CN103290083B

CN103290083B - 一种人胰岛素酯的制备方法

Info

Publication number: CN103290083B
Application number: CN201310279350.1A
Authority: CN
Inventors: 曹春来; 谭叶林; 肖拥军
Original assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-07-04
Filing date: 2013-07-04
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2033-07-04
Also published as: CN103290083A

Abstract

本发明公开了一种人胰岛素酯的制备方法。本发明对含有desB₃₀人胰岛素的溶液，离心或抽滤得到desB₃₀人胰岛素含水粉末；使用desB₃₀人胰岛素含水粉末进行转肽反应，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在转肽反应体系中的终浓度为13mM～33mM，desB₃₀人胰岛素与苏氨酸酯或其衍生物的摩尔比为1：15～150，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比为10～120：1。本发明克服现有胰岛素转肽反应中胰岛素浓度较低的缺陷，将转肽反应中胰岛素的浓度到13mM～33mM，提高了单位反应的效率，转肽的效率最高可以达到91.80%，节约成本，适合工业化大规模生产。

Description

一种人胰岛素酯的制备方法

技术领域

本发明属于人胰岛素制备工艺领域，特别涉及一种人胰岛素酯的制备方法。

背景技术

随着人口老龄化、饮食失调、运动减少和肥胖人数的持续增多，无论在发达国家或是发展中国家，糖尿病的发病率将越来越高。目前全球有超过3.6亿糖尿病病人，糖尿病已成为继癌症和心血管疾病之后的第三大死亡原因。同时糖尿病是一个沉默的杀手，糖尿病慢性并发症现已成为造成糖尿病人致残或过早死亡的主要原因，其早期很多症状易被忽略，而晚期的并发症又带给人很多痛苦。

目前我国糖尿病的患者数量已经接近一亿人。目前临床应用中，胰岛素是降低体内血糖最有效的药物，一型糖尿病患者和严重的二型糖尿病患者都必须注射胰岛素，补充胰岛素以控制血糖的水平，提高患者的生活质量的同时降低糖尿病并发症的发生。我国胰岛素的市场95%的由国外厂商垄断，价格比较昂贵，严重影响到我国糖尿病用药的安全；同时由于国外公司把持我国胰岛素市场，导致胰岛素在我国糖尿病患者的使用率较低。为了打破国外厂商对于我国胰岛素市场的垄断，提高国产重组人胰岛素的竞争优势，势必需要对现有的重组人胰岛素生产工艺进行革新，以降低生产成本。

重组人胰岛素的目前有两种生产工艺，一种采用大肠杆菌的表达系统，表达的产物在菌体中以包涵体的形式存在，在后期的工艺中进行复性，酶切后得到重组人胰岛素，该工艺的难点在于包涵体的复性难度较大，而且蛋白浓度不能太高，因而工业放大较困难；第二种采用酵母的表达系统，目前通用的是酿酒酵母和毕赤酵母表达系统，是将外源基因整合到酵母基因组中，表达产物可以分泌到发酵的上清中，而且容易实现高密度发酵。但是采用酵母的表达系统的难点是表达的分子中不含有B链30位的Thr，因而需要后期的转肽反应，人工将苏氨酸连接到B链29位Lys的C端。转肽反应体系中需要大量的胰蛋白酶和苏氨酸酯，这两个物质的成本较高。如果我们在现有的反应体系中，提高反应中的胰岛素的浓度，可以增加单位反应的产量，减少胰蛋白酶和苏氨酸酯的用量，同时可以减少设备投入。

发明内容

为克服上述的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种人胰岛素酯的制备方法。本发明克服现有胰岛素转肽反应中胰岛素浓度较低的缺陷。通过工艺的调整，成功实现高浓度胰岛素13mM～33mM的转肽反应，同时反应还保持较高的转化收率。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人胰岛素酯的制备方法，包括以下步骤：

（1）从含有desB₃₀人胰岛素的溶液，离心或抽滤得到desB₃₀人胰岛素含水粉末；

（2）使用desB₃₀人胰岛素含水粉末进行转肽反应，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在转肽反应体系中的终浓度为13mM～33mM；

