DE60307658T2

DE60307658T2 - Monomeres insulin

Info

Publication number: DE60307658T2
Application number: DE60307658T
Authority: DE
Inventors: Youshang Zhang; Jinguo Ding; Jaihao Shi; Dafu Cui
Original assignee: SHANGHAI C A S SHENGLONGDA BIO; Shanghai Cas Shenglongda Biotech (group) Co; GENEMEDIX PLC; GENEMEDIX PLC NEWMARKET
Current assignee: SHANGHAI C A S SHENGLONGDA BIO; Shanghai Cas Shenglongda Biotech (group) Co; GENEMEDIX PLC; GENEMEDIX PLC NEWMARKET
Priority date: 2002-07-19
Filing date: 2003-07-17
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2023-07-18
Also published as: CN1468864A; CA2492728A1; JP2006508695A; AU2003246946A1; EP1543031B1; US20050171008A1; PL373278A1; IL166261A0; MXPA05000830A; WO2004009629A1; ATE336507T1; CN1247616C; BR0312726A; DE60307658D1; DK1543031T3; AU2003246946B2; EP1543031A1

Description

Hintergrund
Diese Erfindung betrifft die medizinischen und pharmazeutischen Gebiete. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine neue Insulin-B-Kette, ein monomeres Insulinmolekül, das die B-Kette enthält, pharmazeutische Zusammensetzungen, die das monomere Insulin enthalten, die Herstellungen und die Anwendungen des monomeren Insulins.
Stand der Technik
Diabetes ist eine wachsende Bedrohung der Volksgesundheit in der Welt. Hyperglykämie führt zu verschiedenen Diabeteskomplikationen, was eine Hauptursache für die Mortalität ist. Strenge Überwachung der Glukose im Serum ist der wichtigste Faktor zur Vorbeugung und zum Herauszögern von späten Komplikationen von Diabetes, siehe The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N Engl. J Med., 1993 329 (14) 5.977-86.
Seit der Entdeckung von Insulin in den 1920er Jahren wurde es für die Behandlung von Diabetes als ein unersetzlicher Wirkstoff verwendet. Sekretion von Insulin im normalen menschlichen Körper wird durch die Glukosekonzentration im Blut reguliert. Die Insulinkonzentration im Serum steigt auf ein Maximum 30–60 Minuten nach der Mahlzeit und ist 4–5 Stunden später auf ihren Grundspiegel zurückgesunken, was beträchtliche Fluktuationen der Glukosekonzentration im Blut, die durch Nahrungsaufnahme verursacht werden, vermeidet. Regelmäßige Insulinpräparate oder Verabreichung können den Prozess der natürlichen physiologischen Insulinsekretion nicht nachahmen. Diese können daher den Anstieg der Glukose im Serum nach Mahlzeiten nicht wirkungsvoll kontrollieren und als Folge daraus besteht das Risiko einer Hypoglykämie. Der Grund liegt darin, dass Insulin in Form eines Dimers und eines Hexamers bei einer Konzentration von mehr als 100 nM in einem neutralen Medium vorliegt und nach Dissoziation in das Monomer durch Bindung an einen spezifischen Rezeptor wirkt. Die Assoziierung zwischen Insulinmolekülen verstärkt die Stabilität von Insulin und stellt eine exakte und flexible Regulierung der Glukose im Serum sicher. Sie ist jedoch ein Hindernis für die Insulinabsorption. Insulinpräparate, die in der Form eines Hexamers vorliegen, werden nicht durch die Kapillare in das Blut aufgenommen, bis sie in dimeres Insulin umgewandelt wurden und nachfolgend in monomeres Insulin nach Injektion durch Verdünnung auf um das 50.000 bis 100.000fach. Die vielfache Verdünnung im Muskel oder subkutan ist ein langsamer und langer Prozess, bei dem nur 50% Insulin innerhalb von 2–4 Stunden absorbiert werden. 90–120 Minuten nach subkutaner Injektion von Insulinpräparat, erreicht die Insulinkonzentration im Blut einen relativ kleinen Peak und wird später nicht schnell abgebaut, siehe Brange, J. und A. Volund, Insulin analogs with improved pharmacokinetic profiles. Adv Drug Deliv. Rev, 1999.35(2-3)307-335.
Insulin mit einer geringen Neigung zur Selbstassoziation in neutralem Medium wird monomeres Insulin genannt. Monomeres Insulin kann rasch ohne vielfache Verdünnung absorbiert werden und wirkt innerhalb einer kürzeren Zeit nach Injektion. Daher wurde monomeres Insulin eines der Hauptziele bei der Entwicklung neuer Generationen von Diabeteswirkstoffen. Lyspro, ein von Eli Lilly Co. entwickeltes monomeres Insulin, hat sich bei klinischen Versuchen 1996 in Europa und Amerika als sehr effizient erwiesen. Es begann 15 Minuten nach subkutaner Injektion zu wirken, wobei die Konzentration im Blut eine Stunde später ein Maximum erreichte und 2–4 Stunden später auf den normalen Spiegel zurückging. Verabreichung von Lyspro 15 Minuten nach der Mahlzeit ist genauso wirksam wie reguläres Insulin 20 Minuten vor der Mahlzeit. Derzeit ist ein weiteres monomeres Insulin, Aspart von Novo Co., in der klinischen Prüfung, siehe Vajo, Z. und W.C. Duckworth, Genetically engineered insulin analogs: diabetes in the new millennium. Pharmacol. Rev, 2000. 52(1)1-9.
Wir haben ein Verfahren zur Herstellung von monomerem Insulin, DPI (Despentapeptid-Insulin) oder DTI (Destetrapeptid-Insulin) durch Sekretion von monomerem Insulinprecursor (MIP) aus Saccharomyces Cerevisiae und anschließender enzymatischer Transpeptidierung untersucht, siehe Cui, D. F., Li, M. Y., Zhang, Y.S. und Feng, Y. M. Monomeric destetrapeptide human insulin from a precursor expressed in Saccharomyces cerevisiae. J Pept. Res., 2001.57(3) 188–92. [auch im chinesischen Patent ZL98 110912.8 beschrieben]. Das monomere Insulin kann jedoch nicht in einem großen Maßstab hergestellt werden, aufgrund der folgenden Fehler im Verfahren: (1) es erfordert chemische Peptidsynthese, zum Beispiel, GFFY (But) Obut; (2) die Ausbeute liegt nach enzymatischer Transpeptidierung mit Trypsin unter 80%; (3) das Intermediat nach enzymatischer Transpeptidierung erfordert Behandlung mit starker Säure, z. B. TFA, um die Schutzgruppe zu entfernen; (4) das Verfahren ist kompliziert und es gibt chemische Nebenreaktionen.
