CN1468864A - 新的单体胰岛素，药物组合物及其制法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的胰岛素B链、含该B链的单体胰岛素、含所述单体胰岛素的药物组合物，及其制法和用途。本发明的胰岛素类似物B27K去三肽胰岛素(B27K－DTrI)，用酶促半合成法得到高纯度的样品，并证明其具有单体胰岛素(生理pH值、较高浓度时不聚合)的性质，整体生物活力为正常胰岛素的80％。利用酵母表达系统分泌表达单体胰岛素前体，酶切得B27K－DTrI可省却传统工艺中的酶促转肽步骤，从而提高终产率，适合于工业化生产。

Description

新的单体胰岛素，药物组合物及其制法
技术领域
本发明涉及医学和药物学领域。更具体地，本发明涉及新的胰岛素B链、含该B链的单体胰岛素、含所述单体胰岛素的药物组合物，及其制法和用途。
背景技术
糖尿病发病率逐年上升，并能引发心血管疾病致死，是当今威胁人类健康的主要疾病之一。高血糖是引发各种糖尿病并发症的原因，而严格控制每天24小时的血糖浓度在正常范围是防止、延缓糖尿病后期并发症的最关键因素。
胰岛素从20世纪20年代用于治疗糖尿病以来，一直是无可替代的特效药。但是，正常人体内胰岛素的分泌是受血糖浓度调控的，一般是在进餐后30-60分钟血胰岛素浓度达到峰值，4-5小时后恢复到基础浓度，这样能够保证血糖浓度不因进餐而有大的波动。
常规胰岛素制剂在临床给药中不能模仿生理胰岛素分泌的时相性，很难有效的控制饭后的血糖升高，还有给患者带来低血糖的危险。这是因为在中性溶液中，浓度高于100nM时胰岛素以二聚体、六聚体的形式存在，而其必须解离成单体后结合专一受体发挥生理功能。这种分子间的聚合提高了胰岛素的稳定性，利于贮存和调节活性，确保能够精细、灵活地调控血糖，但给胰岛素的吸收造成很大的障碍。胰岛素制剂(0.6mM)以六聚体形式存在，注射后经过5-10万倍的稀释由六聚体转为二聚体在转为单体胰岛素方能被毛细血管吸收进入血液循环，在肌肉或皮下这种高倍的稀释是一个慢而长的过程，2-4小时只有50％的胰岛素被吸收。皮下注射胰岛素制剂后，90-120分钟后血胰岛素达到比较低的峰值，之后又不能快速降低。(Home，P.D.，et al.，Metabolism，1981，30：439；Blundall，T.，et al.，Adv.Protein Chem.，1972，26：279；Drejer，K.，Diabetes/Metabolism Reviews，1992，8：259；Insulin research group，Academia Sinica，Sci.Sin.，1974，17：779；Brange，J.Stability of insulin，1994；Brange，J.et al.，Advanced Drug Delivery Reviews，1999，35：307-335)。
在中性溶液中自聚合性质降低的胰岛素称为单体胰岛素，在给药处无须经过高倍稀释即可被迅速吸收，且缩短了给药后药物作用的时程，故而获得可用于临床的单体速效胰岛素是开发新一代治疗糖尿病药物的主要目标之一。EliLilly公司开发的单体胰岛素Lyspro于1996年分别在欧洲和美国用于临床，取得很好效果。皮下注射Lyspro后15分钟起效，1个小时血胰岛素浓度达到峰值，2-4小时后恢复到，饭后15分钟给Lyspro和饭前20分钟给常规胰岛素的效果相当。目前Novo公司研发的另一种单体胰岛素Aspart正处于临床研究中。(Howey，D.C.，et al.，Diabetes，1994，43：396-402；Torlone，E.et al.，Diabetologia，1994，37：713-720；Rami，B.et al.，Eur.J.Pediatr.1999，156：838-840；Vajo，Z.et al.Pharmacological reviews.2000，52：1-9)。
中国专利ZL98 110912.8公开了在啤酒酵母中分泌表达单体胰岛素前体(MIP)，通过酶促转肽获得单体胰岛素的方法。该单体胰岛素的B链C端去五肽胰岛素DPI，或者B链C端去四肽胰岛素DTI)(Cui，D.F.，et al.，JPept Res，2001.57：188-92)。然而，该工艺因以下主要缺点而难以大规模生产：(1)需要化学合成小肽，如GFFY(But)Obut；(2)胰蛋白酶酶促转肽时，得率在80％以内；(3)酶促转肽后中间体需要经过强酸，如三氟乙酸(TFA)处理以脱去保护基；(4)工艺流程复杂，存在化学副反应。
因此，本领域迫切需要开发新的制法简便、适合大规模生产的单体胰岛素。
发明内容
本发明的目的就是提供一种制法简便、适合大规模生产的单体胰岛素。
本发明的另一目的是提供含有该单体胰岛素的药物组合物。
本发明的再一目的是提供所述单体胰岛素和药物组合物的制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种胰岛素B链，具有以下氨基酸序列：
FVNQH  LCGSH  LVEAL  YLVCG  ERX23X24X25X26Y27(SEQID NO：1)
