DE602005004557T2

DE602005004557T2 - Verfahren zur herstellung von mycophenolat-mofetil mittels enzymatischer umesterung

Info

Publication number: DE602005004557T2
Application number: DE602005004557T
Authority: DE
Inventors: Paride Grisenti; Paolo Prestileo
Original assignee: Poli Industria Chimica SpA
Current assignee: Poli Industria Chimica SpA
Priority date: 2004-09-03
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2025-07-27
Also published as: EP1784497A1; DK1784497T3; HRP20080081T3; ITMI20041703A1; DE602005004557D1; CN101035904B; NO20071602L; AR050289A1; HK1107120A1; US7727751B2; TW200621989A; WO2006024582A1; JP4880604B2; ATE384802T1; EP1784497B1; CN101035904A; JP2008511309A; US20080085542A1; TWI354703B

Description

Mykophenolatmofetil (MMF; Registriernummer 128794-94-5), der Ester der Mykophenolsäure (MPS; Registriernummer 24280-93-1) mit N-(2-Hydroxyethyl)morpholin (Registriernummer 622-40-2) ist ein Immunsuppressivum, das gegenwärtig bei der Behandlung von Patienten, die eine Nierentransplantation erhalten haben, verwendet wird.
Nach oraler Verabreichung wird MMF zu MPS hydrolysiert, die das tatsächliche immunsuppressive Mittel ist, weil sie ein starker Inhibitor der Inosinmonophosphatdehydrogenase ist (B. J. Bornes, A. E. Eakin, R. A. Izydore und I. H. Hall Biochemical Pharmacology, 62, (2001), S. 91–100).
MMF wurde zum ersten Mal im US-Patent 4,753,935 (1987, dem das Patent EP 028713B1 entspricht) beschrieben: In dem Patent wird die Herstellung von MMF mittels des konventionellen Verfahrens der Veresterung von MPS mit N-(2-Hydroxyethyl)morpholin beschrieben. Dieses Verfahren sieht die Kondensation zwischen MPS und N-(2-Hydroxyethyl)morpholin mittels des Säurechlorids der MPS oder mittels der Verwendung eines Kondensationsmittels, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, vor. Dieses Syntheseverfahren hat allerdings den Nachteil, dass es neben der Bildung des gewünschten Produkts wegen der gleichzeitigen Anwesenheit eines phenolischen Hydroxyls und einer Lactonfunktion zusätzlich zu der Carboxylgruppe im Molekül zu einer Reihe von sekundären MPS-Polykondensationsprodukten führt.
Um dieses Problem zu lösen, sind kürzlich alternative Verfahren zur Herstellung von MMF entwickelt worden. Einige Verfahren, die in den Patentanmeldungen WO 00-34503 (2000) und WO 03-042393 (2003) beschrieben werden, berichten über die Herstellung von MMF unter Verwendung eines biokatalytischen Verfahrens durch die Reaktion zwischen MPS und N-(2-Hydroxyethyl)morpholin mittels enzymatischer Katalyse. Dafür ist bekannt, dass viele hydro lytische Enzyme, wie z. B. Lipasen, Esterasen oder Proteasen, die heutzutage einfach kommerziell erhältlich sind, die in organischen Lösungsmitteln und unter strenger Kontrolle der Versuchsbedingungen (dem Wassergehalt, dem pH, der Temperatur, der Gegenwart von Tensiden und Wasserscavengern) verwendet werden, nicht nur in der Lage sind, die Hydrolyse von nicht natürlichen Substraten durchzuführen, sondern auch die Synthese von Estern zu katalysieren (Klibanov A. M. CHEMTECH, 1986, 16, 354; Schopineau J., McCafferty F. D., Therisod M., Klibanov A. M. Biotechnol. und Bioeng. 1988, 31, 208; Therisod M., Klibanov A. M. Journal of Chemical American Society, 1987, 109, 3977).
Allerdings sind diese enzymatischen Verfahren auch nicht vollkommen zufriedenstellend, weil die Gegenwart von Wasser, das während der Veresterungsreaktion entsteht oder im Reaktionsmedium enthalten ist, einen beachtlichen Einfluss auf den Grad des Fortschritts der Reaktion hat, während die Verwendung eines Tensids in dem Reaktionsmedium die nachfolgenden MMF-Aufreinigungsverfahren aus dem Reaktionsrohprodukt erschweren kann. Zusätzlich kann die Art des verwendeten organischen Lösungsmittels einen starken Einfluss auf die Reaktionskinetik und die katalytische Effizienz des Enzyms haben, was in einigen Fällen zu langen Reaktionszeiten führt, um einen Grad des Fortschritts der Reaktion zu erzielen, der für die Anwendung dessen in industriellen Schlüsselherstellungen annehmbar ist.
