CN1585824A - 生产l－抗坏血酸和d－异抗坏血酸的酶方法 - Google Patents

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Abstract

一种通过分别将2－酮基－L－古洛糖酸或2－酮基－D－葡糖酸与具有α－淀粉酶活性的酶在溶液中进行接触来由2－酮基－L－古洛糖酸生产L－抗坏血酸或由2－酮基－D－葡糖酸生产D－异抗坏血酸的方法。用于这种反应的溶剂可以是水、含水醇、有机溶剂或其混合物。在各种情况中，起始材料可以是游离酸、钠盐或钙盐的形式。

Description

生产L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的酶方法
本发明涉及一种通过使用α-淀粉酶或具有α-淀粉酶活性的酶分别由2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸来生产L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸的新方法。
L-抗坏血酸，也被称为维生素C，不仅被广泛用作药物，而且还被用广泛用于食品工业、化妆品工业等领域，是一种十分有用的化合物。D-异抗坏血酸主要作为抗氧剂用于食品添加剂。
迄今为止，一直是用众所周知的Reichstein法来工业制备L-抗坏血酸，在该方法中，L-抗坏血酸是由D-葡萄糖经由D-山梨醇、L-山梨糖、乙酰丙酮-L-山梨糖、乙酰丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸、2-酮基-L-古洛糖酸和2-酮基-L-古洛糖酸甲酯来进行生产的。在这种过程中，D-山梨醇向L-山梨糖的转化是唯一的微生物步骤，其它步骤都是化学步骤。乙酰丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗坏血酸的转化是通过两种不同的操作来完成的：(i)去保护得到2-酮基-L-古洛糖酸，然后用甲醇进行酯化并进行碱催化的环化；和(ii)通过酸催化的环化直接由被保护形式或去保护形式的2-酮基-L-古洛糖酸获得L-抗坏血酸。这些转化过程必需通过无水或低水的反应系统来进行。从环境和经济学角度考虑，优选不使用有机溶剂的反应。
另一方面，D-异抗坏血酸一直是由D-葡萄糖经由2-酮基-D-葡糖酸来进行制造的，其本身可通过用属于假单胞菌属的菌株进行的发酵，并经由2-酮基-D-葡糖酸甲酯来进行制备。
人们投入了大量的时间和努力去发现通过微生物来制造L-抗坏血酸的其它方法。大多数用微生物生产L-抗坏血酸的研究都着重于生产L-抗坏血酸所用的中间体——2-酮基-L-古洛糖酸的生产，该中间体可以用单一的、混和的或重组的培养物从L-山梨糖(例如EP 213,591；US 4,960,695；EP221,707)、D-山梨醇(例如EP 213,591；US 5,312,741；WO 95/23220；WO98/17819)、或经由2，5-二酮基葡糖酸从D-葡萄糖生产。然后，可以通过上述的化学方法将2-酮基-L-古洛糖酸转化成L-抗坏血酸。
如上所述，2-酮基-L-古洛糖酸经由2-酮基-L-古洛糖酸γ-内酯转化成L-抗坏血酸是一种伴有除去水分子的酸催化反应。该反应的主要原理是形成一种羧基酯键从而在2-酮基-L-古洛糖酸分子中产生γ-内酯环。因此，尤其是在水相中，该平衡反应中的最终状态是由物理-化学条件决定的。通过化学转化由2-酮基-L-古洛糖酸进行的L-抗坏血酸的生产即使在水相中也十分可观，但不足以用于工业应用。对于成本效果和环境需要而言，十分需要在水相或在具有低有机溶剂含量的水相中进行的生产过程。于是，对于在水相中的生产而言，一定会需要对该化学转化进行一些生物学增强。高温度和高酸度的(低)pH对于该反应而言显然都是有利的。
WO 97/43433描述了一种通过将2-酮基-L-古洛糖酸或其酯与水解酶催化剂进行接触来制备L-抗坏血酸的方法，所说的水解酶催化剂选自蛋白酶(酶分类为EC 3.4.x.x)、酯酶(酶分类为EC 3.1.x.x)、脂肪酶(酶分类为EC 3.1.x.x)和酰胺酶(酶分类为EC 3.5.x.x)。US 6,022,719举例说明了用水解酶如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或酰胺酶，由2-酮基-L-古洛糖酸的酯如2-酮基-L-古洛糖酸丁酯来形成L-抗坏血酸，但是从2-酮基-L-古洛糖酸本身不能明显地形成L-抗坏血酸。其并没有公开α-淀粉酶或具有α-淀粉酶活性的酶可作为水解酶催化剂用于由2-酮基-L-古洛糖酸来形成L-抗坏血酸。