其中，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；
Y27是Lys，或Arg。
在一优选例中，Y27是Lys。
在另一优选例中，X23X24X25X26是GFFY。
在本发明的第二方面，提供了一种胰岛素，它上述的B链。
在一优选例种，所述胰岛素是单体胰岛素。
在另一优选例中所述的胰岛素的结构如下：
Figure A0213610700061
其中，X23、X24、X25、X26、Y27如上定义。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，含有本发明所述的胰岛素和药学上可接受的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种单体胰岛素表达前体，它从氨基端至羧基端分别含有本发明上述的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链，其中连接肽为Ala-Ala-Lys。
在本发明的第五方面，提供了一种分离的DNA，该DNA编码上述的胰岛素B链、或单体胰岛素表达前体。还提供了含有所述DNA的载体，以及含有所述DNA或所述载体的宿主细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种制备胰岛素的方法，包括步骤：
(a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码单体胰岛素表达前体的DNA，从而表达出所述的单体胰岛素表达前体；
所述的前体从氨基端至羧基端分别含有胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链，其中胰岛素B链具有以下氨基酸序列：
FVNQH  LCGSH  LVEAL  YLVCG  ERX23X24X25X26Y27
式中，X23、X24、X25、X26和Y如上定义；
(b)分离出所述的单体胰岛素表达前体；
(c)用胰蛋白酶酶切割所述的单体胰岛素表达前体；
(d)分离出单体胰岛素。
附图说明
图1，DOI的DEAE-Sephadex A25分离图，流动相为pH7.3，50mmol/L Tris缓冲液，含有40％异丙醇，盐梯度为(0.05-0.2mol/L NaCl)；主峰为DOI。横坐标为流出体积，纵坐标为A280nm。
图2，Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的薄层层析，左，粗品；右，纯化后产物。3/7系统：展开剂为3份A(吡啶4V，醋酸1V，水1.5V)、7份B(醋酸丁酯10V，异丙醇4V)，氯气-淀粉-KI显色。
图3，Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的HPLC分析，C8柱，(Beckman，4.6×250mm)，流动相B为含0.1％TFA的70％乙腈，流动相A为含0.1％TFA的水，梯度(0-100％B/0-50min)，流速为1ml/min。横坐标为流出时间，纵坐标为A280nm。
图4，pH8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶浓度为15％，考马斯亮兰染色。从左到右分别为：DOI，酶促反应液，B27K-DTrI粗品，B27K-DTrI纯品，猪胰岛素。
图5，酶促反应液的sephadex G50(f)柱(1.6×60cm)的分离图，流动相为30％乙酸，峰2为B27K-DTrI和DOI的混合物。横坐标为流出体积，纵坐标为A280nm。
图6，B27K-DTrI(Boc)Obut的RP-HPLC的分离图，C8柱(Beckman，10×250mm)，流动相B为含0.1％TFA的70％乙腈，流动相A为含0.1％TFA的水，梯度(10-60％B/10-40min)，流速为2ml/min.峰1为DOI，峰2为B27K-DTrI(Boc)Obut，峰3为Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut。横坐标为流出时间，纵坐标为A280nm。
图7，B27K-DTrI的RP-HPLC的分离图，C8柱(Beckman，10×250mm)，流动相B为含0.1％TFA的70％乙腈，流动相A为含0.1％TFA的水，梯度(10-60％B/10-40min)，流速为2ml/min，主峰为B27K-DTrI。横坐标为流出时间，纵坐标为A280nm。
图8，B27K-DTrI HPLC分析，C8柱(Beckman，4.6×250mm)，流动相B为含0.1％TFA的70％乙腈，流动相A为含0.1％TFA的水，梯度(30-70％B/10-40min)，流速为1ml/min。横坐标为流出时间，纵坐标为A230nm。
图9，B27K-DTrI的电喷雾质谱分析(MATLCQ ESI-MS)，电喷电压为4.25KV，毛细管温度为200℃。理论分子量为5508.3，实测分子量为5509.0，误差为0.01％。
