DE69217045T2

DE69217045T2 - Verfahren zur herstellung von nahrungsmitteln und getränken

Info

Publication number: DE69217045T2
Application number: DE69217045T
Authority: DE
Inventors: Makoto Egi; Yoichi - - Koiwa; Hideo Nasu; Nobuo - Ogata; Shigenori - - Ohta; Nobuko - Yoshida
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: MC Food Specialties Inc
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-12
Publication date: 1997-06-26
Anticipated expiration: 2012-11-13
Also published as: AU655516B2; EP0574586A1; ATE147945T1; WO1993009681A1; AU2932892A; EP0574586B1; EP0574586A4; JP3114995B2; DE69217045D1; DK0574586T3; US5520933A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken mit einem gewünschten Aroma, insbesondere einem Esteraroma, umfassend das Inkontaktbringen eines Ester synthetisierenden Enzyms tierischen Ursprungs oder einer Substanz, die das Enzym enthält, mit den Nahrungsmitteln und Getränken während deren Herstellung, wodurch die Nahrungsmittel und Getränke mit einem Esteraroma versehen werden.

Stand der Technik

In Nahrungsmittelprodukten sind eine große Zahl aromatischer Bestandteile enthalten. Zu diesen Bestandteilen zählt das Esteraroma, das als Fruchtaroma bekannt ist.
Bisher wurden viele Versuche unternommen, das Esteraroma zu intensivieren. Die Versuche umfassen ein Verfahren, bei dem zu Ölen und Fetten, die flüchtige Fettsäuren enthalten, Alkohol zugegeben wird, ein Verfahren, bei dem eine von Rhizopus chinensis oder von Candida cylindracea stammende Lipase verwendet wird, um eine Esterverbindung herzustellen [Japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 50554/1981, Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology 30, Nr. 10, (1983), 572], ein Verfahren, bei dem der Geschmack durch Zusatz einer von Rhizopus delemar, Aspergillus niger oder Candida cylindracea stammenden Lipase zu Fruchtsaft intensiviert wird (Japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 39904/1977) usw..
Mikrobielle Esterasen, z.B. Bäckerhefe und Bierhefe [J. Inst. Brew. 82 (1976), 170], Sake-Hefe [Hakko Kogaku Kaishi 64 (1986), 175], Sake-Koji [Hakko Kogaku Kaishi 64 (1986), 247], Weinhefe [Tr. Tashk. Politekh. Inst. 107 (1973), 94], Pilze auf Trauben (Botrytis cinerea) [Izv. Akad. Nauk. Mold. SSR. Ser. Biol. Khim.-Nauk. 2 (1975), 78), Lactobacillus [J. Dairy Sci. 57 (1974), 1432, ibid. 57 (1974), 535] usw., sind bekanntermaßen an der Estererzeugung beteiligt.
Es ist bekannt, daß Esterasen und Lipasen aus tierischen Geweben die Fähigkeit besitzen, Ester zu synthetisieren [Am. Chem. J. 24 (1900), 491]. Jedoch hört man wenig über die Erforschung der Anwendung von Esterasen und Lipasen bei Nahrungsmitteln und Getränken.
Es wird beschrieben, daß, wenn man Lipase in einem hochwäßrigen System arbeiten läßt, die Reaktion zur Hydrolyse tendiert und daß aus diesem Grund zur Induktion der Estersynthese häufig nicht-wäßrige Medien verwendet werden [Science 224 (1984), 1249, Japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 39233/1988, Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 116629/1983].
Verfahren zur Herstellung von Käsegeschmack unter Verwendung von aus Säugern stammenden prägastrischen Esterasen und aus Mikroorganismen stammenden Lipasen sind bekannt (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 113869/1984, Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr.66856/1984, Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 14369/1972). Die Erfinder haben untersucht, ob unter Verwendung von aus Mikroorganismen stammenden Enzymen und aus tierischem Larynx oder Pankreas stammenden Enzympräparaten Ester synthetisiert werden können, hierbei wurde keine befriedigende Estersynthese beobachtet (vgl. die nachstehende Tabelle 1).
Es wurde gefunden, daß Ester, die durch die aus tierischen Organen stammenden Ester synthetisierenden Enzyme produziert wurden, Nahrungsmitteln und Getränken einen gewünschten Geschmack verleihen. Insbesondere wurde gefunden, daß die Enzyme auch in wäßrigen Lösungen mit extrem nierigen Alkoholkonzentrationen eine Ester synthetisierende Aktivität besitzen, dies zeigt, daß die Enzyme als Esteraroma-Zusätze für Nahrungsmittel und Getränke nützlich sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei einem Nahrungsmittel oder Getränk ein Geschmack verliehen wird, umfassend die Zugabe eines Ester synthetisierenden Enzyms oder einer Substanz, die ein solches Enzym enthält, zu einem Nahrungsmittel oder Getränk während dessen Herstellung, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Enzym ein Buttersäureethylester synthetisierendes Enzym tierischen Ursprungs ist oder die Substanz ein solches Enzym enthält und daß das Enzym oder die Substanz eine Stärke von mindestens 0,1 Einheiten Enzymaktivität pro mg Protein besitzt (1 Einheit Enzymaktivität = die Enzymmenge, die für die Herstellung von Buttersäureethylester mit einer Geschwindigkeit von 1 µMol pro Minute in einer Substratlösung, die 0,5 Gew.-% Ethanol und 2,6 Gew.-% Buttersäure in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6) enthält, bei 30ºC erforderlich ist).
Vorzugsweise ist das Nahrungsmittel oder Getränk ein Nahrungsmittel oder Getränk, dessen Herstellung einen Fermentationsschritt umfaßt, wobei das Enzym oder die das Enzym enthaltende Substanz während des Fermentationsschrittes zum Nahrungsmittel oder Getränk zugegeben wird.
Vorzugsweise ist der Fermentationsschritt ein Fermentationsschritt, bei dem entweder eine Hefe oder ein Lactobacillus als fermentierender Organismus verwendet wird.
Vorzugsweise hat das Enzym eine Aktivität, die bei Messung in einer Standard-Substratlösung mindestens 30 % des Wertes beträgt, der bei Messung in einer Substratlösung, die 5 Gew.-% Ethanol und 2,6 Gew.-% Buttersäure enthält, erhalten wird, vorzugsweise mindestens 60 %.
Vorzugsweise ist das Tier, aus dem das Enzym oder die Substanz stammt, ein Schwein, eine Kuh, Ziege oder ein Pferd.
Vorzugsweise stammt das Enzym oder die Substanz aus Niere, Leber oder Herz des Tieres.
Vorzugsweise ist das Nahrungsmittel oder Getränk ein Vertreter der folgenden Produkte: Brot, Braugewürz, Alkohol enthaltendes Gewürz, aufbereitetes Fleischprodukt, Milchprodukt oder eingelegtes Produkt.
Vorzugsweise wird das Enzym oder die das Enzym enthaltende Substanz zu dem Nahrungsmittel oder Getränk während der Herstellung in einer Menge zugegeben, die ausreichend ist, um 0,0001 bis 10,0 Einheiten (wie definiert) Enzymaktivität pro kg, vorzugsweise 0,0002 bis 5,0 Einheiten/kg, bereitzustellen.
Vorzugsweise erfordert die Herstellung des Nahrungsmittels oder Getränkes einen Fermentationsschritt.
Vorzugsweise wird ein Alkohol oder eine organische Säure zusammen mit der Ester synthetisierenden Enzymsubstanz für die Reaktion zur Esterproduktion zu dem Nahrungsmittel oder Getränk zugegeben.
Vorzugsweise ist das Nahrungsmittel oder Getränk einer der folgenden Stoffe: ein Alkohol oder ein alkoholisches Getränk.
Ausführungsformen der Erfindung werden anhand der Beispiele beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können somit Nahrungsmittel und Getränke mit einem gewünschten Aroma und einem gewünschten Geschmack hergestellt werden, indem ein Ester synthetisierendes Enzym tierischen Ursprungs, das eine Stärke im Bereich von 0,1 Einheiten/mg Protein oder mehr unter den Bedingungen aufweist, daß Buttersäureethylester durch Umsetzung von 0,5 Gew.-% [% bedeutet nachstehend Gew.-%] Ethanol und 2,6 % Buttersäure erzeugt wird, oder eine das Enzym enthaltende Substanz [nachstehend als die Ester synthetisierende Enzymsubstanz bezeichnet] mit den Nahrungsmitteln und Getränken während ihrer Produktionsprozesse in Kontakt gebracht wird.
Eine Einheit in der hier verwendeten Definition ist die Stärke der Enzymaktivität, die unter den nachstehend beschriebenen Testbedingungen in einer Minute 1 µMol Buttersäureethylester produziert.
Die Nahrungsmittel und Getränke, auf die die vorliegende Erfindung angewendet wird, umfassen beliebige Nahrungsmittel und Getränke, deren Herstellung einen Schritt umfassen, der für eine Enzymreaktion geeignet ist. Insbesondere kann man beachtliche Effekte erwarten, wenn man die vorliegende Erfindung bei Nahrungsmitteln und Getränken anwendet, deren Herstellung einen Fermentationsschritt erfordert. Insbesondere werden die folgenden Produkte erwähnt: Brot (einschließlich süße Backwaren usw.), fermentierte Gewürze (Miso, Sojasauce usw.), alkoholische Getränke (Sake, Wein, Bier, Shochu, Whiskey, Brandy, Gin, Rum, Wodka, Huangjiu, Baijiu usw.), alkoholische Gewürze (alkoholische Produkte gemäß den Vereinbarungen des "Japan Liquor Tax Act", z.B. süßer Sake, Sake-ähnliche Gewürze usw.), aufbereitete Fleischprodukte (Schinken, Speck, Wurst, Corned Beef, geräuchertes Huhn, Schweinebraten, geräucherte Zunge, Hamburger Steak, Fleischbällchen, Jiaozi, Shao-mai usw.), Milchprodukte [fermentierte Milch (Joghurt usw.), Käse, fermentierte Butter, fermentierte Sahne usw.] und eingelegte Produkte ("Pickles") (Soja-Pickles, Miso-Pickles, Sake-Kasu-Pickles, gemälzte Reis-Pickles, Essig-Pickles, Reiskleie-Pickles, Senf-Pickles, Moromi-Pickles, Suguki-Pickles, eingelegte Gurken, Koreanische Pickles, Sauerkraut usw.).
Die Enzymsubstanz, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist ein beliebiges geeignetes Enzym, rohes Enzym oder eine ein Enzym enthaltende Substanz, solange es/sie von Tieren stammt, die Fähigkeit besitzt, in Gegenwart eines Alkohols und einer organischen Säure einen Ester zu erzeugen, und die Fähigkeit aufweist, bei der enzymatischen Umsetzung der als Substrate eingesetzten 0,5 % Ethanol und 2,6 % Buttersäure in einer Stärke von 0,1 Einheiten/mg Protein oder mehr Buttersäureethylester zu produzieren.
Insbesondere eine Ester synthetisierende Enzymsubstanz ist am stärksten bevorzugt, die, wenn man die Ester synthetisierende Aktivität bei einer 5 % Ethanolkonzentration als 100 definiert, eine Ester synthetisierende Aktivität bei einer 0,5 % Ethanolkonzentration von 30 oder mehr, vorzugsweise von 60 oder mehr aufweist.
Das Enzym (Lipase), das eine Ester synthetisierende Aktivität aufweist, tendiert im allgemeinen in Lösungen mit niedrigen Alkoholkonzentrationen zur Hydrolyse, deshalb wird sein Nutzen bei der Herstellung von Ester nur als schwach eingeschätzt. Die Enzymsubstanz, die in einer 0,5 % Alkohollösung eine solche Ester synthetisierende Aktivität aufweist, kann somit ausreichend Ester produzieren und Nahrungsmitteln, ins-besondere Nahrungsmitteln und Getränken mit einem hohen Wassergehalt, einen Geschmack verleihen.
Alkohole, die verwendet werden können, sind Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, Amylalkohol, Isoamylalkohol, Phenethylalkohol, Hexanol usw..
Organische Säuren, die verwendet werden können, sind Ameisensäure, Essigsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Folsäure, Isofolsäure, Capronsäure, Oenanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Weinsäure, Brenztraubensäure, Lävulinsäure, Gluconsäure, Phenylessigsäure usw..
Die verwendete Ester synthetisierende Enzymsubstanz kann z.B. aus Leber, Niere, Herz oder einem anderen Organ eines Tieres, z.B. eines Schweines, einer Kuh, eines Pferdes oder einer Ziege, stammen.
Nachstehend wird ein Verfahren zur Herstellung der bevorzugten Enzymsubstanz aus den tierischen Organen genau erklärt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Ester synthetisierende Enzymsubstanz während eines beliebigen Schrittes des Produktionsprozesses von Lebensmitteln und Getränken zugegeben werden, solange keine Inaktivierung des Enzyms stattfindet. Bei fermentierten Lebensmitteln und Getränken ist es vorteilhaft, die Ester synthetisierende Enzymsubstanz während des Fermentationsschrittes zuzugeben.
Zur Erzeugung von Estern während der Enzymreaktion ist das Vorliegen des vorstehend erwähnten Alkohols und der vorstehend erwähnten organischen Säure erforderlich, sofern diese Bestandteile jedoch während des Verfahrens produziert werden, ist keine Zugabe erforderlich. Die Zugabe von Alkoholen und organischen Säuren ist im Fall von fermentierten Lebensmitteln nicht erforderlich, insbesondere bei Fermentationen, die Hefen umfassen, wobei üblicherweise Alkohole und organische Säuren erzeugt werden. In Fällen, in denen die vorliegende Erfindung bei Lebensmitteln und Getränken angewendet wird, in denen Alkohole und organische Säuren nicht oder nur in kleinen Mengen vorliegen, kann zu den Nahrungsmitteln oder Getränken ein geeignetes Substrat zusammen mit einer Ester synthetisierenden Enzymsubstanz für die Reaktion der Esterproduktion zugegeben werden, um den Nahrungsmitteln oder Getränken einen gewünschten Geschmack zu verleihen.
Da die Beziehung zwischen Aroma und Geschmack heikel ist, sollten die Auswahl des Alkohols und der organischen Säure und die zeitliche Abfolge der Zugabe dieser Substrate usw. für das jeweilige Nahrungsmittel und Getränk experimentell bestimmt werden. Solche Experimente können von einem Fachmann einfach durchgeführt werden.
Die Mengen der Ester synthetisierenden Enzymsubstanz, die zu den Nahrungsmitteln und Getränken zugegeben werden, hängen vom Typ, der Zusammensetzung der Nahrungsmittelbestandteile und den Produktionsbedingungen der Nahrungsmittel und Getränke und außerdem von der gewünschten Intensität des Esteraromas ab, das während des Produktionsprozesses produziert werden soll. Normalerweise kann sie jedoch mit 0,0001 bis 10,0 und vorzugsweise mit 0,0002 bis 5,0 Einheiten pro kg der Nahrungsmittel oder Getränke zugegeben werden. Die Einheit ist als Ester synthetisierende Aktivität definiert, die durch das nachstehend beschriebene Verfahren bestimmt wird.
Im folgenden wird das Verfahren zur Herstellung der Enzymsubstanz erklärt. Die Bestimmung der Enzymaktivität, d.h. die Bestimmung der Estersynthese- und -hydrolyse-Aktivität, wurde nach den nachstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt.