α-淀粉酶是一种可催化淀粉α-1，4-糖苷键水解并释放出各种长度的多糖和低聚糖的内切型水解酶。α-淀粉酶来源广泛，可得自微生物、植物以及动物。已知一些α-淀粉酶具有良好的热稳定性。此外，热嗜酸性细菌酸热脂环酸杆菌产生一种α-淀粉酶，其在酸性条件下具有很好的热稳定性。
本发明提供了一种由2-酮基-L-古洛糖酸来制备L-抗坏血酸的酶方法，其包括将2-酮基-L-古洛糖酸在溶液中与α-淀粉酶进行接触。此外，本发明还提供了一种由2-酮基-D-葡糖酸来制备D-异抗坏血酸的方法，其包括将2-酮基-D-葡糖酸在溶液中与α-淀粉酶相接触。
这里所用的术语“α-淀粉酶”包括α-淀粉酶本身和具有α-淀粉酶活性的酶。
微生物“解淀粉芽孢杆菌”、“地衣芽孢杆菌”和“酸热脂环酸杆菌”还包括如原核生物命名法的国际代码所定义的具有相同物理-化学性质的该类种属的同义词和基本异名。
在本发明的方法中用作催化剂的α-淀粉酶是那些得自生物体的淀粉酶，所说的生物体包括动物、植物以及微生物如真菌、酵母菌和细菌。本发明优选的α-淀粉酶是那些解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酸热脂环酸杆菌以及猪胰腺的α-淀粉酶。更优选的是酸热脂环酸杆菌、尤其是酸热脂环酸杆菌ATCC 27009的具有α-淀粉酶活性的酶。
用于本发明方法的α-淀粉酶可以购自供应商如Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，USA)或可以通过常规的蛋白纯化方法如硫酸铵沉淀法、色谱法和结晶法从任何适宜的生物体，包括动物、植物和微生物中被分离出来。在本发明的方法中，可以使用任何形式的α-淀粉酶，特别是酶溶液或被固定的酶。
在本发明的方法中，2-酮基-L-古洛糖酸和2-酮基-D-葡糖酸优选的化学形式是游离酸或其金属盐如钠盐和钙盐。
该反应混合物可以包含适宜的α-淀粉酶稳定剂如Ca离子，并且可以进一步包含抗氧化剂如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或半胱氨酸以防止所产生的L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸降解。
本发明方法的反应温度在0℃至120℃的范围内。优选的温度为20℃至100℃，并且最优选地为37℃至90℃。
本发明方法适宜的pH为1.5至12。优选的pH为1.5至8，并且最优选的为2至7。可以用适宜的缓冲液对该反应混合物的pH进行调整或可以通过加入酸例如HCl或碱例如NaOH来对其直接进行调整。
反应周期适宜地在1至7天的范围内，优选地在1至3天的范围内。
本发明的方法可以在溶剂如水、含水醇、有机溶剂或其混合物中进行。醇的实例包括C1-C6醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或叔丁醇。有机溶剂的实例包括脂族烃(例如，庚烷和异辛烷)、脂环族烃(例如，环己烷)和芳族烃(例如，苯和甲苯)。优选的溶剂是水或含水溶剂。
在上述条件下所产生的L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸可以用现有技术中公知的方法容易地进行回收。例如，可以通过结晶、电渗析或使用离子交换树脂的柱色谱来进行L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸的分离。
用下面的实施例对本发明进行了更详细的说明；但是，应当清楚的是本发明并不限于这些特定的实施例。
实施例1：用解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和猪胰腺的α-淀粉酶将2-酮基-L-古洛糖酸转化成L-抗坏血酸
进行了解淀粉芽孢杆菌(Sigma-Aldrich，产品号码10068)、地衣芽孢杆菌(Sigma-Aldrich，产品号码A4551)和猪胰腺(Sigma-Aldrich，产品号码A4268)的α-淀粉酶将2-酮基-L-古洛糖酸转化成L-抗坏血酸的试验。将酶粉末溶解于缓冲液1[20mM Na-MES缓冲液(pH7.0)和2mM CaCl2]中并将其用于转化试验。该反应混合物在50μl 100mM的缓冲液中包含12％2-酮基-L-古洛糖酸钠单水合物、2mM CaCl2和α-淀粉酶。α-淀粉酶和缓冲液在各反应混合物中的浓度如表1所示。将该反应在70℃下在厌氧条件下进行20小时。
用使用YMC-Pack PolyamineII柱(内径4.6×150mm；YMC Co.，日本)的HPLC在264nm下对L-抗坏血酸进行分析，使用包含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氢铵的流动相溶剂，流速为1.5ml/分钟。通过由含和不含α-淀粉酶的反应液所获得的结果之间的差异来测定生物学产生的L-抗坏血酸的量。将所产生的L-抗坏血酸的量概括地列与表1中。