图10，蛋白质浓度对脱锌猪胰岛素(上)和B27K-DTrI(下)的凝胶层析的影响，Superdex75柱，流动相为pH7.4的PBS，流速为0.4ml/min；蛋白质浓度从低到高分别为：40，80，200，400，600μmol/L。横坐标为流出时间，纵坐标为A280nm。
图11，蛋白质浓度对层析的峰形(上)和保留时间(下)的影响。横坐标为蛋白质浓度，纵坐标中Fs为对称因子，Kav为保留因子。
图12，脱锌猪胰岛素(I)，Lyspro(II)，B27K-DTrI(III)和DPI(IV)的凝胶层析，Superdex75柱，流动相为pH7.4的PBS，流速为0.4ml/min，蛋白质浓度均为80μmol/L。
图13，本发明一种单体胰岛素的结构。
图14，本发明B27K-DtrI与现有技术中DTI的生产工艺比较。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现在胰岛素B链末端添加碱性氨基酸，可以大大简化胰岛素的生产工艺，而对胰岛素活性基本无影响，在此基础上完成了本发明。例如，在羧端去四肽胰岛素上再添加一个碱性氨基酸后得到胰岛素类似物B27K去三肽胰岛素(B27K-DTrI)，B27K-DtrI不仅具有单体胰岛素(生理pH值、较高浓度时不聚合)的性质，整体生物活力为正常胰岛素的80％，而且利用酵母等表达系统分泌表达单体胰岛素前体时，可通过酶切得B27K-DtrI，从而省却传统工艺中的酶促转肽步骤，从而提高终产率，特别适合于工业化生产。
如本文所用，术语“DOI”指B链羧端去八肽胰岛素。
如本文所用，术语“B27K-DtrI”指B链27位氨基酸为赖氨酸的B链羧端去三肽胰岛素。其基本结构如下：
FVNQH  LCGSH  LVEAL  YLVCG  ERX23X24X25X26Y27(SEQID NO：1)
其中，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；Y27是Lys，或Arg。研究已表明，胰岛素B链只要具有前25个氨基酸(从第23位起的氨基酸可以任意变化)就可具有一定活性。在本发明中，第23-26位的氨基酸可以是任意氨基酸，较佳地是除了Lys，Arg和Cys之外的任何氨基酸，尤其是L型氨基酸。
如本文所用，“本发明的多肽”指B27K-DtrI、含B27K-DtrI的胰岛素、及相应的单体胰岛素表达前体(MIP)。
本发明的多肽可以是重组多肽或合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明的B27K-DtrI核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。首先可用人工合成的方法来合成有关序列，因为胰岛素的长度较短。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明中，B27K-DtrI多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含B27K-DtrI编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS细胞等动物细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在一优选例中，本发明的B27K-DtrI是先以单体胰岛素表达前体形式表达，然后在经酶切处理得到B27K-DtrI。从氨基端至羧基端，单体胰岛素表达前体分别含有本发明的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链。连接肽没有特别限制，只要起连接作用，并且在与A链相连的氨基酸残基为Lys或Arg即可。一类连接肽例子是(Ala)2-5Lys，例如Ala-Ala-Lys。
酶切处理可以用任何切割Lys和/或Arg的酶，例如胰蛋白酶。酶切条件可根据选用的酶而变化。一种优选的酶切条件是：溶剂：0.02-0.05M Tris缓冲液，pH：7-8，底物浓度，约5mg/ml，胰蛋白酶用量，约为底物质量1/50，4-25℃，1-6小时。
MIP酶切后，用分子筛层析等方法分离酶切产物，即可获得本发明的B27K-DtrI。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明B27K-DtrI多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明药物组合物可用于治疗糖尿病及其并发症。使用药物组合物时，是将安全有效量的B27K-DtrI蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的单体胰岛素不仅可以单独使用，还可以与其他治疗糖尿病的药物(如其他胰岛素)一起使用。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的胰岛素具有强的单体性质。
(2)本发明的单体胰岛素可以由表达的单体胰岛素前体经过一步酶切得到，无需酶促转肽或体外复性处理。
(3)含有该结构的胰岛素的药物组合物用于注射以外的给药途径，有很高的生物利用度。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 DOI的制备
