPPC,PC, CL,PG,PS,FAvagy TG lipiddel vagy ezek elegyével összekeverve &ógyszerkészítménnyé feldolgozzuk. (Elsőbbsége: 1988.07.

10 01.)