表1
  α-淀粉酶* 酶(μg/ml)     缓冲液(pH) L-抗坏血酸(mg/l)
    10068     400   Na-MES(pH6.0)     29.1
    A4551     320   醋酸Na(pH5.0)     84.9
    A4268     400   Na-MES(pH5.5)     61.9
*产品号码
实施例2：得自酸热脂环酸杆菌的具有α-淀粉酶活性的酶的纯化使酸热脂环酸杆菌ATCC 27009在24.6升包含9.8mM(NH4)2SO4、0.47mM CaCl2、2.7mM KH2PO4、1.0mM MgSO4、10μM FeSO4、9.1μMMnCl2、11.7μM Na2B4O7、0.57μM ZnSO4、0.2μM CuCl2、0.12μM VOSO4、0.16μM NaMoO4、30nM CoSO4和10mM麦芽糖(pH3.5)的基质中在55℃下有氧生长15小时。通过离心回收培养液。
在酶纯化过程中，所有柱色谱的运行都是在4℃下进行的。通过用对-硝基苯基α-D-麦芽戊糖苷(Sigma-Aldrich)作为底物，用分光光度分析对α-淀粉酶活性进行测定。该试验混合物在40μl 50mM的醋酸钠缓冲液(pH4.0)中包含1mM对-硝基苯基α-D-麦芽戊糖苷和酶样品。将其在55℃下培养20分钟后，向该反应混合物中加入100μl 1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)。在405nm下以吸光度的方式测定所释放的对-硝基苯酚。
将回收的培养液用DEAE Sepharose Fast Flow (AmershamPharmacia Biotech UK Ltd.Buckinghamshire，UK)柱色谱进行处理。在20mM下将0.5M Na-MES缓冲液(pH6.0)加入该培养液中并用NaOH将pH调节至6.0。将由1.65升培养物所制得的液体样品加载到用缓冲液2[20mM Na-MES缓冲液(pH6.0)、0.5mM CaCl2和1.0mM MgSO4]进行了平衡的DEAE Sepharose Fast Flow柱(100ml：内径4.4×6.6cm)上。在用缓冲液2洗涤后，用NaCl的线性梯度(0-0.45M，在缓冲液2中)对酶进行洗脱。将该步骤重复四次以对6.6升培养物进行处理。将四次色谱运行的活性级分合并并用缓冲液3[20mM醋酸钠缓冲液(pH3.0)、0.5mM CaCl2和1.0mM MgSO4]对其进行透析。将进行了透析的样品加载到用缓冲液3平衡的SP Sepharose Fast Flow柱(80ml：内径4.4×5.3cm，AmershamPharmacia Biotech UK)上。在用缓冲液3进行洗涤后，用NaCl的线性梯度(0-0.6M，在缓冲液3中)对酶进行洗脱。收集活性成分。在用缓冲液2进行透析后，将该酶样品加载到用缓冲液2平衡的Q Sepharose Fast Flow柱(30ml：内径2.5×6.2cm，Amersham Pharmacia Biotech UK)上。在用缓冲液2洗涤后，用NaCl的线性梯度(0-0.8M，在缓冲液2中)对酶进行洗脱。收集活性级分并用Centriplus YM-30(Millipore Co.，USA)将其浓缩至3.5ml。用缓冲液4[20mM Na-MES缓冲液(pH6.0)、0.5mM CaCl2、1.0mMMgSO4和0.15M NaCl]使浓缩了的样品通过HiPrep Sephacryl S-300 HRl6/60(Amersham Pharmacia Biotech UK)。得到9ml包含具有α-淀粉酶活性的酶的级分。用缓冲液5[20mM Na-MES缓冲液(pH6.0)、0.5mM CaCl2、1.0mM MgSO4和50mM NaCl]对该酶样品进行透析并通过浓缩器用Centricon YM-30(Millipore Co.，USA)反复进行浓缩/稀释将其浓缩至0.1lml。在SDS-PAGE上，纯化了的酶主要表现出约160kDa的分子量。最后，获得0.47mg纯度为约80％的具有α-淀粉酶活性的酶。
实施例3：酸热脂环酸杆菌的具有α-淀粉酶活性的酶进行的2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗坏血酸的转化