Daher ist es eine dringende Aufgabe auf diesem Gebiet, neues monomeres Insulin zu entwickeln, das in großem Maßstab und durch eine einfache Herstellung hergestellt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Gegenstand dieser Erfindung ist die Bereitstellung von neuem monomeren Insulin, das in großem Maßstab und durch ein einfaches Verfahren hergestellt werden kann.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das monomere Insulin enthält. Darüber hinaus zielt diese Erfindung auf die Bereitstellung der Herstellung und Anwendung des monomeren Insulins und der pharmazeutischen Zusammensetzung ab.
Der erste Aspekt dieser Erfindung stellt eine Insulin-B-Kette bereit, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:
FVNQH LCGSH LVEAL L Y L V C G E R X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆Y₂₇
wobei X₂₃, X₂₄, X₂₅ und X₂₆ individuell unabhängige Aminosäuren sind und ausgewählt sind aus der Gruppe von Aminosäuren bestehend aus Gly, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, His, Val, oder nicht vorhanden sind, und wobei höchstens eine der individuell unabhängigen Aminosäuren nicht vorhanden ist; und es sich ferner bei Y₂₇ entweder Lys oder Arg ist handelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Y27 Lys.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆ GFFY dar.
Der zweite Aspekt dieser Erfindung stellt ein Insulinmolekül mit der oben genannten B-Kette bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Insulin monomer.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Sequenz des genannten Insulins:
wobei die Aminosäuren X₂₃, X₂₄, X₂₅ und X₂₆ individuell unabhängig sind und ausgewählt sind aus der Gruppe von Aminosäuren bestehend aus Gly, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, His, Val, oder nicht vorhanden sind, und wobei höchstens eine der individuell unabhängigen Aminosäuren nicht vorhanden ist; und ferner, es sich bei Y27 entweder Lys oder Arg handelt.
Der dritte Aspekt dieser Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die das in dieser Erfindung beschriebene, monomere Insulin und einen pharmazeutisch zulässigen Träger enthalten.
Der vierte Aspekt dieser Erfindung stellt einen monomeren Insulinprecursor bereit, der die B-Kette, ein verbindendes Peptid und eine Insulin-A-Kette von einem Amino-Terminus zu einem Carboxyl-Terminus enthält, wobei das verbindende Peptid Ala-Ala-Lys ist.
Der fünfte Aspekt dieser Erfindung stellt DNA bereit, welche die Insulin-B-Kette oder den monomeren Insulinprecursor kodiert. Er stellt auch den die DNA enthaltenden Vektor und die Wirtszelle bereit, welche die DNA oder den Vektor enthält.
Der sechste Aspekt dieser Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung des Insulins bereit, in welchem die folgenden Schritte eingeschlossen sind:
eine Wirtszelle, welche einen DNA enthält kodierend für den monomeren Insulinprecursor enthält, wird für die Expression kultiviert, wobei der monomere Insulinprecursor exprimiert wird, wobei der Precursor eine Insulin-B-Kette, ein verbindendes Peptid und eine Insulin-A-Kette von einem Amino-Terminus zu einem Carboxyl-Terminus umfasst, und wobei die Insulin-B-Kette die folgende Aminosäuresequenz enthält:
FVNQH LCGSH LVEAL L Y L V C G E R X23 X24 X25 X26 Y27
wobei X23, X24, X25 und X26 individuell unabhängig und ausgewählt aus der Gruppe von Aminosäuren, bestehend aus Gly, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, His, Val, oder nicht vorhanden sind, und wobei mit höchstens eine der individuell unabhängigen Aminosäuren nicht vorhanden ist; und es sich ferner bei Y27 entweder um Lys oder Arg handelt und das verbindende Peptid Ala-Ala-Lys ist;
Reinigung des monomeren Insulinprecursors;
Enzymspaltung des monomeren Insulinprecursors mittels Trypsin;
Reinigung des monomeren Insulins.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Reinigung von DOI auf DEAE-Sephadex A25. Die mobile Phase hat einen pH-Wert von 7,3, 50 mmol/l, Tris-Puffer, enthaltend 40% Isopropanol; Elutionsgradient 0,05–0,2 mol/l NaCl von Start bis Ende. Der Hauptpeak ist DOI. Die Abszisse ist das Elutionsvolumen und die Ordinate die Extinktion bei 280 nm.
2 zeigt die Dünnschichtchromatographie von Gly-Phe-Phe-Tyr-Ls(Boc)Obut; auf der linken Seite das Rohprodukt; auf der rechten Seite das gereinigte Produkt. Die Entwicklungslösung war eine Mischung aus 3 Volumenteilen Lösung A (Pyridin/Essigsäure/Wasser 4 : 1 : 1,5 nach Volumen) und 7 Volumenteilen Lösung B (Ethylacetat/Isopropanol 10 : 4 nach Volumen). Das Chromatogramm wurde durch Chlor-Stärke-KI gefärbt.
3 zeigt eine RP-HPLC-Analyse von Gly-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut, C8-Säule (Beckman, 4,6 × 250 mm), die mobile Phase Lösung A war Wasser mit 0,1%TFA und Lösung B war 70% Acetonitril mit 0,1% TFA. Der Elutionsgradient betrug 0–100% Lösung B in (0–50 min), Fließgeschwindigkeit 1 ml/min. Die Abszisse ist die Elutionsdauer und die Ordinate die Extinktion bei 280 nm.
4 zeigt Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei einem pH-Wert von 8,3 mit einer Gelkonzentration von 15%, gefärbt mit Coomassie-Brillantblau. Von links nach rechts sind jeweils: DOI, enzymatische Reaktionslösung, B₂₇K-DTrI reines Produkt, Schweineinsulin.
5 zeigt eine Trennung einer enzymatischen Reaktionslösung auf Sephadex-G50-(f)-Säule (1,6 × 60 cm), mobile Phase ist 30%ige Essigsäure, Peak 2 ist die Mischung aus B₂₇K-DTrI und DOI. Die Abszisse ist das Elutionsvolumen und die Ordinate die Extinktion bei 280 nm.
6 zeigt ein RP-HPLC-Trennungsprofil von B₂₇K-DTrI(Boc)Obut, C8-Säule (Beckman, 10 × 250 mm), die mobile Phase Lösung A war Wasser mit 0,1%TFA und Lösung B war 70% Acetonitril mit 0,1% TFA. Der Elutionsgradient betrug 10–60% Lösung B in (10–40 min), Fließgeschwindigkeit 2 ml/min. Peak 1 ist DOI, Peak 2 ist B₂₇K-DTrI(Boc)Obut und Peak 3 ist Gly-Phe-Phe-Tyr-Ls(Boc)Obut. Die Abszisse ist die Elutionsdauer und die Ordinate die Extinktion bei 280 nm.
7 zeigt ein RP-HPLC-Trennungsprofil von B₂₇K-DTrI, CS-Säule (Beckman, 10 × 250 mm), die mobile Phase Lösung A war Wasser mit 0,1%TFA und Lösung B war 70% Acetonitril mit 0,1% TFA. Der Elutionsgradient betrug 10–60% Lösung B in (10–40 min), Fließgeschwindigkeit 2 ml/min. Der Hauptpeak ist B₂₇K-DTrI. Die Abszisse ist die Elutionsdauer und die Ordinate die Extinktion bei 280 nm.