613毫克脱锌胰岛素溶解在127毫升(5毫克/毫升)0.05mol/L硼砂溶液中(含0.001M OCaCl2)，调pH＝8.9。加入24.5毫克结晶胰蛋白酶(酶与底物的质量比为1∶25)，在37℃水浴中搅拌反应3小时，经DEAE-Sephadex A25离子交换柱纯化，收集主峰(图1)对水透析后冻干，后经Sephadex G25脱盐，得到DOI。
实施例2 GFFYK(Boc)Obut的制备
2.1 Boc-Phe-Osu的制备
取3.18g Boc-Phe(12mmol)和等摩尔量的HOsu溶于15ml THF中，置于反应瓶-5℃盐冰浴10分钟；另取等摩尔量的DCCI溶于2ml THF，缓慢滴加入反应瓶中，同时-5℃电磁搅拌；加液完成后，继续-5℃搅拌2小时，有白色的DCU沉淀出现。反应瓶密封置于4℃过夜，三层滤纸过滤，滤液经旋转蒸发后呈白色固体。固体加入15ml异丙醇并加热到90℃，呈黄色溶液，室温静置重结晶。白色结晶经抽滤、洗涤、干燥后得2.5g产物，熔点为138-140℃，薄层层析显示均一，硅胶板，层析展开相为3/7系统；产率为53％。
2.2(TFA)Phe-Tyr-OC2H5的制备
取5.97g(16.5mmol)Boc-Phe-Osu置250ml圆底瓶，加干燥乙酸乙酯至80ml溶解，加入等摩尔量的HCl-Tyr-OC2H5，室温电磁搅拌，加入约等摩尔量的N-甲基吗啡啉使得反应体系的pH值为8，室温搅拌过夜。次日，分别用10％柠檬酸、1％碳酸钾、饱和氯化钠溶液萃取洗涤反应液三次，再用无水硫酸钠干燥反应液2小时，旋转蒸发反应液至粘稠状，滴加石油醚至微浑，室温静置重结晶。白色结晶经抽滤、洗涤、干燥后得6.1g产物，熔点为126-128℃，Boc-Phe-Tyr-OC2H5薄层层析显示均一(3/7系统)，产率为81％。结晶溶于100ml无水的50％ TFA/DCM中，室温下搅拌35分钟后，旋转蒸发，用DCM反复洗涤成粘稠油状，真空干燥，产物对茚三酮显色为紫色。
2.3(TFA)Phe-Phe-Tyr-OC2H5的制备
取13mmol(TFA)Phe-Tyr-OC2H5溶于20ml干燥THF中，盐冰预冷，缓慢滴加N-甲基吗啡啉5.4ml，调pH值为7；另取等摩尔量的Boc-Phe-oSU溶于35ml干燥THF中，滴加到反应瓶中，补加适量N-甲基吗啡啉维持反应液为中性，室温电磁搅拌过夜。次日，抽干反应液中的THF，再用乙酸乙酯溶解，经10％柠檬酸、1％碳酸钾、饱和氯化钠溶液萃取洗涤反应液三次，用无水硫酸钠干燥反应液2小时，旋转蒸发至极小体积，加大量的乙醚室温静置后有结晶析出，干燥得2g产物，略黄，熔点为106-108℃的Boc-Phe-Phe-Tyr-OC2H5，薄层层析显示均一(3/7系统)，产率为30％。将产物全部溶于25ml DCM，冰浴滴加25ml TFA，室温电磁搅拌30分钟后旋转蒸发至干，DCM反复洗涤5次以上后即为(TFA)Phe-Phe-Tyr-OC2H5。
2.4 Z-Gly-Osu的制备
取10g(47mmol)Z-Gly和等摩尔量的HOsu溶于100ml干燥的THF中，置于反应瓶-5℃盐冰浴10分钟；另取等摩尔量的DCCI溶于2ml THF，缓慢滴加入反应瓶中，同时-5℃电磁搅拌；加液完成后，继续-5℃搅拌2小时，有白色的DCU沉淀出现。反应瓶密封置于4℃过夜，三层滤纸过滤，滤液经旋转蒸发至少量油状物，加少量DCM溶解，再加入大量的乙醚，研磨瓶壁至有黄色沉淀、溶液变清，清夜倒出，室温静置有白色针状结晶析出，经抽滤、洗涤、干燥后得6.5g产物，熔点为100-102℃，薄层层析显示均一(3/7系统)，产率为46％。
2.5 Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-OC2H5的制备
取3.3mmol(TFA)Phe-Phe-Tyr-OC2H5与5mol Z-Gly-Osu溶于10ml干燥的THF中，加适量的N-甲基吗啡啉调pH值到8，室温下电磁搅拌72小时，旋转蒸发反应液至粉状，再用乙酸乙酯溶解，经10％柠檬酸、1％碳酸钾、饱和氯化钠溶液萃取洗涤反应液三次，再用无水硫酸钠干燥反应液2小时，旋转蒸发至极小体积，加大量的乙醚，溶液由清变浑再转清，室温静置72小时后有灰黄色沉淀，乙醚洗涤后真空干燥得2g产物，熔点为148-151℃，薄层层析显示均一(3/7系统)，产率为87％。
2.6 Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-NHNH2的制备
取Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-OC2H5 2g(2.9mmol)，溶于9ml无水甲醇，加入15mmol的85％的水合肼回流2小时，冷却后有白色晶体析出。10ml无水乙醚、10ml甲醇/无水乙醚(5V/5V)各洗涤一次，水洗至中性，干燥后共得1.29g Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-NHNH2，薄层层析显示均一(3/7系统)，产率为65％。
2.7 Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的制备
取37g亚硝酸钠溶于150ml蒸馏水，置于500ml圆底瓶，加入38g叔丁醇，电磁搅拌，1小时内滴加60ml 35％硫酸，继续搅拌30分钟，同时撤除冰浴，静置15分钟，分液取上层，5％碳酸氢钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥，得30ml亚硝酸叔丁酯，密封于棕色瓶中，4℃保存。另取1.25g(1.9mmol)Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-NHNH2于50ml圆底瓶，加入8ml干的DMF，电吹风稍加热使溶解，加入2ml 2N HCl/THF(4mmol)，圆底瓶置于液氮中，控制温度为-20℃，缓慢滴加0.3ml亚硝酸叔丁酯(2.5mmol，摇动10分钟，加入预冷至-20℃的干燥乙酸乙酯10ml，液氮中冷至-30℃；同时称取(HCl)Lys(Boc)Obut0.65g(1.9mmol)，溶于7ml干燥的DMF中，冷至-30℃，加入247微升三乙胺，然后加入圆底瓶中混合再加入预冷至-20℃的干燥乙酸乙酯10ml，加三乙胺调pH值为8，4℃摇动30分钟，再静置72小时。反应液旋转蒸发至粉状，用乙酸乙酯溶解，经10％柠檬酸、1％碳酸钾、饱和氯化钠溶液萃取洗涤反应液三次，再用无水硫酸钠干燥反应液2小时，经10％柠檬酸、1％碳酸钾、饱和氯化钠溶液萃取洗涤反应液三次，再用无水硫酸钠干燥反应液2小时，旋转蒸发至油状，加入3倍体积乙醚得到白色结晶，结晶抽干后用冷的乙酸乙酯和冷的乙醚洗涤后得到干燥产物1g，熔点为160-162℃，薄层层析正确，产率为56％。
2.8 Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut的制备
取Z-Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut 0.56g溶于90ml无水甲醇中，置于氢化反应瓶中，加少许冰醋酸调pH值至3，再加入0.12g钯碳，通氢气6小时后，将反应液用硅藻土过滤，钯碳用氯仿浸泡后弃置，旋转蒸发滤液至干，干燥后得到块状物，用乙酸乙酯反复洗涤后得到产物，产物对茚三酮显色，薄层层析显示基本均一(图2)，HPLC为单一(图3)，氨基酸分析值与理论值相符：Gly1.2(1.0)；Tyr1.0(1.0)；Phe2.2(2.0)；Lys1(1.0)，产率为93％。
实施例3 B27K-DTrI的制备
取0.237g(0.172mmol)Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut，加入0.26mlDMSO，50℃以下加热至全溶，置于37℃水浴保温；另取DOI 86mg(0.0172mmol)，缓慢加到反应器中使全部溶解，然后加入预热至37℃的1-4丁二醇1.82ml，反应液略浑，再加入预热至37℃的去离子水，反应液变清，加入5微升N-甲基吗啡啉调pH值精确到6.5(以pH计测定)。加入7.8mgTPCK-Trypsin后，将水浴温度缓慢降至30℃，2小时和4小时后分别加入TPCK-Trypsin 4.5g，酶量为DOI量的五分之以一。20小时后反应液呈中度浑浊，加入.1.1ml冰醋酸和少量1N HCl调pH为3终止酶促反应，溶液变清。将反应液直接上样到Sephadex G50(f)柱分离，流动相为30％醋酸，得到76mg粗产物B27K-DTrI(Boc)Obut，除去TPCK-Trypsin和过量的小肽(图5)，产率为80％。再经过C8反相柱纯化得到B27K-DTrI(Boc)Obut(图6)，用冷丙酮干燥后，加入无水TFA(多肽浓度为3mg/ml)，以去除Boc保护基，10℃静置1小时后抽干TFA并用二氯甲烷反复洗涤至白色，溶于0.1％TFA后经过C8反相柱纯化得到B27K-DTrI(图7)。样品尿素PAGE电泳为单一条带(图4)、C18HPLC分析为单一峰(图8)。电喷雾质谱测定为单一分子量5509Da(图9)，理论分子量为5508.3，误差为0.01％，测定了N端14个氨基酸和C端2个氨基酸的序列(表1)，说明样品的电荷和亲疏水性均一，蛋白质序列与设计序列相符(SEQ ID NO：5)。
    表1  B27K-DtrI的N端、C端序列(N端→C端)
   N端：A链： GIVEQCCTSICSLY----(实测)
GIVEQCCTSICSLY----(理论)
   B链： FVNQHLCGSHLVEA----(实测)
FVNQHLCGSHLVEA----(理论)
   C端：A链：- ----------------N(实测)
----------------N(理论)
   B链： ----------------YK(实测)
----------------YK(理论)
实施例4自聚合性质的测定
在中性溶液中较高浓度胰岛素聚合后形成单体、二体六体的混合物，使用分子筛层析：Superdex 75(HR 10/30)柱，流动相为PBS(phosphate-bufferedsaline，pH7.4)，流速为0.4ml/min，上样量为0.1ml，室温，280nm检测。用对称因子Fs描述混合物均一度，用分配系数Kav描述混合物的平均分子量。Fs＝W0.05h/2A，其中W0.05h为在0.05峰高处的峰宽，A为0.05峰高处的前半峰宽；Kav＝(Vr-V0)/(Vc-Vo)，其中Vr为流出体积，V0为外水体积，Vc为总的柱床体积。随着脱锌胰岛素浓度的上升，其在Superdex 75柱上的保留时间缩短、峰的不对称性增强，说明高浓度的胰岛素是不均一的含有大的聚合体的混合物。而B27K-DTrI的出峰时间和峰形不随蛋白质浓度的变化。(图10A和10B，图11A和11B)在同一浓度下比较了脱锌胰岛素、Lyspro、DPI(B链C端去5肽胰岛素，despentapeptide insulin)和B27K-DTrI在Superdex 75柱上的层析行为，B27K-DTrI的Kay值为0.51，Lyspro的Kav值为0.48，这说明B27K-DTrI为单体胰岛素。(图12)
实施例5生物活性测定
5.1鼠惊厥法(中国药典，1985，附录100页)
雄性昆明小鼠，体重为27-30g，按体重随机分四组，每组24只，实验前禁食2小时。样品用盐酸调至pH值为5的生理盐水溶解，10D280nm＝1mg/L。估计样品效价为标准品的80％，高剂量为0.09U/ml，低剂量为0.045U/ml，溶剂为盐酸调节pH为2.5的生理盐水。25℃，15分钟内每只小鼠皮下注射0.3ml，置于37℃观察90分钟，惊厥的、死亡的、使其仰卧后3秒内不能自行翻身者均认为是阳性反应。数据按质反应测定法计算。
5.2小鼠降血糖法(中国药典，2000，附录106页)
雄性昆明小鼠，体重为28-30g，按体重随机分四组，每组10只。估计样品效价为标准品的80％，高剂量为0.07U/ml，低剂量为0.035U/ml，溶剂为盐酸调节pH为2.5的生理盐水。25℃，每只小鼠皮下注射0.25ml，注射40分钟后眼静脉丛取血测定血糖；三小时以后按照双交叉法给每组各鼠第二次给药(标准品低剂量组给测试品高剂量)，40分钟后测定血糖。数据按照量反应测定法计算。
小鼠惊厥法测得活性为21U/mg，可信限率FL％为23.5％(＜30％)(表2)；小鼠降血糖法测得活性为23U/mg，FL％为11.9％(＜25％)(表3)。实验中所用的标准品为中检所提供的27U/mg的胰岛素。两种方法得到的结果吻合，B27K-DTrI的活性为天然胰岛素的80％。
表2  小鼠惊厥法测定B27K-DTrI的生物活性(中国药典，1985版)
样品               剂量(U/ml)           测试的小鼠           惊厥的小鼠
标准胰岛素         0.09                 24                   17
                   0.045                24                   4
B27K-DTrI         0.09                 24                   19
                   0.045                24                   2
表3.小鼠降血糖法测定B27K-DTrI的生物活性(中国药典2000版)
鼠号          第1组          第2组         第3组         第4组
1             69.9           28.9          61.3          31.7
2            68.9            42.4            50.6            35.8
3            64.1            42.4            53.7            51.3
4            64.1            24.5            65.8            48.6
5            65.5            54.4            66.8            39.6
6            62.7            32.4            55.8            47.2
7            64.1            58.6            54.8            25.8
8            68.2            40.3            55.8            40.0
9            61.3            42.4            48.6            40.0
10           52.7            57.9            54.8            40.0
均值         64.1            42.4            55.8            40.0
1            36.9            53.4            37.2            35.8
2            44.1            52.4            39.3            32.7
3            41.3            58.6            33.8            58.2
4            28.9            53.4            44.1            48.2
5            34.1            52.0            39.3            47.2
6            43.4            51.7            40.6            47.2
7            36.9            59.9            40.0            47.2
8            37.9            53.4            40.6            48.9
9            36.9            47.9            39.3            47.5
10           28.9            50.6            39.3            59.6
均值         36.9            53.3            39.3            47.3
实施例6  基因工程表达B27K-DTrI
在本实施例中，将B27K-DTrI的B链C端用连接肽(如Ala-Ala-Lys)与其A链N端相连构成表达前体(MIP，monomeric insulin precusor)，因为MIP的结构有利于胰岛素在生物合成后折叠并形成正确的二硫键。步骤如下：
化学合成得到MIP基因(SEQ ID NO：3)，在MIP基因5’端加上信号肽序列(α-MFL，α-mating factor leader)，利用BamH1和EcoR1酶切位点克隆到pPIC9K质粒中得到pPIC9K/MIP。pPIC9K/MIP经BglII线性化处理后转化到甲醇酵母P.pastoris中，用点杂交法筛选高拷贝菌株。
通过高密度发酵，得到发酵产物。发酵产物经疏水层析得到MIP，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
MIP经胰蛋白酶酶切(溶剂：0.03M Tris缓冲液，pH：7.5，20℃，2小时)处理后，经分子筛层析得到高纯度的B27K-DTrI(结构如图13所示)。
讨论
同样的技术路线也可用于其它的酵母表达系统或分泌型大肠杆菌表达系统来表达B27K-DTrI。该技术路线与中国专利申请98110912.8中所公开DTI的制备方法相比，可以避免化学合成小肽GFFY(But)Obut，酶促转肽，HPLC分离等烦琐的工艺，可以大幅度提高产率，更适合于工业生产。两种工艺的比较见图14。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                                    序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所<120>新的单体胰岛素，药物组合物及其制法<130>023970<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><221>MISC_FEATURE<222>(23)..(26)<223>Xaa＝Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val，或不存在<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa＝Lys或Arg<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(27)<223>胰岛素B链<400>lPhe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        20                  25<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(21)<223>胰岛素A链<400>2Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1               5                   10                  15Glu Asn Tyr Cys Asn
        20<210>3<211>153<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(153)<223><400>3ttc gtt aac caa cac ttg tgc ggt tcc cac ttg gtt gag gct ttg tac       48Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15ttg gtt tgc ggt gaa aga ggt ttc ttc tac aag gct gct aag ggt att       96Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile
        20                  25                  30gtc gaa caa tgc tgt acc tcc atc tgc tcc ttg tac caa ttg gaa aac      144Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
    35                  40                  45tac tgc aac                                                          153Tyr Cys Asn
50<210>4<211>51<212>PRT<213>人工序列<400>4Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile
        20                  25                  30Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
    35                  40                  45Tyr Cys Asn
50<210>5<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(27)<223>一种胰岛素B链B27K-DTrI<400>5Phe Val Ash Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys
        20                  25

Claims (12)

1.一种胰岛素B链，其特征在于，具有以下氨基酸序列：
FVNQH  LCGSH  LVEAL  YLVCG  ERX23X24X25X26Y27
其中，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；
Y27是Lys，或Arg。
2.如权利要求1所述的胰岛素B链，其特征在于，Y27是Lys。
3.如权利要求1所述的胰岛素B链，其特征在于，X23X24X25X26是GFFY。
4.一种胰岛素，其特征在于，它具有权利要求1所述的B链。
5.如权利要求4所述的胰岛素，其特征在于，它是单体胰岛素。
6.如权利要求4所述的胰岛素，其特征在于，其结构如下：
其中，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；
Y27是Lys，或Arg。
7.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求4所述的胰岛素和药学上可接受的载体。
8.一种单体胰岛素表达前体，其特征在于，从氨基端至羧基端分别含有权利要求1所述的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链。
9.一种分离的DNA，其特征在于，它编码权利要求1所述胰岛素B链、或权利要求8所述的单体胰岛素表达前体。
10.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求9所述的DNA。
11.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求10所述的表达载体或含有权利要求9所述的DNA。
12.一种制备胰岛素的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码单体胰岛素表达前体的DNA，从而表达出所述的单体胰岛素表达前体；
所述的前体从氨基端至羧基端分别含有胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链，其中胰岛素B链具有以下氨基酸序列：
FVNQH  LCGSH  LVEAL  YLVCG  ERX23X24X25X26Y27
式中，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；Y是Lys，或Arg；
且连接肽为Ala-Ala-Lys；
(b)分离出所述的单体胰岛素表达前体；
(c)用胰蛋白酶酶切割所述的单体胰岛素表达前体；
(d)分离出单体胰岛素。
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