Wir entschieden daher zu ermitteln, ob es nicht möglich wäre, geeignete Versuchsbedingungen zu finden, die uns ermöglichen würden, die Herstellung von MMF durch die Verwendung von Enzymen, mittels einer Durchführung in Abwesenheit von Tensiden und ohne strenge Kontrolle der pH-Bedingungen und der Gegenwart von Wasser im Reaktionsmedium durchzuführen. Weil die Literatur zahlreiche Beispiele der Anwendung von enzymatischen Umesterungsreaktionen, die von Lipasen katalysiert werden, in der organischen Chemie beschreibt, entschieden wird, zu ermitteln, ob dieser Ansatz auch erfolgreich für die Herstellung von MMF eingesetzt werden könnte (E. Santaniello, P. Ferraboschi und P. Grisenti. Enzyme Microb. Technol. 1993, Band 15, S. 367–382). Um dieses zu tun, wäre es nötig gewesen, die geeignetsten hydrolytischen Enzyme für die Durchführung von sowohl der MPS-Veresterungsreaktion mit einem einfachen Alkohol als auch die nachfolgende Umesterung mit N-(2-Hydroxyethyl)morpholin zu identifizieren.
Während des Studiums verschiedener Reaktionsbedingungen für die enzymatische Veresterung von MPS mit verschiedenen aliphatischen Alkoholen und während der Verwendung verschiedener Lipasen (Triacylglycerollipasen, EC 3.1.1.3) als dem enzymatischen Katalysator, ermittelten wir überraschenderweise, dass die Veresterung, katalysiert von Candida antarctica-Lipase (CAL B, Novozym 435), von MPS mit aliphatischen Alkoholen mit einem niedrigen Molekulargewicht, wie z. B. Ethanol oder Methanol, in von 30 bis 40 Stunden quantitativ zu den entsprechenden Ethyl- oder Methylestern führt. Dieses Verfahren, das denselben aliphatischen Alkohol (d. h. Methanol oder Ethanol) als einziges Reaktionslösungsmittel verwendet, wird durch die Bildung von Wasser, das in der Reaktionsumgebung gebildet wird, nicht signifikant beeinträchtigt und erfordert nicht die Verwendung eines Tensids.
Zusätzlich ermöglichte CAL B uns, bei den Versuchsbedingungen, außer der Verwendung von Isopropanol, 2,2,2-Trifluorethanol, 2,2,2-Trichlorethanol, n-Propanol und n-Butanol als Reaktionslösungsmittel, die wir verwendeten, analog zu der Verwendung von Methanol und Ethanol, die entsprechenden MPS-Ester zu erhalten.
Die nachfolgende Umesterungsreaktion dieser MPS-Ester mit N-(2-Hydroxyethyl)morpholin in Tetrahydrofuran (THF), immer noch katalysiert durch CAL B, erwies sich als geeignet, ohne die Verwendung eines Tensids oder die Verwendung in einer wasserfreien Umgebung vorzusehen, quantitativ zu MMF zu führen, (1).
Die Spezifität zwischen MPS und CAL B war um so mehr überraschend, wenn man berücksichtigt, dass unter den gleichen Versuchsbedingungen andere Lipasen, wie z. B. Pseudomonas cepacia-Lipase (PCL) oder Candida rugosa-Lipase (CRL) sich nicht in der Lage zeigten, zu den entsprechenden Methyl- oder Ethylestern zu führen oder die Umesterungsreaktion mit N-(2-Hydroxyethyl)morpholin zu katalysieren.
Solche Lipasen, die in der Literatur dafür bekannt sind, dass sie in der Lage sind, Veresterungs- und Umesterungsreaktionen von verschiedenen nicht natürlichen Substraten zu katalysieren, sind anscheinend nicht in der Lage, unter den Versuchsbedingungen, die wir verwendeten, MPS in ihr aktives Zentrum aufzunehmen.