步骤（1）中所述的desB₃₀人胰岛素是指去除B链30位苏氨酸的人胰岛素；

步骤（1）中所述的含有desB₃₀人胰岛素的溶液可以来自真核细胞（如酿酒酵母或毕赤酵母）表达的人胰岛素原，经过胰蛋白酶酶切反应去除C肽和胰岛素B链30位氨基酸的反应溶液；或是来自原核细胞（大肠杆菌）表达的包涵体，复性后得到的人胰岛素原，经过胰蛋白酶酶切反应去除C肽和胰岛素B链30位氨基酸的反应溶液；或是以直接用desB₃₀人胰岛素的粉末直接溶于水溶液中得到的溶液；

步骤（1）中所述的离心或抽滤之前，先对含有desB₃₀人胰岛素的溶液进行沉淀；

所述的对含有desB₃₀人胰岛素的溶液进行沉淀的方式优选为调节pH值之后静置沉淀，或是先加入Zn²⁺，再调节pH值，之后静置沉淀；

所述的pH值为5.6～6，更优选为5.8；

所述的调节pH值的试剂可以为磷酸、醋酸和氨水中的一种或至少两种；

所述的Zn²⁺可由氯化锌或硫酸锌提供；

所述的Zn²⁺的用量按desB₃₀人胰岛素与Zn²⁺的摩尔比为1：0.5～1.5进行计算添加；

所述的静置的温度优选为4～8℃；

步骤（1）中所述的抽滤使用的滤膜优选为300目；

步骤（2）中所述的转肽反应优选包括如下步骤：用二甲基亚砜溶解苏氨酸或其衍生物，以及desB₃₀人胰岛素含水粉末，再加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液或是只加入胰蛋白酶水溶液，获得转肽的反应体系；然后温和搅拌进行反应；desB₃₀人胰岛素与苏氨酸酯或其衍生物的摩尔比为1：15～150，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比为10～120：1；

所述的苏氨酸酯优选为o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯；

所述的衍生物指的是o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐类衍生物，如o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐酸盐；

所述的反应体系中溶剂的比例优选为二甲基亚砜：1,4-丁二醇：水按体积比15%～50%：0～65%：20%～50%；其中水的含量中包含了desB₃₀人胰岛素含水粉末中包含的水分，通过水分测定仪或者干燥失重的方式测定；

所述的搅拌反应的时间优选为1～8小时，温度优选为25±1℃。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明克服现有胰岛素转肽反应中胰岛素浓度较低的缺陷，将转肽反应中胰岛素的浓度提高到13mM～33mM。将提高制备生产过程中的设备的使用效率，间接节约成本。

（2）本发明转肽的效率最高可以达到91.80%。

（3）达到相同的转肽效率，转肽过程中胰蛋白酶和苏氨酸的使用量均有较大幅度的降低。

附图说明

图1是desB₃₀人胰岛素的质谱分析图。

图2是HPLC检测本发明转肽效果图。

图3是人胰岛素酯[Thr（Bu^t）OBu^t-B₃₀]insulin的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（1）取毕赤酵母表达的人胰岛素原溶液（参考文献：高剑坤，财绍皙，范开等，含短C肽人胰岛素原类似物desB³⁰在毕赤酵母中的表达与纯化，生物化学与生物物理进展，2008,35（1）：63-68”进行制备）大孔吸附后采用反相层析，用异丙醇进行洗脱，其中洗脱液含有体积百分比25%的异丙醇，按胰岛素原与胰蛋白酶的质量比300:1的比例添加胰蛋白酶，缓慢搅拌，37℃酶切后获得含有desB₃₀人胰岛素的溶液，用3M磷酸调至pH3.0，终止酶切反应。得到的含有desB₃₀人胰岛素的溶液中的desB₃₀人胰岛素浓度为1.0mM，加入相当于desB₃₀人胰岛素摩尔数等量的氯化锌，用5M氨水调pH5.80，4～8℃放置4小时后，使用300目的滤膜抽滤，得到desB₃₀人胰岛素含水粉末，测其含水量为50%。按照2010版药典二部中胰岛素相关蛋白检测方法，HPLC检测分析，收集主峰进行质谱分析，分析结果见图1。质谱检测结果为5711.0，与desB₃₀人胰岛素的分子量5707基本一致。