8 zeigt ein B₂₇K-DTrI-HPLC-Analyseprofil, C8-Säule (Beckman, 4,6 × 250 mm), und die mobile Phase Lösung A war Wasser mit 0,1%TFA und Lösung B war 70% Acetonitril mit 0,1% TFA. Der Elutionsgradient betrug 30–70% Lösung B in (10–40 min), Fließgeschwindigkeit 1 ml/min. Der Hauptpeak ist B₂₇K-DTrI. Die Abszisse ist die Elutionsdauer und die Ordinate die Extinktion bei 230 nm.
9 zeigt eine Elektrospray-Massenspektrometrie-Analyse (ESI-MS) von B₂₇K-DTrI, Spannung des Elektrosprays beträgt 4,25 KV und die Kapillartemperatur beträgt 2000. Das theoretische Molekulargewicht beträgt 5508,3 und das tatsächliche Molekulargewicht beträgt 5509,0 mit einem Fehler von 0,01%.
10 zeigt die Wirkung der Proteinkonzentration auf die Gelchromatographie von zinkfreiem Schweineinsulin (oben) und B₂₇K-DTrI (unten), Superdex-75(HR 10/30)-Säule, eluiert bei einem pH-Wert von 7,4 phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Fließgeschwindigkeit 0,4 ml/min; Proteinkonzentrationen von gering nach hoch betragen jeweils: 40, 80, 200, 400, 600 μmol/l. Die Abszisse ist die Elutionsdauer und die Ordinate die Extinktion bei 280 nm.
11 zeigt die Wirkung der Proteinkonzentration auf die Peakform (oben) und die Retentionszeit (unten). Die Abszisse ist die Proteinkonzentration, Fs auf der Ordinate ist der Symmetriefaktor und Kav ist der Retentionsfaktor.
12 zeigt die Gelelektrophorese von zinkfreiem Schweineinsulin (I), Lyspro (II), B₂₇K-DTrI (III) und DPI (IV) auf Superdex-75 (HR 10/30)-Säure, eluiert bei einem pH-Wert von 7,4 phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Fließgeschwindigkeit 0,4 ml/min; Proteinkonzentration beträgt 80 μmol/l.
13 zeigt die Primärstruktur eines erfindungsgemäßen monomeren Insulins.
14 zeigt den Vergleich zwischen den Herstellungsprozessen von erfindungsgemäßem B₂₇K-DTrI mit dem DTI nach dem Stand der Technik, wie es im chinesischen Patent ZL98 110912.8 gelehrt wird.
Detaillierte Beschreibung
Die Addition einer basischen Aminosäure an den C-Terminus der Insulin-B-Kette würde den Herstellungsprozess des Insulinanalogons vereinfachen, ohne dessen Aktivität zu beeinträchtigen. Zum Beispiel besitzt das Insulinanalogon B₂₇K-DTrI, das durch Addition einer anderen basischen Aminosäure an DTI (Destetrapeptid-(B_27-30)-insulin) erhalten wurde, nicht nur die Eigenschaften von monomerem Insulin, sondern weist auch eine In-Vivo-Bioaktivität von 80% des nativen Insulins auf. Das Verfahren zum Erhalt von B₂₇K-DTrI durch Enzymspaltung von monomerem Insulinprecursor, der durch Hefe sezerniert wird, anstelle von enzymatischer Transpeptidierung unter Verwendung von herkömmlichen Techniken steigert demzufolge die Gesamtausbeute und ist für eine industrialisierte Herstellung günstig.
Der in dieser Erfindung verwendete Begriff „DOI" bezieht sich auf Desoctapeptid-(B_23-30)-insulin.
Der in dieser Erfindung verwendete Begriff „B₂₇K-DTrI" bezieht sich auf Destripeptid, wobei in 27 Positionen in der B-Kette Aminosäuren Lys sind. Die Grundstruktur ist wie folgt:
FVNQH LCGSH LVEAL L Y L V C G E R X23 X24 X25 X26 Y27 (SEQ ID NR. 1)
wobei X23, X24, X25 und X26 individuell unabhängig sind und ausgewählt sind aus der Gruppe von Aminosäuren, bestehend aus Gly, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, His, Val, oder nicht vorhanden sind, (d. h. frei). Es ist höchstens erlaubt, dass eine Aminosäure unter den Aminosäuren X₂₃, X₂₄, X₂₅ und X₂₆ nicht vorhanden ist. Y₂₇ wird entweder aus Lys oder Arg ausgewählt. Gemäß dieser Forschung wird das Insulin eine bestimmte Aktivität aufweisen, sofern es die ersten 25 Aminosäuren enthält (von der 23. Position an kann die Aminosäure gegebenenfalls ausgetauscht werden). In dieser Erfindung kann die Aminosäure in der 23.–26. Position ausgetauscht werden. Die ausgetauschte Aminosäure ist vorzugsweise irgendeine der Aminosäuren außer Lys, Arg und Cys, insbesondere L-Aminosäure.
Das erfindungsgemäße Peptid bezieht sich auf B₂₇K-DtrI, ein Insulin, das B₂₇K-DtrI und einen korrespondierenden monomeren Insulinprecursor (MIP) enthält. Das erfindungsgemäße Peptid deckt ein rekombinantes Peptid, ein synthetisches Peptid oder vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid ab. Es kann chemisch synthetisiert oder aus prokaryotischen oder eukaryotischen Wirten erhalten werden (z. B. Bakterien, Hefe, höheren Pflanzen, Insekten- und Säugerzellen).
Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann entweder in DNA- oder RNA-Form vorliegen. Die DNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die DNA kann ein codierender Strang sein oder nicht. Fragmente der Nukleotidsequenz von erfindungsgemäßem B₂₇K-DTrI oder deren volle Länge können durch PCR-Amplifizierung, rekombinante Techniken oder Synthese erhalten werden. Die betreffende Sequenz kann anfänglich durch Synthese erhalten werden. Üblicherweise werden zunächst kleine Fragmente synthetisiert und anschließend verknüpft, um die volle Länge zu erhalten.
Sobald die Sequenz erhalten ist, kann die Sequenz in großem Maßstab durch rekombinante Techniken produziert werden. Üblicherweise wird die Sequenz in einen Vektor kloniert, in eine Wirtszelle überführt und dann mittels herkömmlicher Mittel produziert. Die resultierende Sequenz wird nach der Vermehrung aus der Wirtszelle gereinigt.
In dieser Erfindung kann die B₂₇K-DTrI-Polynucleotidsequenz in den rekombinanten Expressionsvektor insertiert werden. Der Begriff „rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein bakterielles Plasmid, einen Bakteriophagen, ein Hefeplasmid, einen Pflanzenzellvirus, einen Säugervirus wie Adenovirus, Retrovirus, oder andere auf diesem Gebiet wohlbekannte Vektoren.
