DE69220382T2

DE69220382T2 - Verwendung von Peptidderivaten

Info

Publication number: DE69220382T2
Application number: DE69220382T
Authority: DE
Inventors: Ichiro Azuma; Hiroshi Kitaguchi; Masayoshi Kojima; Hiroyuki Komazawa; Hideto Mori; Naoyuki Nishikawa; Mitsunori Ono; Atsushi Orikasa; Ikuo Saiki; Hideaki Satoh
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1991-02-14
Filing date: 1992-02-13
Publication date: 1997-09-18
Anticipated expiration: 2012-02-14
Also published as: EP0503301A2; EP0503301B1; DE69223266T2; EP0619118A1; EP0503301A3; JP2745351B2; JPH05186499A; DE69220382D1; DE69223266D1; US5436221A; EP0619118B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Peptidderivats, das eine Dreipeptid-Einheit enthält oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibition von Metastasen bei Tumoren.

Stand der Technik

Fibronectin ist ein Protein, das an der Kohäsion zwischen den Zellen und einem extrazellulären Substrat beteiligt ist und von dem außerdem angenommen wird, daß es eine Rolle spielt bei der Koagulation von Blutplättchen und der Metastenbildung von Tumoren. Diese Interaktionen werden durch eine Serie von Rezeptoren vermittelt, die auf dem Zelloberflächenbereich vorhanden sind. Es wird bestätigt, daß diese Rezeptoren spezifisch eine Aminosäuresequenz des Fibronectins erkennen können: Arginin-Glycin-Asparaginsäure (hiernach abgekürzt als "Arg-Gly-Asp"), obwohl das Fibronectin ein Makromolekül mit einem Molekulargewicht von ungefähr 250000 ist und es wurde berichtet, daß die Sequenz eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen den Rezeptoren und dem Fibronectin spielt (Nature, 309, 1984, S. 30). Die obengenannte Tripeptidsequenz, Arg-Gly-Asp, ist in anderen kohäsiven Proteinen, wie z.B. Bitronectin vorhanden und Fibronectin assoziiert sich mit den Rezeptoren von Zellen über die Tripeptidsequenz, um die Information des Fibronectins auf die adhärenten Zellen zu übertragen. Außerdem wird vom Fibronectin angenommen, daß es eine Bindungsfähigkeit an natürliche Makromoleküle, wie z.B. Heparin, Kollagen und Fibrin aufweist und daß es an der Adhäsion von Zellen mit interstitiellem verbindenden Geweben, wie auch an der Differenzierung und Proliferation von Zellen beteiligt ist.
Da die Proteine, die eine Zelladhäsionsaktivität aufweisen, verschiedene biologische Aktivitäten, wie oben beschrieben, aufweisen, wurden viele Studien zu den Anwendungen dieser Proteine für pharmazeutische Arzneimittel und Materialien durchgeführt. Zum Beispiel wurde über ein Verfahren zur Inhibition der Koagulation von Blutplättchen durch die Verwendung von verschiedenen linearen und cyclischen Oligopeptiden mit einer Arg-Gly-Asp-Sequenz berichtet (Polymer Preprints, Japan, 38, 1989, S. 3149; japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (hiernach bezeichnet als "JP-A-2-174797)); über ein Verfahren, bei dem ein Peptid mit einer Arg-Gly-Asp-Sequenz als Inhibitionsmittel für die Zellbewegung (JP-A-2-4716) verwendet wird; und über ein Verfahren, das als zelladhäsive Membran einen PMMA-Film verwendet, auf dem Arg-Gly-Asp-Sequenzen immobilisiert sind (Polymer Preprints, Japan, 37, 1988, 5. 705). Zusätzlich offenbaren die JP-A-l-309682 und 1-305960 ein Verfahren, bei dem Peptide mit Arg-Gly-Asp-Sequenz als essentielle Struktureinheit kovalent an ein Polymer gebunden werden und bei dem das resultierende Produkt als Substrat für die Kultivierung von tierischen Zellen oder für biologische zusammengesetzte, künstliche Organe verwendet werden und die JP-A-64-6217 offenbart ein Verfahren, bei dem eine Polypeptid mit Arg-Gly-Asp-Sequenzen als ein Schutzmittel für Blutplättchen verwendet wird bei Blut, das aus dem Körper entnommen wird.
Weiterhin wurde den zelladhäsiven Proteinen Aufmerksamkeit zuteil als Materialien, die bei der Metastasenbildung von Tumoren beteiligt sind. Während des Ablaufs von Schritten bei der Metastasenbildung von Tumoren, könnten Tumorzellen verschiedene Wirtszellen und biologische Makromoleküle kontaktieren und die Zellen bilden durch die Gegenwart von zelladhäsiven Proteinen, wie z.B. Fibronectin, Zellenkoagulationen, wodurch eine Proliferation erleichtert und ein überleben der Tumorzellen vereinfacht wird. In diesem Hinblick wird jedoch berichtet, daß, wenn die adhäsive Kernsequenz des Fibronectins, das Tripeptid Arg-Gly-Asp, in einem solchen Fall vorhanden ist, dieses Tripeptid sich mit den Rezeptoren auf der Oberfläche der Zellen in kompetitiver Weise mit den zelladhäsiven Proteinen assozueren würde und deshalb die Metastasenbildung durch den Tumor inhibieren könnte (Science, 238, (1986) S. 467). Weiterhin ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Metastasenbildung von Tumoren durch die Verwendung von einem Oligopeptid mit Arg-Gly-Asp-Sequenzen oder einem Polypeptid, das die Sequenz als sich wiederholende Einheiten aufweist, inhibiert wird (Int. J. Biol. Macromol., 11, 1989, S. 23 ff., 11, 1989, S. 226; und Jpn. J. Cancer Res., 60, 1989, S. 722).
Wie oben beschrieben, wurden viele Studien zu den Anwendungsmöglichkeiten der Aktivitäten von zelladhäsiven Proteinen, wie z.B. Fibronectin oder Peptidfragmenten davon für pharmazeutische Arzneimittel und verwandte medizinische Materialien aktiv durchgeführt und Studien zur Anwendung der adhäsiven Kernsequenz, Arg-Gly-Asp-Ser für Inhibitionsmittel für die Metastasenbildung bei Tumoren wurden insbesondere sehr intensiv durchgeführt. Jedoch wurde gemäß den soweit vorliegenden Studien die Kernsequenz als essentiell für die Expression der biologischen Aktivität betrachtet, die durch den Rezeptor und den Liganden vermittelt wird und es wurde berichtet, daß jedes Peptidanalog mit einem weiteren Aminosäurerest anstelle von einem konstituierenden Aminosäurerest, insbesondere dem Arg-Rest, die Aktivität nicht zeigen konnte (Polymer Preprints, Japan, 38 (1989) 5. 3149: J. Biol. Chem., 262 (1987) S. 17294).
Die EP-A-368486 offenbart Peptide, die die Tripeptidsequenz Arg-Tyr-Asp als Inhibitoren der Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen enthalten. Eine Substitution von Tyr durch D-Ala reduzierte die inhibitorische Fähigkeit der Peptide gemäß der EP-A-368486.
Es ist eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, eine neue Verwendung für ein Peptidderivat oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon vorzusehen, das in Blut stabil ist.
Um das obengenannte Ziel zu erreichen, haben wir systematisch verschiedene Sequenzen der adhäsiven Kernsequenz von Fibronectin, Arg-Gly-Asp-Ser, untersucht, insbesondere Analoge mit anderen verschiedenen Aminosäureresten anstelle des Gly- und Ser-Rests der adhäsiven Kernsequenz Arg-Gly-Asp-Ser und wir haben die jeweiligen biologischen Aktivitäten bestimmt, um eine neue Verwendung für Peptidderivate der adhäsiven Kernsequenz von Fibronectin zu finden, die im Blutstrom für eine lange Zeitspanne stabil sind, die einfach synthetisiert werden können und die keine gefährlichen Nebenwirkungen aufweisen und kamen so schließlich zu der vorliegenden Erfindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Peptidderivat verwendet, enthaltend 1 bis 20 Einheiten einer Peptideinheit, die durch die folgende allgemeine Formel [I] dargestellt wird, oder ein Salz davon.
[Z]-Arg-X-Asp-[Y] [I]
wobei Arg einen L- oder D-Argininrest darstellt, Asp stellt einen L-Asparaginsäurerest dar, X stellt einen L-Phenylalaninoder D-Alaninrest dar, und [Z] und [Y] stellen jeweils einen Aminosäure- oder einen peptiärest dar, der vorhanden oder nicht vorhanden sein kann und ausgewählt ist als Glycin, L-Serin, L-Threonin, L- und D-Asparaginsäure, L-Alanin, L- und D-Glutaminsäure, L-Prolinresten und einem Peptidrest, der aus den vorgenannten Aminosäureresten zusammengesetzt ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibition der Metastasenbildung bei Tumoren.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden im einzelnen beschrieben werden.
Die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, die 1 bis 20 Einheiten der Peptideinheit enthalten, wie dargestellt durch die folgende allgemeine Formel [I] oder ein Salz davon;
[Z]-Arg-X-Asp-[Y] [I]
wobei Arg einen L- oder D-Argininrest bedeutet, Asp einen L-Asparaginsäurerest bedeutet, X einen L-Phenylalanin- oder D-Alaninrest bedeutet, und [Z] und [Y] jeweils einen Aminosäure- oder einen Peptidrest bedeuten, der vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, ausgewählt aus der Gruppe Glycin, L-Serin, L-Threonin, L- und D-Asparaginsäure, L-Alanin, L- und D-Glutaminsäure, L-Prolinresten und einem Peptidrest, der durch die vorstehenden Aminosäurereste gebildet wird.