对实施例2中由酸热脂环酸杆菌纯化得到的具有α-淀粉酶活性的酶进行的2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗坏血酸的转化进行了试验。该反应混合物在20μl中包含10％2-酮基-L-古洛糖酸钠单水合物(用HCl将pH调至2.5)和酶(100或200μg/ml)。将该反应在厌氧条件下在80℃下进行24小时。用实施例1中所描述的方法对L-抗坏血酸进行分析。通过由含和不含酶的反应液所获得的结果之间的差异来测定生物学产生的L-抗坏血酸的量。100μg/ml酶产生3.90g/l L-抗坏血酸，200μg/ml酶产生4.22g/l L-抗坏血酸。
实施例4：由解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及猪胰腺的α-淀粉酶进行的2-酮基-D-葡糖酸向D-异抗坏血酸的转化
对实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及猪胰腺的α-淀粉酶进行的2-酮基-D-葡糖酸向D-异抗坏血酸的转化进行了试验。用溶解于缓冲液1中的α-淀粉酶来进行该转化反应。该反应混合物在50μl100mM缓冲液中包含5％2-酮基-D-葡糖酸半钙盐(Sigma-Aldrich)、4mMCaCl2和400μg/ml的α-淀粉酶。各反应混合物中的缓冲液如表2所示。将该反应在厌氧条件下在70℃下进行20小时。用与分析L-抗坏血酸所用的方法(如实施例1所述)相同的方法来对D-异抗坏血酸进行分析。通过由含和不含α-淀粉酶的反应液所获得的结果之间的差异来测定生物学产生的D-异抗坏血酸的量。将所产生的D-异抗坏血酸的量概括地列于表2中。
表2
  α-淀粉酶* 酶(μg/ml)   缓冲液(pH) D-异抗坏血酸(mg/l)
    10068     400 醋酸Na(pH5.0)     64.7
    A4551     400 醋酸Na(pH5.0)     69.5
    A4268     400 Na-MES(pH5.5)     60.5
*产品号码
实施例5：由酸热脂环酸杆菌的具有α-淀粉酶活性的酶进行的2-酮基-D-葡糖酸向D-异抗坏血酸的转化
对实施例2中由酸热脂环酸杆菌纯化得到的酶进行的2-酮基-D-葡糖酸向D-异抗坏血酸的转化进行了试验。该反应混合物在20μl中包含5％2-酮基-D-葡糖酸半钙盐(用HCl将pH调至2.5)和酶(0或200μg/ml)。将该反应在厌氧条件下在70℃下进行21小时。用实施例4所述的方法对D-异抗坏血酸进行分析。通过由含和不含酶的反应液所获得的结果之间的差异来测定生物学产生的D-异抗坏血酸的量。含酶的反应液产生了76.0mg/l的D-异抗坏血酸。

Claims (10)

1.一种由2-酮基-L-古洛糖酸制备L-抗坏血酸或由2-酮基-D-葡糖酸制备D-异抗坏血酸的方法，其包括分别将含有2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸的溶液与α-淀粉酶或具有α-淀粉酶活性的酶进行接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中的溶剂是一种选自水、醇以及其混合物的水性溶剂。
3.如权利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在0℃至120℃的温度范围内与酶进行接触的。
4.如权利要求3所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在20℃至100℃的温度范围内与酶进行接触的。
5.如权利要求4所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在37℃至90℃的温度范围内与酶进行接触的。
6.如权利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在1.5至12的pH范围内与酶进行接触的。
7.如权利要求6所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在1.5至8的pH范围内与酶进行接触的。
8.如权利要求6所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在2至7的pH范围内与酶进行接触的。
9.如权利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸选自游离酸和金属盐。
10.如权利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在37℃至90℃的温度范围内和在2至7的pH范围内与具有α-淀粉酶活性的酶进行接触的。
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