DE69119185T2 - Derivate von Carboxymethyl-Chitin und ihre Verwendung - Google Patents

Derivate von Carboxymethyl-Chitin und ihre Verwendung

Info

Publication number
DE69119185T2
DE69119185T2 DE69119185T DE69119185T DE69119185T2 DE 69119185 T2 DE69119185 T2 DE 69119185T2 DE 69119185 T DE69119185 T DE 69119185T DE 69119185 T DE69119185 T DE 69119185T DE 69119185 T2 DE69119185 T2 DE 69119185T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
chitin
amino acid
group
derivative
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69119185T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69119185D1 (de
Inventor
Masayoshi Kojima
Hiroyuki Komazawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Holdings Corp
Original Assignee
Fuji Photo Film Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP3066156A external-priority patent/JP2662830B2/ja
Application filed by Fuji Photo Film Co Ltd filed Critical Fuji Photo Film Co Ltd
Publication of DE69119185D1 publication Critical patent/DE69119185D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69119185T2 publication Critical patent/DE69119185T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C07K9/005—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure containing within the molecule the substructure with m, n > 0 and m+n > 0, A, B, D, E being heteroatoms; X being a bond or a chain, e.g. muramylpeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf CM-Chitinderivate mit einem Tripeptid, Arg-Gly-Asp, als wesentlicher Einheit und Salze davon, wie auch auf eine Zusammensetzung zum Hemmen der Adhäsion tierischer Zellen und auf eine Zusammensetzung zum Hemmen der Koagulation oder Adhäsion von Blutplättchen.
  • Fibronectin ist ein Protein, das bei der extrazellulären Zellsubstratadhäsion und wahrscheinlich bei der Koagulation von Blutplättchen und der Krebsmetastasierung eine Rolle spielt. Diese Wechselwirkungen werden durch eine Reihe von Rezeptoren, die im Zelloberflächenbereich vorhanden sind, vermittelt; es ist bestätigt, daß diese Rezeptoren spezifisch die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp des Fibronectins erkennen können, obwohl Fibronectin ein Makromolekül mit einem Molekulargewicht von ungefähr 250000 ist; es ist berichtet worden, daß die Sequenz eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung zwischen den Rezeptoren und Fibronectin spielt (Nature, 1984, 309, S. 30). Seit dieser Zeit sind viele Studien durchgeführt worden, in denen ein oligopeptid oder Polypeptid mit einer solchen Aminosäuresequenz verwendet wurde.
  • Es ist über verschiedene Studien berichtet worden, beispielsweise über ein Verfahren zum Hemmen der Koagulation von Blutplättchen unter Verwendung von verschiedenen linearen und zyklischen Oligopeptiden mit einer Arg-Gly-Asp-Sequenz (Polymer Prepints, Japan, 1989, 38, S. 3149; japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (nachstehend als "J.P. KOKAI" bezeichnet) Nr. Hei 2-174797), ein Verfahren, in dem ein Peptid mit einer Arg-Gly-Asp-Sequenz als Zellbewegungs-hemmendes Agens verwendet wird (J.P. KOKAI Nr. Hei 2-4716) und ein Verfahren unter Verwendung einer PMMA-Schicht als zelladhäsive Membran, auf der Arg-Gly-Asp-Sequenzen immobilisiert sind (Polymer Preprints, Japan, 1988 37 S. 705). Weiterhin offenbaren J.P. KOKAI Nr. Hei-309682 und Hei 1-305960 ein Verfahren, welches Peptide mit Arg-Gly-Asp-Sequenzen als wesentliche Struktureinheiten umfaßt, die kovalent an ein Polymer gebunden sind, und das erzeugte Produkt wird als Substrat zum Kultivieren von tierischen Zellen oder für biologische, künstliche Verbundorgane verwendet; und J.P. KOKAI Nr. Sho 64-6217 offenbart ein Verfahren, in dem ein Polypeptid mit Arg-Gly-Asp-Ser-Sequenzen als Plättchen- Schutzagens für dem Körper entnommenes Blut verwendet wird. Ferner ist ein Verfahren bekannt, welches das Hemmen der Metastasierung von Krebs unter Verwendung eines Oligopeptids mit Arg-Gly-Asp-Sequenzen oder eines Polypeptids mit dieser Sequenz als Wiederholungseinheiten umfaßt (Int. J. Biol. Macromol., 1989 11 S. 23; ibid, 1989, 11 S. 226; Jpn. J. Cancer Res., 1989 60 S. 722).
  • Chitin ist ein Polysaccharid, in dem N-Acetyl-D-glucosamin über eine β-(1 T 4)-Bindung verknüpft ist, und ein Hauptbestandteil des Exoskeletts von Krustentieren und Insekten. Es ist weit verbreitet in niederen Tieren und in Invertebraten, und dient dazu, die Organe zu unterstützen und/oder zu schützen. Dessen Funktionen entsprechen denjenigen von Zellulose in der Pflanze. Chitin wird auch als letzte Biomasse bezeichnet; Derivate davon sind kürzlich auf verschiedene Weise untersucht worden, und insbesondere ist über viele Studien betreffend in Lösungsmittel lösliche Chitinderivate berichtet worden. Unter diesen ist CM- Chitin, in dem eine Carboxymethylgruppe an die C-6- Hydroxylgruppe gebunden ist, wasserlöslich und eine sehr wichtige Verbindung als Ausgangsmaterial für das Herstellen verschiedener Chitinderivate. Chitin und dessen Derivate sind genau beschrieben in "Applications of Chitin and Chitosan", herausgegeben von der Gesellschaft für Chitin- und Chitosan- Forschung und veröffentlicht durch die Gihodo Publishing Company und "The Last Biomass: Chitin und Chitosan", herausgegeben von derselben Gesellschaft und veröffentlicht durch die Gihodo Publishing Company.
  • CM-Chitin verursacht eine Deacetylierung während einer Carboxylierung, und dies deutet das Vorhandensein einer Aminogruppe zusätzlich zu einer Carboxylgruppe an. Dessen Aminogruppe kann leicht eine Carboxylierung mit einer dibasischen Säure oder einem Derivat davon, vorzugsweise einem polybasischen Säureanhydrid, eingehen. Die N,O-Sulfatierung von CM-Chitin ist auch einfach. Jedoch ist bisher keine Verbindung bekannt geworden, die ein Oligopeptid mit einer Arg-Gly-Asp-Sequenz als wesentlicher Einheit oder ein Polypeptid mit den Sequenzen als Wiederholungseinheit umfaßt. Wenn ein solches Oligopeptid oder Polypeptid in eine Verbindung eingeführt wird, würde erwartet werden, daß deren Fähigkeit, an einen Rezeptor zu binden und deren Stabilität im Blut stark verbessert sind.
  • Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues CM-Chitinderivat bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung zum Hemmen der Adhäsion von tierischen Zellen, welche das Chitinderivat als einen wesentlichen Bestandteil enthält, bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine Zusammensetzung zur Unterdrückung der Koagulation oder Adhäsion von Blutplättchen bereitzustellen, welche das neue CM- Chitinderivat als einen wirksamen Bestandteil umfaßt.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung, wird ein CM- Chitinderivat, welches als wesentliche Einheit ein adhäsives Peptid, das durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt ist, über eine Amidbindung, Esterbindung, Etherbindung oder Urethanbindung in der Seitenkette aufweist, oder ein Salz davon bereitgestellt:
  • -[R¹] - [CO] - ([X] -Arg-Gly-Asp- [Y])n - [Z] - [R²] - (I)
  • In der allgemeinen Formel (I) bedeutet [ ], daß die entsprechende Gruppe oder der entsprechende Rest in der Klammer vorhanden oder abwesend sein kann, und X und Y bedeuten jeweils, wenn sie vorhanden sind, einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ser, Gly, Val, Asn und Pro, oder einen Peptidrest, bestehend aus zwei oder mehr Aminosäuren; Z bedeutet -O- oder -NH-; einer der Reste R¹ und R² bedeutet ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen oder einer Arylgruppe mit 6 bis 9 Kohlenstoffatomen, worin die Alkyl- und Arylgruppen sustituiert sein können, und der andere Rest ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte Alkylengruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen oder eine Arylengruppe mit 6 bis 9 Kohlenstoffatomen, worin die Alkylen- und Arylengruppen substituiert sein können; und n ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5.
  • Beispiele für die Substituenten für R und R umfassen Halogenatome, Carbonyl-, Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl-, Sulfo-, Aryl-, Nitro- und Cyanogruppen, eine ungesättigte Doppelbindung und Dreifachbindung; und sie können zwei oder mehrere Substituenten haben.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zum Hemmen der Adhäsion von tierischen Zellen oder zum Unterdrücken einer Koagulation oder Adhäsion von Blutplättchen bereitgestellt, welche das vorstehend erwähnte CM-Chitinderivat als einen wesentlichen Bestandteil umfaßt.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein CM- Chitinderivat, in dem ein adhäsives Peptid mit einer Arg-Gly- Asp-Sequenz als wesentlicher Einheit kovalent an ein sulfatiertes CM-Chitin, carboxyliertes CM-Chitin oder CM-Chitin gebunden ist. Das Molekulargewicht der CM-Chitinderivate ist nicht größer als 200000, insbesondere 3000 bis 100000, und das Derivat ist vorzugsweise bei Raumtemperatur in Wasser löslich.
  • Beispiele für hierin verwendbare, carboxylierende Mittel sind Bernsteinsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Phthalsäureanhydrid, Itaconsäureanhydrid, Citraconsäureanhydrid, Pyromellitsäureanhydrid und Trimellitsäureanhydrid. In dem adhäsiven Peptid verwendbare Aminosäuren können entweder L- oder D-Isomere und vorzugsweise L-Isomere sein.
  • Beispiele für Salze der erfindungsgemäßen CM-Chitinderivate sind solche mit anorganischen Säuren, wie Hydrochloride, Sulfate, Nitrate, Phosphate und Borate; und solche mit organischen Säuren, wie Acetate, Trifluoracetate, Trifluormethansulfonate, Lactate und Tartrate.
  • Verfahren zum Synthetisieren dieser Peptide sind nicht auf spezifische Verfahren beschränkt und können Flüssigphasen- und Festphasenverfahren sein und solche, in denen ein automatisches Synthetisiergerät verwendet wird. Diese Syntheseverfahren sind genau beschrieben in beispielsweise, Lectures on Biochemical Experiments, "Chemistry of Proteins IV", S. 207-495, herausgegeben von Biochemical Society of Japan, veröffentlicht durch Tokoy Kagaku Dojin Publishing Company; Lectures on Biochemical Experiments, Second Series, "Chemistry of Proteins (der letzte Band)", herausgegeben von Biochemical Society of Japan, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin Publishing Company; und "Foundamental Knowledge and Experiments of Peptide Synthesis", herausgegeben von Izumiya et al., veröffentlicht von Maruzen Publishing Company.
  • Alternativ ist es auch möglich, kommerziell erhältliche, synthetische Peptide zu verwenden.
  • Amidbindung-bildende Verfahren, in welchen Agenzien, wie Cyanogenbromid, Säureazide oder wasserlösliche Carbodiimide eingesetzt werden, können zum Verknüpfen des OM-Chitins oder carboxylierten CM-Chitins mit einem adhäsiven Peptid verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen CM-Chitinderivate haben eine Kernsequenz, Arg-Gly-Asp, eines zellbindenden Proteins, und sind über die Kernsequenz gemäß einem Mechanismus, der ähnlich zu demjenigen des zelladhäsiven Proteins ist, an Zellen angehaftet. Aus diesem Grund dienen sie als Agonisten oder Antagonisten des zelladhäsiven Proteins, die verschiedene biologische Aktivitäten, wie eine immunregulierende Wirkung, eine wundheilende Wirkung, eine Wirkung zum Hemmen einer in Blutgefäßen beobachteten Plättchenkoagulation und eine Nervenkrankheiten heilende Wirkung, ausüben.
  • Folglich kann mindestens eines der erfindungsgemäßen CM- Chitinderivate zusammen mit gewöhnlich verwendeten, wahlweisen Trägern oder pharmazeutischen Hilfsmitteln in der Form wundheilender Mittel, immunregulierender Mittel oder die Plättchenkoagulation oder -adhäsion hemmender Mittel verabreicht werden. Insbesondere werden die Derivate vorzugsweise als die Adhäsion tierischer Zellen hemmende Mittel oder als die Plättchenkoagulation oder -adhäsion hemmende Mittel verwendet. Die Dosis variiert in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, wie die zu behandelnden Zustände, das Alter und Gewicht der Patienten, und liegen gewöhnlich im Bereich von 0,2 µg/kg bis 400 mg/kg.