(1) Verfahren zur Bestimmung der Ester synthetisierenden Aktivität

Die Ester synthetisierende Aktivität wird bestimmt, indem die Menge von Buttersäureethylester gemessen wird, die aus den Substraten Ethanol und Buttersäure erzeugt wird. Die Substratlösung wird hergestellt, indem 0,5 % oder 5 % Ethanol und 2,6 % Buttersäure zu 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 6) zugegeben werden. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von Natriumhydroxid auf 6 eingestellt. 1,9 ml der Substratlösung werden mit 0,1 ml der Enzymlösung, die nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, versetzt und miteinander gemischt. Das Gemisch wird zehn Minuten bei 30º0 stehengelassen und sodann mit 1 ml Aceton versetzt, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend werden 2,0 ml wäßriger Diethylether, der 50 µM Capronsäureethylester als inneren Standard enthält, zugegeben und gemischt, sodann wird das Gemisch zentrifugiert (3000 x g, zehn Minuten). Die erhaltene obere Schicht wird nun einer Gaschromatographie unterworfen, wobei die Menge des erzeugten Buttersäureethylesters bestimmt wird. Außerdem wird die Enzymlösung zur gleichen Substratlösung, die 1 ml Aceton enthält, zugegeben und das resultierende Gemisch als Leerprobe verwendet. Die Enzymaktivität wird angegeben, wobei die Enzymmenge, die in 1 Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen (0,5 % Ethanolkonzentration im Reaktionssystem) 1 µMol Buttersäureethylester produziert, als eine Einheit definiert wird.

(2) Verfahren zur Bestimmung der Esterhydrolyse-Aktivität

Die Esterhydrolyse-Aktivität wird folgendermaßen bestimmt, wobei auf das in Methods in Enzymology 77 (1981), 333, beschriebene Verfahren Bezug genommen wird.
Die Substratlösung wird hergestellt, indem 18,1 mg p-Nitrophenylacetat in 1 ml Acetonitril gelöst werden und ein Tris-Malat-Puffer (50 mM, pH 7,0) zugegeben wird, so daß 100 ml Lösung erhalten werden. 0,2 ml der Enzymlösung werden zu 1,8 ml der Substratlösung zugefügt. Das Gemisch wird zehn Minuten bei 30ºC stehengelassen und anschließend mit 1 ml Aceton versetzt, um die Reaktion zu stoppen, sodann wird die Absorption bei 405 nm gemessen. Mit den auf diese Weise erhaltenen Absorptionswerten von 0,2 bis 1,0 wurde eine lineare Beziehung zwischen der Enzymmenge und der Absorption beobachtet. Die Enzymmenge, die zur Hydrolyse von 1 µMol p-Nitrophenylacetat in einer Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen erforderlich ist, wird als eine Einheit definiert.

(3) Verfahren zur Bestimmung der spezifischen Aktivität

Der Proteintest wird unter Verwendung eines Proteintest- Kits (PROTEIN ASSAY, Bio-Rad Laboratories) mit Rinderserumalbumin als Standardlösung durchgeführt.

(4) Verfahren zur Herstellung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzymsubstanz

1) Verfahren zur Herstellung der das Enzvm enthaltenden Lösung aus einem tierischen Organ

Nach Zerkleinern des Organs wird eine Saccharose enthaltende Pufferlösung (pH 6 bis 7) zugegeben, das Gemisch aufgeschlossen und anschließend zur Auftrennung zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird sodann mit einer Säure (Essigsäure usw.) auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,5 eingestellt und zur Auftrennung zentrifugiert, wodurch ein Niederschlag erhalten wird. Der Niederschlag wird mit einem Lösungsmittel (Aceton usw.) entfettet und in einer Pufferlösung (pH 6 bis 7) suspendiert. Die Suspension wird sodann zentrifugiert und der erhaltene Überstand mit Ammoniumsulfat bis zu 70 % Sättigung versetzt, anschließend wird das Gemisch zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird sodann in 3,2 M Ammoniumsulfat suspendiert, wodurch die das Enzym enthaltende Lösung erhalten wird.

2) Verfahren zur Herstellung der das Enzym enthaltenden Lösung aus einem Mikroorganismus zur Verwendung im Vergleichstest

Hefen oder Pilze werden z.B. in einem YM-Kulturmedium gezüchtet, das aus Glucose, Malzextrakt, Hefeextrakt und Pepton zusammengesetzt ist, wohingegen Lactobacilli bei 35 bis 40ºC z.B. unter Verwendung eines Mediums für Lactobacilli, "Inoculum Broth" (Nissui Pharmaceutical Co.), gezüchtet werden. Die Kultur wird durch Zentrifugation in Zellen (Niederschlag) und Überstand aufgetrennt. Die Zellen werden mit destilliertem Wasser gewaschen, in einer Pufferlösung (pH 5,5 bis 6,5) suspendiert und aufgeschlossen, anschließend wird Ammoniumsulfat bis zu 70 % Sättigung zugegeben. Der durch Zentrifugation erhaltene Niederschlag wird in einer Pufferlösung (pH 5,5 bis 6,5) suspendiert und als Enzymsubstanz verwendet.
Außerdem wird die Kulturlösung einer Membranfiltration unterworfen. Ammoniumsulfat wird bis zu 70 % Sättigung zugegeben und der durch Zentrifugation erhaltene Niederschlag in 3,2 M Ammoniumsulfat suspendiert, wodurch die das Enzym enthaltende Lösung erhalten wird.

3) Verfahren zur Herstellung einer das Enzym enthaltenden Lösung aus einem im Handel verfügbaren Lipasepräparat zur Verwendung im Vergleichstest

Ein im Handel verfügbares Lipasepräparat wird in einer Pufferlösung (pH 5,5 bis 6,5) gelöst. Die Lösung wird einer Zentrifugation und Membranfiltration unterworfen, wodurch die das Enzym enthaltende Lösung erhalten wird.
Außerdem wird ein pulverförmiges Enzymprodukt erhalten, indem die vorstehend erwähnte das Enzym enthaltende Lösung nach einem herkömmlichen Verfahren, z.B. durch Gefriertrocknung, getrocknet wird.
Die Ester synthetisierende Aktivität und die Esterhydrolyse-Aktivität von jedem das Enzym enthaltenden Produkt werden in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Anm.: *1 Erhalten in den nachstehend beschriebenen Bezugsbeispielen
*2 Zahlen in Klammern: Ester synthetisierende Aktivität in einem Reaktionsgemisch mit 0,5 % Ethanolkonzentration, wobei die Ester synthetisierende Aktivität in einem Reaktionsgemisch mit 5 % Ethanolkonzentration als 100 definiert wird
*3 ND: Nicht bestimmt
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die Ester synthetisierende Aktivität der Enzymsubstanzen, die aus Schweineleber, Schweineniere, Rinderleber, Rinderniere und Rinderherz stammten, die höheren Werte aufweist.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend beschrieben, wobei jeweils bestimmte Nahrungsmittel und Getränke berücksichtigt werden.

1) Verfahren zur Herstellung von Brot

Die Brotherstellung nach dem Vorteig-Verfahren ("Sponge dough method") läuft folgendermaßen ab. Eine Ester synthetisierende Enzymsubstanz und Wasser werden zu den Hauptzutaten, umfassend Weizenmehl und Bäckerhefe, zugegeben, das Gemisch durchgeknetet und anschließend zwei bis fünf Stunden bei 25 bis 35ºC fermentiert (erste Fermentation). Das fermentierte Produkt wird mit den Teigzutaten gemischt, die hauptsächlich Weizenmehl, Zucker und Backfett umfassen, und das Gemisch mit Wasser versetzt, die resultierenden Bestandteile werden gemischt und zu einem Teig geknetet. Der Teig wird normalerweise 10 bis 40 Minuten bei 25 bis 35ºC stehengelassen (Abstehzeit, "Floor time"). Sodann wird der Teig in Stücke geeigneter Größe aufgeteilt und 10 bis 30 Minuten bei 15 bis 35ºC stehengelassen (Ruhezeit, "Bench time") . Die Teigstücke werden anschließend geformt und in eine Backform gelegt, wo die endgültige Fermentation bei 35 bis 45ºC solange durchgeführt wird, bis der Teig sich auf eine bestimmte Höhe gehoben hat. Danach werden die Teigstücke 10 bis 30 Minuten bei 180 bis 240ºC gebacken.
Die Brotherstellung nach dem direkten Verfahren läuft folgendermaßen ab.
Die Ester synthetisierende Enzymsubstanz und das Wasser werden zu den Zutaten zugegeben, die hauptsächlich Weizenmehl, Zucker, Backfett und Hefebestandteile ("yeast food") usw. umfassen, und das Gemisch zu einem Teig verknetet. Der Teig wird 60 bis 180 Minuten bei 25 bis 35ºC fermentiert. Anschließend wird der Teig in Stücke geeigneter Größe aufgeteilt und 10 bis 30 Minuten bei 15 bis 35ºC stehengelassen (Ruhezeit, "Bench time") . Sodann werden die Teigstücke geformt und in eine Backform gelegt, wo die endgültige Fermentation bei 35 bis 45ºC solange durchgeführt wird, bis der Teig sich auf eine bestimmte Höhe gehoben hat. Danach werden die Teigstücke 10 bis 30 Minuten bei 180 bis 240ºC gebacken.
2) Verfahren zur Herstellung von fermentiertem Gewürz Miso wird z.B. folgendermaßen hergestellt. Sojabohnen werden mit Wasser gewaschen und anschließend in Wasser eines Volumens, das dem 2,5- bis 3,5-fachen Gewicht entspricht, 10 bis 24 Stunden eingeweicht. Das Wasser wird entfernt und die Sojabohnen fünf bis 80 Minuten unter 0,5 bis 2,0 kg/cm² mit Dampf behandelt. Anschließend werden die Sojabohnen auf 30 bis 40ºC abgekühlt, und schließlich wird die Masse zerkleinert, indem sie durch ein 1- bis 5-mm-Sieb gedrückt wird. Getrennt davon wird polierter Reis oder Weizen mit Wasser gewaschen und 10 bis 24 Stunden in Wasser eingeweicht. Das Wasser wird entfernt und der Reis oder Weizen mit Dampf behandelt und zum Abkühlen stehengelassen. Wenn die Temperatur etwa 35ºC erreicht hat, wird eine Koji-Vorkultur zugefügt. Anschließend wird durch Züchtung ein Koji erzeugt. Sodann werden Koji, Salz und Wasser zu den vorher mit Dampf behandelten Sojabohnen zugegeben und, falls nötig, mit Miso-Hefe versetzt und gemischt. Die Fermentation wird unter Rühren bei 15 bis 37ºC einen Monat bis 12 Monate durchgeführt, währenddessen wird das Gemisch etwa einmal in 20 bis 40 Stunden belüftet, wodurch das fermentierte Produkt erhalten wird. Die Ester synthetisierende Enzymsubstanz wird sodann zu dem fermentierten Produkt zugegeben und die Fermentation einen Tag bis zehn Tage bei 15 bis 37ºC durchgeführt, wodurch Miso erhalten wird. Nötigenfalls kann das Produkt auch zur endgültigen Behandlung 10 bis 30 Minuten auf 65 bis 85ºC erhitzt werden.
Sojasauce wird z.B. folgendermaßen hergestellt. Weizen wird geröstet, bis leicht gebräunte Flecken auf der Oberfläche sichtbar werden, und mit einem Quetschwerk in jeweils vier bis fünf Stücke zerkleinert. Die gleiche Menge entfetteter Sojabohnen läßt man mit heißem Wasser auf etwa 120 bis 130 % quellen. Die entfetteten Sojabohnen werden mit Dampf behandelt und mit dem zerkleinerten Weizen gemischt. Anschließend wird das Gemisch auf 40ºC oder weniger abgekühlt und mit Koji-Vorkultur versetzt. Koji wird unter Verwendung einer belüfteten Koji- Apparatur hergestellt. Sodann wird Salz und nötigenfalls auch Sojasauce-Hefe zugefügt. Die Fermentation wird vier bis 15 Monate bei 15 bis 30ºC durchgeführt, wobei etwa einmal pro Woche gerührt wird, wodurch ein Moromi erhalten wird. Das Moromi wird ausgepreßt, wodurch frische Sojasauce erhalten wird. Zu der frischen Sojasauce wird sodann die Ester synthetisierende Enzymsubstanz zugesetzt und das Gemisch einen Tag bis zehn Tage bei 15 bis 30ºC weiter fermentiert, wodurch die Sojasauce erhalten wird. Außerdem kann die Sojasauce nötigenfalls zur endgültigen Behandlung z.B. 10 bis 30 Minuten bei 80 bis 85ºC erhitzt und filtriert werden.

