DE60208582T2

DE60208582T2 - Enzymatisches verfahren zur herstellung von l-ascorbinsäure und d-erythorbinsäure

Info

Publication number: DE60208582T2
Application number: DE60208582T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Kamakura-shi Hoshino; Tatsuya Fujisawa-shi Kiyasu; Masako Kamakura-shi SHINJOH
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-10-31
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2022-11-01
Also published as: US7465563B2; ES2256569T3; US20050019878A1; EP1446494B1; DE60208582D1; CN1318600C; ATE315098T1; WO2003040381A3; WO2003040381A2; CN1585824A; EP1446494A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neues Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure oder D-Erythorbinsäure aus 2-Keto-L-gulonsäure bzw. 2-Keto-D-gulonsäure durch eine α-Amylase oder ein Enzym mit α-Amylaseaktivität.
L-Ascorbinsäure, auch bekannt als Vitamin C, wird verbreitet nicht nur als Medizin sondern auch im Bereich der Lebensmittelindustrie, der Kosmetikindustrie und dergleichen verwendet und ist eine sehr nützliche Verbindung. D-Erythorbinsäure wird hauptsächlich als ein Antioxidationsmittel für Lebensmittelzusätze verwendet.
Bisher ist L-Ascorbinsäure kommerziell durch das allgemein bekannte Reichstein-Verfahren hergestellt worden, in dem L-Ascorbinsäure aus D-Glukose mittels D-Sorbitol, L-Sorbose, Diaceton-L-sorbose, Diaceton-2-keto-L-gulonsäure, 2-Keto-L-gulonsäure und Methyl-2-keto-L-gulonat hergestellt wurde. In diesem Verfahren ist die Umwandlung von D-Sorbitol zu L-Sorbose der einzige mikrobielle Schritt, die anderen sind chemische Schritte. Die Umwandlung von Diaceton-2-keto-L-gulonsäure zu L-Ascorbinsäure wird durch zwei unterschiedliche Verfahren erreicht: (i) Entschützung, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten, gefolgt von Veresterung mit Methanol und Basen-katalysierter Cyclisierung; und (ii) Säuren-katalysierte Cyclisierung zu L-Ascorbinsäure direkt aus der geschützten oder entschützten 2-Keto-L-gulonsäure. Diese Umwandlungsverfahren müssen durch Nicht- oder Wenigwasserreaktionssysteme durchgeführt werden. Aus Umwelt- und wirtschaftlichen Gründen, ist eine Reaktion ohne organische Lösungsmittel bevorzugt.
Andererseits ist D-Erythorbinsäure aus D-Glukose mittels 2-Keto-D-Gluconsäure, die selbst durch Fermentation mit einem Stamm, der zu der Gattung Pseudomonas gehört, hergestellt werden kann, und mittels Methyl-2-keto-D-gluconat hergestellt worden.
Es ist viel Zeit und Mühe aufgewendet worden, um andere Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure durch Mikroorganismen zu finden. Die meisten Studien an der mikrobiellen Herstellung von L-Ascorbinsäure richteten sich auf die Herstellung eines Zwischenproduktes der L-Ascorbinsäureherstellung, 2-Keto-L-gulonsäure, aus L-Sorbose (z. B. EP 213,591 ; US 4,960,695; EP 221,707), aus D-Sorbitol (z. B. EP 213,591 ; US 5,312,741; WO 95/23220; WO 98/17819) oder aus D-Glukose mittels 2,5-Diketogluconsäure mit einer einzelnen, einer gemischten oder einer rekombinanten Kultur. Die 2-Keto-L-gulonsäure kann dann in L-Ascorbinsäure durch chemische Mittel wie oben beschrieben umgewandelt werden.
Wie oben erwähnt, ist die chemische Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure zu L-Ascorbinsäure mittels 2-Keto-L-gulonsäure-γ-lacton eine Säure-katalysierte Reaktion unter Entfernung eines Wassermoleküls. Das Hauptprinzip der Reaktion ist eine Carboxylesterbindungsbildung, zur Erzeugung des γ-Lactonringes in dem 2-Keto-L-gulonsäuremolekül. Daher wird insbesondere in der Wasserphase die letzte Stufe in der Gleichgewichtsreaktion durch physikochemische Bedingungen bestimmt. Die Herstellung von L-Ascorbinsäure aus 2-Keto-L-gulonsäure durch chemische Umwandlung ist selbst in der Wasserphase erheblich, ist jedoch für eine kommerzielle Anwendung nicht ausreichend. Das Herstellungsverfahren in der Wasserphase oder in der Wasserphase mit einem geringen Gehalt an organischem Lösungsmittel hinsichtlich der Kosteneffektivität und der Umweltansprüche überaus wünschenswert. Ferner muß die chemische Umwandlung für die Herstellung in der Wasserphase biologisch etwas verbessert werden. Sowohl eine hohe Temperatur als auch ein saurer (niedriger) pH sind für die Reaktion bevorzugt.