（2）使用二甲基亚砜溶解o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐与步骤（1）得到的desB₃₀人胰岛素含水粉末，接着依次加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液（纯水配制），得到反应体系，于25±1℃搅拌，转肽反应8h，得到人胰岛素酯[Thr（Bu^t）OBu^t-B₃₀]insulin；其中，desB₃₀人胰岛素在反应体系中的终浓度为17mM，desB₃₀人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐按摩尔比1：15配比，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比20：1配比，水（包括desB₃₀人胰岛素粉末所含水分以及胰蛋白酶水溶液中的水）、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为20%：20%：60%。

HPLC分别检测转肽2、4、6、8小时的转肽效率，其中2、4、6、8小时的转肽效率分别是88.02%、89.36%、91.52%、90.77%。

6小时的转肽样品的HPLC检测图谱见图2，收集6小时转肽样品的HPLC检测主峰，进行质谱分析，图谱见图3。图谱显示样品的分子量为5925.1，与5920的理论分子基本一致。

实施例2

使用二甲基亚砜溶解o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐与desB₃₀人胰岛素含水粉末（按实施例1步骤（1）制备得到），接着依次加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液（纯水配制），得到反应体系，于25±1℃搅拌，转肽反应8h，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在反应体系中的终浓度为17mM，desB₃₀人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐按摩尔比1：15配比，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比40：1配比，水（包括desB₃₀人胰岛素粉末所含水分以及胰蛋白酶水溶液中的水）、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为20%：40%：40%。

HPLC检测分析，检测转肽2、4、6、8小时的转肽效率，其中2、4、6、8小时的转肽效率分别是85.52%、88.55%、86.52%、85.53%。

实施例3

（1）取大肠杆菌表达后复性的人胰岛素原水溶液（参考文献：翁樑，刘丽军，王智等。重组人胰岛素的纯化及其性质的初步鉴定。生物技术通报，2003，14（5）：387-389），按胰岛素原与胰蛋白酶的质量比300:1的比例添加胰蛋白酶，缓慢搅拌，37℃酶切后的溶液，其中desB₃₀人胰岛素的浓度为0.5mM，按照desB₃₀人胰岛素：氯化锌的摩尔比1：1.5加入氯化锌，用3M磷酸调pH5.60，4～8℃沉淀4小时，抽滤得到desB₃₀人胰岛素含水粉末，水分测定仪测其水分为45%，HPLC检测其含量。

（2）使用二甲基亚砜溶解o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐酸盐（H-Thr(tBu)-OtBu.HCl）与步骤（1）得到的desB₃₀人胰岛素含水粉末，接着加入胰蛋白酶水溶液（纯水配制），得到反应体系，于25±1℃搅拌，转肽反应6h，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在反应体系中的终浓度为13.0mM，desB₃₀人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐酸盐按摩尔比1：100配比，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比10：1配比，水和二甲基亚砜的体积比为50%：50%。

HPLC分别检测转肽2、4、6小时的转肽效率，其中2、4、6小时的转肽效率分别是91.31%、91.80%、91.50%。

实施例4

（1）取实施例1中终止酶切反应，冻干获得desB₃₀人胰岛素粉末。溶解于pH值3.0的水溶液（用1M磷酸调节）中，desB₃₀人胰岛素的浓度为10mM，按desB₃₀人胰岛素与氯化锌的摩尔比1：0.5的比例加入氯化锌，用5M氨水调pH5.80、溶液4～8℃沉淀4小时，抽滤得到desB₃₀人胰岛素含水粉末，水分测定仪测其水分为43%。HPLC检测其含量。

（2）使用二甲基亚砜溶解o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯与步骤（1）得到的desB₃₀人胰岛素含水粉末，接着加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液（纯水配制），得到反应体系，于25±1℃搅拌，转肽反应8h，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在反应体系中的终浓度为15mM，desB₃₀人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯按摩尔比1：15配比，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比30：1配比，水、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为20%:40%:40%。