3) Verfahren zur Herstellung von Alkoholen

Eine Kohlenstoffquelle wird mit Enzymen oder Koji verzuckert und das Gemisch mit Hefe versetzt, das sodann fermentiert wird. Während der Fermentation wird eine Ester synthetisierende Enzymsubstanz zugegeben. Bei der Herstellung von Sake oder Shochu wird normalerweise ein Teil der Kohlenhydratsubstanzen zu Beginn der Fermentation zugegeben und die restlichen Kohlenhydratquellen schrittweise im Verlauf der Fermentationsschritte zugesetzt.
Für die Kohlenstoffquelle kann ein Kohlenhydrat oder Stärke, abhängig vom gewünschten Alkoholtyp, ausgewählt werden. Z.B. können Kartoffeln, Buchweizen, Reis (nicht-glutinöser, glutinöser Reis usw.), Gerste, Kolbenhirse, Deccan-Gras, Mais, Gaoliang, Gewöhnliche Hirse usw. oder Stärken daraus, Koji daraus, Früchte, wie z.B. Trauben usw., Melassen, Glucose usw. verwendet werden.
Die verwendete Carbohydrase kann eine Carbohydrase sein, die von den Aspergillaceae, z.B. Aspergillus oryzae, Aspergillus awamon, Aspergillus kawachii usw., produziert wird, und verwendete Enzympräparate können z.B. Enzyme in Koji, Amylase, Protease usw. sein. Die verwendete Hefe kann ein zur Gattung Saccharomyces gehörender Mikroorganismus sein.
Wenn ein Kohlenhydrat in Form einer Frucht, z.B. Trauben, oder Melassen, Glucose usw. verwendet wird, kann die einfache Fermentation durchgeführt werden, indem Hefe direkt zugesetzt wird. Wenn Getreide, wie z.B. Reis, Gerste, Buchweizen, Mais, Gaoliang, Gewöhnliche Hirse, Deccan-Gras usw., und Kartoffeln verwendet werden, wird die parallele komplexe Fermentation durchgeführt, indem zuerst die Getreide, die eine Stärkesubstanz darstellen, unter Einsatz einer Carbohydrase in Saccharide zersetzt werden und sodann die Hefe für die Fermentation zugegeben wird.
Die Temperatur und die Zeit für die Fermentation sollte z.B. für Sake bei 10 bis 20ºC und 12 bis 25 Tagen; für Wein bei 15 bis 30ºC und fünf bis 20 Tagen; für Bier bei 0 bis 15ºC und fünf Tagen bis zwei Monaten; für destillierte Spirituosen wie Whiskey, Wodka, Gin, Rum usw. bei 15 bis 35ºC und zwei bis 30 Tagen; für Chinesischen Sake (Huangjiu, Baijiu usw.) in einem gefüllten Faß am Boden bei mindestens vier bis fünf Tagen und höchstens einem Monat bis neun Monaten liegen.
Im folgenden werden einige Verfahren angeführt, wobei das durch Hefefermentation erzeugte Moromi zu einem Alkohol umgewandelt werden kann, abhängig vom gewunschten Typ. Z.B. wird im Fall von Wein, Bier, Sake und Huangjiu, nachdem die Fermentation des Moromi vollständig abgelaufen ist, eine Filtration durchgeführt, um den Fermentationsrückstand und die Hefezellen vom reinen Alkohol abzutrennen. Im Fall von Whiskey, Brandy, Rum, Gin, Wodka und Baijiu wird eine Destillierapperatur usw. verwendet, um das Moromi zu reinem Alkohol zu destillieren. Die durch diese Verfahren erhaltenen Alkohole können als solche verwendet werden, oder sie können in einer anderen Ausführungsform erhitzt und gemischt werden, um die Haltbarkeit zu erhöhen und die Qualität zu stabilisieren. Eine Hitzebehandlung wird zur Sterilisation und zum Stillstand der Reifung durchgeführt, wobei die Produkttemperatur bei 60 bis 80ºC liegt. Das Mischen umfaßt den Zusatz gesonderter Alkohole und die Kombination anderer Produkte, um im Fall von gebrauten Alkoholen, wie z.B. Sake, Wein usw., ein spezifisches Produkt zu konservieren, und im Fall von destillierten Spirituosen, die Alkoholkonzentration einzustellen.

4) Verfahren zur Herstellung von Alkohol enthaltenden Gewürzen

Die Alkohol enthaltenden Gewürze werden z.B. folgendermaßen hergestellt.
Die gleichen Stoffe wie bei der Herstellung von Alkoholen werden verwendet, und die gleichen Produktionsschritte wie bei der Produktion von Alkoholen werden eingesetzt. Der charakteristische Aspekt im Fall von Alkohol enthaltenden Gewürzen besteht darin, daß die Produktionsschritte den Zusatz von Salz, Essig usw. zu dem Moromi vor vollständigem Ablauf der Fermentation umfassen (nicht trinkbar nach dem "Liquor Tax Act"), worauf die Filtration oder der Zusatz einer Würzsubstanz, z.B. von Zucker, einer organischen Säure, Aminosäure, von tierischem oder pflanzlichem Extrakt, Fruchtsaft, Vitamin, Würze usw., folgt, wodurch eine Zusammensetzung erhalten wird, die zum Würzen geeignet ist. Außerdem liegt im Fall von süßem Sake im Produktionsprozess kein Fermentationsschritt mit Hefe vor, vielmehr umfaßt der Produktionsprozess die Verzuckerung von glutinösem Reis und die anschließende Zugabe von vorher hergestelltem Shochu oder einem anderen Alkohol.

5) Verfahren zur Herstellung von aufbereiteten Fleischprodukten

Hier wird ein Verfahren zur Herstellung von typischen Beispielen wie Schinken, Speck und Wurst beschrieben.

(1) Verfahren zur Herstellung von Schinken und Speck

Das Fleisch, das als Hauptbestandteil verwendet werden soll, wird geschnitten und geformt, sodann werden für das Pökeln Zusatzstoffe und eine Ester synthetisierende Enzymsubstanz zugegeben. Die gepökelte Masse wird z.B. in eine Hülle gegeben und anschließend zur Fertigstellung getrocknet, geräuchert und gekocht.
Hierfür kann Fleisch verwendet werden, das von Rindern, Schweinen, Ziegen, Pferden, Kaninchen, Rentieren, Kamelen, Geflügel, Walen, Fischen usw. stammt.
Die verwendeten Zusatzstoffe können Salz, Süßstoff (Zucker, Glucose, Lactose usw.), Protein (Milchproteine, Casein usw.), Bindemittel (Phosphat usw.), Konservierungsmittel (Sorbinsäure usw.), Antioxidantien (Ascorbinsäure, Natriumascorbat, Erythorbinsäure, Natriumerythorbat usw.), Entwickler (Nitrat, Natriumnitrit usw.), Gewürze (Pfeffer, Muskatnuß, Kardamome, Paprika, Ingwer, Koriander usw.) sein.
Die Mikroorganismen, die durch die Rohsubstanzen eingebracht werden, zählen zu den Gattungen Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Micrococcus, Debarvomyces, Mucor, Rhizopus, Penicillium oder Aspergillus.
Das Pökeln wird normalerweise 15 Stunden bis einen Monat bei 1 bis 40ºC durchgeführt, wobei ein aus rohen Zusatzstoffen bestehendes Pökelmittel mittels Immersion, Injektion, Einreiben usw. auf eine rohe Fleischsubstanz aufgetragen wird. Das Ganze wird sodann in eine Hülle aus tierischem Eingeweide usw. unter Verwendung einer Stopfapparatur usw. abgefüllt.
Die Trocknung wird 30 Minuten bis fünf Tage bei 15 bis 80ºC durchgeführt. Geräuchert wird 30 Minuten bis fünf Tage bei 15 bis 140ºC. Der Kochvorgang wird solange durchgeführt, bis die Temperatur im Inneren des Fleisches 60 bis 70ºC erreicht hat.

(2) Verfahren zur Herstellung von Wurst

Das Fleisch, das als roher Hauptbestandteil verwendet werden soll, wird zerkleinert. Rohe Zusatzstoffe und eine Ester synthetisierende Enzymsubstanz werden zugegeben und das Pökeln und Fertigstellung des Fleisches wie im Verfahren zur Herstellung von Schinken und Speck durchgeführt. Hierfür werden die gleichen Fleischarten und Zusatzstoffe verwendet, die auch für Schinken und Speck eingesetzt werden.
Außerdem wird bei der Herstellung von fermentierten Würsten während des Pökelns im vorstehend erwähnten Verfahren zur Herstellung von Würsten ein Mikroorganismus als Starter zugegeben.
Hierfür können Mikroorganismen der Gattung Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Debaryomyces, Micrococcus, Staphylococcus oder Penicillium verwendet werden.

6) Verfahren zur Herstellung von Milchprodukten

Hier wird das Verfahren zur Herstellung von Joghurt und Käse beschrieben.

(1) Verfahren zur Herstellung von Joghurt

Milch oder ein Gemisch aus Milch und einem Stabilisator wird erhitzt und eine Ester synthetisierende Enzymsubstanz und ein Mikroorganismus als Starter zugegeben. Man läßt die Fermentation ablaufen, wodurch Joghurt erhalten wird.
Hierfür kann Milch von Säugern, wie z.B. Kühen, Ziegen, Kamelen, Yaks, Pferden, Eseln, Rentieren usw. verwendet werden. Sie kann in einer beliebigen Form, z.B. als Vollmilch, Milchkonzentrat, Trockenmilch, Magermilch usw. verwendet werden.
Als Stabilisator können Xanthan, Agar, Gelatine, Pektin usw. eingesetzt werden.
Nötigenfalls können außerdem ein Süßstoff (Glucose, Saccharose usw.), Geschmackstoff, Farbstoff usw. zugegeben werden.
Erhitzt wird zehn Minuten bis eine Stunde bei 60 bis 100ºC.
Als Starter können Mikroorganismen verwendet werden, die zur Gattung Streptococcus, Lactobacillus oder Bifidobacterium gehören.
Die Fermentation wird zwei bis zehn Stunden bei 20 bis 40ºC durchgeführt.

(2) Verfahren zur Herstellung von Käse

Nötigenfalls wird die Milch mit Calciumchlorid versetzt, um sie mit Calcium anzureichern, und das Gemisch erhitzt. Sodann werden eine Ester synthetisierende Enzymsubstanz und ein Mikroorganismus (Starter) zugefügt und fermentiert. Sodann wird Lab zugegeben und die Milch koaguliert. Anschließend wird sie dünn geschnitten und erhitzt, falls erforderlich. Die Molke wird entfernt, d.h. das Wasser wird entfernt, sodann wird die Masse in Formen gefüllt und gepreßt, wodurch Frischkäse erhalten wird. Salz wird zugegeben und, falls erforderlich, läßt man Schimmel auf der Oberfläche des Frischkäses wachsen, oder die Oberfläche wird mit genießbarem Käsewachs überzogen, sodann läßt man den Käse reifen. Außerdem wird der auf diese Weise hergestellte natürliche Käse durch Erhitzen geschmolzen, emulgiert und in Formen gebracht, wodurch zubereiteter Käse hergestellt wird.
Die hier verwendete Milch umfaßt die bei der Herstellung von Joghurt verwendeten Milchsorten.
Hierfür können Mikroorganismen der Gattung Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Bifidobacterium, Penicillium, Candida, Debaryomyces oder Geotrichum verwendet werden.
Die Fermentation wird zwei bis zehn Stunden bei 20 bis 40ºC durchgeführt.