WO 97/43433 beschreibt ein Verfahren zur angeblichen Herstellung von L-Ascorbinsäure durch das Kontaktieren von 2-Keto-L-gulonsäure oder eines Esters davon mit einem Hydrolaseenzymkatalysator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen (Enzymklasse EC 3.4.x.x), Esterasen (Enzymklasse EC 3.1.x.x), Lipasen (Enzymklasse EC 3.1.x.x) und Amidasen (Enzymklasse EC 3.5.x.x). Unter Verwendung einer Hydrolase wie einer Protease, einer Esterase, einer Lipase oder einer Amidase stellt US 6,022,719 exemplarisch die Bildung von L-Ascorbinsäure aus einem Ester von 2-Keto-L-gulonsäure wie Butyl-2-keto-L-gulonat dar, aber keine ersichtliche Bildung von L-Ascorbinsäure aus 2-Keto-L-gulonsäure selbst. Es offenbart keine α-Amylase oder ein Enzym mit α-Amylaseaktivität als den Hydrolaseenzymkatalysator zum Zwecke der L-Ascorbinsäurebildung aus 2-Keto-L-gulonsäure.
α-Amylase ist eine Endohydrolase, die die Hydrolyse der α-1,4-Glucosidverknüpfungen von Stärke katalysiert und Poly- und Oligosaccharidketten mit variierenden Kettenlängen entwickelt. α-Amylasen sind aus einer Vielzahl von Quellen, Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren erhältlich. Bekanntermaßen haben α-Amylasen eine gute Thermostabilität. Überdies erzeugt das thermoazidophile Bakterium Alicyclobacillus acidocaldarius eine α-Amylase, die unter sauren Bedingungen sehr thermostabil ist.
Die vorliegende Erfindung liefert ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus 2-Keto-L-gulonsäure, das die Kontaktierung von 2-Keto-L-gulonsäure in Lösung mit einer α-Amylase umfaßt. Überdies liefert die vorliegende Erfindung auch ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von D-Erythorbinsäure aus 2-Keto-D-gluconsäure, das die Kontaktierung von 2-Keto-D-gluconsäure in Lösung mit einer α-Amylase umfaßt.
Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck „α-Amylase" das α-Amylaseenzym selbst und Enzyme mit α-Amylaseaktivität.
Die Mikroorganismen „Bacillus amyloliquefaciens", „Bacillus licheniformis" und „Alicyclo- bacillus azidocaldarius" umfassen auch Synonyme oder Basonyme für solche Spezies mit denselben physikochemischen Eigenschaften, wie von International Code of Nomenclature of Prokaryotes definiert.
Die α-Amylasen, die als Katalysatoren in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind die, die aus Organismen einschließlich Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen, wie Pilzen, Hefen und Bakterien erhalten werden. Die bevorzugten α-Amylasen der vorliegenden Erfindung sind die von B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, A. azidocaldarius, und Schweinepankreas. Stärker bevorzugt ist ein Enzym mit α-Amylaseaktivität von A. azidocaldarius, insbesondere A. azidocaldarius ATCC 27009.
Die α-Amylasen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind von Lieferanten wie Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA) erhältlich oder können aus irgendwelchen geeigneten Organismen, einschließlich Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen durch übliche Proteinreinigungsverfahren wie Ammoniumsulfatausfällung, Chromatographie und Kristallisation isoliert werden. In den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann irgendeine Form von α-Amylase verwendet werden, insbesondere eine Enzymlösung oder das immobilisierte Enzym.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten chemischen Formen von 2-Keto-L-gulonsäure und 2-Keto-D-gluconsäure die freien Säuren oder deren Metallsalze wie die Natrium- und Calciumsalze.
Das Reaktionsgemisch kann einen geeigneten Stabilisator für α-Amylase enthalten, wie ein Ca-Ion und kann ferner ein Antioxidationsmittel enthalten, wie 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol oder Cystein, um die Zersetzung der hergestellten L-Ascorbinsäure oder D-Erythorbinsäure zu verhindern.