Die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können ein Peptid sein, das aus einer Einheit der Peptidsequenz besteht, die durch die Formel [I] repräsentiert wird, aber vorzugsweise bestehen sie entweder aus einem Oligopeptid oder einem Polypeptid, das zwei oder mehr der obigen Peptideinheiten enthält, wie dargestellt durch die allgemeine Formel [I], oder sie bestehen aus einer Verbindung, die aus einer oder mehreren der Peptideinheiten, wie dargestellt durch die allgemeine Formel [I], bestehen und einem oder mehreren von pharmazeutisch akzeptablen organischen Gruppen, die an die Einheiten gebunden sind, die die Wasserlöslichkeit der Verbindung aufrechterhalten und die deren biologische Aktivität nicht reduzieren.
Wenn die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden aus einem Oligopeptid oder Polypeptid bestehen, kann der Carboxylterrninus der Peptide amidiert sein.
Es ist bereits bekannt gewesen, daß die Stabilität von pharmazeutischen Arzneimitteln in lebenden Körpern nach ihrer Verabreichung, wie dargestellt durch die Zeitspanne des Verbleibs im Blutstrom und die Zeitspanne, bevor die Arzneimittel von den lebenden Körpern ausgeschieden werden, einen großen Einfluß darauf haben würde, ob die Arzneimittel in einer therapeutisch wirksamen Konzentration in den lebenden Körpern aufrechterhalten werden könnten. Das heißt, nicht nur die biologische Aktivität, sondern auch die Stabilität der Arzneimittel in lebenden Körpern ist sehr wichtig für die Arzneimittel, damit sie ausreichend wirksam sein können. Dies kann auch auf die Peptidsequenz, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, angewandt werden, die durch die allgemeine Formel [I] dargestellt ist. Wenn die Peptidsequenzen gemäß der Formel [I] selbst verabreicht werden, können die Peptidsequenzen schnell abgebaut und ausgeschieden werden und ein solcher schneller Abbau und eine Ausscheidung sind für die Peptidverbindungen im allgemeinen üblich. Es ist deshalb nicht notwendigerweise möglich, eine ausreichende biologische Aktivität der Peptidsequenzen gemäß der Formel [I] zu erwarten, wenn die Sequenzen per se verabreicht werden. Dies ist der Grund, warum wir verschiedene Peptidderivate untersucht haben, die die Peptidsequenz gemäß der Formel [I] enthielten, wie z.B. diejenigen, die aus einem Oligopeptid bestehen, das die Sequenz als sich wiederholende Einheit enthält, diejenigen, die die Sequenzen, gebunden an andere organische Gruppen, enthalten, und diejenigen, die D-Aminosäuren anstelle der korrespondierenden L-Aminosäuren enthalten und wir sind so schließlich zu der vorliegenden Erfindung gekommen.
Wie oben erklärt, sind die wichtigen Zwecke der Modifikation der Peptidsequenz mit den organischen Gruppen diejenigen, die effektive Sequenz vom Abbau durch die Enzyme in der Körperflüssigkeit zu schützen, indem die Nachbarschaft der Sequenz modifiziert wird, einer Akkumulierung der Derivate in einem spezifischen Organ zuvorzukommen oder auf diese abzuzielen, indem die Sequenz mit sauren Gruppen oder Saccharidgruppen modifiziert wird, die Derivate mit der Eigenschaft langsamer Freisetzung auszustatten, indem die Sequenz in hochmolekulare Verbindungen eingeschlossen wird und ähnliches. Deshalb, soweit die an die Sequenz zu bindenden organischen Gruppen pharmazeutisch akzeptabel sind, fähig sind, die Wasserlöslichkeit der Verbindung aufrechtzuerhalten und die biologische Aktivität der Sequenz nicht zerstören, können verschiedene organische Gruppen verwendet werden, abhängig von den Absichten.
Die organischen Gruppen werden vorzugsweise aus den substituierten und unsubstituieren Acyl-, Alkyl- und Alkylaminogruppen ausgewählt, wobei diese Gruppen vorzugsweise 1 bis 15 Kohlenstoffatome aufweisen und eine -O-, -NH-, -S-, Esterbindung, Amidbindung, Urethanbindung oder Harnstoffbindung aufweisen können und Gruppen, abgeleitet von Monosacchariden, Oligosacchariden, vorzugsweise mit 2 bis 7 Monosaccharideinheiten, Polysaccharidderivate, Polycarbonsäuren, vorzugsweise mit 2 bis 12 carboxylgruppen, Polyamine, vorzugsweise mit 2 bis 12 Aminogruppen, Polymere, die aus Monomeren mit einer ethylenisch ungesättigten Bindung gebildet werden, wie z.B. Acrylsäure, Methacrylsäure, Ethacrylsäure und Allylamin, Polyethylenglykol, vorzugsweise mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2000 bis 10000 und Carbonsäurederivate von Polyethylenoxid (PEO-Säure).
Wenn die organischen Gruppen aus denjenigen ausgewählt werden, die von den Sacchariden abgeleitet sind, enthalten die Peptidderivate gemäß der Erfindung vorzugsweise 1 bis 10 Einheiten der Peptidsequenz der Formel [I]. Wenn die organischen Gruppen aus denjenigen ausgewählt sind, die von den Polycarbonsäuren oder Polyaminen abgeleitet sind, enthalten die Peptidderivate gemäß der Erfindung vorzugsweise 1 bis 5 Einheiten der Peptidsequenz der Formel [I].
Die konstituierenden Saccharide der Monosaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide sind vorzugsweise aus z.B. Glucose, Galactose, N-Acetylglucosamin, Glucosamin, N-Acetylgalactosamin, Galactosamin, Uronsäure und Sialsäure ausgewählt und diese Saccharide können in jeder Kombination verwendet werden.
Beispiele für die Polysaccharide umfassen Chitin, Chitosan, carboxymethyliertes Chitin, sulfatiertes, carboxymethyliertes Chitin, Chondroitinsulfat, Curdlansulfat, Heparinsulfat, Keratinsulfat und Hyaluronsäure. Die Polysaccaride weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht von ungefähr 10000 bis 30000 auf.
Diese organischen Gruppen können anionische Gruppen aufweisen, wie z.B. SO&sub3;(X), -OSO&sub3;(x), -OPO&sub3;(X) und -CO&sub2;(X), wobei X ein Wasserstoffatom oder ein pharmazeutisch akzeptables Gegenanion bedeutet; vorzugsweise steht es für ein Alkalimetallanion.
Die Peptidsequenz und die organischen Gruppen sind z.B. über eine Esterbindung, Amidbindung, Urethanbindung oder Harnstoffbindung miteinander verbunden.
Insbesondere, wenn die organischen Gruppen aus denjenigen, die von z.B. Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden oder Polymeren abgeleitet sind, ausgewählt sind, können die Peptidsequenz der Formel [I] und die organische Gruppe über eine Alkylengruppe oder eine Arylengruppe verbunden sein. In solchen Fällen sind die Alkylgruppe und Arylengruppe vorzugsweise linear und substituiert, vorzugsweise mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen und können eine -O-, -NH-, -S-, Esterbindung, Amidbindung, Urethanbindung oder Harnstoffbindung aufweisen.
Die organischen Gruppen sind vorzugsweise an die Peptidsequenz der Formel [I] am Carboxyterminus oder dem Aminoterminus der Peptidsequenz gebunden. Wenn die organische Gruppe an die Peptidsequenz am aminoterminalen Ende der Peptidsequenz gebunden ist, hat der Carboxyterminus der Peptidsequenz vorzugsweise die Form von -ORa oder -NRb Rc, wobei jeder der Reste Ra, Rb und Rc ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder cyclische Alkylgruppe bedeutet und Rb und Rc miteinander verbunden sein können, um eine Ringstruktur zu bilden. Weiterhin kann Ra, Rb und Rc eine -O-, -NH-, -S-, Esterbindung, Amidbindung, Urethanbindung oder Harnstoffbindung enthalten. Ra, Rb und Rc sind vorzugsweise aus Methyl-, Ethyl-, Isopropyl- und cyclohexylgruppen ausgewählt.
Wenn die organische Gruppe an die Peptidsequenz am Carboxyterminus der Peptidsequenz gebunden ist, weist der Aminoterminus vorzugsweise ein Wasserstoffatom auf oder ist eine substituierte oder unsubstituierte Acylgruppe. Die Acylgruppe weist vorzugsweise 1 bis 15 Kohlenstoffatome auf. Bevorzugte Beispiele des Substituenten der Acylgruppe sind die vorstehenden anionischen Gruppen, wie z.B. eine carboxylgruppe und Sulfonsäuregruppe. Die Acylgruppe kann eine -O-, -NH-, -S-, Esterbindung, Amidbindung, Urethanbindung oder Harnstoffbindung aufweisen.
Das Molekulargewicht der Peptidderivate gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, soweit die biologische Aktivität der Derivate erhalten bleibt und das gesamte Derivat wasserlöslich gehalten wird, aber das durchschnittliche Molekulargewicht liegt vorzugsweise bei 1000 bis 100000.
Als Salze der Peptidderivate gemäß der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise Salze mit anorganischen Säuren, z.B. Hydrochloride, Sulfate, Nitrate, Phosphate und Borate genannt werden und Salze mit organischen Säuren, z.B. Acetate, Trifluoracetate, Trifluormethansulfonate, Lactate und Tartrate. Eine Umwandlung der Derivate in diese Salze kann in konventioneller Weise geschehen.
Bevorzugte Beispiele des Peptidderivats, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einschließlich denjenigen, die in den Beispielen beschrieben werden (Synthese der Derivate und Untersuchung ihrer biologischen Aktivität) werden unten aufgelistet, aber die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise auf diese spezifischen Beispiele begrenzt. Wenn der Aminoterminus der Peptidsequenz ein Wasserstoffatom aufweist und wenn der carboxyterminus der Peptidsequenz eine -OH-Gruppe aufweist, werden Angaben des Wasserstoffatoms und der -OH- Gruppe in den Formeln in übereinstimmung mit der Orthographie in diesem Gebiet unterlassen. Weiterhin werden D-Aminosäuren mit der Angabe von "D-" dargestellt, aber die Angaben von "L-" von L-Aminosäuren werden ausgelassen.