Die MPS-Veresterungsreaktion wird auf eine typische Weise unter Verwendung von CAL B als Enzym und einem geeigneten Alkohol als Lösungsmittel, bevorzugt einem C₁-C₄-Alkylalkohol oder einem halogenierten Derivat davon, durchgeführt. Die bevorzugte Menge des verwendeten Enzyms beträgt von 20 bis 60 mg pro mmol MPS, bevorzugt 53 mg. Die MPS-Konzentration beträgt von 0,05 bis 0,2 mol/l, bevorzugt 0,1 mol/l. Die Reaktion wird unter Rühren bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, bevorzugt 30°C, für einen Zeitraum von 30 bis 40 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wird durch die Entfernung des Enzyms mittels Filtration und Konzentrierung des Filtrats unter Vakuum abgeschlossen.
Die Umesterungsreaktion von MPS-Estern mit N-(2-Hydroxyethyl)morpholin wird auf eine typische Weise unter Verwendung von CAL B als Enzym und einem aprotischen polaren organischen Lösungsmittel, bevorzugt mit einem log P von weniger als 0,5 und noch stärker bevorzugt THF oder 1,4-Dioxan, durchgeführt.
Die bevorzugte Menge des verwendeten Enzyms beträgt von 50 bis 150 mg pro mmol Substrat, bevorzugt 107 mg. Die Konzentration des Substrats beträgt von 0,1 bis 0,3 mol/l, bevorzugt 0,25. Das Molverhältnis zwischen dem MPS-Ester und N-(2-Hydroxyethyl)morpholin beträgt von 0,2 bis 0,4, bevorzugt 0,3. Die Reaktion wird unter Rühren bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, bevorzugt bei von 25 bis 30°C, für einen Zeitraum von 24 bis 36 Stunden durchgeführt und wird dann durch die Entfernung des Enzyms mittels Filtration und Konzentrierung des Filtrats unter Vakuum abgeschlossen. Alternativ kann die MPS-Veresterungsreaktion und die nachfolgende Umesterungsreaktion mit N-(2-Hydroxyethyl)morpholin unter Wiederverwendung des gleichen Enzyms ohne, im Vergleich zur Verwendung als "frisches" Enzym, scheinbaren Verlust der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden.
Zusätzlich kann CAL B unter den oben beschriebenen Versuchsbedingungen in mehreren Verwendungszyklen sowohl bei der Veresterung als auch bei der Umesterung ohne jeden nennenswerten Verlust katalytischer Aktivität verwendet werden.
Experimenteller Teil
Beispiel 1
Herstellung von Mykophenolsäureethylester (2)
1,01 g (3,15 mmol) MPS werden unter Rühren bei einer Temperatur von 30°C in 37,5 ml reinem Ethanol gelöst und dann werden 170 mg CAL B hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird unter starkem Rühren für 40 Stunden bei einer Temperatur von 30°C gehalten und dann wird die Reaktion abgeschlossen: das Enzym wird mittels Filtration entfernt und die filtrierte Lösung wird unter Vakuum unter Gewinnung eines öligen Rückstandes konzentriert. Der ölige Rückstand wird mit Dichlormethan (20 ml) aufgenommen und die erhaltene organische Lösung wird in dieser Reihenfolge mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung (15 ml) und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum unter Gewinnung von 1,042 g (2,99 mmol; 95% Ausbeute) Mykophenolsäureethylester (2) konzentriert, der direkt ohne jede weitere Aufreinigung im nächsten Syntheseschritt verwendet wird.
Elementaranalyse berechnet für C₁₉H₂₄O₆: C = 65,50; H = 6,94; O = 27,55. Ist: C = 65,42; H = 6,90; O = 27,44.
Massenspektrum (analytische Fragmente): 349 (m + 1), 348 (Molekülion), 303 (m – 45)
¹H-NMR (500 MHz) CDCl₃: 1,16 (t, 3H, CH₃-CH₂-), 1,76 (s, 3H, CH3-C=), 2,15 (s, 3H, CH₃-Ar), 2,26 (m, 2H, CH₂-C=), 2,35 (m, 2H, CH₂CO), 3,35 (d, 2H, CH₂Ar), 3,75 (s, 3H, OCH₃), 4,04 (q, 2H, CH₃-CH₂O), 5,16 (s, 2H, ArCH₂O), 5,20 (t, 1H, CH=).
Die folgenden MPS-Ester wurden ebenfalls in analoger Art und Weise hergestellt: Methylester, 2,2,2-Trifluorethylester, 2,2,2-Trichlorethylester, Propylester, i-Propylester, n-Butylester.
Methylester (1)