7) Verfahren zur Herstellung von Pickles

Pickles werden erhalten, indem große Mengen eines Ausgangsmaterials für die Pickles zusammen mit einer Ester synthetisierenden Enzymsubstanz in einem Grundstoff zum Einlegen ("Pickle base"), umfassend Salz, Sojasauce, Miso, Kasu (gepresster Kuchen aus der Herstellung von Sake oder süßem Sake), Koji, Essig, Kleie (Reiskleie, Weizenkleie usw.), Senf, Moromi (Sojasauce-Moromi, Miso-Moromi usw.), oder in einer Gewürzflüssigkeit, die durch Zusatz von Zucker (Glucose, Saccharose usw.), organischen Säuren (Citronensäure, Bernsteinsäure usw.), Aminosäuren (Natriumglutamat usw.), Vitaminen (Vitamin C, Vitamin B&sub2; usw.), süßem Sake, Shochu, Gewürzen, Geschmackstoffen, Farbstoffen, Süßstoffen, Konservierungsmitteln, Verdickungsmitteln usw. zum Grundstoff zum Einlegen hergestellt wird, eingelegt werden. Der Mikroorganismus spielt beim Verfahren zur Herstellung von Pickles ("Pickling process") eine wichtige Rolle.
Außerdem wird das in dem Grundstoff zum Einlegen oder der Gewürzflüssigkeit eingelegte Ausgangsmaterial manchmal in einen neuen Grundstoff zum Einlegen oder einer neuen Gewürzflüssigkeit eingeweicht, entweder wie es ist oder nach Entsalzen mit Wasser usw., wobei eine sekundäre Prozessierung durchgeführt wird (Einlege-Hauptbehandlung, "Main pickling"). In diesem Fall wird die Einlege-Vorbehandlung mit Salz zur Entfernung von überschüssigem Wasser aus dem Ausgangsmaterial Einlege-Vorbehandlung ("Pre-pickling") genannt und das vorher bereits eingelegte Material in gleicher Art und Weise einer sekundären Prozessierung unterworfen. Das Ausgangsmaterial, das zum Einlegen verwendet werden kann, umfaßt z.B. Gemüse, wie z.B. Breitblättriger Senf, Chinesischer Kohl, Kohl, Rutensenf, Schalotten, Roter Pfeffer, Knoblauch, Bambussprossen, Pestwurz, Adlerfarn, Osmunda, Sellerie, Zwiebel, Rettich, Rübe, Ingwer, Japanischer Meerrettich, Kletten, Auberginen, Gurken, Melonen, Bohnensprossen, Japanischer Ingwer, Chrysanthemum, Blumenkohl usw.; Früchte, wie z.B. Aprikosen, Pflaumen usw.; Seegras, wie z.B. Kelp, Undaria usw.; und Pilze, wie z.B. Shiitake, Lyophyllum aggregatum, Champignon usw., die frisch oder erhitzt und getrocknet verwendet werden können.
Hierfür können Mikroorganismen der Gattung Leuconostoc, Streptococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Torulopsis, Hansenula, Pichia, Mycoderma, Debaryomyces, Candida oder Kloechera verwendet werden.
Das Einlegen wird z.B. einen Tag bis 12 Monate bei 0 bis 40ºC durchgeführt, abhängig vom Typ der gewünschten Pickles, der Verarbeitung der Substanz, der Salzkonzentration, dem pH- Wert usw..

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Gaschromatographie-Analyse der aromatischen Komponenten im Vorteig, wobei Ester synthetisierende Enzymsubstanz zugegeben wurde.
Fig. 2 zeigt eine Gaschromatographie-Analyse der aromatischen Komponenten im Vorteig, wobei keine Ester synthetisierende Enzymsubstanz zugegeben wurde.

Erklärung der Symbole

1. Schwefelkohlenstoff
2. Essigssäureethylester
3. Ethanol
4. Buttersäureethylester
5. Essigsäurebutylester
6. Benzol
7. Propanol
8. Essigsäure-2-methylethylester
9. Valeriansäureethylester
10. 1-Propanol-2-methyl- -
11. Essigsäurepentylester
12. 3-Penten-2-on-4-methyl- -
13. 2-Buten-2-methyl- -
14. Capronsäureethylester
15. Hexanol
16. 1-Propanol-3-ethoxy- -
17. Essigsäure

Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung

Nachstehend werden Beispiele, Vergleichsbeispiele und Bezugsbeispiele dargestellt.

Beispiel 1 Verfahren zur Herstellung von Brot

Brot wurde gemäß dem nachstehend beschriebenen Rezept und Verfahren hergestellt. In den Beispielen sind die Mengen der Zutaten als Gewichtsprozent angegeben, wobei die bei der Herstellung von Brot zu verwendende Gesamtmenge Weizenmehl als 100 definiert ist.

Rezept der Zutaten des Vorteigs ("Sponge") (Gew.-%)

Weizenmehl 70
Hefe 2
Hefebestandteile 0,1
Wasser 42
Enzymsubstanz Dargestellt in Tabelle 2
(Zugegebene Menge: Einheiten/Weizenmehl 100 Gew.-%)

Rezept der Teigzutaten (Gew.-%)

Weizenmehl 30
Zucker 5
Salz 2
Backfett 5
Magermilchpulver 2
Wasser 26

Herstellungsverfahren

Die vorstehend angegebenen Zutaten des Vorteigs und die Enzymsubstanz wurden verknetet, wobei ein Senkrechtmischer (Typ 55-151; hergestellt von Kanto Mixer, Inc.; wird auch nachstehend eingesetzt) drei Minuten bei niedriger Geschwindigkeit (30 UpM; wird auch nachstehend eingesetzt) und eine Minute bei mittlerer Geschwindigkeit (60 UpM; wird auch nachstehend eingesetzt) verwendet wurde. Die Fermentation des Vorteigs wurde vier Stunden bei 28ºC durchgeführt. Die Mischtemperatur betrug 24ºC.
Der auf diese Weise erhaltene Vorteig und die Teigzutaten mit Ausnahme des Backfetts wurden unter Verwendung eines Senkrechtmischers drei Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und zwei Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit miteinander gemischt. Anschließend wurde das Backfett zugegeben und zwei Minuten bei niedriger Geschwindigkeit, drei Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit und zwei Minuten bei hoher Geschwindigkeit (90 UpM; wird auch nachstehend eingesetzt) gemischt. Sodann folgten 20 Minuten Abstehzeit ("Floor time") bei Raumtemperatur, worauf der Teig geteilt, zu runden Stücken geformt, 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen (Ruhezeit, "Bench time") und unter Verwendung einer Formmaschine geformt wurde.
Anschließend wurde der Teig 50 Minuten bei 38ºC in einer abgedichteten Kiste, die eine relative Luftfeuchtigkeit von 85 % aufwies, fermentiert und schließlich 28 Minuten bei 220ºC gebacken.
Die Laibe wurden sodann zwei Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, anschließend wurden sie verpackt und weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Ein Geruchs- und Geschmackstest wurde mit geschulten Testpersonen durchgeführt, um die Qualität des Brotes zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
Anm.: Der Durchschnittswert, der durch Beurteilung der Testpersonen von Stärke des Esteraromas, Alkoholgeruchs und muffigen Geruchs erhalten wurde, beruhte auf den folgenden Kriterien:
0: Nicht wahrnehmbar
1: Schwach wahrnehmbar
2: Deutlich wahrnehmbar
3: Stark wahrnehmbar (Das gleiche Beurteilungsschema wurde in den folgenden Tabellen verwendet.)
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, nimmt bei Zugabe der Enzymsubstanz zum Brotteig ein gewünschtes Esteraroma im Brot zu, wohingegen der muffige Geruch abnimmt. Brot, dem 0,02 Einheiten Enzymsubstanz zugefügt wurden, ist am stärksten bevorzugt.
Andererseits zeigte Brot, bei dem die im Handel verfügbare Lipase MY verwendet wurde, weder eine Zunahme des gewünschten Esteraromas noch eine Abnahme des muffigen Geruchs. Keine der Testpersonen mochte dieses Brot.

Beispiel 2 Verfahren zur Herstellung von Brot

Ein Fermentationsprodukt wird unter Verwendung von Weizenmehl, Wasser, Hefe und einer Enzymsubstanz (der Enzymsubstanz aus Schweineleber von Bezugsbeispiel 1 oder Lipase LP) hergestellt und das Produkt als das fermentierte Gewürz beim Herstellungsverfahren von Brot gemäß diesem Beispiel zugegeben. In diesem Beispiel sind die Mengen der Zutaten als Gewichtsprozent angegeben, wobei die bei der Herstellung des fermentierten Brotgewürzes oder des Brotes zu verwendende Gesamtmenge Weizenmehl als 100 definiert ist.

Rezept des fermentierten Gewürzes für Brot (Gew.-%)

Weizenmehl 100
Wasser 180
Hefe 2
Zucker 10
Enzymsubstanz Dargestellt in Tabelle 3 (Zugegebene Menge: Einheiten/Weizenmehl 100 Gew.-%)
Das vorstehend erwähnte fermentierte Gewürz für Brot wurde 24 Stunden bei 30ºC stehengelassen und das Produkt bei der nachstehend angegebenen Brotherstellung als Zusatzstoff verwendet.

Rezept der Teigzutaten (Gew.-%)

Weizenmehl 100
Zucker 5
Salz 2
Backfett 5
Magermilchpulver 2
Hefe 3
Wasser 69
Fermentiertes Gewürz 10
Die vorstehend erwähnten Teigzutaten wurden unter Verwendung eines Senkrechtmischers drei Minuten bei geringer Geschwindigkeit, acht Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit und sechs Minuten bei hoher Geschwindigkeit verknetet. Der resultierende Teig wurde sodann 40 Minuten bei 28ºC fermentiert. Der Teig wurde geteilt und zu runden Formen geformt, 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen (Ruhezeit, "Bench time") und anschließend unter Verwendung einer Formmaschine geformt. Sodann wurde die folgende Vorgehensweise wie in Beispiel 1 zur Herstellung von Brot wiederholt. Auch der Geruchs- und Geschmackstest des Brotes wurde genauso wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, wird bei Zugabe der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 zum Brotteig ein gewünschtes Esteraroma im Brot stärker. Brot, dem 0,0002 Einheiten Enzymsubstanz zugefügt wurden, war am stärksten bevorzugt. Andererseits zeigte Brot, bei dem die im Handel verfügbare Lipase LP verwendet wurde, keine Zunahme des gewünschten Esteraromas. Keine der Testpersonen mochte dieses Brot.

Beispiel 3 Verfahren zur Herstellung von Brot

Brot wurde nach dem nachstehend beschriebenen Rezept und Verfahren hergestellt. In diesem Beispiel sind die Mengen der Zutaten als Gewichtsprozent angegeben, wobei die bei der Herstellung von Brot zu verwendende Gesamtmenge Weizenmehl als 100 definiert ist.

Rezept der Zutaten des flüssigen Vorteigs (Gew.-%)

Weizenmehl 30
Zucker 2
Salz 1
Hefe 2
Wasser 50
Enzymsubstanz Dargestellt in Tabelle 4 (Zugegebene Menge: Einheiten/Weizenmehl 100 Gew.-%)

Rezept der Teigzutaten (Gew.-%)

Weizenmehl 70
Zucker 5
Salz 1
Backfett 5
Magermilchpulver 2
Hefe 0,5
Wasser 20

Herstellungsverfahren

Die vorstehend erwähnten Zutaten des flüssigen Vorteigs wurden gemischt und das Gemisch 2,5 Stunden bei 30ºC fermentiert. Die Gesamtmenge des Fermentationsproduktes und die Teigzutaten mit Ausnahme des Backfettes wurden unter Verwendung eines Senkrechtmischers drei Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und zwei Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit miteinander verknetet. Anschließend wurde das Backfett zugegeben und das Gemisch zwei Minuten bei niedriger Geschwindigkeit, drei Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit und fünf Minuten bei hoher Geschwindigkeit geknetet. Sodann wurde das folgende Verfahren genauso wie in Beispiel 1 zur Herstellung von Brot durchgeführt, das sodann einem Geruchs- und Geschmackstest unterzogen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, nimmt bei Zugabe der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 zum Brotteig das gewünschte Esteraroma im Brot zu und der muffige Geruch ab.
Andererseits zeigte Brot, bei dem die im Handel verfügbare Lipase P verwendet wurde, weder eine Zunahme des gewünschten Esteraromas noch eine Abnahme des muffigen Geruch. Das durch Zusatz der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 hergestellte Brot wurde dem unter Verwendung von Lipase P produzierten Brot vorgezogen.

Testbeispiel

Vergleich

Die aromatischen Bestandteile im Brot, das nach dem Vorteig-Verfahren hergestellt wurde, wurden analysiert.

Rezept der Zutaten des Vorteigs

Weizenmehl 131 g
Hefe 3,8 g
Wasser 78,8 ml
Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1
(Zugegebene Menge: 0,02 Einheiten/100 g Weizenmehl)
Die vorstehend erwähnten Zutaten des Vorteigs wurden unter Verwendung eines Senkrechtmischers drei Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und eine Minute bei mittlerer Geschwindigkeit verknetet. Das resultierende Produkt wurde sodann in einen 2-Liter-Kessel gegeben und bei 30ºC gehalten. Ab dem Zeitpunkt, zu dem die Fermentation begann, wurden am einen Ende des Kessels pro Minute 500 ml Stickstoffgas 17 Stunden lang eingeblasen und ein mit 0,05 g eines Adsorptionsmittels (TENAX GC; Gasukuro Kogyo, Inc.) gefülltes Glasröhrchen an der Öffnung des Kessels befestigt, um die Aroma-Komponenten vollständig zu adsorbieren. Das mit TENAX GC gepackte Glasröhrchen wurde in ein Glasfläschchen (10 ml Volumen) gegeben, um eine Analyse des Luftraums durchführen zu können. Sodann wurde 10 Minuten eine Hitze von 150ºC angewendet und die Verbindungen im Luftraum des Fläschchens durch Gaschromatographie/Massenspektrometer (GC-MS) analysiert. Das Ergebnis der Gaschromatographie ist in Fig. 1 dargestellt.
Außerdem wurde als Kontrolle eine Gaschromatographie mit einem Produkt durchgeführt, bei dem kein Enzym zugegeben worden war, die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt.

Analysebedingungen

Analysator: HP5971A, 19395A (Hewlett Packard Co.)
Säule: DB-WAX (Polyethylenglykol 20M), Länge 30 m, Innendurchmesser 0,25 mm, Filmdicke 0,25 µm (J & W Co.)
Trägergas: He
Durchflußgeschindigkeit: 1 ml/min
Injiz. Probenvolumen: 1 ml (Teilungsverhältnis = 1:10)
Ofentemperatur: 38ºC, 4 Minuten, erhöht um 2ºC/min auf 60ºC, erhöht um 5ºC/min auf 150ºC
Injektionstemperatur: 150ºC
Zwischenschicht-Temperatur: 250ºC
Detektor: Ionisierungsverf.: EI Ionisierungsspannung: 70 eV
Wie aus den Figuren 1 und 2 ersichtlich ist, wurden im Vorteig, dem die Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 zugefügt worden war, größere Mengen an Buttersäureethylester, Essigsäurebutylester, Valeriansäureethylester, Essigsäurepentylester, Capronsäureethylester usw. nachgewiesen als im Vorteig, dem keine Enzymsubstanz zugefügt worden war, dies zeigt, daß die Enzymsubstanz an der Synthese der verschiedenen Ester im Brotteig beteiligt war.