Referenzverbindung 1

Arg-Leu-Asp-Ser

Verbindung 6

Arg-Phe-Asp-Ser

Verbindung 10

Arg-D-Ala-Asp-Thr-NH&sub2;

Verbindung 27

Acetyl-Asp-Arg-Phe-Asp-Ser

Verbindung 28

Acetyl-D-Asp-Arg-Phe-Asp-Ser

Verbindung 45

(D-Arg-Phe-Asp)&sub2; &sub0;

Verbindung 51

NaO&sub3;SO(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-CO-Gly-D-Arg-L-Phe-Asp-Ser-NH-CH&sub3;

Verbindung 53

NaO&sub3;SO-CH&sub2;CH(OSO&sub3;Na)-CO-Arg-Phe-Asp-Ser
Die Verbindungen 56 und 60 sind diejenigen Polymere, die von jeweils den folgenden Monomeren 56 und 60 gebildet werden.

Referenzmonomer 56

CH&sub2;=CCH&sub3;-CONHCH&sub2;CH&sub2;-CO-Arg-Leu-Asp-Ser

Monomer 60

CH&sub2;=CCH&sub3;-CONHCH&sub2;CH&sub2;-CO-Gly-Arg-Phe-Asp-Ser-NH-isoC&sub3;H&sub7;

Verbindung 64

HOOC-C(CH&sub2;-O-COCH&sub2;CH&sub2;-CO-Gly-Arg-Phe-Asp-Ser)&sub3;

Verbindung 66

NaO&sub3;SO- (CH&sub2;)&sub1;&sub1;-CO-Gly-Arg-Phe-Asp-Ser-NHCH&sub3; Verbindung 83 Referenzverbindung 87 Verbindung 89 Referenzverbindung 94 und Verbindung 96
Referenzverbindung 94 W=Asp-Arg-Leu-Asp-Ser n=4
Verbindung 96 W=Gly-Arg-Phe-Asp-Ser n=4 Referenzverbindung 98 und Verbindung 100
Referenzverbindung 98 W&sub1;=SO&sub3;H oder CH&sub2;CO-ASP-Arg-Leu-Asp-Ser n=1-10
Verbindung 100 W&sub1;=SO&sub3;H oder CH&sub2;CO-Gly-Arg-Phe-Asp-Ser n=1-10

Referenzverbindung 102

Succinyliertes Polyallylamin mit -Arg-D-Leu-Asp-Ser

Verbindung 103

Succinyliertes Polyallylamin mit -(Asp-D-Arg-Phe-Asp-Ser)&sub2; trägt

Referenzverbindung 105

CM-Chitin mit -Arg-Leu-Asp-Ser

Referenzverbindung 113

Sulfatiertes CM-Chitin mit -Gly-Arg-Nle-Asp-Ser-NH-CH&sub3;

Verbindung 115

Sulfatiertes succinyliertes CM-Chitin mit -Arg-Phe-Asp-Ser-NH-iso-C&sub3;H&sub7;

Referenzverbindung 117

Chondroitinsulfat mit -Gly-D-Arg-Leu-Asp-Ser-NH-isoC&sub3;H&sub7;

Verbindung 118

Succinyliertes Chondroitinsulfat mit -D-Arg-Phe-Asp-Ser
Verfahren für die Synthese der Peptidsequenzen sind nicht auf irgendein spezifisches Verfahren begrenzt und ein geeignetes Verfahren kann aus Flüssigphasenverfahren ausgewählt werden, Festphasenverfahren und Verfahren, die eine automatische Synthesevorrichtung verwenden, abhängig von der Art der organischen Gruppe, mit der Peptidsequenzen verbunden werden sollen. Bei den Festphaseverfahren werden Oligopeptide unter Verwendung von Boc-Gruppen synthetisiert, bei der die Spaltung der Peptide von einem Harzträger und eine Eliminierung der Schutzgruppen an der Seitenkette unter Verwendung von Trifluormethansulfonsäure durchgeführt wird und die Peptide oder ihre Derivate durch HPLC (Hochdruckleistungschromatographie) zur Fraktionierung gereinigt werden und als Fraktionen, die einen einzelnen Peak zeigen, gesammelt werden. Zum Beispiel kann das Peptidderivat gemäß der vorliegenden Erfindung, Verbindung 45, unter Verwendung einer YMC-Pack ODS Säule (Länge: 500 mm, innerer Durchmesser: 20 mm) und einem geeigneten Elutionsmittel, wie z.B. 0,01N HCl/Acetonitril, 0,1% TFA/Acetonitril und 0,1% TFA/Wasser fraktioniert werden. Das Eluenz kann einen geeigneten Gradienten aufweisen. Die Peptide werden dann z.B. in Salzsäuresalz oder Essigsäuresalz umgewandelt, indem sie über eine Anionenaustauschharzsäule, wie z.B. Amberlite IRA-400, geführt werden, C1-Form und IRA-93ZU; Essigsäuresalzform. Obwohl man das so erhaltene Peptid direkt mit den organischen Gruppen reagieren lassen kann, kann es mit den organischen Gruppen modifiziert werden, bevor es von dem Harzträger gespalten wird. Bei der Synthese durch die Flüssigphasenverfahren werden die Peptide in der Regel in der wohlgeschützter Form synthetisiert, gegebenenfalls an einer spezifischen Modifikationsstelle oder -stellen von den Schutzgruppen befreit und modifiziert und dann von allen Schutzgruppen befreit.
Obwohl hier nur die repräsentativen Beispiele der Synthese der geschützten Peptide beschrieben werden, werden die Details der Syntheseverfahren von geschützten Peptiden z.B. in Lectures on Biochemical Experiments, "Chemistry of Proteins IV", S. 207 bis 495, herausgegeben von Biochemical Society of Japan, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin; Lectures on Biochemical Experiments, Second Series, "Chemistry of Proteins (the last volume)", herausgegeben von Biochemical Society of Japan, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin und "Fundamental Knowledge and Experiments of Peptide Synthesis", herausgegeben von Izumiya et al., veröffentlicht von Maruzen, beschrieben. Alternativ ist es auch möglich, kommerziell erhältliche synthetische Peptide als Intermediate zu verwenden. Die Peptide, die aus sich wiederholenden Einheiten bestehen, können einfach durch kontinuierliche Polymerisationsverfahren durch Diphenylphosphorylazid (DPPA) von N. Nishi et al.., Int. J. Peptide Protein Res., 30, S. 275 (1987) synthetisiert werden. Außerdem können die Peptide durch die Verfahren der Biotechnologie hergestellt werden.
Die Synthese des Saccharidbestandteils kann unter Verwendung einer Glycosylierungsreaktion als Schlüsselreaktion durchgeführt werden. Verschiedene Verfahren der Glycosylierung sind bekannt und die Reaktionsbedingungen können unter Berücksichtigung der Arten und Verfügbarkeit von Sacchariden und den Bedingungen der Entfernung der Schutzgruppen ausgewählt werden. Die Synthese von Saccharidwird im wesentlichen durch eine Kondensationsreaktion eines Zuckerdonors und eines Zuckerrezeptors von Alkohol in Gegenwart eines Promotors ausgeführt. Wenn z.B. Zuckerchlorid, Zuckerbromid und ähnliches als Zuckerdonor verwendet werden, können Silberoxid, Silbercarbonat, Silberperchlorat, Silbertrifluoromethansulfonat, Quecksilber(II)cyanid, Quecksilberbromid und ähnliches als Promotor verwendet werden. Wenn Zuckerfluorid und ähnliches als Zuckerdonor verwendet werden, können Zinn(II)chlorid/Silberperchlorat, Zirconocendichlorid/Silberperchlorat und ähnliches als Promotor verwendet werden. Wenn Alkylthioverbindungen von Zucker als Zuckerdonor verwendet werden, können Dimethyl (methylthio) sulfonium-Triflat, Methyl-Trifluormethan- Sulfonatester, Phenylselenyl-Triflat und ähnliches als Promotor verwendet werden. Wenn Imidatverbindungen als Zuckerdonor verwendet werden, kann die Reaktion unter Verwendung von Lewissäuren, wie z.B. Bortrifluorid/Diethyletherkomplex ausgeführt werden. Dehydratations-Trocknungsmittel, wie z.B. molekulare Siebe und Drylite können bei den oben erklärten Glycosylierungsreaktionen verwendet werden. Wenn der Zuckerdonor einen reduzierenden Endzucker eines 2-Acetamid-2-deoxyzucker, wie z.B. N-Acetylglucosamin, aufweist, kann die Glycosylierungsreaktion wirksam durch das Oxazolinverfahren durchgeführt werden.
Zuckerreste des Arylglycosid können unter Verwendung einer Reaktion von polyacetyliertem Zucker und Phenol synthetisiert werden, die in einem nichtpolaren Lösungsmittel, wie z.B. Benzol und Toluol als Schlüsselschritt erhitzt werden. Außerdem, betreffend die p-Nitrophenyl-Glycosidverbindungen, sind viele solcher Verbindungen kommerziell erhältlich.
S-Glycoside können durch das König-Knorr-Verfahren synthetisiert werden, wobei man die Zuckerdonoren von Zuckerchlorid, Zuckerbromid und ähnlichem mit Thiolverbindungen reagieren läßt. Die nukleophile Reaktivität der Thiolverbindungen ist großer als diejenige von Alkoholen und daher schreitet die Reaktion leicht voran.
Wenn die Peptidsequenzen und die pharmazeutisch akzeptablen organischen Gruppen mit Amidbindungen oder Esterbindungen gebunden sind, können die Peptidderivate gemäß der vorliegenden Erfindung, z.B. durch aktive Esterverfahren, das gemischte Säureanhydridverfahren, das Azidverfahren, das Säurechloridverfahren, das symmetrische Säureanhydridverfahren, das DCC-Verfahren, das DCC-Additivverfahren oder das carbonyldiimidazolverfahren hergestellt werden.
Die Peptidderivate, die aus Polymeren bestehen, wie z.B. Propenamidderivate, können z.B. durch konventionelle Radikalpolymerisationsverfahren oder Ionenpolymerisationsverfahren hergestellt werden.
Die resultierenden Polymere können abhängig von ihrem Molekulargewicht z.B. durch konventionelle Verfahren, wie z.B. Gelfiltration oder Dialyse aufgetrennt werden.
Der Mechanismus der starken in vivo-Aktivität zur Inhibition der Metastasenbildung von Tumoren der Peptidderivate oder ihrer Salze gemäß der vorliegenden Erfindung ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es wurde jedoch deutlich gezeigt, daß die inhibitorische Aktivität auf die Zell-Migration (Infiltration) in einem in vitro-System der vorliegenden Peptidderivate derjenigen des Peptids Arg-Gly-Asp-Ser überlegen ist, das die minimale Einheit der zelladhäsiven Proteine zur Ausübung der adhäsiven Funktion darstellt, obwohl die inhibitonsche Aktivität der Zelladhäsion und die inhibitorische Aktivität der Koagulation von Blutplättchen in einem in vitro-System der vorliegenden Peptidderivate demjenigen von Arg-Gly-Asp-Ser nicht notwendigerweise überlegen ist. Daher können die Peptidderivate oder ihre Salze gemäß der vorliegenden Erfindung Patienten gegebenenfalls zusammen mit konventionellen Trägerstoffen oder pharmazeutischen Hilfsmitteln verarbreicht werden, d.h., als eine Zusammensetzung, die mindestens eins der Peptidderivate gemäß der vöniegenden Erfindung enthält, als inhibitorische Mittel für die Metastasenbildung von Tumoren oder Krebs. Die Dosierung zur Verabreichung kann abhängig von den Bedingungen der zu behandelnden Krankheit und dem Alter und dem Körpergewicht der Patienten variieren, liegt aber in der Regel zwischen 0,2 µg/kg bis 400 mg/kg pro Tag.
Die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können über verschiedene Wege verabreicht werden, die im allgemeinen für die Verabreichung von peptidhaltiger Arzneimittel verwendet werden. Zum Beispiel werden sie vorzugsweise parenteral verabreicht, z.B. intravenös, intramuskulär und subkutan. Bei der Herstellung von injizierbaren pharmazeutischen Präparationen, die die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden enthalten, werden die Derivate z.B. in PBS und physiologischer Kochsalzlösung, wie unten beschrieben gelöst oder in ungefähr 0,1N wäßriger Essigsäuresösung gelöst und dann lyophilisiert, um eine lyophilisierte Präparation zu ergeben. Diese pharmazeutischen Präparationen können einen konventionellen Stabilisator, wie z.B. Glycin und Albumin enthalten. Zusätzlich können die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, oral in Form einer Mikrokapsel verabreicht werden, indem die Derivate z.B. in Liposmen und Mikrosphären oder in Form eines Hydrogels verkapselt werden. Zusätzlich können die Derivate, wenn sie in Form von z.B. einem Suppositonum, sublingualen Tabletten oder Nasensprays, formuliert sind, über andere muköse Schleimhäute absorpiert werden, als die des Verdauungstraktes.
Die vorliegende Erfindung wird hiernach im einzelnen beschrieben mit Bezug auf die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele, aber die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise durch diese spezifischen Beispiele begrenzt.
Die hier verwendeten Abkürzungen sind unten aufgelistet. In der Beschreibung weiter unten werden die D-Aminosäurereste mit der Angabe von "D-" beschrieben, aber für die L-Aminosäurereste wird die Angabe von "L-" unterlassen.
Boc : t-Butoxycarbonyl
Bn : Benzyl
Z : Benzyloxycarbonyl
Ac : Acetyl
Su : Succinyl
Me : Methyl
Et : Ethyl
ipr : Isopropyl
OSu : N-Hydroxysuccinimid
ONb : Nitrobenzylester
Mts : Mesitylensulfonyl
HOBt : 1-Hydroxybenzotriazol
DCC : Dicyclohexylcarbodiimid
iPr2NEt : Diisopropylethylamin
AcOH : Essigsäure
AcOEt : Ethylacetat
DMF : Dimethylformamid
CDI : Carbonyldiimidazol
TFA : Trifluoracetat
DC-Urea : Dicyclohexylharnstoff
Thr : Threonin
Arg : Arginin
Gly : Glycin
Asp : Asparaginsäure
Ser : Serin
Pro : Prolin
Val : Valin
Leu : Leucin
Phe : Phenylalanin
Phg : Phenylglycin
Ile : Isoleucin
Nle : Norleucin
Glu : Glutaminsäure
Ala : Alanin