  • Die CM-Chitinderivate können über verschiedene Wege verabreicht werden, die gewöhnlich für die Verabreichung von peptidhaltigen Arzneimitteln verwendet werden. Z.B. werden sie vorzugsweise parenteral, intravenös, intramuskulär und subkutan verabreicht. Für die Herstellung von dasselbe enthaltenden, injizierbaren, pharmazeutischen Präparaten wird das Chitinderivat beispielsweise in PBS oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst, um eine injizierbare Lösung zu erzeugen. Diese pharmazeutischen Präparate können ein gewöhnlich verwendetes Stabilisierungsmittel, wie Glycin und Albumin, umfassen. Weiterhin kann das Chitinderivat dadurch parenteral verabreicht werden, daß es in Liposomen eingeschlossen wird, um Mikrokapseln zu erzeugen. Wenn sie weiterhin in der Form von beispielsweise Zäpfchen, sublinguale Tabletten oder Nasensprays formuliert werden, können sie durch andere Schleimhäute als diejenigen des Verdauungstrakts absorbiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer mit Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Arbeitsbeispiele und Herstellungsbeispiele erklärt, wobei die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls auf diese spezifischen Beispiele beschränkt ist.
    • Herstellungsbeispiel 1: Synthese von kohäsiven Peptiden durch ein Festphasenverfahren
  • Die Synthese dieses Peptids wurde unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts gemäß dem Merrifield-System durchgeführt. α-Aminogruppen wurden mit Boc geschützt, und das erzeugte Peptid wurde durch präparative Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt, nachdem es von der Festphase getrennt worden war, um ein adhäsives, synthetisches Peptid, welches einen einzelnen Peak zeigt, zu erzeugen. Synthetisierte, adhäsive Peptide Name Strukturformel Sequenz-Nr. Ausbeute Peptid H-Arg-Gly-Asp-OH
    • Herstellungsbeispiel 2: Synthese von Peptid-5: H-(Arg-Gly-Asp- Ser-Gly)-NH&sub2; (Sequenz-Nr. 5)
  • Das Peptid-5 wurde durch ein Flüssigphasenverfahren gemäß einem sequenziellen Extensionsverfahren hergestellt.
    • (1) Synthese von Boc Ser((Bzl)GLyNH&sub2;
  • In 400 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden 59 g (0,2 mol) Boc Ser(Bzl) gelöst, und danach wurden 41,2 g (0,2 mol) DCC unter Eiskühlung zugegeben. Eine Lösung von 22,1 g GLyNH&sub2; HCl in 400 ml CH&sub2;Cl&sub2;, welche danach durch die Zugabe von 20,2 g N-Methylmorpholin unter Eiskühlung neutralisiert wurde, wurde zu der erhaltenen Lösung zugegeben. Die Mischung wurde für 3 Stunden unter Eiskühlung und danach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abtrennen von gebildeten Präzipitaten durch Filtration wurde das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert, und danach wurde der erhaltene Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung, einer wäßrigen 1M Citronensäurelösung und danach mit einer wäßrigen NaCl- Lösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft, um 58,3 g (Ausbeute 83%) des Produkts als weißes Pulver zu erzeugen.
    • (2) Synthese von BocAsp(OBzl)Ser((Bzl)GLyNH&sub2;
  • 400 ml TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (=1/1) wurden zu 56,2 g (0,16 mol) BocSer((Bzl)GLyNH&sub2; gegeben, die erhaltene Mischung wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, und TFA und CH&sub2;Cl&sub2; wurden unter reduziertem Druck durch Konzentrierung entfernt, worauf Lösen in Ethylacetat, Neutralisieren mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung und Waschen mit einer wäßrigen NaCl-Lösung folgte. Nach Trocknen der Lösung über Na&sub2;SO&sub4; wurde das Ethylacetat durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt.
  • Die erzeugte Verbindung und 51,7 g (0,16 mol) BocAsp(OBzl) wurden in 800 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, worauf die Zugabe von 33 g (0,16 mol) DCC unter Eiskühlung, und Rühren für 3 Stunden und weiterhin über Nacht bei Raumtemperatur folgte. Nach Abdestillieren von CH&sub2;Cl&sub2; unter reduziertem Druck wurde der entstandene Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung, einer wäßrigen 1M Citronensäurelösung und danach mit einer wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft, um 71,2 g (Ausbeute 80%) des Produkts als weißes Pulver zu erzeugen.
    • (3) Synthese von BocGlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)GLyNH&sub2;
  • 400 ml TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (=1/1) wurden zu 66,7 g (0,12 mol) BocAsp(OBzl)Ser((Bzl)GLyNH&sub2; gegeben, die entstandene Mischung wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, und TFA und CH&sub2;Cl&sub2; wurden unter reduziertem Druck durch Konzentrierung entfernt, worauf Lösen in Ethylacetat, Neutralisieren mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung und Waschen mit einer wäßrigen NaCl- Lösung folgte. Nach Trocknen der Lösung über Na&sub2;SO&sub4; wurde das Ethylacetat durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt.
  • Die entstandene Verbindung und 51,7 g (0,12 mol) BocGly wurden in 700 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, worauf die Zugabe von 24,7 g (0,12 mol) DCC unter Eiskühlung und Rühren für 3 Stunden und weiterhin über Nacht bei Raumtemperatur folgte. Nach Entfernen des entstandenen DCurea durch Filtration und Abdestillieren von CH&sub2;Cl&sub2; unter reduziertem Druck wurde der entstandene Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung, einer wäßrigen 1M Citronensäurelösung und danach mit einer wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft, um 61,8 g (Ausbeute 84 %) des Produkts als weißes Pulver zu erzeugen.
    • (4) Synthese von BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser((Bzl)GLyNH&sub2;
  • 400 ml TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (=1/1) wurden zu 61,3 g (0,1 mol) BocGlyAsp(OBzl)Ser((Bzl)GLyNH&sub2; zugegeben, die erhaltene Mischung wurde für eine Stunde beim Raumtemperatur gerührt, und TFA und CH&sub2;Cl&sub2; wurden unter reduziertem Druck durch Konzentrierung entfernt, worauf Lösen in Ethylacetat, Neutralisieren mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung und Waschen mit einer wäßrigen NaCl-Lösung folgte. Nach Trocknen der Lösung über Na&sub2;SO&sub4; wurde das Ethylacetat durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt.