Beispiel 4 Verfahren zur Herstellung von Miso

Sojabohnen wurden mit Wasser gewaschen und sodann über Nacht in der dreifachen Menge Wasser eingeweicht. Die Sojabohnen wurden 60 Minuten bei einem Druck von 0,5 kg/cm² mit Dampf behandelt. Anschließend wurden die Sojabohnen auf 35ºC abgekühlt und unter Verwendung eines Zerkleinerers durch ein 1,9- mm-Sieb bedrückt. Getrennt davon wurde polierter Reis 17 Stunden in Wasser eingeweicht und das Wasser entfernt. Der Reis wurde unter Normaldruck 50 Minuten mit Dampf behandelt. Sobald die Produkttemperatur 35ºC erreicht hatte, wurde Miso-Vorkultur für Koji "Miso seed koji" (Aspergillus oryzae, Akita Konno Store Co.) zugegeben und das Gemisch in einem Koji-Raum 48 Stunden bei 35ºC fermentiert, wobei es zum Erhalt von Reis- Koji nach 42 Stunden kopfüber umgedreht wurde. Sodann wurden 6 kg der vorher mit Dampf behandelten Sojabohnen, 2 kg Reis- Koji, 1,36 kg Salz und 600 ml Wasser gemischt und 30 Tage bei 35ºC fermentiert, wodurch ein Fermentationsprodukt erhalten wurde. Die in Tabelle 5 angegebene Enzymsubstanz wurde zu 1 kg des Fermentationsproduktes zugegeben. Das Gemisch wurde drei Tage bei 35ºC weiter fermentiert, wodurch Miso erhalten wurde. Außerdem wurde das Gemisch ohne Enzymzugabe drei Tage bei 35ºC in gleicher Art und Weise fermentiert, wodurch Miso erhalten wurde, das keine Enzymsubstanz enthielt. Von der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz wurden 0,01, 0,1, 1 bzw. 10 Einheiten und von der Lipase MY 0,01 bzw. 10 Einheiten, bezogen auf 1 kg der 30 Tage bei 35ºC fermentierten Substanz, zugegeben.
1,5 g des erhaltenen Miso wurden in 150 ml heißem Wasser (80ºC) gelöst und ein Geruchs- und Geschmackstest mit geschulten Testpersonen durchgeführt, um die Qualität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Anm.: * Der Durchschnittswert, der durch Beurteilung der Testpersonen von Stärke des Wachsgeruchs und Korngeruchs erhalten wurde, beruhte auf den folgenden Kriterien:
0: Nicht wahrnehmbar
1: Schwach wahrnehmbar
2: Deutlich wahrnehmbar
3: Stark wahrnehmbar
(Das gleiche Beurteilungsschema wurde in den folgenden Tabellen verwendet.)
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte das unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 erhaltene Miso eine Zunahme des gewünschten Esteraromas und eine Abnahme des Korngeruchs. Andererseits wies das unter Verwendung von im Handel verfügbarer Lipase MY erhaltene Miso ein schwächeres gewünschtes Esteraroma auf und besaß einen unerwünschten Wachsgeruch. Außerdem mochte keine der Testpersonen dieses Miso, zu dem Lipase MY zugefügt worden war.

Beispiel 5 Verfahren zur Herstellung von Sojasauce

5 kg Weizen wurden in einem zylinderförmigen Umwälzröster geröstet, bis eine leicht geröstete Oberfläche erhalten wurde, und der Weizen sodann mit einem Quetschwerk zerkleinert. Getrennt davon ließ man 5 kg entfettete Sojabohnen in heißem Wasser auf ein Volumen von 120 % quellen, diese wurden sodann 40 Minuten bei einem Druck von 1 kg/cm² mit Dampf behandelt. Die mit Dampf behandelten Sojabohnen wurden anschließend mit dem vorher zerkleinerten Weizen gemischt. Sobald die Temperatur des Gemisches wieder auf 40ºC zurückgegangen war, wurde Miso-Vorkultur für Koji ("Miso seed koji") (Aspergillus oryzae, Hishiroku) zugegeben und das Gemisch in einer belüfteten Koji-Apparatur 45 Minuten bei 27ºC gezüchtet, wodurch Koji hergestellt wurde. Das Koji wurde mit einer Kochsalzlösung versetzt, die durch Lösen von 3 kg Salz in 17,3 Liter Wasser erhalten wurde. Das Gemisch wurde fünf Monate bei 18ºC fermentiert, wodurch Moromi erhalten wurde. Als nächstes wurde das Moromi mit einer Lamellenpresse ausgedrückt, wobei frische Sojasauce erhalten wurde. Die in Tabelle 6 aufgegebene Enzymsubstanz wurde zu 1 kg frischer Sojasauce zugefügt. Das Gemisch wurde weiter drei Tage bei 18ºC fermentiert, wodurch Sojasauce erhalten wurde. Außerdem wurde ein Gemisch ohne zugegebene Enzymsubstanz in gleicher Art und Weise drei Tage bei 18ºC fermentiert, wodurch Sojasauce ohne Enzymsubstanz erhalten wurde. Von der aus Rinderleber stammenden Enzymsubstanz wurden 0,05, 0,5 bzw. 1 Einheit und von Lipase LP 0,05 bzw. 1 Einheit pro kg der fünf Monate bei 18ºC fermentierten Sojasauce zugegeben.
1,5 g der erhaltenen Sojasauce wurden in 150 ml heißem Wasser (80ºC) gelöst und ein Geruchs- und Geschmackstest mit geschulten Testpersonen durchgeführt, um die Qualität zu beurteilen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte die Sojasauce, bei der die Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 3 verwendet worden war, eine Zunahme des gewünschten Esteraromas. Andererseits wies die unter Verwendung von im Handel erhältlicher Lipase LP hergestellte Sojasauce ein schwächeres gewünschtes Esteraroma auf und besaß den unerwünschten Wachsgeruch. Außerdem mochte keine der Testpersonen die Sojasauce, zu der Lipase LP zugefügt worden war.

Beispiel 6 Verfahren zur Herstellung von Sake

60 g Koji-Reis*&sup4;, 1 ml Sake-Hefe*&sup5; und 0,9 ml 95 % Milchsäure wurden in 200 ml frischem Wasser dispergiert und gemischt. Das Gemisch wurde vier Stunden bei 15ºC stehengelassen. 120 g mit Dampf behandelter Reis wurden zugegeben und gemischt (erste Zugabe) und die Fermentation zwei Tage bei 15ºC durchgeführt. Sodann wurden 70 g Koji-Reis, 250 g mit Dampf behandelter Reis und 420 ml frisches Wasser zugegeben (zweite Zugabe). Das Gemisch wurde weiterhin einen Tag bei 15ºC fermentiert. Schließlich wurden 70 g Koji-Reis, 430 g mit Dampf behandelter Reis und 680 ml frisches Wasser zugegeben (dritte Zugabe) und gemischt. Das Gemisch wurde weiterhin 12 Tage bei 15ºC fermentiert.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 oder Lipase MY) wurde während der letzten Zugabe zugesetzt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz produzierten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz waren 0,05, 0,5, 5 und 10 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz und 0,05 und 10 Einheiten der Lipase MY pro kg Moromi.
Anm.: *4 Der verwendete Aspergillus war "Sake koji fungi" (Aspergillus oryzae)
*5 Sake-Hefe #9 der "Japan Brewing Society" wurde zwei Tage bei 30ºC in einem YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton, 2 % Glucose) gezüchtet und die Kultur drei Minuten bei 7000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, wodurch Sake-Hefe erhalten wurde.
Das fermentierte Moromi wurde druckfiltriert, wodurch ein Überstand erhalten wurde. Ein Geruchs- und Geschmackstest wurde durchgeführt, um die Qualität zu beurteilen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
Anm.: *6 Der Durchschnittswert, der durch Beurteilung der Testpersonen von Aroma (Gesamtbeurteilung, einschließlich Esteraroma) und Geschmack erhalten wurde, beruhte auf den folgenden Kriterien:
1: Sehr schlecht
2: Schlecht
3: Normal
4: Gut
5: Sehr gut
(Das gleiche Beurteilungsverfahren wurde in der folgenden Tabelle verwendet.)
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte der unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 hergestellte Sake eine Zunahme des gewünschten Esteraromas, wobei die Zunahme eine direkte Beziehung zur Zugabe der Estersubstanz aufwies. Andererseits zeigte der unter Verwendung von Lipase MY hergestellte Sake keine Zunahme des Esteraromas, der Geschmack und das Aroma konnten nicht verbessert werden.

Beispiel 7 Verfahren zur Herstellung von Shochu

50 ml Sake-Hefe*&sup7; und 280 g Reis-Koji*&sup8; wurden in 400 ml frischem Wasser dispergiert (erste Zugabe). Das Gemisch wurde sechs Tage bei 20ºC fermentiert. Anschließend wurden 560 g Gerste und 800 ml frisches Wasser zugegeben (zweite Zugabe). Das Gemisch wurde weiterhin zehn Tage bei 20ºC fermentiert.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineniere stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 oder Lipase LP) wurde während der zweiten Zugabe zugesetzt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz produzierten Produkt verglichen.
Die Enzymdosen betrugen 0,01, 0,1, 1 bzw. 10 Einheiten der aus Schweineniere stammenden Enzymsubstanz und 0,01 bzw. 10 Einheiten Lipase LP pro kg Moromi.
Anm.: *7 Shochu-Hefe #2 der "Japan Brewing Society" wurde 24 Stunden bei 30ºC in einem YPD-Medium gezüchtet und die Kulturlösung durch Schwerkraft 15 Stunden bei 5ºC sedimentiert. Nach Entfernung der oberen Schicht wurde Sake-Hefe erhalten.
*8 Der verwendete Aspergillus war "Shochu koji fungi" (Aspergillus oryzae).
Das fermentierte Moromi wurde unter vermindertem Druck bei 60º0 destilliert. Man ließ das Moromi vier Tage bei 5ºC abkühlen, sodann wurde das Öl durch Filtration entfernt. Das T nicht-ölige Moromi wurde einem Geruchs- und Geschmackstest unterworfen. Tabelle 8
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte sich bei Zugabe der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 zu dem Shochu eine Zunahme des gewünschten Esteraromas, wobei die Zunahme eine direkte Beziehung zur Zugabe der Estersubstanz aufwies. Andererseits zeigte das unter Verwendung von Lipase LP hergestellte Shochu keine Zunahme des Esteraromas, der Geschmack und das Aroma konnten nicht verbessert werden.

Beispiel 8 Verfahren zur Herstellung von Weißwein

Weinhefe (Japan Brewing Society OC-2) wurde zu 1 kg Traubensaft ("Verdelet") zugegeben (50 Millionen Hefezellen pro kg Saft). Die Fermentation wurde 14 Tage bei 20ºC durchgeführt. Die Enzymsubstanz (aus Schweineniere stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 oder Lipase LP) wurde während der Zugabe der Weinhefe zugesetzt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz produzierten Produkt verglichen.
Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,1, 1 bzw. 10 Einheiten der aus Schwieneniere stammenden Enzymsubstanz und 0,1 bzw. 10 Einheiten Lipase LP pro kg Moromi.
Der vergorene Wein wurde zur Beurteilung der Qualität einem Geruchs- und Geschmackstest unterworfen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte sich bei Zugabe der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 zum Wein eine Zunahme des gewünschten Esteraromas, wobei die Zunahme eine direkte Beziehung zur Zugabe der Estersubstanz aufwies.
Andererseits zeigte der unter Verwendung von Lipase LP hergestellte Wein keine Zunahme des Esteraromas, der Geschmack und das Aroma konnten nicht verbessert werden.

Beispiel 9 Verfahren zur Herstellung von Sake-ähnlichem Gewürz (Alkohol enthaltendes Gewürz)

150 g Koji-Reis*&sup4;, 1,5 ml Sake-Hefe*&sup5; und 1,9 ml 95 % Milchsäure wurden mit 380 ml frischem Wasser gemischt. Das Gemisch wurde vier Stunden bei 20ºC stehengelassen. Anschließend wurden 180 g mit Dampf behandelter Reis zugegeben und gemischt (erste Zugabe). Die Fermentation wurde sechs Tage bei 20ºC durchgeführt. Anschließend wurden 210 g Koji-Reis, 500 g mit Dampf behandelter Reis und 1280 ml frisches Wasser zugegeben (zweite Zugabe). Das Gemisch wurde weiterhin sieben Tage bei 20ºC fermentiert. Am achten Tag wurden 65 g Salz zugesetzt.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 oder Lipase MY) wurde während der zweiten Zugabe zugesetzt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz produzierten Produkt verglichen.
Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,01, 0,1 bzw. 10 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz und 0,01 bzw. 10 Einheiten Lipase MY pro kg Moromi.
Anm.: *4, *5 Die in Beispiel 6 verwendeten Substanzen wurden eingesetzt.
Die unlöslichen Bestandteile wurden von dem Moromi durch Druckfiltration entfernt. Die Qualität wurde durch einen Geruchs- und Geschmackstest beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte sich bei Zugabe der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 eine Zunahme des gewünschten Esteraromas, wobei die Zunahme eine direkte Beziehung zur Zugabe der Estersubstanz aufwies, wodurch ein geschmackvolles Produkt bereitgestellt wurde. Andererseits zeigte das unter Verwendung von Lipase MY hergestellte Produkt keine Zunahme des Esteraromas, außerdem konnte das Aroma nicht verbessert werden.