Beispiel 1: Synthese der Referenzverbindung 1

Referenzverbindung 1 wurde durch den folgenden Weg 1 unten synthetisiert. Weg 1 Referenzverbindung 1

Synthese der Referenzverbindung (1a)

Einer DMF-Lösung (150 ml), die t-Boc-Ser(Bn) (14,8 g, 50 mMol) und NaHCO&sub3; (8,4 g, 0,1 Mol) enthielt, wurde Benzylbromid (8,55 g, 50 mMol) tröpfchenweise hinzugegeben und die Lösung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde durch Zugabe von 4%-iger wäßriger Na&sub2;CO&sub3;-Lösung und Ethylacetat extrahiert und die organischen und wäßrigen Schichten wurden getrennt. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser und Salzlösung nacheinander gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das organische Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck evaporiert um 17,0 g (4,4 Mol) der Referenzverbindung (1a) als öliges Produkt zu ergeben. Ertrag: 88%.

Synthese der Referenzverbindung (1b)

Die Referenzverbindung (1a) (17,0 g, 44 mMol) wurde in Methylenchlorid (30 ml) gelöst, mit TFA (30 ml) versetzt und 3 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Nachdem Methylenchlorid und TFA durch einen Rotationsverdampfer entfernt worden waren, wurde der Rest durch Zugabe von Ethylacetat und 4%-iger wäßriger Na&sub2;CO&sub3;-Lösung extrahiert und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel unter reduziertem Druck evaporiert worden war, wurde der Rest in einem gemischten Lösungsmittel aus Methylenchlorid (60 ml) und DMF (40 ml) gelöst, mit t-Boc-AsP(OBn) (15 g, 46 mMol) und HOBt-Monoydrat (HOBt H&sub2;O, 6,7 g, 44 mMol) versetzt und unter Kühlung auf Eis gerührt. Die Reaktiqnsmischung wurde mit DCC (10,3 g) versetzt und 2 Stunden unter Kühlung mit Eis gerührt sowie über Nacht bei Raumtemperatur. Dann wurde das prazipitierte Harnstoffderivat durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde durch Zugabe von Ethylacetat und 4%-iger wäßriger Na&sub2;CO&sub3;-Lösung extrahiert und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die Ethylacetatschicht wurde nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das neu präzipitierte Harnstoffderivat durch Filtration entfernt worden war, wurde das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde durch Chromatographie auf einer Silicagelsäure gereinigt (n-Hexan/Ethylacetat = 2/1), um die Referenzverbindung (1b) (15,8 g, 26,7 mMol) als weißen Feststoff zu ergeben. Ertrag: 61%

Synthese der Referenzverbindung (1c)

Die Referenzverbindung (1b) (15,5 g, 26,2 mMol) wurde in Methylenchlorid (30 ml) gelöst, mit TFA (30 ml) versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem Ethylenchlorid und TFA durch einen Rotationsverdampfer entfernt worden waren, wurde der Rest mit einem gemischten Lösungsmittel aus n-Hexan und Ether (5:1) versetzt und der präzipitierte weiße Feststoff der Referenzverbindung (1c) (15,0 g, 24,8 mMol) wurde durch Filtration gewonnen. Ertrag: 95%.

Synthese der Referenzverbindung (1d)

Eine Reaktionsmischung, die die Ref erenzverbindung (1c) (1,5 g, 2,48 mMol), t-Boc-Leu H&sub2;O (690 mg, 2,96 mMol), HOBt H&sub2;O (380 mg, 2,5 mMol) und Diisopropylether (0,470 µl, 2,7 mMol) in Methylenchlorid (15 ml) und DMF (7 ml) enthielt, wurde unter Kühlung mit Eis gerührt.
Diese Reaktionsmischung wurde mit DCC (570 mg) versetzt und 2 Stunden unter Kühlung mit Eis gerührt sowie über Nacht bei Raumtemperatur. Nachdem das präzipitierte Harnstoffderivat durch Filtration entfernt worden war, wurde das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Ethylacetat versetzt und mit 10%-iger wäßriger Lösung Citronensäure, 4%-iger wäßriger Lösung Na&sub2;CO&sub3;&sub1; Wasser und Salzlösung nacheinander gewaschen. Nachdem das wiederum präzipitierte Harnstoffderivat durch Filtration entfernt worden war, wurde das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde durch Chromatographie auf einer Silicagelsäule gereinigt (n-Hexan/Ethylacetat 10/1), um die Referenzverbindung (1d) (1,39 g, 2 mMol) als weißen Feststoff zu ergeben. Ertrag: 80%.