Elementaranalyse berechnet für C₁₈H₂₂O₆: C = 64,66; H = 6,63; O = 28,71. Ist: C = 64,59; H = 6,54; O = 28,65
Massenspektrum (analytische Fragmente): 335 (m + 1), 334 (Molekülion), 303 (m – 31).

n-Propylester (3)
Elementaranalyse berechnet für C₂₀H₂₆O₆: C = 66,28; H = 7,23; O = 26,49. Ist: C = 66,18; H = 7,15; O = 26,37
Massenspektrum (analytische Fragmente): 363 (m + 1), 362 (Molekülion), 319 (m – 43),
Isopropylester (4)

Elementaranalyse berechnet für C₂₀H₂₆O₆: C = 66,28; H = 7,23; O = 26,49. Ist: C = 66,20; H = 7,17; O = 26,40.
Massenspektrum (analytische Fragmente): 363 (m + 1), 362 (Molekülion), 319 (m – 43).

2,2,2-Trifluorethylester (5)

Elementaranalyse berechnet für C₁₉H₂₁F₃O₆: C = 56,72; H = 5,26; F = 14,17; O = 23,86. Ist: C = 56,63; H = 5,18; F = 14,11; O = 23,80.
Massenspektrum (analytische Fragmente): 403 (m + 1), 402 (Molekülion), 303 (m – 99).

2,2,2-Trichlorethylester (6)

Elementaranalyse berechnet für C₁₉H₂₁Cl₃O₆: C = 50,52; H = 4,69; Cl = 23,54; O = 21,25. Ist: C = 50,43; H = 4,65; Cl = 23,45; O = 21,14.
Massenspektrum (analytische Fragmente): 458 (m + 6), 456 (m + 4), 454 (m + 2), 452 (Molekülion), 303 (m – 149).

n-Butylester (7)

Elementaranalyse berechnet für C₂₁H₂₈O₆: C = 67,00; H = 7,50; O = 25,50. Ist: C = 66,92; H = 7,42; O = 25,40.
Massenspektrum (analytische Fragmente): 377 (m + 1), 376 (Molekülion), 303 (m – 73).