Die Reaktionstemperaturen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegen im Bereich von 20 bis 120°C. Die bevorzugten Temperaturen liegen im Bereich von 20 bis 100°C und am stärksten bevorzugt im Bereich von 37 bis 90°C.
Geeignete pHs für die Verfahren der vorliegenden Erfindung liegen im Bereich von 2 bis 7. Der pH des Reaktionsgemisches kann unter Verwendung geeigneter Puffer eingestellt werden oder direkt durch die Zugabe von Säure, z. B. HCl oder Alkali, z. B. NaOH, eingestellt werden.
Der Reaktionszeitraum liegt geeigneterweise im Bereich von 1 bis 7 Tagen, bevorzugt im Bereich von 1 bis 3 Tagen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in einem Lösungsmittel wie Wasser, einem wässerigen Alkohol, einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch hiervon durchgeführt werden. Beispiele für einen Alkohol umfassen einen C₁-C₆-Alkohol, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol, iso-Butanol oder tert-Butanol. Beispiele für organische Lösungsmittel umfassen aliphatische Kohlenwasserstoffe (z. B. Heptan und Isooctan), alicyclische Kohlenwasserstoff (z. B. Cyclohexan) und aromatische Kohlenwasserstoffe (z. B. Benzol und Toluol). Das bevorzugte Lösungsmittel ist Wasser oder ein wässeriges Lösungsmittel.
Die L-Ascorbinsäure oder D-Erythorbinsäure, die unter den oben beschriebenen Bedingungen hergestellt werden, können durch Verfahren, die in der Technik bekannt sind, leicht aufbereitet werden. Beispielsweise können L-Ascorbinsäure oder D-Erythorbinsäure durch Kristallisation, Elektrodialyse oder Säulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschharz isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele ausführlich beschrieben; es sollte jedoch selbstverständlich sein, daß die vorliegende Erfindung nicht auf diese besonderen Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1: Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure in L-Ascorbinsäure durch α-Amylasen von B. amyloliquefaciens, B. licheniformis und Schweinepankreas
Die α-Amylasen von B. amyloliquefaciens (Sigma-Aldrich, Produktnummer 10068), B. licheniformis (Sigma-Aldrich, Produktnummer A4551) und Schweinepankreas (Sigma-Aldrich, Produktnummer A4268) wurden hinsichtlich der Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure in L-Ascorbinsäure getestet. Die Enzympulver wurden in Puffer 1 [20 mM Na-MES-Puffer (pH 7,0) und 2 mM CaCl₂] gelöst und für die Umwandlungsreaktion verwendet. Das Reaktionsgemisch enthielt 12% Natrium-2-keto-L-gulonsäuremonohydrat, 2 mM CaCl₂ und die α-Amylase in 50 μl 100 mM Puffer. Die Konzentration der α-Amylase und des Puffers in jedem Reaktionsgemisch wird in Tabelle 1 gezeigt. Die Reaktion wurde unter anaeroben Bedingungen bei 70°C 20 Stunden durchgeführt.
L-Ascorbinsäure wurde durch HPLC auf einer YMC-Pack Polyaminell Säule (ID. 4.6 × 150 mm; YMC Co., Japan) bei 264 nm geprüft, wobei das Mobilphasenlösungsmittel 70% (V./V.) Acetonitril und 15 mM Ammoniumdihydrogenphosphat bei einer Flußrate von 1,5 ml/min enthielt. Die Mengen an biologisch hergestellter L-Ascorbinsäure wurden durch die Differenz zwischen den Ergebnissen aus den Reaktionen mit und ohne α-Amylase bestimmt. Die Mengen an hergestellter L-Ascorbinsäure werden in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

* Produktnummer

Beispiel 2: Reinigung eines Enzyms mit α-Amylaseaktivität aus A. azidocaldarius
A. azidocaldarius ATCC 27009 konnte in 24,6 l eines Mediums, das aus 9,8 mM (NH₄)₂SO₄, 0,47 mM CaCl₂, 2,7 mM KH₂PO₄, 1,0 mM MgSO₄, 10 μM FeSO₄, 9,1 μM MnCl₂, 11,7 μM Na₂B₄O₇, 0,57 μM ZnSO₄, 0,2 μM CuCl₂, 0,12 μM VOSO₄, 0,16 μM NaMoO₄, 30 nM CoSO₄ und 10 mM Maltose (pH 3,5) besteht, bei 55°C 15 Stunden aerob wachsen. Das Kulturfluid wurde durch Zentrifugation aufgearbeitet.