Zusammenfassend gesagt, es kann jegliches Plasmid und jeglicher Vektor verwendet werden, der sich replizieren kann und stabil bleibt. Eine wichtige Eigenschaft des Expressionsvektors ist, dass er üblicherweise einen Replikationsursprung, Promotor, Marker, Gen- und Translationskontrollelemente enthält.
Der Expressionsvektor, der die das B₂₇K-DTrI kodierende DNA-Sequenz und geeignete Transkriptions-/Translationskontrollsignale enthält, kann mittels Verfahren konstruiert werden, die Fachleuten auf diesem Gebiet vertraut sind. Diese Verfahren umfassen In-Vitro-DNA-Rekombinationstechnik, DNA-Synthese, In-Vivo-Rekombination usw. Die DNA-Sequenz kann effizient mit einem geeigneten Promotor im Expressionsvektor verbunden werden, um die Synthese von mRNA zu steuern. Die typischen Beispiele für diese Promotoren sind: lac- oder trp-Promotor von E. coli, eukaryotische Promotoren einschließlich CMV-immediate-early-Promotor, HSV-Thymidinkinase-Promotor, früher und später SV40-Promotor und andere Promotoren, die in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder in Viren mittels kontrollierbarer Gene exprimiert werden. Der Expressionsvektor umfasst auch eine Ribosomenbindungsstelle für Translationsstart und Transkriptionsstop.
Außerdem enthält der Expressionsvektor vorzugsweise ein oder mehrere selektive Markergene zur Bereitstellung von phänotypischen Eigenschaften zur Selektion transformierter Wirtszellen, wie Dihydrofolat-Reductase für eukaryotische Zellkultur, Neomycinresistenz und Grünfluoreszierendes Protein (GFP) oder Tetracin, Ampicillin für E. coli.
Der Vektor, der die richtige DNA-Sequenz und den Promotor oder die Kontrollsequenz wie oben beschrieben enthält, kann verwendet werden, um die geeignete Wirtszelle zu transformieren, so dass sie das Protein exprimieren kann.
Die Wirtszellen können prokaryotische Zellen sein, z. B. bakterielle Zellen; oder niedere eukaryotische Zellen, z. B. Hefezellen, oder höhere eukaryotische Zellen, z. B. Säugerzellen. Die typischen Beispiele sind: E. coli, Streptomyces; Pilzzellen, z. B. Hefe; Pflanzenzellen, Insektenzellen oder Fruchtfliege S2 oder S9; tierische Zellen einschließlich CHO, COS usw.
Die Zugabe von rekombinanter DNA in die Wirtszelle kann mittels herkömmlicher Techniken ausgeführt werden, die Fachleuten auf diesem Gebiet vertraut sind. Ist der Wirt ein prokaryotischer Organismus wie E. coli, kann die kompetente Zelle, die DNA aufnehmen kann, nach der exponentiellen Wachstumsphase geerntet werden und anschließend mit CaCl₂ behandelt werden, Schritte, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Ein weiteres Verfahren ist die Verwendung von MgCl₂ anstelle von CaCl₂. Falls erforderlich, kann während der Transformation auch Elektroporation angewandt werden. Ist der Wirt ein eukaryotischer Organismus, können die folgenden DNA-Transfektionsverfahren verwendet werden: Calciumphosphat-Cofällung, herkömmliche Verfahren einschließlich Mikroinjektion, Elektroporation, Liposomeinschluss, usw.
Der so erhaltene transformierende Faktor kann auf herkömmliche Weise kultiviert werden, um das durch das erfindungsgemäße Gen kodierte Peptid zu exprimieren. Das zur Kultivierung verwendete Kulturmedium wird aus verschiedenen herkömmlichen Kulturmedien entsprechend der verwendeten Wirtszelle ausgewählt. Die Kultur wird unter Bedingungen ausgeführt, die für ein Wachstum der Wirtszelle geeignet sind. Ist die Wirtszelle bis zu einer bestimmten Zelldichte gewachsen, wird mittels eines geeigneten Verfahrens (Temperaturswitching oder chemische Induktion) ein ausgewählter Promotor dazu angeregt, die Zelle weiter zu kultivieren.
Das rekombinante Peptid der oben beschriebenen Verfahren kann innerhalb der Zelle exprimiert werden oder aus der Zelle sezerniert werden. Wenn erforderlich, können verschiedene Trennungsverfahren verwendet werden, um das rekombinante Protein gemäß der physikalischen, chemischen oder anderen Eigenschaften des Peptids zu reinigen. Diese Verfahren sind auf diesem Fachgebiet wohlbekannt. Beispiele dieser Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: konventionelle Rückführung, Proteinausfällung (Aussahen), Zentrifugieren, Permeation, Superzentrifugieren, Größenausschlusschromatographie (Gelelektrophorese), Absorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, HPLC und andere verschiedene Flüssigphasen-Chromatographietechniken und Kombinationen daraus.
In einem bevorzugten Beispiel wird B₂₇K-DTrI zunächst in der Form eines monomeren Insulinprecursors exprimiert und wird anschließend nach Behandlung durch Enzymspaltung erhalten. Das monomere Insulinvorläufermolekül enthält die erfindungsgemäße Insulin-B-Kette, ein verbindendes Peptid und eine Insulin-A-Kette von einem Amino-Terminus zu einem Carboxyl-Terminus. Es gibt keine spezifische Wahl für das verbindende Peptid, vorausgesetzt, dass es eine verbindende Funktion aufweist und der mit der A-Kette verbundene Aminosäurerest Lys oder Arg ist. Ein Beispiel für eine Art von verbindendem Peptid ist (Ala)2-5Lys, zum Beispiel Ala-Ala-Lys. Jegliches Enzym, z. B. Trypsin, das zur Spaltung von Lys und/oder Arg verwendet wird, kann für die Enzymspaltungsbehandlung verwendet werden. Bedingungen für die Spaltung verändern sich gemäß dem verwendeten Enzym. Ein Beispiel für die Bedingungen ist: Lösungsmittel: 0,02–0,05 M Tris-Puffer, pH: 7–8, Konzentration des Substrats bei etwa 5 mg/ml, Gewicht an Trypsin beträgt etwa 1/50 des Substrats, 4–25 ☐, 1–6 Stunde. Nach Enzymspaltung wird MIP, das Produkt, B₂₇K-DTrI dieser Erfindung, gereinigt durch Größenausschlusschromatographie.