  • Die entstandene Verbindung und 45,6 g (0,1 mol) BocArg(Mts) (Mts: eine Mesitylen-2-sulfonyl-Gruppe) wurden in 800 ml DMF gelöst, worauf die Zugabe von 22,5 g (0,1 mol) DCC und 14 g (0,1 mol) HOBt under Eiskühlung und Rühren für 3 Stunden und weiterhin über Nacht bei Raumtemperatur folgte. Nach Entfernen des entstandenen DCurea durch Filtration und Abdestillieren des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde der entstandene Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung, einer wäßrigen 1M Citronensäurelösung und danach mit einer wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft, um 42,8 g (Ausbeute 45%) des Produkts als weißes Pulver zu erzeugen.
    • (5) Entfernung der Schutzgruppen (Synthese von Peptid-5)
  • Zu einer Lösung von BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser((Bzl)GLyNH&sub2; (5 g; 5,3 mM) in TFA wurde unter Eiskühlung eine 1M-Lösung von Trifluormethansulfonsäure-Thioanisol-m-Cresol in TFA zugegeben, um diese für eine Stunde reagieren zu lassen, und danach wurden die an den Seitenketten und Enden des Peptids vorhandenen Schutzgruppen entfernt. Die Reaktionsiösung wurde in Ether gegossen, die entstandenen öligen Präzipitate in destilliertem Wasser gelöst, danach mit Ethylacetat gewaschen und durch eine mit einem Anionaustauschharz (Amberlite IRA-400Cl-Typ) gepackten Säule geschickt, um auf diese Weise eine Umwandlung in ein Hydrochlorid zu erreichen, und lyophilisiert, um 2,17 g (Ausbeute 86%) eines weißen Feststoffes zu erzeugen. Aminosäureanalyse (nmol/50µl) Arg Gly Asp Ser Massenspektrum: M&spplus; 404
    • Herstellungsbeispiel 3: Synthese von Peptid-6: H-(Gly-Arg-Gly- Asp-Ser-Pro)-OH (Sequenz-Nr. 6)
  • Die Synthese von diesem Peptid wurde unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts gemäß dem Merrifield-System durchgeführt. α-Aminogruppen wurden mit Boc geschützt, das entstandene Peptid wurde durch präparative HPLC gereinigt, nachdem es von der Harz-Festphase abgetrennt worden war, um ein adhäsives, synthetisches Peptid, das einen einzelnen Peak zeigt, zu erzeugen (Ausbeute 25%).
    • Beispiel 1: Synthese von CM-Chitin-RGDS (Sequenz-Nr. 7)
  • 0,30 g CM-Chitin (erhältlich von Yaizu Fishery Chemical Industries, Ltd.) mit einer Viskosität von 9 cps (1%-ige Lösung bei 20ºC), einem Veretherungsgrad von 0,78 und einem Deacetylierungsgrad von 0,5 wurde in einem Phosphatpuffer mit pH 7,4 gelöst, und eine Lösung von 128 mg wasserlösliches DCC (1- Ethyl-3,3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid] in 2,6 ml Phosphatpuffer wurde zugegeben, während die Temperatur auf 0ºC gehalten wurde, um die Reaktion für 1,5 Stunden durchzuführen. Danach wurde eine Lösung von 400 mg eines adhäsiven Peptids, Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) (erhältlich von Teikoku Chemical Industries Co., Ltd.) in 8 ml Phosphatpuffer zu der Reaktionslösung gegeben, und die Reaktion wurde über Nacht bei 4ºC fortgeführt. Die Reaktionslösung wurde in ein Visking-Röhrchen gefüllt, durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser und danach gegen reines Wasser gereinigt, um die Bestandteile mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, und danach lyophilisiert (Ausbeute 0,24 g). Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. CM-Chitin RGDS Aminosäureanalyse (nmol/50µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • Die Einführungsrate von RGDS-Fragmenten wurde ausgehend vom Verhältnis der Konzentration der Argininreste zu derjenigen von Glucosamin gemäß der folgenden Beziehung bestimmt und betrug ungefähr 10%.
  • Einführungsrate = [Arg] / [Glucsosamin] x 100
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1652 cm&supmin;¹
    • Beispiel 2: Synthese von succinyliertem CM-Chitin-RGDS
  • 20,0 g des im Beispiel 1 verwendeten CM-Chitins wurden in 100 ml einer 1%-igen Triethylamin-Lösung gelöst, 34,0 g Bernsteinsäureanhydrid und 2,0 g 4-Dimethylaminopyridin wurden zu der entstandenen Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für einen Tag und eine Nacht gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung in einen großen Überschuß von Aceton gegossen, um das succinylierte CM-Chitin zu präzipitieren. Nach Gewinnen der Präzipitate wurden die Präzipitate mit einer großen Menge Methanol und danach Ether gewaschen, und in vacuo getrocknet.
  • Ausbeute = 22,40 g.
  • 0,30 g des succinylierten CM-Chitins wurde in einem Phosphatpuffer mit pH 7,4 gelöst, und eine Lösung von 128 mg wasserlösliches Carbodiimid [1-Ethyl-3,3-(dimethylaminopropyl)- carbodiimid] in 2,6 ml Phosphatpuffer wurde zugegeben, während die Temperatur auf 0ºC gehalten wurde, um die Reaktion für 1,5 Stunden fortzusetzen. Danach wurde eine Lösung von 400 mg RGDS in 8 ml Phosphatpuffer zu der Reaktionsiösung zugegeben, und die Reaktion wurde über Nacht bei 4ºC fortgesetzt. Die Reaktionslösung wurde in ein Visking-Röhrchen gefüllt, durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser und danach reines Wasser gereinigt, um die Bestandteile mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, und danach lyophilisiert (Ausbeute 0,26 g).
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate von RGDS ungefähr 10% betrug.
  • Die Strukturformel des succinylierten CM-Chitin-RGDS ist folgendermaßen: Kombination von R¹ und R². Succinyliertes CM-Chitin-RGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = 0) 1652 cm&supmin;¹
    • Beispiel 3: Synthese des Maleyiderivats von CM-Chitin-RGDS
  • Dieselben Verfahren, die in Beispiel 2 verwendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 20,00 g des im Beispiel 1 erhaltenen CM- Chitins und 36,6 g Maleinsäureanhydrid reagierengelassen wurden, um 21,60 g Maleylderivat von CM-Chitin zu erzeugen.
  • Das Maleylderivat von CM-Chitin (0,30 g) wurde in einem Phosphatpuffer mit pH 7,4 gelöst, und danach wurden die RGDS- Fragmente auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 an das CM- Chitinderivat gebunden (Ausbeute 0,33 g).