Synthese der Referenzverbindung (1e)

Die Referenzverbindung (1d) (1,15 g, 1,6 mMol) wurde in Methylenchlorid (6 ml) gelöst, mit TFA (6 ml) versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Methylenchlorid und TFA durch einen Rotationsverdampfer evaporiert worden waren, wurde der Rest durch Zugabe von Ethylacetat und 4%-iger wäßriger Na&sub2;CO&sub3;-Lösung extrahiert und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die Ethylacetatschicht wurde nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Ethylacetat unter reduziertem Druck evaporiert worden war, wurde der Rest in einem gemischten Lösungsmittel aus Methylenchlorid (15 ml) und DMF (8 ml) gelöst mit t-Boc-Arg(Z&sub2;) (970 mg, 1,8 mMol) und HOBt H&sub2;O (220 mg, 1,4 mMol) versetzt und unter Kühlung mit Eis gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit DCC (420 mg) versetzt und 2 Stunden unter Kühlung mit Eis gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur. Dann wurde das präzipitierte Harnstoffderivat durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde durch Zugabe von Ethylacetat und 4%-iger wäßriger Lösung Na&sub2;CO&sub3; extrahiert und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die Ethylacetatschicht wurde nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das wiederum präzipitierte Harnstoffderivat durch Filtration entfernt worden war, wurde das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde durch Chromatographie auf einer Silicagelsäule gereinigt (Chloroform/Ethylacetat = 10/1) und von einem gemischten Lösungsmittel aus n-Hexan und Ethylacetat (2/1) rekristallisiert, um die Verbindung (1e) (690 mg, 0,61 mMol) als weißen Feststoff zu ergeben. Ertrag: 38%, Schmelzpunkt: 100-104 ºC.

Synthese der Referenzverbindung 1

Die Referenzverbindung (1e) (590 mg, 0,53 mMol) wurde in Methylenchlorid (6 ml) gelöst, mit TFA (6 ml) versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem Ethylenchlorid und Ethylacetat durch einen Rotationsverdampfer entfernt worden waren, wurde der Rest mit Essigsäure (10 ml) und 10%-igem Palladium/Kohlenstoff (Pd/C, 60 mg) versetzt und eine Hydrogenolyse wurde über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war und die Essigsäure unter reduziertem Druck evaporiert worden war, wurde der Rest mit Ether versetzt und das Präzipitat wurde durch Filtration gewonnen.
Das so erhaltene rohe Peptid wurde in einer geringen Menge Wasser (pH 1 - 2) gelöst und auf einer Säule Amberlite IRA93ZU (Essigsäureform) mit reinem Wasser entwickelt. Positive Fraktionen mit der Ninhydrinreaktion (pH 4 - 5) wurden kombiniert, konzentriert und schließlich lyophilisiert, um die Verbindung 1 (240 mg) als weißes, amorphes Produkt zu ergeben. In der Protonen-NMR wurde eine Peak der Methylgruppe der Essigsäure bei 2,02 ppm beobachtet, dessen integrale Intensität zeigte, daß die Referenzverbindung 1 als Monosalz der Essigsäure erhalten worden war. Ertrag: 82%.
FAB-Masse: 490 (M+H)&spplus;

Beispiel 2: Synthese der Verbindung 6

Die Verbindungen (6d) wurde in derselben Weise hergestellt, wie diejenige, die bei der Synthese der Intermediatverbindung für die Synthese der Referenzverbindung 1, Referenzverbindung (1d) verwendet wurde, unter Verwendung von t-Boc-Phe anstelle von t-Boc-Leu. Dann wurde die Verbindung (6e) in selber Weise hergestellt, wie verwendet bei der Synthese der Referenzverbindung (1e) unter Verwendung der Verbindung (6d) anstelle der Referenzverbindung (1d). Schließlich wurde die Entfernung der Schutzgruppen und die Reinigung der Verbindung (6e) in selber Weise durchgeführt wie verwendet in Beispiel 1, um die Verbindung 6 in Form eines Monosalzes der Essigsäure zu erhalten.
Die Erträge der Reaktionen, Schmelzpunkte und die Massenspektren-Daten der oben erhaltenen Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung sind unten aufgeführt. Tabelle 1: Ertrag (%) Tabelle 2: Schmelzpunkt (ºC) Tabelle 3: FAB-Masse

Beispiel 3: Synthese der Referenzverbindung 56

(a) Eine wäßrige Lösung Natriumhydroxid mit β-Alanin (17,8 g, 0,2 Mol) wurde mit Methacryloylchlorid (20,9 g, 0,2 Mol) unter Kühlung mit Eis versetzt, für 4 Stunden gerührt und mit Salzsäure neutralisiert. Nachdem die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck konzentriert worden war, wurde das präzipitierte Natriumchlorid durch Filtration entfernt. Das Konzentrat wurde mit Chloroform extrahiert und getrocknet. Nachdem das Chlorofom evaporiert worden war, wurde das Konzentrat mit Ether gewaschen um Carboxymethyl-Methacrylamid als weißes festes Produkt (17,6 g) zu erhalten. Ertrag: 56%.
CH&sub2; = CCH&sub3; -CONHCH&sub2;CH&sub2;-COOH
In derselben Weise wie oben beschrieben können verschiedene Propensäurederivate hergestellt werden, z.B. aus Kombinationen von Methacryloylchlorid und 4-Aminobuttersäure, Ethacryloylchlorid und 5-Aminovaleriansäure, Methacrylsäure und 6-Aminocapronsäure, Acrylsäure und 12-Aminolaurinsäure, Acrylsäure und Leucin, Methacrylsäure und Glutamin, Acrylsäure und 2-(2-Aminoethoxy)propionsäure, Methacrylsäure und 2-(2-Aminoethoxy)essigsäure, Methacrylsäure und Glycylglycin und ähnlichem.

(b) Synthese von Boc-Arg(Mts)-Leu-Asp(OBn)-Ser(Bn)-OBn

Boc-Leu-Asp(OBn)-Ser(Bn)-OBn (Referenzverbindung (1d)) (28 g, 39 mMol) wurde einem gemischten Lösungsmittel (200 ml) TFA und CH&sub2;Cl&sub2; (1:1) hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde TFA und CH&sub2;Cl&sub2; unter reduziertem Druck evaporiert. Der Rest wurde in Ethylacetat gelöst, mit einer wäßrigen Lösung NaHCO&sub3; neutralisiert und mit einer wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen. Die Mischung wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck evaporiert.
Das erhaltene Produkt und Boc-Arg(Mts) (17,8 g, 39 mMol) wurden in DMF (400 ml) gelöst, mit DCC (8,0 g, 30 mMol) und mit HOBt (6,8 g, 45 mMol) unter Kühlung mit Eis versetzt und 3 Stunden unter Kühlung mit Eis gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur. Nachdem DC-Harnstoff durch Filtration entfernt worden wurde, wurde die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck konzentriert und der Rest wurde in Ethylacetat gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit wäßriger NaHCO&sub3;-Lösung, 1 M wäßriger Lösung Citronensäure und wäßriger NaCl-Lösung nacheinander gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trocknung unter reduziertem Druck evaporiert, um die gewünschte Verbindung als weißes Pulver (19,5 g) zu erhalten. Ertrag: 48%.

(c) Synthese des Referenzmonomers 56

Boc-Arg(Mts)-Leu-Asp(OBn)-Ser(Bn)-OBn (15,6 g, 15 mMol) wurde mit einem gemischten Lösungsmittel (100 ml) TFA und CH&sub2;Cl&sub2; (1:1) versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck evaporiert. Der Rest wurde in Ethylacetat gelöst, mit wäßriger NaHCO&sub3;-Lösung neutralisiert und mit wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Die Mischung wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck evaporiert.
Das so erhaltene Produkt und Carboxyethyl-Methacrylamid (2,4 g, 15 mMol) wurden in CH&sub2;c1&sub2; (200 ml) gelöst, mit DCC (3,1 g, 15 mMol) versetzt und 3 Stunden unter Kühlung mit Eis und weiterhin über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert und mit Aceton versetzt und der gebildete DC-Harnstoff wurde durch Filtration entfernt. Die Mischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, mit Ether gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, um ein weißes Pulver zu ergeben (10,0 g). Ertrag: 62%.
Das oben erhaltene Produkt (10,0 g, 9,3 mMol) wurde in TFA gelöst, mit einer Lösung 1 M-Tri-fluormethansulfonsäure/Thioanisol/m-Cresol in TFA unter Kühlung mit Eis versetzt und man ließ es 1 Stunde reagieren, um die Schutzgruppen zu entfernen, die an der Seitenkette sowie am Terminus des Peptids vorhanden waren. Die Reaktionslösung wurde in Ether gegossen, das resultierende ölige Präzipitat wurde in destilliertem Wasser gelöst, dann mit Ethylacetat gewaschen, über eine Anionenaustauschharzsäule geführt (Amberlite IRA-400; C1-Form), um es in ein Hydrochlorid zu überführen und lyophilisiert, um das gewünschte Monomer als weißes Festprodukt zu ergeben (4,4 g). Ertrag: 76%.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Arg: 0,9877
Leu: 0,9916
Asp: 0,9899
Ser: 0,8891
β-Ala: 1,0115
Massenspektrum (MS): M&spplus; 573

(d) Synthese der Referenzverbindung 56 (Polymerisation des Referenzmonomers 56)