Diese Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine sichere und wirksame Dosierung von erfindungsgemäßem B₂₇K-DTrI-Peptid und einen pharmakologisch zulässigen Träger oder Hilfsstoff enthält. Die Art von Hilfsstoff umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, Puffer, Glukose, Wasser, Glycerin, Ethanol und die Verbindung. Die Wirkstoffherstellung und die Wirkstoff Freisetzungsmethode müssen zusammenpassen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in eine Dosierung für Injektion hergestellt werden, zum Beispiel, hergestellt auf herkömmliche Weise in physiologischer Kochsalzlösung oder wässrigen Lösungen, die Glukose und andere Co-Zusatzstoffe enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung wie eine Tablette oder Kapsel kann ebenfalls auf herkömmliche Weise hergestellt werden. Alle diese Formen, einschließlich der Dosierung für die Injektion, Lösung, Tablette und Kapsel werden unter sterilen Bedingungen hergestellt werden. Die Freisetzungsmenge an aktiven Bestandteilen ist die wirksame Menge für eine Behandlung, zum Beispiel, etwa 1 μg/kg (Gewicht) – etwa 5 mg/kg (Ge wicht). Das erfindungsgemäße Peptid kann auch zusammen mit anderen Wirkstoffen verwendet werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Behandlung von Diabetes und seinen Komplikationen verwendet werden. Die sichere und wirksame Dosierung von B₂₇K-DTrI-Protein in einem Säuger beträgt üblicherweise mindestens 10 μg/kg (Gewicht) und üblicherweise nicht mehr als 10 mg/kg (Gewicht), wobei die bevorzugte Dosierung etwa 10 μg/kg (Gewicht) – 100 μg/kg (Gewicht) beträgt. Sicherlich muss das Freisetzungsverfahren, der Gesundheitszustand des Patienten usw. in Betracht gezogen werden, wenn der Wirkstoff freigesetzt wird, was unter die Verantwortlichkeit der Ärzte fällt.
Erfindungsgemäßes monomeres Insulin kann nicht nur allein verwendet werden, sondern kann zusammen mit anderen Wirkstoffen (z. B. anderen Insulinen) zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden.
Die Hauptvorteile dieser Erfindung liegen in Folgendem:
Das erfindungsgemäße Insulin hat eine starke monomere Eigenschaft.
Das erfindungsgemäße monomere Insulin kann durch eine Enzymspaltung in einem Schritt aus monomerem Insulinprecursor erhalten werden ohne Enzym-Transpeptidierung oder -renaturierung.
Die das Insulin enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung hat eine hohe Bioverfügbarkeit, wenn es nicht mittels Injektion freigesetzt wird.
Die folgenden Beispiele werden aufgeführt, um diese Erfindung weiter zu erläutern, nicht aber, um sie einzuschränken. Werden keine konkreten Bedingungen genannt, sollen normale Anforderungen, die in Molecule Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) von Sambrook et. al. spezifiziert werden; oder vom Hersteller vorgeschlagene angewandt werden.
Beispiel 1 Herstellung von DOI
613 mg zinkfreies Schweineinsulin wurden in 127 ml 0,05 mol/L Borax-Lösung (enthaltend 0,001 M CaCl₂), pH 8,9, gelöst.9. Die Lösung wurde bei 37°C in einem Wasserbad 3 Stunden gerührt, danach wurden 24,5 mg kristallines Trypsin zugegeben, dann wurde der Hauptpeak gesammelt (1), gegen Wasser dialysiert und nach dem Reinigen der Lösung auf einer DEAE-Sephadex-A25-Ionenaustauschersäule lyophilisiert. DOI wurde so nach Entsalzen auf Sephadex G25 erhalten.
Beispiel 2 Herstellung von GFFYK (Boc) Obut
2.1 Herstellung von Boc-Phe-Osu
3,18g Boc-Phe (12 mol) und äquimolares N-Hydroxysuccinimid (HOSu) wurden gegenseitig in 15 ml THF gelöst. Die Reaktionsmischung wurde auf einem Salzeisbad (–5°C) 10 Minuten gehalten und dann wurde eine äquimolare Menge an Dicyclohexcylcarbodiimid (DCCI), gelöst in 2 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF), unter Rühren mit einem Magnetrührer bei –5°C langsam in die Reaktionsflasche getropft. Nach Rühren bei –5°C für mehr als 2 Stunden wurde die Lösung über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Der gebildete Harnstoff wurde mittels Filtration mit dreilagigem Filterpapier abgetrennt und das Filtrat wurde zu einem weißen Feststoff. Der Rückstand wurde mit 15 ml Isopropanol gelöst und bei Raumtemperatur umkristallisiert, um nach Waschen und Trocknen 2,5 g (53%) Produkt zu ergeben. Das Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 138–140°C, war in einer Dünnschicht-Chromatographie, 3/7-System, homogen. Die Entwicklungslösung war eine Mischung aus 3 Volumenteilen Lösung A (Pyridin/Essigsäure/Wasser 4 : 1 : 1,5 nach Volumen) und 7 Volumenteile Lösung B (Ethylacetat/Isopropanol 10 : 4 nach Volumen). Das Chromatogramm wurde durch Chlor-Stärke-KI gefärbt.
2.2 Herstellung von (TFA) Phe-Tyr-OC₂H₅
5,97 g (16,5 mmol) Boc-Phe-Osu und äquimolares HCl-Tyr-OC₂H₅ wurden gegenseitig in 80 ml wasserfreiem Ethylacetat gelöst und mit etwa äquimolarem N-Methylmorpholin bis pH 8 neutralisiert. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dreimal mit jeweils 10%iger Zitronensäure, 1%igem Kaliumcarbonat bzw. gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat 2 Stunden lang getrocknet und wieder auf ein äußerst kleines Volumen rotationsverdampft. Das Produkt wurde mit Petrolether kristallisiert, um nach Waschen und Trocknen 6,1 g (81%) zu ergeben. Das Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 126–128°C war in einer Dünnschicht-Chromatographie (3/7-System) homogen. Der Kristall wurde in 50 ml Dichlormethan (DCM) gelöst, 25 ml Trifluoressigsäure (TFA) wurden in die Lösung getropft. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 35 Minuten wurde die Lösung unter Vakuum eingeengt, um das Lösungsmittel zu entfernen. Das Produkt (TFA) Phe-Tyr-OC₂H₅ wurde so nach mehr als fünfmaligem Waschen mit Dichlormethan erhalten.
2.3 Herstellung von (TFA) Phe-Phe-Tyr-OC₂H₅
13 mmol (TFA)-Phe-Tyr-OC₂H₅ wurden in 20 ml wasserfreiem THF (Lösungsmittel) gelöst und mit 5,4 ml N-Methylmorpholin auf pH 7 neutralisiert. Die Lösung wurde auf einem Salzeisbad gehalten. Dann wurde eine äquimolare Menge an Boc-Phe-OSu in 35 ml wasserfreiem 7HF gelöst und wurde in eine (TFA)-Phe-Tyr-OC₂H₅-Lösung getropft, wobei die Reaktionslösung mit N-Methylmorpholin bei einem neutralen pH-Wert gehalten wurde. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Rotationsverdampfen bis auf Pulver wurde die Mischung mit Ethylacetat gelöst und dreimal mit jeweils 10%iger Zitronensäure, 1%igem Kaliumcarbonat bzw. gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat 2 Stunden lang getrocknet und wieder auf ein äußerst kleines Volumen rotationsverdampft. Das Rohprodukt Boc-Phe-Phe-Tyr-OC₂H₅ wurde mit einer großen Menge an Ether kristallisiert, um 2 g (30%) zu ergeben. Das Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 106–108°C, war in einer Dünnschicht-Chromatographie (3/7-System) homogen. Das gesamte Produkt wurde in 25 ml DCM gelöst und 25 ml TFA wurden in die Lösung getropft. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten wurde die Lösung unter Vakuum eingeengt, um das Lösungsmittel zu entfernen. Das Produkt (TFA) Phe-Phe-Tyr-OC₂H₅ wurde so nach mehr als fünfmaligem Waschen mit DCM erhalten.