Beispiel 10 Verfahren zur Herstellung von Süßem-Sake-Gewürz (Alkohol enthaltendes Gewürz)

Zu 85 % raffinierter glutinöser Reis wurde fünf Stunden in Wasser eingeweicht und anschließend 30 Minuten bei einem Druck von 1,2 kg/cm² mit Dampf behandelt. Sodann wurden 260 g des mit Dampf behandelten glutinösen Reises (mit Dampf behandelter Reis) und 38 g Koji-Reis*&sup9; miteinander gemischt. 400 ml einer Gewürzflüssigkeit*¹&sup0; wurden zugegeben und das Gemisch verzuckert und 30 Tage bei 30ºC abgelagert.
Die Enzymsubstanz (aus Rinderleber stammende Enzymsubstanz von Bezuggsbeispiel 3 oder Lipase P) wurde während der Zugabe des Gewürzes zugegeben und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen.
Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,005, 0,05 bzw. 5 Einheiten der aus Rinderleber stammenden Enzymsubstanz und 0,005 bzw. 5 Einheiten Lipase P pro kg Moromi.
Anm.: *9 Der verwendete Aspergillus war "Sake koji fungi" (Aspergillus oryzae)
*10 Ein Gemisch aus 4 % Glucose, 17 % Ethanol (95 %), 0,07 % Milchsäure (90 %) und 78,93 % Wasser.
Das verzuckerte und abgelagerte Moromi wurde zur Abtrennung von Sake-Kasu (unlösliche Bestandteile) zentrifugiert (7000 x g, 20 Minuten), anschließend wurde mit dem süßem Sake ein Geruchs- und Geschmackstest durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11 Anm.: *11 Der Durchschnittswert, der durch Beurteilung der Testpersonen des Koji-Geschmacks erhalten wurde, beruhte auf den folgenden Kriterien:
1: Sehr schwach
2: Schwach
3: Normal
4: Stark
5: Sehr stark
(Das gleiche Beurteilungsverfahren wurde in der folgenden Tabelle verwendet.)
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte sich bei Zugabe der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 3 zum süßen Sake eine Zunahme des gewünschten Esteraromas, wobei die Zunahme eine direkte Beziehung zur Zugabe der Estersubstanz aufwies, während der Koji-Geruch abnahm. Andererseits zeigte der unter Verwendung von Lipase P hergestellte süße Sake keine Zunahme des Esteraromas, gleichzeitig nahm der Koji-Geruch nicht ab. Außerdem konnten Geschmack und Aroma nicht verbessert werden.

Beispiel 11 Verfahren zur Herstellung von Sake

60 g Koji-Reis, 1 ml Sake-Hefe und 0,9 ml 95 % Milchsäure wurden in 200 ml frischem Wasser gemischt. Das Gemisch wurde vier Stunden bei 15ºC stehengelassen. 120 g mit Dampf behandelter Reis wurden zugegeben und gemischt (erste Zugabe). Die Fermentation wurde zwei Stunden bei 15ºC durchgeführt. Sodann wurden 70 g Koji-Reis, 250 g mit Dampf behandelter Reis und 420 ml frisches Wasser zugesetzt (zweite Zugabe). Das Gemisch wurde weiterhin einen Tag bei 15ºC fermentiert. Schließlich wurden 70 g Koji-Reis, 430 g mit Dampf behandelter Reis und 680 ml frisches Wasser zugegeben und gemischt (dritte Zugabe). Das Gemisch wurde weiterhin 12 Tage bei 15ºC fermentiert.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 oder aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 36) wurde während der dritten Zugabe zugegeben. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,43 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 und 0,10 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 36 pro kg Moromi. Das fermentierte Moromi wurde einer Druckfiltration unterworfen und mit der resultierenden Flüssigkeit ein Geruchs- und Geschmackstest durchgeführt, um die Qualität zu bestimmen.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12

Beispiel 12 Verfahren zur Herstellung von Schinken

Schweinelende wurde in Stücke zu je 1 kg geschnitten und getrimmt. Anschließend wurden 1000 g eines Pökelmittels mit der in Tabelle 13 angegebenen Zusammensetzung mit einer Spritze in die Fleischstücke injiziert. Tabelle 13
Das Fleisch wurde mit einer Massagevorrichtung behandelt, um das injizierte Pökelmittel im Fleisch zu verteilen (15ºC, 20 Minuten). Sodann wurde das Fleisch vier Tage bei 5ºC gepökelt. Das gepökelte Fleisch wurde anschließend in eine Hülle gestopft und 40 Minuten bei 50ºC getrocknet.
Das Fleisch wurde 40 Minuten bei 60ºC unter Verwendung von Kirschbaumzweigen geräuchert und solange gekocht, bis die Temperatur im Inneren des Fleisches 70ºC erreicht hatte. Der erhaltene Schinken wurde in Eiswasser abgekühlt und sodann zwei Tage bei 5ºC stehengelassen.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 oder Lipase MY) wurde während der Zugabe des Pökelmittels zugefügt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,01, 0,1, 1 und 10 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz und 0,01 und 10 Einheiten Lipase MY pro kg Schweinelende.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 14 gezeigt. Tabelle 14
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte der Schinken unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 ein verbessertes Aroma und einen verbesserten Geschmack. Andererseits wies der unter Verwendung von Lipase MY hergestellte Schinken keine Verbesserung von Aroma oder Geschmack auf.

Beispiel 13 Verfahren zur Herstellung von Würsten

Ein Fleischwolf mit einer Platte mit 5-mm-Löchern wurde verwendet, um 8,5 kg Fleisch vom Rinderrücken und 1,5 kg Fett vom Schweinerücken zu zerkleinern. Das Hackfleisch wurde mit Pökelmittel (393 g) versetzt, das die in Tabelle 15 angegebene Zusammensetzung aufwies. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 2ºC stehengelassen. Das Gemisch wurde erneut unter Verwendung eines Fleischwolfes mit einer Platte mit 5-mm-Löchern zerkleinert. Sodann wurde das Fleisch in Rinderdarm jeweils auf eine Länge von 7 cm gefüllt. Als nächstes wurden die gefüllten Würste 24 Stunden bei 20ºC oberflächlich getrocknet und sodann zehn Stunden bei 40ºC (relative Luftfeuchtigkeit 58 %) unter Verwendung von Kirschbaumzweigen geräuchert. Nach Beendigung des Räucherns wurden die Würste solange gekocht, bis die Temperatur im Inneren 65ºC erreicht hatte. Die fertiggestellten Würste wurden in Eiswasser abgekühlt und schließlich einen Tag bei 5ºC stehengelassen. Tabelle 15
Die Enzymsubstanz (aus Schweineniere stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 oder Lipase P) wurde während der Zugabe des Pökelmittels zugefügt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,1, 1 und 10 Einheiten der aus Schwieneniere stammenden Enzymsubstanz und 0,1 und 10 Einheiten Lipase P pro kg Hackfleisch.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 16 gezeigt. Tabelle 16
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigten die Würste unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 ein verbessertes Aroma und einen verbesserten Geschmack. Andererseits wiesen die unter Verwendung von Lipase P hergestellten Würste keine Verbesserung von Aroma oder Geschmack auf.

Beispiel 14 Verfahren zur Herstellung von Würsten

Ein Fleischwolf mit einer Platte mit 5-mm-Löchern wurde verwendet, um 8,5 kg Fleisch vom Rinderrücken und 1,5 kg Fett vom Schweinerücken zu zerkleinern. Das Hackfleisch wurde mit dem in Beispiel 12 verwendeten Pökelmittel (393 g) versetzt und gemischt. Das Gemisch wurde mit 1,2 g Diversitech HP (Lactobacillus-Starterkultur: Diversitech Inc.), gelöst in 18,8 g Wasser, versetzt und das Gemisch anschließend 24 Stunden bei 2ºC stehengelassen. Das Gemisch wurde erneut unter Verwendung eines Fleischwolfes mit einer Platte mit 5-mm-Löchern zerkleinert. Sodann wurde Rinderdarm jeweils auf eine Länge von 7 cm damit gefüllt.
Nach der Füllung wurden die gefüllten Würste 24 Stunden bei 20ºC oberflächlich getrocknet und sodann zehn Stunden bei 40ºC (relative Luftfeuchtigkeit 58 %) unter Verwendung von Kirschbaumzweigen geräuchert. Anschließend wurden die Würste solange gekocht, bis die Temperatur im Inneren 65ºC erreicht hatte. Die fertiggestellten Würste wurden in Eiswasser abgekühlt und schließlich einen Tag bei 5ºC stehengelassen. Die Enzymsubstanz (aus Schweineniere stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 oder Lipase P) wurde während der Zugabe des Pökelmittels zugefügt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,1 Einheiten der aus Schwieneniere stammenden Enzymsubstanz und 0,1 Einheiten Lipase P pro kg Hackfleisch.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 17 gezeigt. Tabelle 17
Anm.: * Der Durchschnittswert, der durch Beurteilung der Testpersonen des Säuregehaltes erhalten wurde, beruhte auf den folgenden Kriterien:
0: Nicht wahrnehmbar
1: Schwach wahrnehmbar
2: Deutlich wahrnehmbar
3: Stark wahrnehmbar
(Das gleiche Beurteilungsverfahren wurde in der folgenden Tabelle verwendet.)
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, wiesen die Würste, die unter Verwendung der in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen Enzymsubstanz hergestellt wurden, einen verminderten Säuregehalt auf und zeigten einen verbesserten Geschmack und ein verbessertes Aroma. Andererseits zeigten die unter Verwendung von Lipase P hergestellten Würste keinen solchen Effekt.

Beispiel 15 Verfahren zur Herstellung von Joghurt

50 g Trockenmilch wurden mit 1 kg Milch (8,5 % Feststoffe, die kein Fett enthielten; 3,6 % Milchfett) gemischt, wodurch Frischmilch erhalten wurde. Die Frischmilch wurde 30 Minuten bei 80ºC erhitzt. Die erhitzte Frischmilch wurde unmittelbar danach auf 30ºC abgekühlt und bei dieser Temperatur gehalten. Andererseits wurden Bakterien für die Joghurt-Vorkultur ("Yoghurt seed bacteria") (Yoghurt CH1, CHR HANSEN'S Co.) zu einem sterilisierten 10 % Magermilchpulver-Kulturmedium zugegeben. Die Züchtung wurde 20 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Das erhaltene gezüchtete Produkt wurde zu einer sterilisierten 10 % Magermilchpulver-Kultur zugefügt und 20 Stunden bei 37ºC gezüchtet (als Kulturverfahren A bezeichnet). Das Kulturverfahren A wurde dreimal wiederholt, wodurch 50 g einer Kultur (Starter) erhalten wurden. 50 g des erhaltenen Starters wurden sodann zu 1 kg der vorstehend erwähnten Frischmilch zugegeben und das Gemisch sechs Stunden bei 30ºC fermentiert, wodurch Joghurt erhalten wurde.
Die Enzymsubstanz (die in Bezugsbeispiel 1 erhaltene, aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz oder Lipase MY) wurde während der Zugabe des Starters zugefügt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,0001, 0,001 und 0,1 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz und 0,0001 und 0,1 Einheiten Lipase MY pro kg Frischmilch.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 18 gezeigt. Tabelle 18
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte der unter Verwendung der in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Enzymsubstanz hergestellte Joghurt einen verminderten Säuregehalt und wies ein verbessertes Aroma auf. Andererseits zeigte der unter Verwendung von Lipase MY hergestellte Joghurt keinen solchen Effekt.

Beispiel 16 Verfahren zur Herstellung von Käse

Ein kg Milch mit den gleichen Bestandteilen wie in Beispiel 15 wurde 30 Minuten bei 63ºC erhitzt und unmittelbar danach auf 30ºC abgekühlt und bei dieser Temperatur gehalten, wodurch Frischmilch hergestellt wurde. Andererseits wurden Bakterien für die Käse-Vorkultur, "Cheese seed bacteria" (CH- Normal 01, CHR HANSEN'S Co.), zu einem sterilisierten 10 % Magermilchpulver-Kulturmedium zugefügt. Die Züchtung wurde 20 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Die erhaltene Kultur wurde zu einem sterilisierten 10 % Magermilchpulver-Kulturmedium gegeben und 20 Stunden bei 37ºC gezüchtet (als Kulturverfahren B bezeichnet) . Das Kulturverfahren B wurde dreimal wiederholt, wodurch 50 g einer Kultur erhalten wurden (Starter). 20 g des Starters wurden sodann zu 1 kg der vorstehend erwähnten Frischmilch zugegeben und das Gemisch zwei Stunden bei 30ºC fermentiert (der Säuregrad betrug zu dieser Zeit 0,2). Das Gemisch wurde mit 0,03 g Lab (CHR HANSEN'S Co.), gelöst in 2 g Wasser, pro kg Frischmilch versetzt und das Gemisch gerührt und anschließend 40 Minuten bei 30ºC stehengelassen. Nachdem festgestellt wurde, daß die Milch koaguliert war, wurde die geronnene Milch in Scheiben mit einer Dicke von 0,8 cm geschnitten. Ein leichtes Mischen wurde solange durchgeführt, bis die Produkttemperatur 40ºC erreicht hatte. Die geronnene Milch wurde herausgeschöpft und in eine Form gedrückt. Die Form wurde in eine Apparatur vom Typ einer Presse eingebracht und 12 Stunden bei 15ºC stehengelassen. Anschließend wurden 2,0 g Salz auf 100 g des resultierenden Frischkäses gestreut, der sodann solange stehengelassen wurde (15ºC, 24 Stunden), bis die Oberfläche getrocknet war. Anschließend wurde der Käse mit Käsewachs (CHR HANSEN'S CO., 167B red) überzogen und drei Monate bei einer Temperatur von 15 ºC und einer Luftfeuchtigkeit von 85 % gelagert.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineniere stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 oder Lipase P) wurde während der Zugabe des Starters zugefügt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,005, 0,05 und 1 Einheit der aus Schwieneniere stammenden Enzymsubstanz und 0,005 und 1 Einheit Lipase P pro kg Frischmilch.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 19 gezeigt. Tabelle 19
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte der unter Verwendung der in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen Enzymsubstanz hergestellte Käse einen verminderten Säuregehalt und wies ein verbessertes Aroma und einen verbesserten Geschmack auf. Andererseits zeigte der unter Verwendung von Lipase P hergestellte Käse keinen solchen Effekt.