HPLC分别检测转2、4、6、8小时的转肽效率，其中2、4、6、8小时的转肽效率分别是82.81%、83.16%、86.76%、85.58%。

实施例5

（1）取含有desB₃₀人胰岛素的冻干粉末（同实施例4），溶解于水溶液（磷酸调至pH3.0），desB₃₀人胰岛素的浓度为3mM，用5M氨水调pH5.80，溶液4～8℃沉淀4小时，抽滤得到desB₃₀人胰岛素含水粉末，测其水分为55%，HPLC检测其含量。

（2）使用二甲基亚砜溶解o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐与步骤（1）得到的desB₃₀人胰岛素含水粉末，接着加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液（纯水配制），得到反应体系，于25±1℃搅拌，转肽反应8h，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在反应体系中的终浓度为20mM，desB₃₀人胰岛素含水粉末与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐按摩尔比1：40配比，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比40：1配比，水、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为20%:15%:65%。

HPLC分别检测转1、4、6、8小时的转肽效率，其中1、4、6、8小时的转肽效率分别是71.49%、83.95%、85.54%、84.34%。

实施例6

（1）取含有desB₃₀人胰岛素的冻干粉末（同实施例4），溶解于水溶液（磷酸调至pH3.0），desB₃₀人胰岛素的浓度为8mM，按desB₃₀人胰岛素：硫酸锌的摩尔比1：1.0加入硫酸锌，用5M氨水调pH6.0，溶液4～8℃沉淀4小时，8000g离心得到desB₃₀人胰岛素含水粉末，测其水分为78%，HPLC检测其含量。

（2）使用二甲基亚砜溶解o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐与步骤（1）得到的desB₃₀人胰岛素含水粉末，接着加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液（纯水配制），得到反应体系，于25±1℃搅拌，转肽反应6h，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在前述反应体系中的终浓度为33mM，desB₃₀人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐按摩尔比1：150配比，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比120：1配比，水、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为50%:15%:35%。

HPLC分别检测转2、4、6小时的转肽效率，其中2、4、6小时的转肽效率分别是74.85%、85.56%、84.95%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人胰岛素酯的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（2）使用desB₃₀人胰岛素含水粉末进行转肽反应，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在转肽反应体系中的终浓度为13mM～33mM。

2.根据权利要求1所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：步骤（1）中所述的离心或抽滤之前，先对含有desB₃₀人胰岛素的溶液进行沉淀。

3.根据权利要求2所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：所述的对含有desB₃₀人胰岛素的溶液进行沉淀的方式为调节pH值之后静置沉淀，或是先加入Zn²⁺，再调节pH值，之后静置沉淀。

4.根据权利要求3所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：所述的pH值为5.6～6。

5.根据权利要求3所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：所述的Zn²⁺的用量按desB₃₀人胰岛素与Zn²⁺的摩尔比为1：0.5～1.5进行计算添加。

6.根据权利要求3所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：所述的静置的温度为4～8℃。

7.根据权利要求1所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：步骤（2）中所述的转肽反应包括如下步骤：用二甲基亚砜溶解苏氨酸或其衍生物，以及desB₃₀人胰岛素含水粉末，再加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液或是只加入胰蛋白酶水溶液，获得转肽的反应体系；然后搅拌进行反应；desB₃₀人胰岛素与苏氨酸酯或其衍生物的摩尔比为1：15～150，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比为10～120：1。

8.根据权利要求7所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：所述的苏氨酸酯为o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯；所述的衍生物指的是o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐类衍生物。

9.根据权利要求7所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：所述的反应体系中溶剂的比例为二甲基亚砜：1,4-丁二醇：水按体积比15%～50%：0～65%：20%～50%；其中水的含量中包含了desB₃₀人胰岛素含水粉末中包含的水分。

10.根据权利要求7所述的人胰岛素酯的制备方法，其特征在：所述的搅拌反应的时间为1～8小时，温度为25±1℃。