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate von RGDS ungefähr 11% betrug. Maleylderivat von CM-Chitin-RGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1648 cm&supmin;¹
    • Beispiel 4: Synthese des Phthaloylderivats von CM-Chitin-RGDS
  • Dieselben Verfahren, die in Beispiel 2 verwendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 20,00 g des im Beispiel 1 erhaltenen CM- Chitins und 50,0 g Phthalsäureanhydrid reagierengelassen wurden, um 22,31 g Phthaloylderivat von CM-Chitin zu erzeugen.
  • Das Phthaloylderivat von CM-Chitin (0,30 g) wurde in einem Phosphatpuffer mit pH 7,4 gelöst, und danach wurden die RGDS- Fragmente auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 an das CM- Chitinderivat gebunden (Ausbeute 0,44 g).
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate von RGDS ungefähr 12% betrug. Phthaloylderivat von CM-Chitin-RGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1652 cm&supmin;¹
    • Beispiel 5: Synthese des Itaconylderivats von CM-Chitin-RGDS
  • Dieselben Verfahren, die in Beispiel 2 verwendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 20,00 g des im Beispiel 1 erhaltenen CM- Chitins und 38,0 g Itaconäureanhydrid reagierengelassen wurden, um 21,45 Itaconylderivat von CM-Chitin zu erzeugen.
  • Das Itaconylderivat von CM-Chitin (0,30 g) wurde in einem Phosphatpuffer mit pH 7,4 gelöst, und danach wurden die RGDS- Fragmente auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 an das CM- Chitinderivat kovalent gebunden (Ausbeute 0,36 g).
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate von RGDS ungefähr 9% betrug. Itaconylderivat von CM-Chitin-RGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1650 cm&supmin;¹
    • Beispiel 6: Synthese des Trimellitylderivats von CM-Chitin-RGDS
  • Dieselben Verfahren, die in Beispiel 2 verwendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 20,00 g des im Beispiel 1 erhaltenen CM- Chitins und 64,9 g Trimellitylanhydrid reagierengelassen wurden, um 23,75 g Trimellitylderivat von CM-Chitin zu erzeugen.
  • Das Trimeilitylderivat von CM-Chitin (0,30 g) wurde in einem Phosphatpuffer mit pH 7,4 gelöst, und danach wurden die RGDS- Fragmente auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 an das CM- Chitinderivat gebunden (Ausbeute 0,37 g)
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate von RGDS ungefähr 14% betrug. Trimellitylderivat von CM-Chitin-RGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1656 cm&supmin;¹
    • Beispiel 7: Synthese von CM-Chitin-GRGDS (Sequenz-Nr. 8)
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 1 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 460 mg Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (GRGDS) (erhältlich von Kokusan Chemical Industries Co., Ltd.) als kohäsives Peptidfragment verwendet wurden, um 0,36 g CM-Chitin- GRGDS zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des GRGDS- Fragments ungefähr 10% betrug. CM-Chitin-GRGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1654 cm&supmin;¹
    • Beispiel 8: Synthese von succinyliertem CM-Chitin-GRGDS
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 2 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 460 mg GRGDS als adhäsives Peptidfragment verwendet wurde, um 0,39 g succinyliertes CM-Chitin- GRGDS zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des GRGDS- Fragments ungefähr 12% betrug. Succinyliertes CM-Chitin-GRGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1643 cm&supmin;¹
    • Beispiel 9: Synthese von succinyliertem CM-Chitin-RGD (Sequenz-Nr. 9)
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 2 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 460 mg RGD als adhäsives Peptidfragment verwendet wurde, um 0,34 g succinyliertes CM-Chitin-RGD zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des RGD- Fragments ungefähr 16% betrug. Succinyliertes CM-Chitin-RGD Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1650 cm&supmin;¹
    • Beispiel 10: Synthese von succinyliertem CM-Chitin-(RGD)&sub2; (Sequenz-Nr. 10)
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 2 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 460 mg (RGD)&sub2; als adhäsives Peptidfragment verwendet wurde, um 0,31 g succinyiiertes CM-Chitin- (RGD)&sub2; zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des (RGD)&sub2;-Fragments ungefähr 12% betrug. Succinyliertes CM-Chitin-(RGD)&sub2; Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1654 cm&supmin;¹
    • Beispiel 11: Synthese von succinyliertem CM-Chitin-(RGD)&sub3; (Sequenz-Nr. 11)
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 2 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 460 mg (RGD)&sub3; als adhäsives Peptidfragment verwendet wurde , um 0,33 g succinyliertes CM-Chitin- (RGD)&sub3; zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des (RGD)&sub3;-Fragments ungefähr 10% betrug. Succinyliertes CM-Chitin-(RGD)&sub3; Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1648 cm&supmin;¹
    • Beispiel 12: Synthese von succinyliertem CM-Chitin-(RGD)&sub5; (Sequenz-Nr. 12)
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 2 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 460 mg (RGD)&sub5; als adhäsives Peptidfragment verwendet wurde, um 0,28 g succinyliertes CM-Chitin- (RGD)&sub5; zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des (RGD)&sub5;-Fragments ungefähr 15% betrug. Succinyliertes CM-Chitin-(RGD)&sub5; Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1656 cm&supmin;¹
    • Beispiel 13: Synthese von sulfatiertem CM-Chitin-RGDS (Sequenz- Nr. 7)
  • CM-Chitin mit einem Veretherungssgrad von 0,50 und einem Deacetylierungsgrad von 0,05 wurde gemäß dem Verfahren von Tokura (Jpn. J. Cancer Res., 1989, 80, S. 866-872; Cancer Res., 1990, 50, S. 3631-3637) sulfatiert, und danach wurden die RGDS- Fragmente auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 kovalent an das suifatierte CM-Chitin gebunden (Ausbeute 0,36 g).
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des RGDS- Fragments ungefähr 12% betrug. Sulfatiertes CM-Chitin-RGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1650 cm&supmin;¹
    • Beispiel 14: Synthese von sulfatiertem CM-Chitin-GRGDS (Sequenz-Nr. 8)
  • Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurden 460 mg GRGDS und das im Beispiel 13 erhaltene sulfatierte CM-Chitin kovalent miteinander verbunden, um 0,35 g sulfatiertes CM-Chitin-GRGDS zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate von GRGDS ungefähr 10 % betrug. Sulfatiertes CM-Chitin-GRGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Ainidocarbonyl (C = O) 1655 cm&supmin;¹
    • Beispiel 15: Synthese von sulfatiertem, succinyliertem CM- Chitin-RGDS (Sequenz Nr. 7)
  • Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 13 wurde das in Beispiel 2 erhaltene succinylierte CM-Chitin sulfatiert, und die RGDS- Fragmente wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 daran gebunden (Ausbeute 0,37 g).