Beispiel 2
Herstellung von MMF mittels Umesterung von Mykophenolsäureethylester
195 mg (0,56 mmol) Mykophenolsäureethylester werden unter Rühren bei einer Temperatur von 25 bis 30°C in wasserfreiem THF (2 ml) gelöst. 60 mg CAL B und 0,23 ml (249 mg, 1,9 mmol) N-(2-Hydroxyethyl)morpholin werden dann hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird unter Rühren für 35 Stunden bei einer Temperatur von 25 bis 30°C gehalten. Nach diesem Zeitraum wird die Reaktion abgeschlossen: das Enzym wird mittels Filtration entfernt und die filtrierte Lösung wird unter Gewinnung eines öligen Rückstandes unter Vakuum konzentriert. Der ölige Rückstand wird mit Dichlormethan (20 ml) aufgenommen und die erhaltene organische Lösung wird in dieser Reihenfolge mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung (15 ml) und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Gewinnung von 206 mg (0,45 mmol; 82% Ausbeute) MMF unter Vakuum konzentriert. Für analytische Zwecke wird dieses Produkt mittels Chromatographie über Silikagel (1/100 = p/p) aufgereinigt: mittels Elution mit Dichlormethan/Methanol = 96/4 v/v, 143 mg aufgereinigtes MMF werden zurückgewonnen.
¹H-NMR (500 MHz) CDCl₃: 1,80 (s, 3H, CH₃-C=), 2,18 (s, 3H, CH₃-Ar), 2,20–2,45 (m, 4H, CH₂-N und CH₂-C=), 2,48 (m, 4H, 2 CH₂-N), 2,60 (m, 2H, CH₂CO), 3,40 (d, 2H, CH₂Ar), 3,78 (m, 4H, CH₂O), 3,80 (s, 3H, OCH₃), 4,20 (t, 2H, CH₂O), 5,15–5,30 (m, 3H, CH₂O und CH=).
MMF wurde in analoger Art und Weise mittels Umesterung, auch ausgehend von den folgenden MPS-Estern hergestellt: Methylester, 2,2,2-Trifluorethylester, 2,2,2-Trichlorethylester, n-Propylester, i-Propylester, n-Butylester.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Mykophenolatmofetil (MMF), worin ein Ester der Mykophenolsäure (MPS) mit einem aliphatischen Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht mit N-(2-Hydroxyethyl)morpholin in der Gegenwart von Candida Antarctica-Lipase umgeestert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der aliphatische Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht ein C₁-C₄-Alkylalkohol oder ein halogeniertes Derivat davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der C₁-C₄-Alkylalkohol oder sein halogeniertes Derivat ausgewählt ist aus Methanol, Ethanol, Isopropanol, 2,2,2-Trifluoroethanol, 2,2,2-Trichloroethanol, n-Propanol oder n-Butanol.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Umesterungsreaktion in einem aprotischen polaren organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das aprotische polare organische Lösungsmittel einen log P von weniger als 0,5 hat.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das aprotische polare organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus THF und Dioxan und bevorzugt THF ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Umesterungsreaktion ohne ein Tensid durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Menge der Lipase 50 bis 150 mg, bevorzugt 107 mg pro mmol des Substrats beträgt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Konzentration des Substrats 0,1 bis 0,3, bevorzugt 0,25 molar ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Molverhältnis zwischen dem MPS-Ester und dem N-(2-Hydroxyethyl)morpholin 0,2 bis 0,4, bevorzugt 0,3 beträgt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Umesterungsreaktion unter Schütteln bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, bevorzugt von 25 bis 30°C, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die MPS-Veresterungsreaktion in der Gegenwart von Candida Antarctica-Lipase unter Verwendung des korrespondierenden Alkohols als Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Menge der Lipase zwischen 20 und 60 mg, bevorzugt 53 mg pro mmol MPS beträgt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 12 und 13, worin die Konzentration der MPS 0,05 bis 0,2 molar, bevorzugt 0,1 molar ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 12 bis 14, worin die Veresterungsreaktion unter Schütteln bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, bevorzugt 30°C, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 12 bis 15, worin die Veresterungsreaktion ohne ein Tensid durchgeführt wird.