Beispiel 17 Verfahren zur Herstellung von Koji-Pickles

Ein kg eines Koji-Gemisches, umfassend 2 kg Reis-Koji, 70 g Salz und 1 kg Wasser, wurden zu 400 g Rettich zugegeben, der drei Tage bei 5ºC in 2 % Salz, bezogen auf das Gewicht des verwendeten Gemüses, eingelegt worden war. (Das gleiche Verfahren soll nachstehend verwendet werden.) Das Gemisch wurde zehn Tage bei 5ºC eingelegt.
Die Enzymsubstanz (die in Bezugsbeispiel 1 erhaltene, aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz oder Lipase MY) wurde während des Einlegens zugefügt und das Produkt mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,01, 0,1 und 1 Einheit der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz und 0,01 und 1 Einheit Lipase MY pro kg Koji-Gemisch.
Das eingelegte Produkt wurde aus dem Koji-Gemisch genommen und das noch daran hängende Koji-Gemisch mit Mull entfernt. Sodann wurde ein Geruchs- und Geschmackstest durchgeführt, um die Qualität zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 20 gezeigt. Tabelle 20
Anm.: *12 Der Durchschnittswert, der durch Beurteilung der Testpersonen des grasartigen Geruchs erhalten wurde, beruhte auf den folgenden Kriterien:
0: Nicht wahrnehmbar
1: Schwach wahrnehmbar
2: Deutlich wahrnehmbar
3: Stark wahrnehmbar
(Das gleiche Beurteilungsverfahren wurde in der folgenden Tabelle verwendet.)
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, wiesen die unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 hergestellten Koji-Pickles ein stärkeres Esteraroma, einen schwächeren Koji-Geruch und ein verbessertes Aroma und einen verbesserten Geschmack auf. Außerdem war der grasartige Geruch der Gemüseprodukte (Rettich) geringer. Andererseits zeigten die unter Verwendung von Lipase MY hergestellten Koji-Pickles ein schwächeres Esteraroma und keine Verbesserung von Aroma oder Geschmack.

Beispiel 18 Verfahren zur Herstellung von Sake-Kasu-Pickles

Ein kg Sake-Kasu-Gemisch, umfassend 1,2 kg Sake-Kasu (gepreßter Kuchen aus der Sake-Produktion), 60 ml Shochu (Alkoholspiegel 35) und 24 g Salz wurden zwei Wochen bei 30ºC abgelagert. Das abgelagerte Sake-Kasu-Gemisch wurde als Einlegetunke ("Pickling bed") verwendet. In die Tunke wurden 400 g weiße Melone zugegeben, die vorher drei Monate bei 10ºC mit 15 % Salz eingelegt und zur Entsalzung über Nacht mit fließendem Wasser gewaschen worden war, und der Einlegevorgang 20 Tage bei 10ºC durchgeführt. Die Kasu-Teilchen wurden von der eingelegten Melone entfernt und diese sodann einen Monat bei 30ºC in eine gleiche Menge einer Einlegetunke eingelegt, die die gleiche Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben aufwies und einen Monat bei 30ºC abgelagert worden war. Die Melone wurde weiterhin 20 Tage bei 10ºC eingelegt.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineniere stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 oder Lipase LP) wurde während des zweiten Einlegevorgangs zugefügt und die eingelegte Melone mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,0005, 0,005, 0,05 und 1 Einheit der aus Schwieneniere stammenden Enzymsubstanz und 0,0005, 0,005, 0,05 und 1 Einheit Lipase LP pro kg Einlegetunke.
Das eingelegte Produkt wurde aus der Einlegetunke entnommen und die noch daran hängenden Kasu-Teilchen mit Mull entfernt. Zur Beurteilung der Qualität wurde ein Geruchs- und Geschmackstests durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 21 gezeigt. Tabelle 21
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigten die Sake- Kasu-Pickles unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 2 ein stärkeres Esteraroma sowie ein verbessertes Aroma und einen verbesserten Geschmack. Andererseits wiesen die unter Verwendung der im Handel erhältlichen Lipase LP hergestellten Pickles ein schwächeres Esteraroma und keine Verbesserung von Geschmack oder Aroma auf.

Beispiel 19 Verfahren zur Herstellung von Kleie-Pickles

Ein kg Reiskleie wurde hellbraun geröstet, auf Raumtemperatur abgekühlt und sodann mit 500 g ungerösteter Reiskleie gemischt. Anschließend wurden 430 g Salz und 1,5 kg Wasser zugegeben und 200 g Gurken in dieses Gemisch eingelegt. Einmal täglich wurde das Ganze gemischt. Jeden zweiten Tag wurden alle Gurken entnommen und 200 g frische Gurken eingelegt. Diese Vorgehensweise wurde zwei Monate lang bei 20ºC wiederholt, wodurch eine abgelagerte Kleie-Einlegetunke erhalten wurde. Die Kleietunke wurde gut gemischt, 300 g frische Gurken wurden zugegeben und einen Tag bei 20ºC eingelegt. Die Enzymsubstanz (aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 oder Lipase LP) wurde während des Einlegevorgangs der Gurken zu der abgelagerten Einlegetunke zugefügt und die eingelegten Gurken mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,005, 0,05, 0,5 und 5 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz und 0,005 und 5 Einheiten Lipase LP pro kg der abgelagerten Kleie-Einlegetunke.
Die erzeugten Reiskleie-Pickles wurden aus der Einlegetunke entnommen und die noch daran hängende Kleie mit Mull entfernt. Zur Beurteilung der Qualität wurde ein Geruchs- und Geschmackstests durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 22 gezeigt. Tabelle 22
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigten die Kleie- Pickles unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 ein stärkeres Esteraroma bei gleichzeitiger Abnahme des grasartigen Geruchs des Gemüses. Außerdem lagen ein verbessertes Aroma und ein verbesserter Geschmack vor. Andererseits wiesen die unter Verwendung der im Handel erhältlichen Lipase LP hergestellten Kleie-Pickels ein schwächeres Esteraroma und keine Verbesserung von grasartigem Geruch, Aroma oder Geschmack auf.

Beispiel 20 Verfahren zur Herstellung von Essig-Pickles

360 ml Essig, 80 g Salz, 800 g Zucker, 20 ml süßer Sake, 4 g Citronensäure, 0,4 g Bernsteinsäure, 30 g Natriumglutamat und 10 g Kaliumsorbat wurden in 1 l Wasser gelöst. Sodann wurde weiter Wasser zugegeben, bis das Gesamtvolumen 2 Liter erreichte, und die Lösung als Essig-Einlegetunke verwendet. Ingwer wurde in Streifen geschnitten und vorher mit 3 % Salz sieben Tage bei 5ºC eingelegt. Sodann wurden 2,2 kg des resultierenden Ingwers zwei Tage bei 5ºC in die Essig-Einlegetunke eingelegt.
Die Enzymsubstanz (aus Rinderleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 3 oder Lipase P) wurde während der Zugabe von Ingwer zugefügt und der eingelegte Ingwer mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,0005, 0,005, 0,05 und 1 Einheit der aus Rinderleber stammenden Enzymsubstanz und 0,0005 und 1 Einheit Lipase P pro kg der Essig-Einlegetunke.
Der eingelegte Ingwer wurde aus der Einlegetunke entnommen und zur Beurteilung der Qualität ein Geruchs- und Geschmackstests durchgeführt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 23 gezeigt. Tabelle 23
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigten die Essig- Pickles unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 3 ein stärkeres Esteraroma sowie gleichzeitig ein geringeren Säuregehalt. Außerdem wiesen sie ein verbessertes Aroma und einen verbesserten Geschmack auf. Andererseits zeigten die unter Verwendung der im Handel erhältlichen Lipase P hergestellten Essig-Pickles kein stärkeres Esteraroma und keine Verbesserung von Säuregehalt, Aroma oder Geschmack.

Beispiel 21 Verfahren zur Herstellung von Miso-Pickles

Die Miso-Einlegetunke wurde hergestellt, indem 1 kg Miso, 400 ml süßer Sake und 50 g Zucker gemischt wurden. In diese Tunke wurden 1,2 kg Gurken eingelegt, die vorher mit 2 % Salz zehn Tage bei 5ºC eingelegt worden waren, und die Gurken weiterhin fünf Tage bei 20ºC eingelegt.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 oder Lipase MY) wurde während des Einlegevorgangs zum Miso-Bad zugegeben. Die eingelegten Gurken wurden mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,005, 0,05, 0,5 und 5 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz und 0,005 und 5 Einheiten Lipase MY pro kg Miso-Einlegetunke. Die erzeugten Miso-Pickles wurden aus der Einlegetunke entnommen und das noch daran hängende Miso mit Mull entfernt. Zur Beurteilung der Qualität wurde ein Geruchs- und Geschmackstests durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 24 gezeigt. Tabelle 24
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigten die Miso- Pickles unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 ein stärkeres Esteraroma und außerdem ein verbessertes Aroma und einen verbesserten Geschmack. Andererseits wiesen die unter Verwendung der im Handel erhältlichen Lipase MY hergestellten Miso-Pickels kein Esteraroma auf und zeigten eine Verschlechterung von Aroma und Geschmack.

Beispiel 22 Verfahren zur Herstellung von Koreanischen Pickles (Kimchi)

Die Zutaten für Koreanische Pickles (Kimchi) sind in der Tabelle 25 angegeben. Tabelle 25

Verfahren:

Das Mehl von raffiniertem glutinösem Reis wurde durch Erhitzen in Wasser gelöst. Der rote Pfeffer wurde in Scheiben geschnitten und Knoblauch sowie Ingwer zerrieben. Der Chinakohl wurde einzeln entblättert und mit 3 % Salz versetzt, die Blätter wurden drei Tage bei 5ºC eingelegt, wobei ein Druck angewendet wurde, der das Gewicht der eingelegten Zutaten ausglich. Der Knoblauch, rote Pfeffer, Zucker, Salz und die eingesalzenen Fischinnereien wurden mit einer Lösung des raffinierten glutinösen Reis-Mehls gemischt, die auf Raumtemperatur vorgekühlt worden war. Sodann wurden die Chinakohlblätter in dieses Gemisch eingelegt und Salz gleichmäßig zwischen den einzelnen Blättern verteilt. Der Einlegevorgang wurde drei Wochen bei 10ºC durchgefürt.
Die Enzymsubstanz (aus Rinderniere stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 4 oder Lipase P) wurde zu Beginn des Einlegevorgangs zugegeben und der eingelegte Kohl mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,005, 0,05, 0,5 und 5 Einheiten der aus Rinderniere stammenden Enzymsubstanz und 0,005 und 5 Einheiten Lipase P pro kg des eingelegten Produktes. Die Koreanischen Pickles ließ man etwas abtropfen. Zur Beurteilung der Qualität wurde ein Geruchs- und Geschmackstests durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 26 gezeigt. Tabelle 26
Anm.: *13 Der Durchschnittswert, der aus der Beurteilung der Testpersonen des Knoblauchgeruchs erhalten wurde, beruhte auf den folgenden Kriterien:
0: Nicht wahrnehmbar
1: Schwach wahrnehmbar
2: Deutlich wahrnehmbar
3: Stark wahrnehmbar
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigten die Koreanischen Pickles unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 4 einen schwächeren Knoblauchgeruch und eine Verbesserung von Aroma und Geschmack, die in direkter Beziehung zur zugegebenen Menge der Enzymsubstanz stand. Andererseits wiesen die unter Verwendung der im Handel erhältlichen Lipase P hergestellten Koreanischen Pickels keine Verbesserung von Knoblauchgeruch, Geschmack oder Aroma auf.

Beispiel 23 Verfahren zur Herstellung von Sauerkraut

Frischer Kohl wurde einzeln entblättert, mit Wasser gewaschen und 10 Tage an einem schattigen, gut belüfteten Platz getrocknet.
Der welke Kohl wurde in Streifen geschnitten und mit 2 % (bezogen auf getrockneten Kohl) Salz bestreut, und ein Gewicht, das dem Gewicht des Kohls entsprach, darauf gelegt. Der Kohl wurde 30 Tage bei 15ºC stehengelassen.
Die Enzymsubstanz (aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 oder Lipase MY) wurde zu Beginn des Bestreuens zugegeben. Der resultierende Kohl wurde mit dem ohne Enzymsubstanz hergestellten Produkt verglichen. Die zugegebenen Mengen der Enzymsubstanz betrugen 0,005, 0,05, 0,5 und 5 Einheiten der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz und 0,005 und 5 Einheiten Lipase MY pro kg Kohl.
Das Sauerkraut ließ man etwas abtropfen. Zur Beurteilung der Qualität wurde ein Geruchs- und Geschmackstests durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 27 gezeigt. Tabelle 27
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte das Sauerkraut unter Verwendung der Enzymsubstanz von Bezugsbeispiel 1 ein stärkeres Esteraroma und gleichzeitig einen geringeren Säuregehalt. Außerdem wies es ein verbessertes Aroma und einen verbesserten Geschmack auf. Andererseits zeigte das unter Verwendung der im Handel erhältlichen Lipase MY hergestellte Sauerkraut ein schwächeres Esteraroma und keine Verbesserung von Aroma oder Geschmack.