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate von RGDS ungefähr 14 % betrug. Sulfatiertes, succinyliertes CM-Chitin-GRGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1654
    • Beispiel 16: Synthese von sulfatiertem, succinyliertem CM- Chitin-GRGDS (Sequenz-Nr. 8)
  • Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 13 wurde das in Beispiel 2 erhaltene succinylierte CM-Chitin sulfatiert, und die GRGDS- Fragmente wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 7 daran gebunden (Ausbeute 0,31 g).
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des GRGDS-Fragments ungefähr 17 % betrug. Sulfatiertes, succinyliertes CM-Chitin-GRGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1652 cm&supmin;¹
    • Beispiel 17: Synthese von CM-Chitin-RGDSG-NH&sub2; (Sequenz-Nr. 13)
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 1 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 460 mg Peptid-5 (RGDSG-NH&sub2;; Herstellungsbeispiel 2) als adhäsives Peptidfragment verwendet wurde, um 0,36 g CM-Chitin-RGDSG-NH&sub2; zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des RGDSG- NH&sub2;-Fragments ungefähr 10% betrug. CM-Chitin-RGDSG-NH&sub2; Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1658 cm&supmin;¹
    • Beispiel 18: Synthese von CM-Chitin-RGDS (Sequenz-Nr. 7)
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 1 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 1,5 g RGDS als adhäsives Peptidfragment verwendet wurde, um 0,32 g CM-Chitin-RGDS zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des RGDS- Fragments ungefähr 20% betrug. CM-Chitin-RGDS Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1655 cm&supmin;¹
    • Beispiel 19: Synthese von CM-Chitin-GRGDSP (Sequenz-Nr. 14)
  • Dieselben Verfahren, die im Beispiel 1 angewendet wurden, wurden wiederholt, außer daß 480 mg Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP), d.h. das adhäsive Peptidfragment-6 (Herstellungsbeispiel 3) als adhäsives Peptidfragment verwendet wurde, um 0,35 g CM-Chitin-GRGDSP zu erzeugen.
  • Die Struktur des Produkts wurde durch IR und die Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde gefunden, daß die Einführungsrate des GRGDSP-Fragments ungefähr 10% betrug. CM-Chitin-GRGDSP Aminosäureanalyse (nmol/50 µl) Glucosamin Arg Gly Asp Ser Pro
  • IR: Streckschwingung von Amidocarbonyl (C = O) 1657 cm&supmin;¹
    • Testbeispiel 1: Bestimmung der Zelladhäsions-inhibierenden Aktivität
  • Nachstehend wird ein Verfahren zum Bestimmen der Aktivität der erfindungsgemäßen CM-Chitinderivate hinsichtlich der Hemmung der Adhäsion von Zellen an Fibronectin oder Vitronectin beschrieben. Der hierin verwendete Kompetitionsassay ist im Gebiet der Biochemie oft angewendet worden und beispielsweise beschrieben in "Method in Enzymology", 1981, 82, Seiten 803-831; und J.P. KOKAI Nr. Hei 1-309682 und Hei 2-174797.
    • Experimentelles Verfahren 1. Herstellung der Adsorptionsplatten
  • Kommerziell erhältliches Fibronectin (vom Menschen stammend; gekauft von Seikagaku Kogyo K.K.) und Vitronectin (vom Menschen stammend; gekauft von Funakoshi Co., Ltd.) wurden jeweils zu 1,0 µl/ml und 2,0 µl/ml mit PBS (NaH&sub2;PO&sub4;, 0,005 M + NaCl 0,07 M) verdünnt, 0,5 ml der erhaltenen, verdünnten Lösung wurde in eine Plastikplatte mit 24 Vertiefungen verteilt und bei 37ºC über Nacht inkubiert, um die Beschichtung der Platte durchzuführen. Danach wurde Rinderserumalbumin (BSA 1%) zugegeben, worauf eine Inkubation für eine Stunde bei 37ºC zum Hemmen einer nicht-spezifischen Adsorption, danach ein Waschschritt mit PBS auf die gewöhnliche Weise und eine ausreichende Entwässerung folgte, um eine Platte mit adsorbiertem Fibronectin oder Vitronectin zu erzeugen.
    • 2. Adhäsions-Inhibitionstest
  • Die durch Lyophilisation erhaltenen CM-Chitinderivate wurden mit Dulbecco's modifiziertem Eagles-Medium (nachstehend als "DMEM" bezeichnet) verdünnt, um Lösungen der CM-Chitinderivate mit Konzentrationen von 0, 0,25, 0,5, 1,0 bzw. 1,5 mg/ml zu erzeugen. Jede der Lösungen (0,25 ml) wurde auf die vorstehend hergestellte Platte verteilt, 0,25 ml einer Suspension von Blutgefäßendothelzellen (4 x 10&sup6; Zellen/ml) wurde zu der Platte zugegeben und für eine Stunde bei 37ºC inkubiert, um auf diese Weise die Adhäsion der Zellen zu verursachen. Die Platte wurde dreimal mit DMEM-Medium gewaschen, um nicht-adhärierte Zellen zu entfernen, danach wurden die adhärierten Zellen mit einer 0,025% EDTA-Trypsin-Lösung abgelöst und mit einer 2%-igen Trypan-Blau-Lösung gefärbt, um die Zahl der adhärierten Zellen zu zählen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt. Tabelle 1: Zelladhäsions-inhibierende Wirkung bezüglich Fibronection (Zellen/Vertiefung) Verbindung Konzentration (mg/ml) zugegeben CM-Chitin CM-Chitinderivat CM-Chitinderivat sulfatiertes CM- Chitin Tabelle 2: Zelladhäsions-inhibirende Wirkung bezüglich Vitronection (Zellen/Vertiefung) Verbindung Konzentration (mg/ml) zugegeben CM-Chitin CM-Chitinderivat sulfatiertes CM- Chitin CM-Chitinderivat
    • Testbeispiel 2: Bestimmung der Plättchenkoagulationsinhibierenden Aktivität
  • Die Plättchenkoagulations-inhibierende Wirkung der erfindungsgemäßen CM-Chitinderivate wurde in vitro unter Verwendung von plättchenreichem, humanem Plasma untersucht. Das experimentelle Verfahren wird nachstehend beschrieben.