Das Monomer 56 (500 mg) wurde in Wasser (5 ml) gelöst, der pH-Wert wurde auf 7,4 mit 1N NaOH eingestellt und es wurden Kaliumpersulfat (2,5 mg) und Natriumhydrogensulfit (1,0 mg) als Initiatoren hinzugefügt und man ermöglichte ihnen eine Polymerisationsreaktion unter Stickstofffluß bei 20ºC für 20 Stunden.
Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung gegen reines Wasser unter Verwendung von Spectrapore 7 (MWCO: 3000) dialysiert, um niedrigmolekulare Verbindungen zu eliminieren und lyophilisiert, um die gewünschte Referenzverbindung 56 (240 mg) zu ergeben.
Die erhaltene Referenzverbindung 56 wurde gemäß ihrem Molekulargewicht durch Gelpermeationschromatographie fraktioniert, die unter Verwendung einer TSK-Gel G3000SW Säule durchgeführt wurde, die erhältich ist von Toso Co., Ltd. und mit 0,2M Phosphatpuffer (pH 7,4) als mobiler Phase bei einer Flußrate von 1,0 ml/min. Das bestimmte Molekulargewicht der Fraktionen der Referenzverbindung 56 war wie folgt (Standard: PEG).
Fraktion 1 Molekulargewicht: ungefähr 48000 (Referenzverbindung 56-1)
Fraktion 2 Molekulargewicht: ungefähr 21000 (Referenzverbindung 56-2)
Fraktion 3 Molekulargewicht: ungefähr 12000 (Referenzverbindung 56-3)

Beispiel 4: Synthese der Referenzverbindung 56-4 (Synthese eines niedrigmolekularen Polymers durch Veränderung der Menge des Initiators)

Die Referenzverbindung 56-4 wurde in selber Weise hergestellt wie die, die in Beispiel 10 verwendet wurden, durch Verwendung der folgenden Initiatoren.
Initiator: Kaliumpersülfat 10 mg
Natriumhydrogensulfit 4 mg
Ertrag: 180 mg
Molekulargewicht: ungefähr 5000

Beispiel 5: Synthese des Referenzpolymers A

Das oben synthetisierte Carboxyethyl-Methacrylamid wurde über eine Radikalpolymerisationsreaktion wie folgt polymerisiert. Carboxyethyl-Methacrylamid (2 g) wurde in DMF (20 ml) gelöst, mit einem Radikalinitiator V65 (2,2-Azobis(2,4-dimethyl)valeronitril, Wako Junyaku Co., Ltd., 10 mg) versetzt und man ließ es unter Stickstofffluß bei 65ºC 4 Stunden polymerisieren. Das resultierende Polymer wurde mit Ethylacetat präzipitiert, gegen reines Wasser unter Verwendung von Spectrapore (MWCO: 3000) dialysiert, um die niedrigmolekulare Fraktion zu eliminieren und lyophilisiert, um das Referenzpolymer A zu erhalten (1,24 g).

Referenzpolymer A

H-(CH&sub2;-CHCH&sub3; (CONHCH&sub2;CH&sub2;COOH) )n.
Molekulargewicht (Standard: PEG): ungefähr 30000

Beispiel 6: Synthese der Verbindung 60 (Polymerisation des Monomers 60)

Die Polymerisation des Monomers 60 wurde in selber Weise durchgeführt, wie verwendet in Beispiel 3 (d).

Beispiel 7: Synthese von succinyliertem Polyallylamin

Polyallylamin (5,2 g, Nitto Boseki Co., Ltd.) und Triethylamin (15,2 g) wurden in Waser (100 ml) gelöst, mit 4-Dimethylaminopyridin (1,7 g) und Bernsteinsäureanhydrid (15,0 g) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die gewünschte Verbindung, succinyliertes Polyallylamin, wurde mit Aceton prazipitiert, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ertrag: 1,26 g, Molekulargewicht 11000.

Beispiel 8: Synthese der Referenzverbindung 102

Succinyliertes Polyallylamin mit -Arg-D-Leu-Asp-Ser
Das succinylierte Polyallylamin (0,39 g), das in Beispiel 7 erhalten wurde, wurde in Phosphatpuffer (25 ml, pH 7,4) gelöst, mit einer Lösung von 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)- Carbodiimid (0,26 g) in Phosphatpuffer (5,0 ml) bei 0ºC versetzt und man ermöglichte eine Reaktion für 1,5 Stunden. Dann wurde die Reaktionslösung mit einer Lösung von Arg-D-Leu-Asp- Ser (0,71 g), gelöst in Phosphatpuffer (10 ml), versetzt und man ließ sie über Nacht bei 4ºC reagieren. Die Reaktionslösung wurde gegen Ionen-Austauschwasser und dann gegen reines Wasser unter Verwendung von Extrapore 7 (MWCO: 8000) dialysiert, um niedrigmolekulare Verbindungen zu eliminieren, gereinigt und lyophilisiert. Ertrag: 0,71 g.
Die Struktur des Produkts wurde durch IR und Elementaranalyse bestätigt. Als Resultat der Elementaranalyse wurde festgestellt, daß die Einführungsrate des Peptidfragments bei ungefähr 15% lag. Die Einführungsrate wurde, wie beschrieben in Beispiel 44, kalkuliert.
Elementaranalyse: N; 19,80%
IR: Valenzschwingung von Amidocarbonyl (C=O) 1648 cm&supmin;¹

Beispiel 9: Synthese der Verbindung 103

Succinyliertes Polyallylamin mit -(Asp-D-Arg-Phe-Asp-Ser)&sub2;
Unter Verwendung von succinyliertem Polyallylamin (0,66 g), wie erhalten in Beispiel 7, (Asp-D-Arg-Phe-Asp-Ser)&sub2; (0,85 g) als Peptidfragment und wasserlöslichem DCC (0,26 g), wurde die Verbindung 103 in derselben Weise hergestellt wie verwendet in Beispiel 8. Ertrag: 0,71 g.
Die Struktur des Produkts wurde durch IR und durch Elementaranalyse bestätigt. Als Ergebnis der Elementaranalyse wurde die Einführungsrate des Peptidfragments, (Asp-D-Arg-Phe-Asp)&sub2; als bei ungefähr 9% liegend gefunden.
Elementaranalyse: N; 19,44%
IR: Valenzschwingung von Amidocarbonyl (C=O) 1648 cm&supmin;¹

Beispiel 10: Synthese der Verbindung 89

Verbindung 89 wurde hergestellt unter Verwendung der Startmaterial ien 4-Nitrophenyl-N-Acetyl-β-Glucosaminid, 4- Nitrophenyl-di-N-Acetyl-β-Chitobiose, 4-Nitrophenyl-di-N- Acetyl-13-Chitotriose, 4-Nitrophenyl-α-D-Glucopyranosid und 4-Nitrophenyl-α-D-maltotriosid, die kommerziell von Seikagaku Kogyo Co., Ltd. und Boeringer Mannheim & Yamanouchi Co., Ltd. erhältlich sind. Als repräsentative Beispiele der Synthese der Verbindung 89 ist die Synthese der Referenzverbindung 87 unten beschrieben.

Synthese der Referenzverbindung 87

Referenzverbindung 87 wurde über den folgenden Weg 4 unten synthetisiert. Weg 4 Intermediatverbindung Intermediat-Referenzverbindung
4-Nitrophenyl-N-Acetyl-β-Glucosaminid (3,4 g, 0,01 Mol) wurde Essigsäureanhydrid (50 ml) und Pyridin (100 ml) hinzugefügt, 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und in konventioneller Weise behandelt, um ein weißes Pulver zu ergeben. Dieses wurde wiederholt mit Ether/Hexan präzipitiert, um 3,8 g der Intermediatverbindung 1 zu ergeben.
Die Intermediatverbindung 1 (3,0 g, 0,0064 Mol) wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst und es wurden 10% Palladium/Kohlenstoff (0,3 g) hinzugefügt und die Hydrogenolyse wurde 6 Stunden unter Wasserstoffatmosphäre durchgeführt. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Filtrat konzentriert, um 2,7 g der konkreten Intermediatverbindung 2 als amorphes Produkt zu ergeben. Aufgrund der geringen Stabilität dieses Produkts wurde es im nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet.
Die Intermediatverbindung 2 (2,5 g, 0,0057 Mol) wurde in Pyridin (50 ml) gelöst, mit Glutarsäureanhydrid (684 mg, 0,006 Mol) und einer katalytischen Menge von Dimethylaminopyridin versetzt und 14 Stunden in einem Wasserbad auf 50ºC erhitzt. Nach einer konventionellen Nachbehandlung wurde der erhaltene Rest durch Chromatographie auf einer Silicagelsäule gereinigt (Elutionsmittel: Chlorofom/Methanol = 30/1), um 2,1 g der konkreten Intermediatverbindung 3 als Pulver zu ergeben.
Die Intermediatverbindung 3 (2,0 g, 0,0036 Mol) und Carbonyldumidazol (640 mg, 0,004 Mol) wurden in trocknem Tetrahydrofuran (40 ml) gelöst und auf 0ºC gekühlt. Die Boc-eliminierte Verbindung 2, wie beschrieben in Beispiel 2 (4,1 g, 0,004 Mol), die eine freie Aminogruppe aufweist, wurde in trocknem DMF (10 ml) gelöst, gekühlt und der Lösung der Intermediatverbindung 3 tröpfchenweise hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und in konventioneller Weise behandelt. Der resultierende Rest wurde durch Chromatographie auf einer Silicagelsäule gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol = 20/1), um 4, 8 g der konkreten Intermediat-Referenzverbindung 4 zu ergeben.
Die intermediäre Referenzverbindung 4 (2,0 g, 0,0013 Mol) wurde in Ethanol (20 ml) gelöst, mit wäßriger 1N NaOH-Lösung (10 ml) versetzt und 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Neutralisierung mit 1N HCl wurde das Lösungsmittel evaporiert und der Rest wurde intensiv getrocknet. Der Rest wurde in trockner DMF (15 ml) gelöst, mit einem Schwefeltrioxid/Trimethylaminkomplex (500 mg, 0,0036 Mol) versetzt und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Verschwinden des Startmaterials durch TLC bestätigt worden war, wurde die Reaktionsmischung mit einer geeigneten Menge gesättigter, wäßriger NaHCO&sub3;-Lösung versetzt, um die Reaktion zu stoppen und neutralisiert. Nach Evaporation eines Hauptteils des Lösungsmittels wurde der Rest mit Ether kristallisiert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um eine Sulfatesterverbindung zu ergeben. Dieses Produkt wurde in Essigsäure (20 ml) gelöst, mit 10% Pd/C (100 mg) versetzt und 40 Stunden bei Raumtemperatur unter Wasserstoffatmosphäre gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration über eine Celite-Schicht entfernt und die Celite-Schicht wurde mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden zusammengeführt und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde in einer geringen Menge Wasser gelöst, durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-10 gereinigt und lyophilisiert, um 710 mg der Verbindung 87 als farbloses Pulver zu ergeben.
FAB-MS: (M-H)&spplus; 998
Die Verbindung 89 wurde in derselben Weise wie oben beschrieben hergestellt. Die FAB-MS-Daten dieser Verbindungen sind unten dargestellt.
Verbindung 89 (M-H)&supmin; 700