2.4 Herstellung von Z-Gly-Osu
10 g (47 mmol) Z-Gly und eine äquimolare Menge Hosu wurden gegenseitig in 100 ml wasserfreiem THF gelöst (einem Lösungsmittel). Die Reaktionsmischung wurde auf einem Salzeisbad (–5 °C) 10 Minuten gehalten und dann wurde eine äquimolare Menge an DCCI, gelöst in 2 ml wasserfreiem THF, langsam unter Rühren mit einem Magnetrührer bei –5°C in die Reaktionsflasche getropft. Nach Rühren bei –5°C für mehr als 2 Stunden wurde die Lösung über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Der gebildete Harnstoff wurde mittels Filtration mit dreilagigem Filterpapier abgetrennt und das Filtrat wurde nach Rotationsverdampfen leicht ölig. Der Rückstand wurde mit einer kleinen Menge DCM gelöst, dann wurde eine große Menge Ether zugegeben, das Filtrat wurde gegen die Flaschenwand geschrubbt, bis sich ein gelber Niederschlag bildete und die Lösung klar wurde. Die klare Lösung wurde ausgegossen und wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Produkt wurde kristallisiert und mittels Filtration aufgefangen, um nach Waschen und Trocknen 6,5 g (46%) Produkt zu ergeben. Das Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 100–102°C und war in einer Dünnschicht-Chromatographie (3/7-System) homogen.
2.5 Herstellung von Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-OC₂H₅
3,3 g mmol (TFA) Phe-Phe-Tyr-OC₂H₅ und 5 mmol Z-Gly-Osu wurden gegenseitig in 10 ml wasserfreiem THF (Lösungsmittel) gelöst. Die Lösung wurde mit N-Methylmorpholin auf pH 8,0 neutralisiert und anschließend 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Rotationsverdampfen bis auf Pulver wurde das Pulver in Ethylacetat gelöst und dreimal jeweils mit 10%iger Zitronensäure, 1%igem Kaliumcarbonat bzw. gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat 2 Stunden lang getrocknet und wieder auf ein äußerst kleines Volumen rotationsverdampft. Die Lösung wurde dann von klar trübe und dann wieder klar, nach der Zuga be einer großen Menge Ether. Es bildete sich ein graugelber Niederschlag, nachdem 72 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde. Der Niederschlag betrug nach Waschen mit Ether und Trocknen 2 g (87%), der Niederschlag hatte einen Schmelzpunkt von 148–151°C. Das Produkt war in einer Dünnschicht-Chromatographie (3/7-System) homogen.
2.6 Herstellung von Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-NHNH₂
15 mmol 85%iges Hydrazinhydrat wurde zu einer Lösung aus 2 g (2,9 mmol) Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-OC₂H₅ in 9 ml wasserfreiem Methanol gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden auf Rückfluss erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Kristalle, die sich sofort bildeten, wurden gesammelt und mit 10 ml wasserfreiem Ether, 10 ml Methanol/Ether (5 : 5) und Wasser auf pH 7 gewaschen. Die Rohausbeute nach Trocknen betrug 1,29 g (65%) und das Produkt war in Dünnschicht-Chromatographie (3/7-System) homogen.
2.7 Herstellung von Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys (Boc) Obut
37g Natriumnitrit wurden in 150 ml destilliertem Wasser gelöst und 38 g tert-Butylalkohol wurden zu der Lösung gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten in einem Eisbad gehalten und dann wurden 60 ml 35%ige Schwefelsäure langsam unter Rühren mit einem Magnetrührer in die Reaktionsflasche getropft. Nach Rühren auf dem Eisbad für mehr als 30 Minuten, wurde die Lösung 15 Minuten stehen gelassen und anschließend wurde der Überstand dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat gewaschen. Es wurden 30 ml tert-Butylnitrit nach Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat hergestellt. 1,25 g (1,9 mmol) Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-NHNH₂ wurden in 8 ml wasserfreiem DMF durch Erhitzen gelöst. 2 ml 2N HCl/THF (4 mmol) wurden zu der Lösung gegeben und die Reaktionsmischung wurde bei –20°C gehalten, anschließend wurden 0,3 ml tert-Butylnitrit (2,5 mmol) langsam in die Lösung getropft und für 15 Minuten geschüttelt, es wurden 10 ml wasserfreies, auf –20°C vorgekühltes Ethylacetat zu der Lösung gegeben. Die Mischung wurde auf –30°C gekühlt. In der Zwischenzeit wurden 0,65 g (1,9 mmol) (HCl)Lys(Boc)Obut in 7 ml wasserfreiem DMF gelöst, 247 μl Triethylamin wurden in die Lösung gegeben, nachdem sie auf –30°C abgekühlt war, anschleißend wurde die Lösung und 10 ml wasserfreies, auf –20°C vorgekühltes Ethylacetat nacheinander in die oben genannte Mischung gegeben. Triethylamin wurde zugegeben, um den pH-Wert auf 8 einzustellen, und dann wurde die Mischung nach Schütteln für 30 Minuten bei 4°C 72 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Nach Rotationsverdampfen bis auf Pulver wurde der Rückstand mit Ethylacetat gelöst und anschließend dreimal jeweils mit 10%iger Zitronensäure, 1%igem Kaliumcarbonat bzw. gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat 2 Stunden lang getrocknet und wiederum zu einem Öl rotationsverdampft. Das Produkt wurde mit dem dreifa chen Volumen an Ether kristallisiert, Ausbeute 1 g (56%) nach Waschen mit kaltem Ethylacetat, kaltem Ether und Trocknen. Das Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 160–162°C und war in einer Dünnschicht-Chromatographie (3/7-System) homogen.
2.8 Herstellung von Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut
0,56 g Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut wurden in 90 ml wasserfreiem Methanol gelöst und die Lösung wurde mit Eisessig auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt. 0,12g Pd/Kohlenstoff wurden zugegeben. Die Reaktionslösung wurde gerührt und 6 Stunden mit Wasserstoff vermischt. Anschließend wurde die Lösung mit Diatomit filtriert. (Pd/Kohlenstoff wurde nach Tränken in Chloroform verworfen) und das Filtrat wurde mittels Rotationsverdampfen getrocknet. Das Produkt (Ausbeute 93 %) wurde nach wiederholtem Waschen mit Ethylacetat erhalten, war in Dünnschicht-Chromatographie (3/7-System) homogen und kann mit Ninhydrin gefärbt werden. Wie in 2 gezeigt. HPLC war homogen, wie in 3 gezeigt. Der analytische Wert der Aminosäuren entsprach dem des theoretischen Werts: Glyl.2 (1,0); Tyrl.0 (1,0); Phe2.2 (2,0); Lys1 (1,0).