    • Experimentelles Verfahren
  • Zu frischem, humanen Blut wurde 1/9 Volumen einer 3,8%-igen Natriumcitratlösung zugegeben, die erhaltene Mischung wurde zentrifugiert (1000 Upm; für 10 Minuten) und die obere Schicht als plättchenreiches Plasma abgetrennt. Die durch Lyophilisation erhaltenen CM-Chitinderivate wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, um mehrere Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 0 bis 1,5 mg/ml zu erzeugen. Jede der Lösungen (25 µl) wurde zu 200 µl Plasma zugegeben, für 3 Minuten bei 37 ºC inkubiert, danach wurde eine 50 µM ADP (Adenosindiphosphat)-Lösung oder eine 200 µg/ml Collagenlösung zugegeben, um das Ausmaß der Koagulation als durch ein Aggregometer bestimmten Transmissionsgrad zu bestimmen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 aufgelistet.
  • Rate der Koagulationsinhibition = (1-T/To) x 100%
  • To: Beobachtete Durchlässigkeit, wenn kein Salz eines CM- Chitinderivats zugegeben wurde.
  • T: Beobachtete Durchlässigkeit, wenn ein Salz eines CM- Chitinderivats zugegeben wurde. Tabelle 3: Plättchenkoagulations-inhibierende Aktivitiät Verbindung zugefügt ADP-Stimulation (µg/ml) Collagen-Stimulation CM-Chitin CM-Chitinderivat sulfatiertes CM-Chitin
    • SEQUENZPROTOKOLL SEQ ID NO: 1
  • SEQUENZLÄNGE: 3
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp
  • 1
    • SEQ ID NO:2
  • SEQUENZLÄNGE: 6
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Arg Gly Asp
  • 1 5
    • SEQ ID NO: 3
  • SEQUENZLÄNGE: 9
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp
  • 1 5
    • SEQ ID NO: 4
  • SEQUENZLÄNGE: 15
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp
  • 1 5 10 15
    • SEQ ID NO: 5
  • SEQUENZLÄNGE: 5
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKULS: Peptid
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Ser Gly
  • 1 5
    • SEQ ID NO: 6
  • SEQUENZLÄNGE: 6
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • SEQUENZ: Gly Arg Gly Asp Ser Pro
  • 1 5
    • SEQ ID NO: 7
  • SEQUENZLÄNGE: 4
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • ART DES FRAGMENTS: C-terminales Fragment
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Ser
  • 1
    • SEQ ID NO: 8
  • SEQUENZLÄNGE: 5
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • ART DES FRAGMENTS: C-terminales Fragment
  • SEQUENZ: Gly Arg Gly Asp Ser
  • 1 5
    • SEQ ID NO: 9
  • SEQUENZLÄNGE: 3
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • ART DES FRAGMENTS: C-terminales Fragment
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp
  • 1
    • SEQ ID NO: 10
  • SEQUENZLÄNGE: 6
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • ART DES FRAGMENTS: C-terminales Fragment
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Arg Gly Asp
  • 1
    • SEQ ID NO: 11
  • SEQUENZLÄNGE: 9
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • ART DES FRAGMENTS: C-terminales Fragment
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp
  • 1 5
    • SEQ ID NO: 12
  • SEQUENZLÄNGE: 15
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • ART DES FRAGMENTS: C-terminales Fragment
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp
  • 1 5 10 15
    • SEQ ID NO: 13
  • SEQUENZLÄNGE: 5
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • ART DES FRAGMENTS: C-terminales Fragment
  • SEQUENZ: Arg Gly Asp Ser Gly
  • 1 5
    • SEQ ID NO: 14
  • SEQUENZLÄNGE: 6
  • ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
  • TOPOLOGIE: linear
  • ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • ART DES FRAGMENTS: C-terminales Fragment
  • SEQUENZ: Gly Arg Gly Asp Ser Pro
  • 1 5

Claims (16)

1. CM-Chitinderivat, welches als wesentliche Einheit ein adhäsives Peptid, das durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt ist, über eine Amidbindung, Esterbindung, Etherbindung oder Urethanbindung in der Seitenkette aufweist oder ein Salz davon:
-[R¹] - [CO] - ([X] -Arg-Gly-Asp- [Y]) n - (Z) - [R²] - ...... (I)
worin die Klammer [ ] bedeutet, daß die entsprechende Gruppe oder der entsprechende Rest in der Klammer vorhanden oder abwesend sein kann, und X und Y jeweils, wenn sie vorhanden sind, einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ser, Gly, Val, Asn und Pro, oder einen Peptidrest, bestehend aus zwei oder mehr Aminosäuren, bedeuten; Z -O- oder -NH- bedeutet; einer der Reste R und R ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe mit 6 bis 9 Kohlenstoffatomen bedeutet und der andere Rest ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte Alkylengruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen oder eine Arylengruppe mit 6 bis 9 Kohlenstoffatomen, worin die Alkylen- und Arylengruppen Substituenten haben können, bedeutet; und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist.
2. CM-Chitinderivat oder das Salz nach Anspruch 1, worin es ein Molekulargewicht von nicht mehr als 200000 hat.
3. CM-Chitinderivat oder das Salz nach Anspruch 2, worin es ein Molekulargewicht im Bereich von 3000 bis 100000 hat.
4. CM-Chitinderivat oder das Salz nach Anspruch 1, worin der Substituent von R¹ und R² mindestens ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Halogenatomen, Carbonyl-, Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl-, Sulfo-, Aryl-, Nitro- und Cyanogruppen, einer ungesättigten Doppelbindung und Dreifachbindung.
5. CM-Chitinderivat oder das Salz nach Anspruch 1, worin es bei Raumtemperatur wasserlöslich ist.
6. CM-Chitinderivat oder das Salz nach Anspruch 1, worin das CM-Chitin sulfatiert oder carboxyliert ist mit Bernsteinsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Phthalsäureanhydrid, Itaconsäureanhydrid, Citraconsäureanhydrid, Pyromellitsäureanhydrid oder Trimellitsäureanhydrid.
7. CM-Chitinderivat oder das Salz nach Anspruch 1, worin die in dem adhäsiven Peptid umfaßten Aminosäuren L-Isomere sind.
8. CM-Chitinderivat oder das Salz nach Anspruch 1, worin das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hydrochlorid, Sulfat, Nitrat, Phosphat, Borat, Acetat, Trifluoracetat, Trifluormethansulfonat, Lactat und Tartrat.
9. Zusammensetzung zum Hemmen der Adhäsion tierischer Zellen, umfassend als wirksamen Bestandteil mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CM-Chitinderivaten und Salzen davon nach Anspruch 1.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin die Dosis des CM- Chitinderivats oder Salzes davon im Bereich von 0,2 µg/kg bis 400 mg/kg liegt.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin sie weiterhin einen Stabilisator umfaßt.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin sie in Liposomen eingebettet ist.