Während der Enzymreinigung wurden alle Durchläufe der Säulenchromatographie bei 4°C durchgeführt. Die α-Amylaseaktivität wurde durch den spektrophotometrischen Assay unter Verwendung von p-Nitrophenyl-α-D-maltopentosid (Sigma-Aldrich) als Substrat bestimmt. Das Assaygemisch enthielt 1 mM p-Nitrophenyl-α-D-maltopentosid und eine Enzymprobe in 40 μl 50 mM Na-Acetatpuffer (pH 4,0). Nach der Inkubation bei 55°C für 20 Minuten wurden 100 μl 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das freigesetzte p-Nitrophenol wurde als eine Absorption bei 405 nm detektiert.
Das aufgearbeitete Kulturfluid wurde DEAE Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd. Buckinghamshire, UK) Säulenchromatographie unterzogen. 0,5 M Na-MES-Puffer (pH 6,0) wurden dem Kulturfluid bei 20 mM zugegeben und der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Die aus 1,65 l Kultur hergestellte Fluidprobe wurde auf eine DEAE Sepharose Fast Flow-Säule (100 ml: I. D. 4,4 × 6,6 cm), äquilibriert mit Puffer 2 [20 mM Na-MES-Puffer (pH 6,0), 0,5 mM CaCl, und 1,0 mM MgSO₄] geladen. Nach dem Waschen mit Puffer 2 wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl (0 bis 0,45 M in Puffer 2) eluiert. Dieser Schritt wurde viermal wiederholt, um 6,6 l der Kultur zu behandeln. Die aktiven Fraktionen der vier Chromatographiedurchläufe wurden zusammengebracht und gegen Puffer 3 [20 mM Na-Acetat-Puffer (pH 3,0), 0,5 mM CaCl₂ und 1,0 mM MgSO₄] dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf eine SP Sepharose Fast Flow-Säule (80 ml: I. D. 4,4 × 5,3 cm, Amersham Pharmacia Biotech UK), äquilibriert mit Puffer 3, geladen. Nach dem Waschen mit Puffer 3 wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl (0 bis 0,6 M in Puffer 3) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Nach der Dialyse gegen Puffer 2 wurde die Enzymprobe auf eine Q Sepharose Fast Flow-Säule (30 ml: I. D. 2,5 × 6,2 cm, Amersham Pharmacia Biotech UK), äquilibriert mit Puffer 2, geladen. Nach dem Waschen mit Puffer 2 wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl (0 bis 0,8 M in Puffer 2) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und mit Centriplus YM-30 (Millipore Co., USA) auf 3,5 ml konzentriert. Die konzentrierte Probe wurde durch HiPrep Sephacryl S-300 HR 16/60 (Amersham Pharmacia Biotech UK) mit Puffer 4 [20 mM Na-MES-Puffer (pH 6,0), 0,5 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄ und 0,15 M NaCl] passagiert. Eine Fraktion von 9 ml, die das Enzym mit α-Amylaseaktivität enthielt, wurde erhalten. Die Enzymprobe wurde gegen Puffer 5 [20 mM Na-MES-Puffer (pH 6,0), 0,5 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄ und 50 mM NaCl] dialysiert und auf 0,11 ml durch wiederholte Konzentration/Verdünnung in einem Konzentrator mit Centricon YM-30 (Millipore Co., USA) konzentriert. Auf SDS-PAGE zeigt das gereinigte Enzym hauptsächlich eine molekulare Masse von ungefähr 160 kDa. Schließlich werden 0,47 mg des Enzyms mit α-Amylaseaktivität mit einer Reinheit von etwa 80% erhalten.
Beispiel 3: Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure in L-Ascorbinsäure durch ein Enzym mit α-Amylaseaktivität von A. azidocaldarius
Das Enzym mit α-Amylaseaktivität, das in Beispiel 2 aus A. azidocaldarius gereinigt wurde, wurde hinsichtlich der Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure in L-Ascorbinsäure getestet. Das Reaktionsgemisch enthielt 10% Natrium-2-keto-L-gulonsäuremonohydrat (eingestellt auf pH 2,5 mit HCl) und das Enzym (100 oder 200 μg/ml) in 20 μl. Die Reaktion wurde unter anaeroben Bedingungen bei 80°C 24 Stunden durchgeführt. L-Ascorbinsäure wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren geprüft. Die Mengen an biologisch hergestellter L-Ascorbinsäure wur den durch die Differenz zwischen den Ergebnissen aus den Reaktionen mit und ohne Enzym bestimmt. 100 μg/ml Enzym ergaben 3,90 g/l L-Ascorbinsäure, 200 μg/ml Enzym ergaben 4,22 g/l L-Ascorbinsäure.