Beispiel 11: Synthese der Referenzverbindung 94

6-O-Carboxymethyl-N-Acetyl-Chitohexaose mit -Asp-Arg-Leu-Asp- Ser
6-O-Carboxymethyl-N-Acetyl-Chitohexaose (0,5 g) wurde in reinem Waser geist, mit WSC (0,37 g) versetzt und 1 Stunde gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Asp-Arg-Leu-Asp- Ser (1,0 g) versetzt und 1 Tag gerührt. Nachdem die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck konzentriert worden war, wurde der Rest mit Ether gewaschen und mit einem Ionenaustauschharz, Amberlite IRA-93 und Sephadex G-50 gereinigt, um 0,6 g der konkreten Verbindung zu ergeben.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Asp: 2,00
Arg: 0,98
Leu. 0,95
Ser: 0,78

Beispiel 12: Synthese der Verbindung 96

6-O-carboxymethyl-N-Acetyl-Chitohexaose mit -Gly-Arg-Phe-Asp- Ser
Die Verbindung 96 wurde in selber Weise wie in Beispiel 11 hergestellt unter Verwendung von 6-O-Carboxymethyl-N-acetyl- Chitohexaose und Gly-Arg-Phe-Asp-Ser.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Gly: 0,91
Arg: 0,92
Phe: 0,94
Ser: 0,82
Asp: 1,00

Beispiel 13: Synthese der Referenzverbindung 98

6-O-sulfatiertes Carboxymethyl-N-Acetyl-Chitooligosaccharid mit -Asp-Arg-Leu-Asp-Ser
6-O-sulfatiertes Carboxymethyl-N-Acetyl-Chitooligosaccharid (0,5 g) wurde in reinem Wasser gelöst, mit WSC (0,2 g) versetzt und 1 Stunde gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Asp-Arg-Leu-Asp-Ser (1,0 g) versetzt und 1 Tag gerührt. Nachdem die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck konzentriert worden war, wurde der Rest mit Ether gewaschen und mit einem Ionenaustauschharz, Amberlite IRA-93 und Sephadex G-50 gereinigt, um 0,3 g der konkreten Referenzverbindung zu ergeben.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Asp: 2,00
Arg: 0,96
Leu: 0,96
Ser: 0,81

Beispiel 14: Synthese der Verbindung 100

6-O-sulfatiertes Carboxymethyl-N-Acetyl-Chitooligosaccharid mit -Gly-Arg-Phe-Asp-Ser
Die Verbindung 100 wurde in selber Weise wie in Beispiel 13 unter Verwendung von Gly-Arg-Phe-Asp-Ser hergestellt.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Gly: 1,04
Arg: 1,12
Phe: 0,94
Asp: 1,00
Ser: 0,84

Beispiel 15: Synthese der Referenzverbindung 105

CM-Chitin mit -Arg-Leu-Asp-Ser
CM-Chitin (Viskosität: 9 cps (1%-ige Lösung, 20ºC), Etherifizierungsgrad: 0,78, Deacetylierungsgrad: 0,5, erhältlich von Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co., Ltd., 0,30 g) wurde in Phosphatpuffer (pH 7,4) gelöst, mit einer Lösung wasserlöslichem DCC (1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-Carbodiimid 128 mg) in Phosphatpuffer (2,6 ml) versetzt, während es bei 0ºC gehalten wurde und man ließ es 1,5 Stunden reagieren. Dann wurde die Reaktionsmischung mit dem Peptid Arg-Leu-Asp-Ser (400 mg) versetzt, in Phosphatpuffer (8 ml) gelöst und man ließ es über Nacht bei 4ºC reagieren. Die Reaktionslösung wurde in ein Visking-Röhrchen gefüllt, durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser und dann gegen reines Wasser gereinigt, um niedrigmolekulare Verbindung zu eliminieren und anschließend lyophilisiert. Ertrag: 0,24 g.
Die Struktur des Produkts wurde durch IR und Aminosäureanalyse bestätigt.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Glucosamin: 20,5558
Arg: 2,0556
Leu: 2,1352
Asp: 1,9854
Ser: 1,8792
Die Einführungsrate des Peptidfragments wurde aus dem Verhältnis der Konzentration des Argininrests zu dem des Glucosamins gemäß der folgenden Relation bestimmt und es stellte sich heraus, daß sie bei ungefähr 10% lag.
Einführungsrate = [Arg] / [Glucosamin] x 100
IR: Valenzschwingung von Amidocarbonyl (C=O) 1652 cm&supmin;¹

Beispiel 16: Synthese der Referenzverbindung 113

Sulfatiertes CM-Chitin mit -Gly-Arg-Nle-Asp-Ser-NHCH&sub3;
CM-Chitin (Etherifizierungsgrad: 0,50, Deacetylierungsgrad: 0,05) wurde gemäß dem Verfahren von Tokura et al., Jpn. J. Cancer Res., 80, S. 866-872 (1989) und Cancer Res., 50, S. 3631-3637 (1990) sulfatiert und kovalent an Gly-Arg-Nle-Asp- Ser-NHCH&sub3;-Fragment in selber Weise wie verwendet in Beispiel 15 gebunden. Ertrag: 0,36 g.
Die Struktur des Produkts wurde durch IR und Aminosäureanalyse bestätigt. Durch die Aminosäureanalyse konnte eine Einführungsrate von ungefähr 12% für das Peptidfragment festgestellt werden.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Glucosamin: 33,1569
Arg: 3,9780
Gly: 3,9251
Asp: 3,6053
Ser: 3,4921
Nle: 3,5548
IR: Valenzschwingung von Amidocarbonyl (C=O) 1650 cm&supmin;¹

Beispiel 17: Synthese der Verbindung 115

Sulfatiertes succinyliertes CM-Chitin mit -Arg-Phe-Asp-Ser-NH-iso-C&sub3;H&sub7;
Succinyliertes CM-Chitin wurde in selber Weise wie verwendet in Beispiel 16 sulfatiert und kovalent mit dem Peptidfragment Arg-Phe-Asp-Ser-NH-iso-C&sub3;H&sub7; verbunden, um die Verbindung 115 zu ergeben. Ertrag: 0,37 g.
Die Struktur des Produkts wurde durch IR und Aminosäureanalyse bestätigt. Durch die Aminosäureanalyse wurde eine Einführungsrate von ungefähr 14% für das Peptidfragment festgestellt.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Glucosamin: 18,6932
Arg: 2,6170
Phe: 2,7739
Asp: 2,5931
Ser: 2,2168
IR: Valenzschwingung von Amidocarbonyl (C=O) 1654 cm&supmin;¹

Beispiel 18: Synthese der Referenzverbindung 117

Chondroitinsulfat mit -Gly-D-Arg-Leu-Asp-Ser-NH-isoC&sub3;H&sub7;
Chondroitinsulfat (Viskosität: 9 cps (1%-ige Lösung, 20ºC), Etherifizierungsgrad: 0,78, erhältlich von Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co., Ltd., 0,30 g) wurde in Phosphatpuffer (pH 7,4) gelöst, mit einer Lösung 1-Ethyl-3-(dimethyl-aminopropyl)- Carbodiimid (128 mg) in Phosphatpuffer (2,6 ml) versetzt und man ließ es 1,5 Stunden reagieren. Dann wurde die Reaktionsmischung mit dem Peptid Gly-D-Arg-Leu-Asp-Ser-NHISOC&sub3;H&sub7; (400 mg), gelöst in Phosphatpuffer (8ml), versetzt und man ließ sie über Nacht bei 4ºC reagieren. Die Reaktionslösung wurde in ein Visking-Röhrchen gefüllt, durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser und dann gegen reines Wasser gereinigt, um niedrigmolekulare Verbindungen zu eliminieren und lyophilisiert. Ertrag: 0,24 g.
Die Struktur des Produkts wurde durch IR und Aminosäureanalyse bestätigt. Durch die Aminosäureanalyse wurde eine Einführungsrate von ungefähr 10% für das Peptidfragment festgestellt.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Glucosamin: 20,5558
D-Arg: 2,0556
Gly: 2,1352
Asp: 1,9854
Ser: 1,8792
Leu: 1,9790
IR: Valenzschwingung von Amidocarbonyl (C=O) 1652 cm&supmin;¹

Beispiel 19: Synthese der Verbindung 118

Succinyliertes Chondroitinsulfat mit -D-Arg-Phe-Asp-Ser
Das Chondroitinsulfat (20,0 g) war dasselbe, wie verwendet in Beispiel 18, wurde in 1%-iger Triethylaminlösung (10 ml) gelöst, mit Bernsteinsäureanhydrid (34,0 g) und mit 4-Dimethylaminopyridin (2,00 g) versetzt bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionslösung in einen großen überschuß Aceton gegossen, um das succinylierte Chondroitinsulfat zu prazipitieren. Die wiedergewonnenen Präzipitate wurden mit einer großen Menge Methanol und mit Ether gewaschen und in Vakuum getrocknet. Ertrag: 22,40 g.
Das succinylierte Chondroitinsulfat (0,30 g) wurde in Phosphatpuffer (pH 7,4) gelöst, mit einer Lösung 1-Ethyl-3- (dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (128 mg) in Phosphatpuffer (2,6 ml) versetzt, während es bei 0ºC gehalten wurde und man ließ es 1,5 Stunden reagieren. Dann wurde die Reaktionsmischung mit dem Peptid D-Arg-Phe-Asp-Ser (400 mg) gelöst in Phosphatpuffer (8 ml), versetzt und man ließ sie über Nacht bei 4ºC reagieren. Die Reaktionslösung wurde in ein Visking- Röhrchen gefüllt, durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser und dann gegen reines Wasser gereinigt, um niedrigmolekulare Verbindungen zu eliminieren und lyophilisiert. Ertrag: 0,26 g.
Die Struktur des Produkts wurde durch IR und Aminosäureanalyse bestätigt. Durch die Aminosäureanalyse wurde eine Einführungsrate von ungef hr 10% für das Peptidfragment festgestellt.