Beispiel 3. Herstellung von B₂₇K-DTrI
0,237 g (0,172 mmol) Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut wurden in 0,26 ml Dimethylsulfon (DMSO) durch Erwärmen auf 50°C gelöst. Anschließend wurde die Lösung bei 37°C Wasserbad inkubiert und 86 mg (0,0172 mmol) DOI wurden langsam zu der Lösung gegeben. 1,82 ml 1,4-Butandiol. und auf 37°C vorgeheizte 0,52 ml Wasser wurden zu der Reaktionslösung gegeben und der pH-Wert wurde mit 5 μl N-Methylmorpholin auf 6,5 eingestellt. 7,8 mg TPCK-Trypsin wurden zugegeben und die Reaktionsmischung bei 30°C inkubiert. Nach 2 und 4 Stunden, wurden jeweils 4,5 mg TPCK-Trypsin zugegeben. Nach 20 Stunden, wurden 1,1 ml Eisessig zugegeben und die Reaktion wurde durch Einstellen des pH-Werts auf 3 mit 1 mol/l HCl beendet. Die Reaktionsmischung wurde durch Sephadex-G50-Feinsäulenchromatographie mit 30%iger Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt. 76 mg (80% Ausbeute) Rohprodukt B₂₇K-DTrI (Boc) Obut wurden erhalten (5). Das Rohprodukt wurde durch C8-RP-HPLC gereinigt (6), mit kaltem Aceton gewaschen und getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in wasserfreier TFA auf eine Konzentration von 3 mg/ml gelöst. Nach Stehen bei 10°C für 1 Stunde, wurde TFA im Vakuum abgedampft und der Rückstand wurde gründlich mit Dichlormethan gewaschen. Das Produkt wurde mittels C₈-RP-HPLC gereinigt, um B₂₇K-DTrI zu erhalten (7). Die Probe war in pH 8,3 PAGE (4) und C₁₈HPLC (8) homogen. Das Molekulargewicht wurde mittels Elektrospray-Massenspektrometrie auf 5509 Da bestimmt (9) und unterschied sich vom theoretischen Molekulargewicht von 5508,3 durch einen Fehler von 0,01%. Die Sequenz aus 14 N-terminalen Resten und 2 C-terminalen Resten wurde als korrekt ermittelt (Ta belle 1). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Ladung, hydrophile und hydrophobe Eigenschaften der Probe alle homogen sind und dass die Proteinsequenz mit der entworfenen Sequenz konsistent ist
(SEQ ID NR. 5). Tabelle 1 N-terminale und C-terminale Sequenzen von B₂₇K DtrI (N-Terminus → C-Terminus)
Beispiel 4. Bestimmung der Selbstassoziationseigenschaft
Das monomere Verhalten von B₂₇K-DTrI wurde durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer Superdex-75-(HR 10/30)-Säule bestimmt, eluiert mittels PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4), mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml/min, Beladungsvolumen 0,1 ml, detektiert bei 280 nm, bei Raumtemperatur. Die molekulare Homogenität wurde durch den Symmetriefaktor Fs gemessen. Fs = WO,05h/2A, wobei, WO,05 die Bandbreite bei 0,05 Peakhöhe ist und A die Breite der ersten Peakhälfte bei 0,05 Peakhöhe ist. Die Veränderung des mittleren Molekulargewichts wurde durch Auftragung des Verteilungskoeffizienten Kav gegen Proteinkonzentration gemessen. Kav = (Vr-V0)/(Vc-Vo), wobei Vr das Retentionsvolumen ist, Vo das Lückenvolumen und Vc das gesamte Bettvolumen. Die Retentionszeit auf der Superdex-75-Säule verminderte sich mit steigender Konzentration an zinkfreier Insulinkontrolle wie in 10A dargestellt. Die Retentionszeit von B₂₇K-DTrI war unabhängig von den Proteinkonzentrationen, wie in 10B dargestellt. Der Fs-Wert von Insulin erhöhte sich deutlich bei Konzentrationen über 400 umol/l (10C) und der Kav-Wert des Insulins verminderten sich mit steigender Konzentration (10D). Während Retentionszeit und Peakform von B₂₇K-DTrI sich mit steigender Proteinkonzentration nicht veränderten. Die monomeren Verhalten von Lyspro (B28Lys, B29Pro-Insulin), DPI (Despentapeptid-Insulin) und B₂₇K-DTrI wurden bei der gleichen Konzentration (80 umol/l) auf einer Superdex-75-Säule verglichen. Die Kav-Werte von B₂₇K-DTrI und Lyspro-Insulin betrugen 0,51 bzw. 0,48 (12).
Beispiel 5 Biologischer Aktivitätstest
5.1 Mauskonvulsionstest (Chinesisches Pharmakopöe, 1985, Anhang 100 Seiten)
Männliche Kunminmäuse (Körpergewicht 27–30 g) wurden zufällig in vier Gruppen mit 24 Tieren in jeder Gruppe unterteilt, die man 2 Stunden vor dem Experiment hungern ließ. Die Probe wurde in Kochsalzlösung gelöst, pH 5,0, eingestellt mit Salzsäure, 10 D 280 nm = 1 mg/L. Die Wirksamkeit der Probe wurde auf 80% des Standardprodukts geschätzt, die höchste Dosis betrug 0,09 U/ml, die geringste Dosis 0,045 U/ml und das Lösungsmittel war physiologische Kochsalzlösung, deren pH mittels Salzsäure auf 2,5 eingestellt war. Jeder Maus wurden innerhalb von 15 Minuten 0,3 ml bei 25°C subkutan verabreicht und dann wurden diese Mäuse für eine Beobachtungszeit von 90 Minuten bei 37°C gehalten; bei allen denjenigen, die krampfend oder tot waren oder sich nicht umdrehen konnten, nachdem sie auf den Rücken gelegt wurden, wurde eine positive Reaktion angenommen. Die Daten wurden durch einen qualitativen Reaktionstest bestimmt.
5.2 Maus-Plasmaglukose-Verminderungstest (Chinesisches Pharmakopöe, 2000, Anhang 106 Seiten)
Männliche Kunminmäuse (Körpergewicht 28–30 g) wurden zufällig in vier Gruppen mit 10 Tieren in jeder Gruppe unterteilt. Die Wirksamkeit der Probe wurde auf 80% des Standardprodukts geschätzt, die höchste Dosis betrug 0,07 U/ml, die geringste Dosis 0,035 U/ml und das Lösungsmittel war physiologische Kochsalzlösung, deren pH mittels Salzsäure auf 2,5 eingestellt war. Jeder Maus wurden bei 25°C 0,25 ml Probe subkutan verabreicht und es wurde Blut aus dem Augenvenengeflecht entnommen, um den Blutzucker 40 Minuten nach der Injektion zu bestimmen; der Wirkstoff wurde jeder Maus drei Stunden später ein zweites Mal verabreicht, gemäß einem Doppelkreuz (hohe Dosis der Probe im Test wurde der Gruppe mit der geringen Dosis des Standardprodukts von vorher verab reicht) und der Blutzucker wurde nach 40 Minuten getestet. Die Daten wurden durch einen quantitativen Reaktionstest bestimmt. Die biologische Aktivität gemäß des Mauskonvulsionstests beträgt 21 U/mg und FL% beträgt 23,5% (<30%) (Tabelle 2); die biologische Aktivität gemäß dem Maus-Plasmaglukose-Verminderungstest beträgt 23 U/mg und FL% beträgt 11,9% (<25%) (Tabelle 3); das im Experiment verwendete Standardprodukt ist 27 U/mg Insulin, bereitgestellt von NICPBP (The National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products). Die Ergebnisse aus den beiden Testverfahren sind miteinander konsistent und die biologische Aktivität von B₂₇K-DTrI beträgt 80% der von nativem Insulin. Tabelle 2 B₂₇K-DTrI Biologische Aktivität durch Mauskonvulsionstest (Chinesisches Pharmakopöe, 1985)
Tabelle 2 B₂₇K-DTrI Biologische Aktivität durch Maus-Plasmaglukose-Verminderungstest (Chinesisches Pharmakopöe, 2000).
Beispiel 6 B₂₇K-DTrI, exprimiert durch Gentechnologie
In diesem Experiment wurde MIP (monomerer Insulinprecursor) durch Verbinden des C-Terminus und des N-Terminus mit einem verbindenden Peptid konstruiert (z. B. Ala-Ala-Lys, denn die MIP-Struktur ist hilfreich für die Insulin-Faltung und Bildung von korrekter Disulfidbindung nach Biosynthese. Die Schritte sind wie folgt:
Eine Signalpeptidsequenz (α-MFL, α-Paarungsfaktorsignal) wurde an das 5-Ende des MIP-Gens addiert (siehe SEQ ID NR. 3 unten), das aus chemischer Synthese erhalten wurde, anschließend wurde das Gen in pPIC9K-Plasmid kloniert, um pPIC9K/MIP durch Verwendung der Enzymspaltungsstelle von EcoRI und NotI zu bekommen. Nach einer Behandlung mittels Linearisierung und Punkthybridisierung zum Screenen nach Strängen mit einer hohen Kopienzahl, wurde pPIC9K/MIP anschließend in Hefe P. pastoris überführt. SEQ ID Nr. 3:
Nach Fermentation mit hoher Biomassekonzentration, wurde MIP aus dem Produkt durch hydrophobe Chromatographie erhalten. Die Aminosäuresequenz wurde in SEQ ID NR. 4 gezeigt:
Hoch reines B₂₇K-DTrI (Struktur in 13) wurde durch Enzymspaltung von MIP mit Trypsin (Lösungsmittel: 0,03 M Tris-Puffer, pH: 7,5, 20°C, 2 Stunden) und anschließender Größenausschlusschromatographie erhalten.
Diskussion
B₂₇K-DTrI kann auch durch ein anderes Hefe-Expressionssystem oder E.-coli-Sekretions-Expressionssystem mit dem gleichen technischen Verfahren exprimiert werden. Dieses technische Verfahren überspringt im Vergleich zur Herstellung von DTI, wie in der chinesischen Patentanmeldung 98 1 10912,8 beschrieben wurde, überentwickelte Schritte der chemischen Synthese von Peptid GFFY(But)OBut, enzymatische Transpeptidierung, HPLC-Trennung usw. in der herkömmlichen Technik und steigert demzufolge die Ausbeute mehrfach und ist für industrialisierte Herstellung besser geeignet. Der Vergleich zwischen den beiden Verfahren ist in 14 dargestellt. Sequenztabelle

Claims

Insulin-B-Kette, umfassend die folgende Aminosäuresequenz: FVNQH LCGSH LVEAL L Y L V C G E R X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ Y₂₇ wobei X₂₃, X₂₄, X₂₅ und X₂₆ individuell unabhängige Aminosäuren sind und ausgewählt sind aus der Gruppe von Aminosäuren bestehend aus Gly, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, His, Val, oder nicht vorhanden sind, und wobei höchstens eine der individuell unabhängigen Aminosäuren nicht vorhanden ist; und ferner, wobei Y₂₇ entweder Lys oder Arg ist.
Insulin-B-Kette nach Anspruch 1, in welcher Y₂₇ Lys ist.
Insulin-B-Kette nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welcher die Sequenz X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆ GFFY ist.
Destetrapeptid-Insulinmolekül, umfassend die Insulin-B-Kette nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Destetrapeptid-Insulinmolekül nach Anspruch 4, bei welchem das Insulin in monomerer Form vorliegt.
Insulinmolekül nach Anspruch 4 oder 5 mit der Struktur:
wobei die Aminosäuren X₂₃, X₂₄, X₂₅ und X₂₅ individuell unabhängig sind und ausgewählt sind aus der Gruppe von Aminosäuren bestehend aus Gly, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, His, Val, oder nicht vorhanden sind, und wobei höchstens eine der individuell unabhängigen Aminosäuren nicht vorhanden ist; und ferner, wobei Y₂₇ entweder Lys oder Arg ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Destetrapeptid-Insulin nach einem der Ansprüche 4 bis 6 und cinen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Monomerer Insulinprecursor, umfassend die Insulin-B-Kette nach Anspruch 1, ein verbindendes Peptid und eine Insulin-A-Kette von einem Aminoterminal zu einem Carboxylterminal.
DNA-Sequenz, kodierend die Insulin-B-Kette nach Anspruch 1 oder den monomeren Insulin precursor nach Anspruch 8.
Expressionsvektor, enthaltend die DNA nach Anspruch 9.
Wirtszelle, enthaltend den Expressionsvektar nach Anspruch 10 oder die DNA nach Anspruch 9.
Verfahren zum Herstellen von Insulin, umfassend die folgenden Schritte: eine Wirtszeile, enthaltend einen DNA-kodierenden monomeren Insulinprecursor, wird für die Expression kultiviert, wobei der monomere Insulinprecursor exprimiert wird, wobei der Precursor eine Insulin-B-Kette, ein verbindendes Peptid und eine Insulin-A-Kette von einem Aminoterminal zu einem Carboxylterminal umfasst, und wobei die Insulin-B-Kette die folgende Aminosäuresequenz enthält. FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆Y₂₇ wobei X₂₃, X₂₄, X₂₅ und X₂₆ individuell unabhängig sind und ausgewählt sind aus der Gruppe von Aminosäuren, bestehend aus Gly, Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, His, Val, oder nicht vorhanden sind, und wobei mit höchstens eine der individuell unabhängigen Aminosäuren nicht vorhanden ist; und ferner wobei Y₂₇ entweder Lys oder Arg ist und das verbindende Peptid Ala-Ala-Lys ist; Reinigung des monomeren Insulinprecursors; Enzymspaltung des monomeren Insulinprecursors mittels Trypsin; Reinigung des monomeren Insulins.