Bezugsbeispiel 1

Ein kg Schweineleber wurde in einem Fleischwolf zerkleinert und sodann mit 3000 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 6,5), die 0,25 M Saccharose enthielt, versetzt und gemischt. Das Gemisch wurde zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten). Der resultierende Überstand wurde mit 2 N Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,3 eingestellt, zehn Stunden bei 4ºC stehengelassen und erneut zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten), wodurch ein Niederschlag erhalten wurde. Der Niederschlag wurde mit 1000 ml gekühltem Aceton (-20ºC) versetzt und das Gemisch gerührt und vakuumfiltriert (Toyo Roshi No. 2). Der Entfettungsvorgang mit Aceton wurde dreimal wiederholt und der erhaltene Rückstand sodann in einem Vakuumtrockner bei 20ºC getrocknet, um das restliche Aceton zu entfernen. Die getrocknete Substanz wurde mit 1000 ml einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 6,7) versetzt und zehn Stunden bei 4ºC gerührt, sodann folgte eine Zentrifugation (10 000 x g, 30 Minuten), wobei ein Überstand erhalten wurde. Anschließend wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 50 % zugegeben und das Gemisch fünf Stunden bei 4ºC stehengelassen. Anschließend wurde das Gemisch zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten) und der Niederschlag entfernt. Ammoniumsulfat wurde bis zu einer Sättigung von 70 % zugegeben. Das Gemisch wurde fünf Stunden bei 4ºC stehengelassen. Die Lösung wurde erneut zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten) und der resultierende Niederschlag mit 3,2 M Ammoniumsulfat versetzt, bis das Gesamtvolumen 100 ml betrug, sodann wurde das Gemisch als die aus Schweineleber stammende Enzymsubstanz verwendet. Die Ester synthetisierende Aktivität der aus Schweineleber stammenden Enzymsubstanz betrug zu diesem Zeitpunkt 0,37 Einheiten/mg Protein (0,5 % Ethanolkonzentration im Reaktionssystem).

Bezugsbeispiele 2 bis 5

In gleicher Art und Weise wie in Bezugsbeispiel 1 wurde die Enzymsubstanz aus Schweineniere, Rinderleber, Rinderniere oder Rinderherz anstelle von Schweineleber hergestellt. Die Enzymsubstanz wies die in Tabelle 28 dargestellten Werte der Ester synthetisierenden Aktivität auf (0,5 % Ethanolkonzentration im Reaktionssystem). Tabelle 28

Bezugsbeispiel 6

Shochu-Hefe (Japan Brewing Society) wurde in 10 ml eines YM-Mediums (Zusammensetzung: 10 g Glucose, 5 g Pepton, 3 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt, 1 Liter destilliertes Wasser; 20 Minuten bei 120ºC in einem Autoklaven sterilisiert) 24 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die Kultur wurde in 1 Liter YM-Medium überführt und weitere 24 Stunden bei 30ºC gezüchtet.
Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugation (10 000 x g, 30 Minuten) in Zellen (Niederschlag) und Überstand A aufgetrennt. Die erhaltenen Zellen wurden zu 200 ml sterilisiertem destilliertem Wasser zugegeben, gemischt, zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten) und der resultierende Überstand abgegossen. Der Vorgang wurde einmal wiederholt und die erhaltenen Zellen gewaschen. Sodann wurden 50 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 6) zu den gewaschenen Zellen zugefügt. Die Zellen wurden mit einem Homogenisator (B. Braun Co.) aufgeschlossen und anschließend mit einem 0,2-µm-Membranfilter (Toyo Roshi Co.) filtriert, um die intakten Zellen aus der Lösung zu entfernen. Ammoniumsulfat wurde bis zu einer Sättigung von 70 % zugegeben und gemischt. Anschließend wurde das resultierende Gemisch fünf Stunden bei 4ºC stehengelassen. Der durch Zentrifugation (10 000 x g, 30 Minuten) erhaltene Niederschlag des Gemisches wurde sodann in 3,2 M Ammoniumsulfat gelöst, bis das Gesamtvolumen der Lösung 5 ml betrug, und die Lösung als die Enzymsubstanz aus den Zellen verwendet.
Außerdem wurde der erhaltene Überstand A mit einem 0,2- µm-Membranfilter filtriert, um die Zellen zu entfernen, die durch die Zentrifugation nicht entfernt werden konnten. Sodann wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70 % zugesetzt und gemischt. Die Lösung wurde fünf Stunden bei 4ºC stehengelassen. Der durch Zentrifugation (10 000 x g, 30 Minuten) erhaltene Niederschlag der Lösung wurde sodann in 3,2 M Ammoniumsulfat gelöst, bis das Gesamtvolumen der Lösung 5 ml betrug. Die resultierende Lösung wurde als die Enzymsubstanz aus Überstand A verwendet.

Bezugsbeispiele 7 bis 12

In gleicher Art und Weise wie in Bezugsbeispiel 6 wurden Miso-Hefe, Sojasauce-Hefe (Japan Brewing Society), Bäckerhefe (Daiya yeast), Sake-Hefe (Japan Brewing Society No. 7), Sake- Hefe (Japan Brewing Society No. 9) oder Weinhefe (Japan Brewing Society OC No. 2) anstelle der Shochu-Hefe verwendet, wodurch Enzymsubstanz-Lösungen aus den Zellen und aus Überstand A erhalten wurden.

Bezugsbeispiele 13 bis 16

Aspergillus oryzae IFO 30104, Aspergillus awamon IFO 4033, Aspergillus sojae ATCC 16320 oder Botrytis cinerea IFO 5881 wurden in 10 ml eines YM-Mediums 24 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde in einen Liter YM-Medium übertragen und 72 Stunden bei 30ºC weiter gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugation (10 000 x g, 30 Minuten) in Zellen (Niederschlag) und Überstand B aufgetrennt. Anschließend wurde in gleicher Art und Weise wie in Bezugsbeispiel 6 vorgegangen, wodurch die Enzymsubstanz aus den Zellen und aus Überstand B erhalten wurden.

Bezugsbeispiele 17 bis 22

Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 15346, Lactococcus lactis subsp. lactis IFO 3434, Lactococcus lactis subsp. cremoris AHU 1175, Lactobacillus plantarum ATCC 21028, Lactobacillus casei IFO 3425 oder Lactobacillus species IFO 3914 wurde in 10 ml eines allgemeinen Lactobacillus-Impfkulturmediums 24 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die Kultur wurde in einen Liter eines allgemeinen Lactobacillus-Impfkulturmediums übertragen und weiterhin 24 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugation (10 000 x g, 30 Minuten) in Zellen (Niederschlag) und Überstand C aufgetrennt. Anschließend wurde die Enzymsubstanz aus den Zellen und aus Überstand C nach den gleichen Verfahren wie in Bezugsbeispiel 6 erhalten.

Bezugsbeispiele 23 bis 35

Lipase M, Lipase F&sub1; Lipase A, Lipase P, Lipase MY, Lipase Au, Lipase LP, Palatase M, Neurase F, Talipase, Pankreatische Lipase 250, Lipase 400 oder Lipase 600 wurde in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 6) gelöst und anschließend zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten). Die erhaltene Lösung wurde sodann mit einem 0,2 µm-Membranfilter filtriert und als Enzymsubstanz verwendet.

Bezugsbeispiel 36

Die in Bezugsbeispiel 1 erhaltene Enzymsubstanz wurde nach dem folgenden Verfahren weiter gereinigt.
Zu 350 ml der in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Enzymsubstanz wurden 3150 ml entionisiertes Wasser zugegeben und das Gemisch geeignet gerührt. Die Enzymsubstanz wurde mit kochendem Wasser unter Rühren auf 50ºC erhitzt und eine Stunde bei 50ºC stehengelassen. Anschließend wurde die Enzvmsubstanz in Eiswasser gestellt und zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten). Die unlöslichen Rückstände, die während des Erhitzens koagulierten, wurden bei der Zentrifugation als Niederschlag erhalten. Ammoniumsulfat wurde zum resultierenden Überstand bis zu einer Sättigung von 70 % zugesetzt, gründlich gelöst und vier Stunden bei 4ºC stehengelassen. Die Lösung wurde sodann zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten), wobei die Enzymsubstanz als Niederschlag erhalten wurde, der als eine 3,2 M Ammoniumsulfatsuspension bei 4ºC gehalten wurde.
4 ml der Enzymsubstanz wurden mit 100 mM Borsäurepuffer (pH 8,0), der 0,1 M Salz enthielt, versetzt. Die Lösung wurde einer Gelfiltrations-Chromatographie unterworfen, wobei eine Sephacryl S-300ER-Säule (Pharmacia Co.) verwendet wurde, die mit 100 mM Borsäurepuffer äquilibriert worden war. Die verwendete Säule hatte einen Innendurchmesser von 26 mm und eine Länge von 80 cm, die Durchflußgeschwindigkeit betrug 5 ml/min. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden gesammelt und erneut mit einer Ammoniumsulfatlösung bis zu einer Sättigung von 70 % versetzt und das Gemisch zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten).
Als nächstes wurden 10 ml der Enzymsubstanz 15 Minuten gegen einen 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert. Die erhaltene entsaizte Enzymsubstanz wurde einer DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia Co.) unterworfen, die mit dem gleichen Tris-HCl-Puffer wie vorstehend erwähnt äquilibriert worden war, und mit einem 0 bis 250 mM NaCl-Gradienten eluiert. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden gesammelt und Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70 % zugegeben. Das Gemisch wurde zentrifugiert (10 000 x g, 30 Minuten). Anschließend wurde der Niederschlag als eine Suspension in 3,2 M Ammoniumsulfat (Proteingehalt 12,3 mg/ml) bei 4ºC gehalten. Die spezifische Aktivität der erhaltenen Enzymsubstanz betrug 1,59 Einheiten/mg Protein (0,5 % Ethanolkonzentration im Reaktionssystem). Die Enzymsubstanz zeigte in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei 4 bis 12 % Konzentration eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von etwa 180 000.

Claims

1. Verfahren, bei dem einem Nahrungsmittel oder Getränk Geschmack verliehen wird, umfassend die Zugabe eines Ester synthetisierenden Enzyms oder einer Substanz, die ein solches Enzym enthält, zu einem Nahrungsmittel oder Getränk während der Herstellung, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Enzym ein Buttersäureethylester synthetisierendes Enzym tierischen Ursprungs ist oder die Substanz ein solches Enzym enthält und daß das Enzym oder die Substanz eine Wirksamkeit von mindestens 0,1 Einheiten Enzymaktivität pro mg Protein besitzt (1 Einheit Enzymaktivität = die Enzymmenge, die für die Herstellung von Buttersäureethylester mit einer Geschwindigkeit von 1 µMol pro Minute in einer Substratlösung, die 0,5 Gew.-% Ethanol und 2,6 Gew.-% Buttersäure in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6) enthält, bei 30ºC erforderlich ist).

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nahrungsmittel oder Getränk ein Nahrungsmittel oder Getränk ist, dessen Herstellung einen Fermentationsschritt umfaßt, und wobei das Enzym oder die das Enzym enthaltende Substanz während des Fermentationsschrittes zum Nahrungsmittel oder Getränk zugegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Fermentationsschritt ein Fermentationsschritt ist, bei dem entweder Hefe oder Lactobacillen als fermentierender Organismus verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Enzym eine Aktivität aufweist, die bei Messung in einer Standard-Substratlösung, wie in Anspruch 1 definiert, mindestens 30 % des Wertes beträgt, der bei Messung in einer Substratlösung erhalten wird, die 5 Gew.-% Ethanol und 2,6 Gew.-% Buttersäure enthält, vorzugsweise mindestens 60 %.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Tier, aus dem das Enzym oder die Substanz stammt, ein Schwein, eine Kuh, eine Ziege oder ein Pferd ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Enzym oder die Substanz aus der Niere, der Leber oder dem Herz des Tieres stammt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nahrungsmittel oder Getränk ein Vertreter der folgenden Produkte ist: Brot, Braugewürz, Alkohol enthaltendes Gewurz, aufbereitetes Fleischprodukt, Milchprodukt oder eingelegtes Produkt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Enzym oder die das Enzym enthaltende Substanz zu dem Nahrungsmittel oder Getränk während der Herstellung in einer Menge zugegeben, die ausreichend ist, um 0,0001 bis 10,0 Einheiten (wie definiert) Enzymaktivität pro kg, vorzugsweise 0,0002 bis 5,0 Einheiten/kg, bereitzustellen.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Herstellung des Nahrungsmittels oder Getränkes einen Fermentationsschritt erfordert.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Alkohol oder eine organische Säure zusammen mit der Ester synthetisierenden Enzymsubstanz für die Reaktion zur Esterproduktion zu dem Nahrungsmittel oder Getränk zugegeben wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nahrungsmittel oder Getränk einer der folgenden Stoffe ist: ein Alkohol oder ein alkoholisches Getränk.