Beispiel 4: Umwandlung von 2-Keto-D-gulonsäure in D-Erythorbinsäure durch α-Amylasen von B. amyloliquefaciens, B. licheniformis und Schweinepankreas
Die α-Amylasen von B. amyloliquefaciens, B. licheniformis und Schweinepankreas, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurden hinsichtlich der Umwandlung von 2-Keto-D-gulonsäure in D-Erythorbinsäure getestet. Die in Puffer 1 gelösten α-Amylasen wurden für die Umwandlungsreaktion verwendet. Das Reaktionsgemisch enthielt 5% 2-Keto-D-gulonsäurehemicalciumsalz (Sigma Aldrich), 4 mM CaCl₂ und 400 μg/ml der α-Amylase pro ml in 50 μl 100 mM Puffer. Der Puffer in jedem Reaktionsgemisch wird in Tabelle 2 gezeigt. Die Reaktion wurde unter anaeroben Bedingungen bei 70°C 20 Stunden durchgeführt. D-Erythorbinsäure wurde durch dasselbe Verfahren für L-Ascorbinsäure (beschrieben in Beispiel 1) durchgeführt. Die Mengen an biologisch hergestellter D-Erythorbinsäure wurden durch die Differenz zwischen den Ergebnissen aus den Reaktionen mit und ohne α-Amylase bestimmt. Die Mengen an hergestellter D-Erythorbinsäure werden in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2

* Produktnummer

Beispiel 5: Umwandlung von 2-Keto-D-gluconsäure in D-Erythorbinsäure durch Enzyme mit α-Amylaseaktivität von A. azidocaldarius
Das in Beispiel 2 aus A. azidocaldarius gereinigte Enzym wurde hinsichtlich der Umwandlung von 2-Keto-D-gluconsäure in D-Erythorbinsäure getestet. Das Reaktionsgemisch enthielt 5% 2-Keto-D-gluconsäurehemicalciumsalz (auf pH 2,5 mit HCl eingestellt) und das Enzym (0 oder 200 μg/ml) in 20 μl. Die Reaktion wurde unter anaeroben Bedingungen bei 70°C für 21 Stunden durchgeführt. D-Erythorbinsäure wurde durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren geprüft. Die Menge an biologisch hergestellter D-Erythorbinsäure wurde durch die Differenz zwischen den Ergebnissen aus den Reaktionen mit und ohne Enzym bestimmt. 76,0 mg/l D-Erythorbinsäure wurden durch die Reaktion mit dem Enzym hergestellt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus 2-Keto-L-gulonsäure oder zur Herstellung von D-Erythorbinsäure aus 2-Keto-D-gluconsäure, wobei das Verfahren die Kontaktierung einer Lösung, enthaltend 2-Keto-L-gulonsäure bzw. 2-Keto-D-gluconsäure, mit einer α-Amylase oder einem Enzym mit α-Amylaseaktivität umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lösungsmittel ein wässeriges Lösungsmittel ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasser, einem Alkohol und einem Gemisch hiervon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei 2-Keto-L-gulonsäure oder 2-Keto-D-gluconsäure mit dem Enzym bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 120°C kontaktiert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei 2-Keto-L-gulonsäure oder 2-Keto-D-gluconsäure mit dem Enzym bei einer Temperatur im Bereich von 37 bis 90°C kontaktiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei 2-Keto-L-gulonsäure oder 2-Keto-D-gluconsäure mit dem Enzym bei einem pH im Bereich von 2 bis 7 kontaktiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei 2-Keto-L-gulonsäure oder 2-Keto-D-gluconsäure aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus der freien Säure oder einem Metallsalz.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei 2-Keto-L-gulonsäure oder 2-Keto-D-gluconsäure mit einem Enzym mit α-Amylaseaktivität bei einer Temperatur im Bereich von 37 bis 90°C und bei einem pH im Bereich von 2 bis 7 kontaktiert werden.