13. Zusammensetzung zum Hemmen der Coagulation/Adhäsion von Plättchen, umfassend als einen wirksamen Bestandteil mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CM- Chitinderivaten und Salzen davon nach Anspruch 1.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die Dosis des CM- Chitinderivats oder Salzes davon im Bereich von 0,2 µg/kg bis 400 mg/kg liegt.
15. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin sie weiterhin einen Stabilisator umfaßt.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin sie in Liposomen eingebettet ist.
DE69119185T 1990-10-26 1991-10-24 Derivate von Carboxymethyl-Chitin und ihre Verwendung Expired - Fee Related DE69119185T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP28949190 1990-10-26
JP33371890 1990-11-30
JP3066156A JP2662830B2 (ja) 1990-10-26 1991-03-29 Ｃｍ−キチン誘導体およびその用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69119185D1 DE69119185D1 (de) 1996-06-05
DE69119185T2 true DE69119185T2 (de) 1996-08-14

Family

ID=27299034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69119185T Expired - Fee Related DE69119185T2 (de) 1990-10-26 1991-10-24 Derivate von Carboxymethyl-Chitin und ihre Verwendung

Country Status (3)

Country Link
US (1) US5298488A (de)
EP (1) EP0482649B1 (de)
DE (1) DE69119185T2 (de)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6521594B1 (en) 1990-04-06 2003-02-18 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5672585A (en) * 1990-04-06 1997-09-30 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US6017877A (en) * 1990-04-06 2000-01-25 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5780303A (en) * 1990-04-06 1998-07-14 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
DE69332203T2 (de) * 1992-10-02 2003-05-28 Diatide, Inc. Multimerische mehrzweckwirkstoffe gegen thrombose
US5459257A (en) * 1993-01-11 1995-10-17 Dainippon Ink And Chemicals, Inc. Sulfated oligoglycoside acylate and antiviral agent containing the same as active ingredient
US5665702A (en) * 1995-06-06 1997-09-09 Biomeasure Incorporated Ionic molecular conjugates of N-acylated derivatives of poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) and polypeptides
US6479457B2 (en) 1995-06-06 2002-11-12 Kinerton Limited Ionic molecular conjugates of N-acylated derivatives of poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) and polypeptides
JPH09143199A (ja) * 1995-11-17 1997-06-03 Nippon Chem Res Kk 血小板第４因子の製造方法
US7192984B2 (en) * 1997-06-17 2007-03-20 Fziomed, Inc. Compositions of polyacids and polyethers and methods for their use as dermal fillers
US6869938B1 (en) 1997-06-17 2005-03-22 Fziomed, Inc. Compositions of polyacids and polyethers and methods for their use in reducing adhesions
US20040096422A1 (en) * 1997-06-17 2004-05-20 Schwartz Herbert E. Compositions of polyacids and polyethers and methods for their use in reducing pain
US20050074495A1 (en) * 1997-06-17 2005-04-07 Fziomed, Inc. Compositions of polyacids and methods for their use in reducing adhesions
US6566345B2 (en) 2000-04-28 2003-05-20 Fziomed, Inc. Polyacid/polyalkylene oxide foams and gels and methods for their delivery
CA2407235A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Fziomed, Inc. Hemostatic compositions of polyacids and polyalkylene oxides and methods for their use

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4326532A (en) * 1980-10-06 1982-04-27 Minnesota Mining And Manufacturing Company Antithrombogenic articles
US4666884A (en) * 1984-04-10 1987-05-19 New England Deaconess Hospital Method of inhibiting binding of von Willebrand factor to human platelets and inducing interaction of platelets with vessel walls
US4988621A (en) * 1985-05-24 1991-01-29 La Jolla Cancer Research Foundation Peptides in cell detachment and aggregation
US4683291A (en) * 1985-10-28 1987-07-28 Scripps Clinic And Research Foundation Platelet binding inhibitors
US4952562A (en) * 1989-09-29 1990-08-28 Rorer Pharmaceutical Corporation Anti-thrombotic peptides and pseudopeptides

Also Published As

Publication number Publication date
EP0482649B1 (de) 1996-05-01
DE69119185D1 (de) 1996-06-05
US5298488A (en) 1994-03-29
EP0482649A2 (de) 1992-04-29
EP0482649A3 (en) 1992-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69119185T2 (de) Derivate von Carboxymethyl-Chitin und ihre Verwendung
DE69220382T2 (de) Verwendung von Peptidderivaten
DE69118826T2 (de) Propenamidderivate, deren Polymere, Copolymere und deren Verwendung
DE69017138T2 (de) Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten.
DE69007004T2 (de) Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten.
EP0384362A2 (de) Glycinderivate
DE69132708T2 (de) Therapeutische Vervendung von Peptiden mit Thrombospondin - ähnlicher Aktivität
DE3780000T2 (de) Peptidverbindungen.
DE68924804T2 (de) Polypeptid mit sich wiederholenden zelladhäsiven Hauptsequenzen.
DE69232716T2 (de) Peptide mit thrombospondin-ähnlicher Aktivität und ihre therapeutische Verwendung
US4438029A (en) Synthetic peptides
DE69304538T2 (de) Aminosäure-derivate und deren verwendung
US5763408A (en) Amino acid derivatives and application thereof
JPH05271094A (ja) カルボキシメチル化キチン誘導体を用いる癌転移抑制剤
WO2007095659A1 (de) Peptide und peptid-derivate, herstellun derselben sowie deren verwendung zur herstellung eines therapeutisch und/oder präventiv wirkenden arzneimittels
DE3685636T2 (de) Lysozymbetreffende peptide.
CH640217A5 (en) Polypeptides, their preparation and pharmaceutical preparations
JP2620727B2 (ja) ペプチド脂質
JPH04221400A (ja) ゼラチン誘導体およびその用途
JPH04221397A (ja) 水溶性ポリペプチド誘導体とその用途
JP2694399B2 (ja) ペプチド誘導体
JP3190758B2 (ja) ペプチド誘導体及びその用途
DE69304156T2 (de) Neue Peptidderivate im Prozess von Zelladhäsion wirksam, Verfahren zur deren Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen die sie enthalten
JP2620728B2 (ja) ペプチド含有ポリエチレングリコール誘導体とその用途
JP3190765B2 (ja) ペプチド誘導体及びその用途

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee