CN102864198A

CN102864198A - 一种重组人胰岛素原转肽方法及其在重组人胰岛素下游纯化中的应用

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Publication number: CN102864198A
Application number: CN2011101869449A
Authority: CN
Inventors: 郭颀然; 许必雄
Original assignee: SHANGHAI TYRONE BIOMEDICINE TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: SHANGHAI TYRONE BIOMEDICINE TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-07-05
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2031-07-05
Also published as: CN102864198B

Abstract

本发明提供了一种重组人胰岛素原转肽方法及其在重组人胰岛素下游纯化中的应用，本发明的重组人胰岛素原转肽方法为将纯化的重组人胰岛素原经转肽反应生成重组人胰岛素，其中，转肽反应的反应体系包括：重组人胰岛素原10-30g/L、二甲基亚砜（DMSO）100-200ml/L、叔丁醚苏氨酸叔丁酯63-103g/L、1,4-丁二醇600-800ml/L、胰蛋白酶2-6g/L、Ca²⁺0.2-100mmol/l、Mg²⁺0.2-100mmol/l和水,pH为6.5-7.0；转肽反应的反应条件为：温度27-47℃，搅拌反应2-10小时。本发明的重组人胰岛素原转肽方法可用于重组人胰岛素的下游纯化。本发明的转肽方法不仅缩短了转肽反应的时间、提高了生产效率，还能减少副产物的产生。

Description

一种重组人胰岛素原转肽方法及其在重组人胰岛素下游纯化中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及重组人胰岛素下游纯化，更具体的，本发明涉及重组人胰岛素原转肽方法及其在重组人胰岛素下游纯化中的应用。

背景技术

糖尿病是仅次于肿瘤和心血管疾病的世界第三大致死疾病，现今世界上已经有超过2亿人的糖尿病患者，胰岛素是治疗糖尿病的特效药，尤其是治疗I型糖尿病和II型糖尿病晚期患者时还没有其他的药物能够代替。胰岛素在临床应用上已经有80多年的历史，随着生物技术的发展，重组人胰岛素已经逐渐取代了动物胰岛素。能够在重组人胰岛素生产中提高生产效率，提高产品质量也就有了现实的意义。分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环，在重组人胰岛素的基因工程生产中同样面临着下游纯化工艺处理复杂的问题，目前基因重组人胰岛素的生产通常有两种，一种是通过大肠杆菌表达胰岛素原包含体，纯化经过胰岛素原纯化，复性，酶切转化，HPLC纯化来得到最后的天然人胰岛素。另外一种方式是通过酵母分泌表达胰岛素原，纯化过程首先是胰岛素原纯化，纯化后利用胰蛋白酶转肽，转肽后去保护利用RP-HPLC纯化得到最终的天然胰岛素。胰岛素原转换成天然的胰岛素，也就是转肽过程已经有很多报导，例如Chandrasekhar Gurramkonda等在文章中报导利用胰蛋白酶，叔丁醚苏氨酸叔丁酯，和氯化钙进行转肽，12度24小时反应，转肽率接近90％(Gurramkonda et al.Application of simple fed-batch technique to high-levelsecretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequentpurification and conversion to human insulin Microbial Cell Factories 2010，9：31)。但由于转肽反应比较复杂，时间比较长，通常转肽过程会带来一些难以去除的副产物，主要副产物是转肽过程中酶切下来的Thr(B30)(胰岛素B链上的第30个氨基酸苏氨酸)，这样就会增加胰岛素纯化的难度。现有的重组人胰岛素在分离纯化过程中转肽反应时间长，副产物多。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中重组人胰岛素在分离纯化过程中转肽反应时间长，副产物多的缺陷，提供一种转肽反应时间短，转肽率高，副产物少的重组人胰岛素下游纯化方法。

本发明一方面提供了一种重组人胰岛素原转肽方法，为将纯化的重组人胰岛素原经转肽反应生成重组人胰岛素，其中，所述转肽反应的反应体系包括：重组人胰岛素原10-30g/L，二甲基亚砜(DMSO)100-200ml/L、叔丁醚苏氨酸叔丁酯63-103g/L、1，4-丁二醇600-800ml/L、胰蛋白酶2-6g/L、Ca²⁺0.2-100mmol/l优选2-10mmol/l、Mg²⁺0.2-100mmol/l优选2-10mmol/l和水，pH为6.5-7.0；所述转肽反应的反应条件为：温度27-47℃，最适温度为37℃，搅拌反应2-10小时，较佳为2-5小时。

本发明的关键在于转肽条件的优化，发明人意外地发现，2价金属离子镁离子与钙离子的复合作用能够提高了胰蛋白酶的酶切反应速度和专一性，大大缩短转肽时间，转肽时间缩短到2个小时以内，转肽的副产物(主要为Thr(B30))的相对减少，这样可以提高重组人胰岛素生产的效率和胰岛素的质量。

在本发明所述转肽反应的反应体系中，所述的水为超纯水。

超纯水是指将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水，电阻率大于18MΩ*cm，或接近18.3MΩ*cm极限值。

在本发明所述转肽反应的反应体系中，Ca²⁺和Mg²⁺可来源于钙或镁的无机盐(如氯化钙、氯化镁、硫酸镁、硫酸钙)。

本发明的转肽方法可应用于酵母发酵生产重组人胰岛素的下游纯化。

本发明还进一步提供了一种重组人胰岛素的下游纯化方法，包括下列步骤：

1)从发酵产物中分离纯化重组人胰岛素原；

2)利用前述转肽方法将纯化的重组人胰岛素原经转肽反应获得转肽产物；

3)转肽产物经脱脂反应去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后纯化得到胰岛素成品；

本发明的步骤1)及步骤3)均可利用现有技术完成。

步骤1)中，所述发酵产物为分泌表达重组人胰岛素原的酵母工程菌的发酵产物，如分泌表达胰岛素原的毕赤酵母的发酵产物。分泌表达重组人胰岛素原的酵母工程菌的构建及其发酵均为现有技术。

较佳的，步骤1)从发酵产物中分离纯化重组人胰岛素原的方法包括下列步骤：

A.将发酵产物离心收集上清；

B.阳离子交换层析纯化重组人胰岛素原；

C.将经步骤B纯化的产物经葡聚糖凝胶层析脱盐获得纯化的重组人胰岛素原。

进一步的，阳离子交换层析采用SP阳离子交换层析柱；葡聚糖凝胶层析采用G25凝胶层析柱。

较佳的，步骤3)所述转肽产物脱脂反应去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后纯化得到胰岛素成品包括下列步骤：

I、转肽产物用反相柱层析纯化；

II、将步骤I获得的纯化产物冻干后采用三氟乙酸(TFA)与转肽产物反应脱脂去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团；

III、脱脂产物冻干后，再经反相柱层析纯化得到胰岛素成品。

所述反相柱层析可采用C18反相制备柱进行HPLC纯化。

所述胰岛素成品具有天然胰岛素的结构和功能。

进一步的，纯化后的胰岛素成品还可进一步冻干以获得胰岛素冻干粉。

现有的重组人胰岛素生产技术在转肽过程中时间一般较长，文献报道中未发现有低于8个小时的转肽反应，而且一般的转肽反应都未考虑过副产物Thr(B30)的产生，而该副产物在一般的纯化过程难以除去，与天然的胰岛素不同，对人体用药可能会有未知的影响。本发明的纯化方法，通过转肽过程中加入二价金属离子钙和镁复合作用不仅缩短了转肽反应的时间，从10小时缩短到2小时，提高了生产效率，而且还能减少副产物Thr(B30)的产生，解决了现有重组人胰岛素生产中转肽反应时间长，副产物多的缺点。

附图说明

图1本发明纯化重组人胰岛素的工艺流程图

图2实施例1转肽前HPLC监测图谱

图3实施例1转肽2小时后HPLC监测图谱

图4实施例1没有添加钙、镁离子的转肽分析图谱

图5实施例1F3峰液相检测结果

图6实施例1脱酯反应检测图谱

具体实施方式

以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。

本发明实施例采用的胰岛素纯化工艺主要物料来源出自毕赤酵母分泌表达胰岛素原，对胰岛素原纯化后优化了转肽反应，转肽过程中添加了二价金属离子镁离子与钙离子共同作用提高了胰蛋白酶的酶切反应速度和专一性，转肽时间大大缩短，减少了副产物产生，之后继续利用RP-HPLC纯化天然胰岛素，得到合格的胰岛素产品。

实施例纯化重组人胰岛素的工艺流程图如图1所示。

实施例1重组人胰岛素的纯化

工艺步骤：

A，SP阳离子交换层析纯化毕赤酵母表达的胰岛素原

重组人胰岛素原酵母发酵液4升(参考Kjeldsen T，Pettersson AF，Hach M：Secretoryexpression and characterization of insulin in Pichia pastoris.Biotechnol Appl Biochem 1999，29：79-86记载的方法制备获得)，7000RPM离心后收集上清液。SP Sepharose FF(GE公司购买)装柱XK50/30层析柱200毫升，首先SP柱经过25mmol醋酸-醋酸纳PH3.5缓冲液平衡5个柱体积，平衡后调节离心上清液PH至3.5上样，上样结束后，利用平衡液清洗柱子到基线，大概3个柱体积。洗脱采用pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液且添加1M氯化纳洗脱，收集洗脱峰大约150毫升即为胰岛素原，准备下一步脱盐。

B，G25脱盐层析

G25凝胶(GE公司)50ml装填26×10柱，先用去离子水洗涤5倍柱体积，后用1.0M NaOH洗涤两个柱体积，再用去离子水洗涤5倍柱体积，最后用0.1M碳酸氢铵溶液(pH8.0)平衡5个柱体积。SP洗脱液上样G25脱盐柱，上样量10毫升，多次上样收集洗脱峰。

C，转肽反应：

称取脱盐后的胰岛素原200mg，依次加入1.5ml二甲基亚砜(DMSO)、叔丁醚苏氨酸叔丁酯0.83g、1，4-丁二醇7ml、胰蛋白酶40mg，2.2mg无水氯化钙(2mmol/l)和1.9mg无水氯化镁(2mmol/l)调节pH6.5-7.0，用超纯水定容至10ml，在小烧杯中利用搅拌子低速搅拌，37度下反应2h，反应结束后8000rpm，离心5min。

转肽产物经过HPLC分析发现2小时后转肽基本完成，转肽率超过90％。

转肽分析的条件和结果如下

分析型HPLC监测转肽反应：

A相：0.15％TFA+超纯水。超声脱气20min。

B相：0.125％TFA+60％乙腈+超纯水。超声脱气20min。

上样量皆为10μl，检测波长为280nm，柱温30℃。

time(min)	0	1	5	35	36	39	40
								％B相	0	0	40	80	100	100	0

(1)转肽前如图2所示(胰岛素原)

(2)2小时转肽后如图3所示

从图中可以看出，转肽在2小时后基本完成，将此峰收集下来做质谱分析，得到的分子量为5919.4Da，而转肽成功的胰岛素酯的理论分子量为5919.97Da，说明转肽成功，大约有90％的转肽率。而没有添加2价钙离子和2价镁离子的转肽反应，转肽时间一般要超过10个小时，而且转肽率不是很高，副产物比例较大，如图4为没有添加钙，镁离子的转肽分析图谱，转肽时间10小时。我们也做了在其余条件一致的情况下单独添加钙离子和镁离子的实验，单独添加了2价钙镁离子会提高胰酶活性，增快转肽反应速度，但是也会增加转肽副产物的比率。下表说明了胰岛素原在转肽反应中的副产物产生比率，证明了钙镁离子复合作用对于减少副产物(主要是Thr(B30))是有效的。

2价金属离子对胰岛素原转肽反应的影响

金属离子	浓度(mmol/l)	Thr(B30)％胰岛素原
			不添加	-	4％
Ca²⁺	2	7％
			Mg²⁺	2	5％
Ca²⁺+Mg²⁺	2+2	0.8％

*副产物的含量检测方法：Thr(B30)是采用HPLC检测氨基酸含量的方法检测的Thr(B30)％胰岛素原：每100g胰岛素原中Thr(B30)的重量

D，HPLC制备：

转肽反应后，对该转肽反应通过制备型高压液相利用C18(Kromasil100-10-C18，250mm*10mm)反相柱进行半制备纯化。

HPLC条件如下：

A相：0.15％TFA(三氟乙酸)+超纯水。B相：0.125％TFA+乙腈。超声脱气30min。

流速控制3.0ml/min(压力一般为6-7MPa)，柱子用15％的B平衡，

转肽反应上清液直接上柱，上样量约6ml，压力达1800psi，上样完毕后用15％B平衡，然后以15-60％B/40min梯度洗脱，收集目的主峰F3，收集后冻干。F3峰液相检测结果如图5所示，纯度达98％以上。

E，脱酯反应：

去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后才能得到与天然胰岛素结构一致的胰岛素。

按10mg∶1mlTFA比例加入。反相目的收集液冻干后约25mg，取20mg加入2mlTFA，22℃反应45min后，冻干。

脱酯反应检测：通过收集转肽反应HPLC检测的目的峰，用HPLC检测，检测条件同转肽反应，图谱如图6。从图可以看出，原来胰岛素酯的峰几乎没有，出现了一个新峰，将这个峰收集下来做质谱检测，得到的分子量为5807.6Da，而天然人胰岛素的分子量为5807.69Da，说明保护基已成功去除，得到了与天然胰岛素结构一致的胰岛素。

F，第二次反相层析得到最终成品：

脱脂冻干品用15％乙腈溶解后，再次反相层析，条件同前。收集目的蛋白，冻干。

通过半制备柱得到的完整胰岛素质谱检测分子量同样为5807.6Da。

经HPLC检测纯度在98％以上，质谱和小分子量电泳检测，分子量与理论值相一致。ELISA活性检测比活较高，约为102IU/mg，与Sigma通过酵母生产的标品相一致。

实施例2重组人胰岛素的纯化

工艺步骤：

A，SP阳离子交换层析纯化毕赤酵母表达的胰岛素原

B，G25脱盐层析

C，转肽反应：

称取脱盐后的胰岛素原100mg，依次加入2.0ml二甲基亚砜(DMSO)、叔丁醚苏氨酸叔丁酯0.63g、1，4-丁二醇6ml、胰蛋白酶30mg，0.22mg无水氯化钙(0.2mmol/l)和5.7mg无水氯化镁(6mmol/l)调节pH6.5-7.0，用超纯水定容至10ml，在小烧杯中利用搅拌子低速搅拌，27度下反应5h，反应结束后8000rpm，离心5min。

转肽产物经过HPLC分析发现5小时后转肽基本完成，转肽率超过90％，Thr(B30)％胰岛素原为11％(转肽分析及副产物检测方法同实施例1)

D，HPLC制备：

HPLC条件如下：

流速控制3.0ml/min(压力一般为6-7MPa)，柱子用15％的B平衡，

转肽反应上清液直接上柱，上样量约6ml，压力达1800psi，上样完毕后用15％B平衡，然后以15-60％B/40min梯度洗脱，收集目的主峰F3，收集后冻干。F3峰液相检测纯度达98％以上。

E，脱酯反应：

按10mg：1mlTFA比例加入。反相目的收集液冻干后约25mg，取20mg加入2mlTFA，22℃反应45min后，冻干。

脱酯反应检测同实施例1，从检测结果判断，保护基已成功去除，得到了与天然胰岛素结构一致的胰岛素。

F，第二次反相层析得到最终成品：

经HPLC检测纯度在98％以上，质谱和小分子量电泳检测，分子量与理论值相一致。ELISA活性检测比活较高，约为98IU/mg，与Sigma通过酵母生产的标品相一致。

实施例3重组人胰岛素的纯化

工艺步骤：

A，SP阳离子交换层析纯化毕赤酵母表达的胰岛素原

B，G25脱盐层析

C，转肽反应：

称取脱盐后的胰岛素原300mg，依次加入1.0ml二甲基亚砜(DMSO)、叔丁醚苏氨酸叔丁酯1.03g、1，4-丁二醇8ml、胰蛋白酶20mg，110mg无水氯化钙(100mmol/l)和0.19mg无水氯化镁(0.2mmol/l)调节pH6.5-7.0，用超纯水定容至10ml，在小烧杯中利用搅拌子低速搅拌，47度下反应8h，反应结束后8000rpm，离心5min。

转肽产物经过HPLC分析发现8小时后转肽基本完成，转肽率超过90％，Thr(B30)％胰岛素原为2.3％(转肽分析及副产物检测方法同实施例1)

D，HPLC制备：

HPLC条件如下：

流速控制3.0ml/min(压力一般为6-7MPa)，柱子用15％的B平衡，

转肽反应上清液直接上柱，上样量约6ml，压力达1800psi，上样完毕后用15B平衡，然后以15-60％B/40min梯度洗脱，收集目的主峰F3，收集后冻干。F3峰液相检测纯度达98％以上。

E，脱酯反应：

F，第二次反相层析得到最终成品：

经HPLC检测纯度在98％以上，质谱和小分子量电泳检测，分子量与理论值相一致。

ELISA活性检测比活较高，约为95IU/mg，与Sigma通过酵母生产的标品相一致。

实施例4重组人胰岛素的纯化

工艺步骤：

A，SP阳离子交换层析纯化毕赤酵母表达的胰岛素原

B，G25脱盐层析

C，转肽反应：

称取脱盐后的胰岛素原250mg，依次加入1.5ml二甲基亚砜(DMSO)、叔丁醚苏氨酸叔丁酯1.03g、1，4-丁二醇6ml、胰蛋白酶60mg，11mg无水氯化钙(10mmol/l)和95mg无水氯化镁(100mmol/l)调节pH6.5-7.0，用超纯水定容至10ml，在小烧杯中利用搅拌子低速搅拌，37度下反应2h，反应结束后8000rpm，离心5min。

转肽产物经过HPLC分析发现2小时后转肽基本完成，转肽率超过90％，Thr(B30)％胰岛素原为1.5％(转肽分析及副产物检测方法同实施例1)

D，HPLC制备：

HPLC条件如下：

流速控制3.0ml/min(压力一般为6-7MPa)，柱子用15％的B平衡，

E，脱酯反应：

F，第二次反相层析得到最终成品：

经HPLC检测纯度在98％以上，质谱和小分子量电泳检测，分子量与理论值相一致。ELISA活性检测比活较高，约为100IU/mg，与Sigma通过酵母生产的标品相一致。

Claims

1.一种重组人胰岛素原转肽方法，为将纯化的重组人胰岛素原经转肽反应生成重组人胰岛素，其特征在于，所述转肽反应的反应体系包括：重组人胰岛素原10-30g/L、二甲基亚砜(DMSO)100-200ml/L、叔丁醚苏氨酸叔丁酯63-103g/L、1，4-丁二醇600-800ml/L、胰蛋白酶2-6g/L、Ca²⁺0.2-100mmol/l、Mg²⁺0.2-100mmol/l和水，pH为6.5-7.0；所述转肽反应的反应条件为：温度27-47℃，搅拌反应2-10小时。

2.如权利要求1所述重组人胰岛素原转肽方法，其特征在于，所述转肽反应的反应体系中，Ca²⁺为2-10mmol/l、Mg²⁺为2-10mmol/l。

3.如权利要求1所述重组人胰岛素原转肽方法，其特征在于，所述转肽反应的温度为37℃。

4.如权利要求1所述重组人胰岛素原转肽方法，其特征在于，所述转肽反应的时间为2-5小时。

5.如权利要求1所述重组人胰岛素原转肽方法，其特征在于，所述Ca2+来源于氯化钙或硫酸钙，所述Mg2+来源于氯化镁或硫酸镁。

6.如权利要求1-5任一权利要求所述重组人胰岛素原转肽方法的用途，为将所述转肽方法应用于酵母发酵生产的重组人胰岛素的下游纯化。

7.一种重组人胰岛素的下游纯化方法，包括下列步骤：

1)从分泌表达重组人胰岛素原的酵母发酵产物中分离纯化重组人胰岛素原；

2)利用权利要求1-5任一权利要求所述重组人胰岛素原转肽方法将纯化的重组人胰岛素原经转肽反应获得转肽产物；

8.如权利要求7所述重组人胰岛素的下游纯化方法，其特征在于，步骤1)从发酵产物中分离纯化重组人胰岛素原的方法包括下列步骤：

A.将发酵产物离心收集上清；

B.阳离子交换层析纯化重组人胰岛素原；

C.将经步骤B纯化的产物经葡聚糖凝胶层析脱盐获得纯化的重组人胰岛素原；

9.如权利要求7所述重组人胰岛素的下游纯化方法，其特征在于，步骤3)所述转肽产物脱脂反应去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后纯化得到胰岛素成品包括下列步骤：

I、转肽产物用反相柱层析纯化；

10.如权利要求7所述重组人胰岛素的下游纯化方法，其特征在于，将步骤3)获得的胰岛素成品经冻干获得胰岛素冻干粉。