Aminosäureanalyse (nMol/50 µl)

Glucosamin: 23,6218
D-Arg: 2,3622
Phe: 2,1253
Asp: 2,2391
Ser: 2,0031
IR: Valenzschwingung des Amidocarbonyl (C=O) 1652 cm&supmin;¹
Pharmakologischer Test: Experimentelle Tumormetastasenbildung in Lungen, Leber und Milz
Die inhibitorischen Aktivitäten auf die Tumormetastasen der Peptidderivate gemäß der vorliegenden Erfindung werden wie folgt untersucht.
Jedes der folgenden Peptidderivate gemäß der vorliegenden Erfindung, Verbindungen 6, 10, 89, 96, 103 und 118, wurde mit B16-8L6 Melanomzellen mit einer starken metastatischen Tendenz in PBS vermischt, so daß 0,2 ml der Mischung 3000, 1000 oder 500 µg des Peptidderivats enthielt und 5 x 10&sup4; B16-BL6 Melanomzellen. Dann wurden 0,2 ml von jeder Mischung intravenös jedem Individuum einer Gruppe von weiblichen C57BL/6 Mäusen, bestehend aus 5 Mäusen, verabreicht. Vierzehn Tage nach der Verabreichung wurde die Anzahl der Melanomzellenkolonien in den Lungen bestimmt und mit denen der Kontrollmäuse verglichen, denen PBS verabreicht worden war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt.
Zum Vergleich wurden die Peptidfragmente, von denen bekannt ist, daß sie eine inhibitorische Aktivität auf die Tumormetastasenbildung haben, Arg-Gly-Asp-Ser (Vergleich A), Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (Vergleich B) und (Arg-Gly-Asp)n (n=5), wie auch das Referenzpolymer A ebenfalls den Mäusen in derselben Weise wie oben verabreicht.
Wie ersichtlich aus den Ergebnissen in Tabelle 4, inhibierten die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, die Metastasen der Tumorzellen in den Lungen sehr viel effektiver als die konventionellen adhäsiven Peptidsequenzen. Dies zeigt deutlich, daß die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden und eine höhere inhibitorische Aktivität auf die Tumormetastasenbildung haben als die konventionellen Peptidverbindungen. Insbesondere die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die die Peptidsequenzen enthalten, die mit organischen Gruppen modifiziert sind, zeigen eine hohe inhibitorische Aktivität bei einer geringen.Verabreichungsdosierung und dies bedeutet, daß die Verstärkung der Aktivität durch die Modifizierung mit den organischen Gruppen, die eines der wichtigsten Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung ist, erfolgreich erzielt worden ist.
Es wurde außerdem festgestellt, daß die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eine hohe inhibitorische Aktivität auf die Tumormetastasenbildung ausüben, obwohl die Derivate 5 Minuten nach der Verabreichung von B16-8L6-Zellen ohne Mischung der Derivate und der Tumorzellen verabreicht wurden.
Dies bedeutet, daß die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, den inhibitorischen Effekt auf die Tumormetastasenbildung bei Patienten mit Krebs ausüben können, wenn die Derivate den Patienten in einer geeigneten Weise, wie z.B. durch intravenöse Injektion, verabreicht wurden. Tabelle 4 Inhibitorische Wirkung auf die experimentelle Melanommetastasenbildung in Lungen, verursacht durch Injektion von B16-BL6-Melanomzellen
* p < 0,01, verglichen mit der Kontrolle in t-Test
** p < 0,001, verglichen mit der Kontrolle in t-Test

Toxizität

Bei den obigen in vivo-Tests wurde bestätigt, daß die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, keine Zytotoxizität auf Erythrozytenzellen, Milzzellen und Thymuszellen der Wirtsmäuse aufweisen und keine unerwünschte Serumprotein-Koagulationsaktivität.
Wie oben beschrieben, weisen die Peptidderivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, höhere inhibitorische Aktivitäten auf die Tumormetastasenbildung auf, verglichen mit den Kernsequenzen der zelladhasiven Proteine und sie zeigen fast keine Toxizitätsprobleme. Die Strukturen der Verbindungen sind sehr einfach und deshalb sind die Peptidderivate gemäß der vorliegenden Erfindung sehr wertvoll als pharmazeutische Arzneimittel

Claims

1. Verwendung eines Peptidderivates, enthaltend 1 bis 20 Einheiten einer Peptideinheit, die durch die folgende allgemeine Formel (1) dargestellt wird, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, zum Herstellen einer pharmazeutischen zusammensetzung zum Inhibieren von Tumormetastasen:

(Z]-Arg-X-Asp-[Y] (1]

wobei Arg einen L- oder D-Argininrest darstellt, Asp stellt einen L-Asparaginsäurerest dar, X stellt einen L-Phenylalanin- oder D-Alaninrest dar, und [Z] und (Y] stellen jeweils einen Aminosäure- oder einen Peptidrest dar, der vorhanden oder nicht vorhanden sein kann und ausgewählt ist aus Glycin, L-Serin, L-Threonin, L- und D- Asparaginsäure, L-Alanin, L- und D-Glutaminsäure, L- Prolinresten und einem Peptidrest, der aus den vorgenannten Aminosäureresten zusammengesetzt ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Peptidderivat ein Oligopeptid oder ein Polypeptid ist, das aus einer oder mehreren Peptidsequenzen der Formel [I] oder pharmazeutisch verträglichen Salzen davon, deren/dessen Carboxylterminus amidiert sein kann, zusammengesetzt ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Peptidderivat 2 bis 20 Einheiten der Peptidsequenz der Formel [I] oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon umfaßt.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Peptidderivat eine Verbindung ist, die aus einer oder mehreren der durch die allgemeine Formel [I] dargestellten Peptideinheiten und einer oder mehreren, an die Einheiten gebundenen pharmazeutisch verträglichen organischen Gruppen besteht, wobei die organischen Gruppen die Wasserlöslichkeit der Verbindung aufrechterhalten und die biologische Aktivität der Verbindung nicht verringern, wobei die organische Gruppe ausgewählt ist aus

(i) Acyl-, Alkyl- und Alkylaminogruppen, wobei diese Gruppen eine -O-, -NH-, -S-, Esterbindung, Amidbindung, Urethanbindung oder Harnstoffbindung enthalten können und

(ii) Gruppen, die von Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysaccharidderivaten, Polycarbonsäuren, Polyaminen, aus Monomeren mit einer ethylenisch ungesättigten Gruppe gebildeten Polymeren, Polyethylenglykol und Carbonsäurederivaten von Polyethylenoxid abgeleitet sind, wobei diese Gruppen an die Peptidsequenzen über eine Alkylengruppe oder eine Arylengruppe gebunden sein können, wobei die Alkylen- oder Arylengruppen eine -O-, -NH-, -S-, Esterbindung, Amidbindung, Urethanbindung oder Harnstoffbindung enthalten können.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die organische Gruppe an die Peptidsequenzen an den Aminotermini der Peptidsequenzen gebunden ist und die Carboxyltermini der Peptidsequenzen eine Gruppe -ORa oder -NRb, Rc haben, wobei Ra, Rb und Rc jeweils ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder cydische Alkylgruppe darstellen und Rb und Rc aneinander gebunden sein können, um eine Ringstruktur zu bilden.

6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die organische Gruppe an die Peptidsequenzen an den Carboxyltermini der Peptidsequenzen gebunden ist und die Aminotermini ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Acylgruppe haben.

7. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Peptidderivat ein Polypeptid ist, das 2 bis 20 Einheiten der Peptidsequenz der Formel [I] umfaßt, wobei der Aminoterminus des Polypeptids eine substituierte oder unsubstituierte Acylgruppe und der Carboxylterminus des Polypeptides eine substituierte oder unsubstituierte lineare oder cyclische Alkylaminogruppe hat.

8. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Peptidderivat 1 bis 5 Einheiten der Peptidsequenz der Formel [I] oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon umfaßt und die organische Gruppe aus von Polycarbonsäuren oder Polyaminen abgeleiteten Gruppen ausgewählt ist.

9. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Peptidderivat 1 bis 10 Einheiten der Peptidsequenz der Formel [I] oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon umfaßt und die organische Gruppe aus den von Polyethylenglykol abgeleiteten Gruppen ausgewählt ist.

10. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Peptidderivat 1 bis 10 Einheiten der Peptidsequenz der Formel [I] oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon umfaßt und die organische Gruppe aus den von Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysaccharidderivaten abgeleiteten Gruppen ausgewählt ist.