DE69829282T2

DE69829282T2 - Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alkoholen

Info

Publication number: DE69829282T2
Application number: DE69829282T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Meabashi-shi NAGAOKA
Original assignee: Sanyo Foods Co Ltd
Current assignee: Sanyo Foods Co Ltd
Priority date: 1997-12-29
Filing date: 1998-12-28
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2018-12-29
Also published as: EP0978567A1; EP0978567A4; US6218581B1; WO1999034010A1; EP0978567B1; DE69829282D1; JP3294860B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Alkohols aus einem Substrat unter Verwendung einer immobilisierten wasserlöslichen Proteinkomponente, die aus Körnchen, Bohnen oder anderen pflanzlichen Quellen, als Katalysator extrahiert wird.
Optisch aktive Alkohole sind als Rohmaterialien oder intermediäre Rohmaterialien für pharmazeutische Produkte und Agrochemikalien als auch Zwischenprodukte, auf dem Gebiet von Feinchemikalien, für Produkte, wie beispielsweise ferroelektrische Flüssigkristalle, äußerst bedeutsame Substanzen.
Bekannte Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung optisch aktiver Alkohole bestehen im Reagieren lassen einer Substanz mit 1) Mikroorganismen und Enzymen aus Mikroorganismen, 2) Enzymen, die von tierischem Gewebe stammen und 3) kultivierten Pflanzenzellen zur Biosynthese einer optisch aktiven Substanz, wie beispielsweise einem optisch aktiven Alkohol.
Das Mikroorganismen einsetzende, vorstehend unter 1) genannte, Verfahren stellt ein Verfahren dar, um optisch aktiven Alkohol durch Reaktion einer Substanz mit kultivierten Mikroorganismen zu erhalten, wobei ein bekanntes Beispiel davon in dem Japanischen Patent 2784578 (ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver 1,2 Diole) offenbart ist.
Außerdem ist das vorstehend unter 2) genannte Verfahren, das ein von Mikroorganismen stammendes Enzym verwendet, ein Verfahren, um optisch aktiven Alkohol durch Reaktion eines Substrats mit einer homogenisierten Flüssigkeit kultivierter Mikroorganismen durch Einführen eines Gens zu erhalten, wobei ein bekanntes Beispiel davon in der ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichung 10-210981 (neues Protein, das die Umwandlung von Halohydrin zu einem optisch aktiven Diol katalysiert) offenbart ist.
Außerdem ist das vorstehend unter 3) genannte Verfahren, das ein Enzym verwendet, das aus tierischem Gewebe stammt, ein Verfahren, um optisch aktiven Alkohol durch Reaktion eines Substrats mit einem aus tierischem Gewebe isolierten Protein zu erhalten, wobei ein bekanntes Beispiel davon in dem Japanischen Patent 2756790 offenbart ist.
Außerdem ist die vorstehend unter 4) genannte Reaktion, die kultivierte Pflanzenzellen verwendet, ein Verfahren, um optisch aktiven Alkohol durch Reaktion eines Substrats mit Pflanzenzellen zu erhalten, wobei ein Beispiel dafür in der Literatur (Chem. Pharm. Bull. 43, 1458–1461) berichtet wird.
Wie aus dem Japanischen Patent 2784578 (ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver 1,2-Diole) und dem Japanischen Patent 2774341 (ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven 2-Hydroxysäurederivats) bekannt ist, synthetisieren Verfahren unter Verwendung der vorstehend unter 1) genannten "Mikroorganismen" optisch aktiven Alkohol durch Züchten von Mikroorganismen in einer Kulturlösung, in dem geeignete Kulturbedingungen eingestellt werden, wobei diese Kulturflüssigkeit behandelt wird, um durch Zentrifugation oder Filtration getrennt zu werden, um die Mikroorganismen zu gewinnen und einen Ketonkörper asymmetrisch zu reduzieren, der als ein Substrat in einer Flüssigkeit verwendet wird, in der die Mikroorganismen in 0,1 M Phosphatpuffer oder in destilliertem Wasser und so weiter suspendiert waren. Da neben der Substratumwandlungsreaktion andere Nebenreaktionen gleichzeitig ablaufen, die durch die verschiedenen in den Mikroorganismen vorkommenden Typen von Enzymen verursacht werden, ist die Ausbeute des Zielprodukts bzw. Testprodukts eines optisch aktiven Alkohols gering. Selbst wenn außerdem die Isolation und Aufreinigung zur Entfernung des Testprodukts eines optisch aktiven Alkohols aus einer das Reaktionsprodukt beinhaltenden Lösung funktioniert, ist es aufgrund der geringen Reinheit des sich ergebenden optisch aktiven Alkohols schwierig es als Synthesezwischenprodukt auf dem Gebiet von Feinchemikalien zu verwenden. Verfahren, die, wie in der ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichung 10-210981 (neues Protein, um die Umwandlung von Halohydrin zu einem optisch aktiven Diol zu katalysieren) offenbart, die vorstehend unter 2) genannten "von Mikroorganismen stammenden Enzyme" verwenden, sind Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Epihalohydrine und optisch aktiver Diole unter Verwendung transformierter Mikroorganismen, wobei Gene, die durch genetische Rekombinationsverfahren kloniert wurden in großer Anzahl in den Mikroorganismen vorkommen (siehe ebenfalls Naemura et al., Tetrahedron: Assymetry 4 (1993), 911–918; Bradshaw et al., J. Org. Chem. 57 (1992), 1532–1536; DE 4205391 und EP 0 645 453 ). Da bei den die Mikroorganismen verwendenden Verfahren in dem Reaktionsverfahren selbst keine großen Unterschiede vorkommen, können die während der Substratreaktion ablaufenden Nebenreaktionen nicht kontrolliert werden, wodurch bewirkt wird, dass dieser Vorgang die gleichen Probleme aufwirft wie die "Mikroorganismen" verwendenden Verfahren. Da außerdem mikrobielle Stämme mit eingeführten Genen heterogene Varietäten in der natürlichen Welt darstellen, besteht das Risiko schädlicher Wirkungen auf den Menschen und anderer Mitglieder des Ökosystems. Folglich ist eine finanzielle Belastung für eine Ausrüstung zur Isolierung aus der äußeren Umwelt bzw. Umgebung als auch eine Verbrennungsbehandlung von Reaktionsresten und so weiter erforderlich. Zusätzlich sind, wie aus dem Japanischen Patent 2756790 (ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Cyclopentenolderivats) bekannt ist, stellen Verfahren, die die vorstehend unter 3) genannten "von tierischem Gewebe abgeleiteten Enzyme" verwenden, Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Cyclopentenolderivats dar, die eine asymmetrische Hydrolysereaktion mit einer Pankreaslipase vom Schwein verwenden (siehe ebenfalls Naemura et al., Tetrahedron: Assymetry 4 (1993), 911–918). Wie in "Organic Chemistry for Biology 3 – Proteins", ediert von Kazuo Satake, Seiten 114–172 (Asakwa Shoten Publishing) beschrieben, kommen Nebenreaktionen in der gleichen Weise wie vorstehend unter 1) und 2) genannt vor, da die von dem tierischen Gewebe stammenden Enzyme unbearbeitete bzw. rohe Enzyme sind, was zu einer unvermeidbaren Verringerung der Ausbeute führt. Zusätzlich weisen die Verfahren, die die vorstehend unter 4) genannten "kultivierte Pflanzenzellen" verwenden, das Problem einer geringen Ausbeute optisch aktiven Alkohols auf, da neben der Substratumwandlungsreaktion andere Nebenreaktionen ablaufen, die durch die verschiedenen in den Pflanzen vorkommenden Enzyme bewirkt werden (siehe ebenfalls Akababe et al., Phytochemistry 30 (1991), 3595–3597; Akababe et al., Phytochemistry 35 (1994), 661–664; Akababe et al., J. Chem. Soc. Perkins. Trans. (1993), 1295–1298 und JP 8103289 ). Zusätzlich ist das Züchten der kultivierten Pflanzenzellen schwierig, wie durch die Notwendigkeit eines sterilen Vorgehens während des gesamten Verfahrens angezeigt wird. Außerdem ist eine Zeitdauer für wiederholtes Subklonieren von 1 bis 2 Jahren zusammen mit der Herstellung einer Reaktionsnährstoffkulturflüssigkeit (beispielsweise MS-Medium) für die Reaktion mit dem Substrat erforderlich, wodurch der Nachteil eines komplexen Reaktionsverfahrens erzeugt wird.
Um die vorstehend erwähnten Probleme zu lösen, besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin ein Herstellungsverfahren bereitzustellen, um optisch aktiven Alkohol mit hoher optischer Reinheit zu erhalten, der zur organischen Synthesechemie verwendet wird, wobei ein aus weltweit erzeugten, preiswerten Körnchen oder Bohnen, extrahiertes, wasserlösliches Protein als ein optischer Abtrennkatalysator verwendet wird, was umweltfreundlich ist und eine beträchtliche Verringerung bei den Reaktionskosten gestattet.
Das Herstellungsverfahren, um optisch aktiven Alkohol mit hoher optischer Reinheit unter Verwendung des vorstehend erwähnten optischen Abtrennkatalysators in der vorliegenden Erfindung zu erhalten, beinhaltet im Allgemeinen die nachstehend angezeigten Verfahren.

1) Ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Alkohols umfassend, ein selektives Oxidieren eines Substrats in der Form eines Enantiomers eines racemischen Alkohols, um ein Keton zu erhalten, was dem anderen Enantiomer gestattet nicht-umgesetzt zu verbleiben und Abtrennen des optisch aktiven Alkohols.
2) Ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Alkohols umfassend, eine asymmetrische Hydrolyse eines Substrats in der acylierten Form eines racemischen Alkohols.
3) Ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Alkohols umfassend, ein selektives Acylieren eines Enantiomers eines racemischen Alkohols in einem organischen Lösungsmittel, Hydrolysieren des sich ergebenden acylierten Enantiomers und Abtrennen des optisch aktiven Alkohols.

Als Ergebnis der Durchführung ernsthafter Forschung nach einem Verfahren, um optisch aktiven Alkohol einer hohen optischen Reinheit zu erhalten, das die vorstehend erwähnten Aufgaben löst, sicher und einfach ist, stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung fest, dass die R und S-Form optisch aktiven Alkohols einer hohen Reinheit, der als Rohmaterial zur Synthese von Synthesezwischenprodukten auf dem Gebiet von Feinchemikalien ausreichend verwendet werden kann, sowohl sicher als auch einfach durch Kombination eines ersten Schritts, der Extrahieren der wasserlöslichen Proteine aus Körnchen oder Bohnen umfasst, wobei die wasserlöslichen Proteine ein Enzym einschließen, das ein aus einem racemischen Alkohol, einem Keton und einer acylierten Form eines racemischen Alkohols ausgewähltes Substrat in einen optisch aktiven Alkohol umwandeln kann, eines zweiten Schritts, der Immobilisieren der vorstehend erwähnten Proteins umfasst, eines dritten Schritts, der Ausführen einer Enzymumwandlungsreaktion des als Rohmaterial dienenden Substrats unter Verwendung des Enzyms als Katalysator mit einem nicht-polaren oder polaren Lösungsmittel umfasst, eines vierten Schritts, der Extrahieren des Reaktionsgemischs, das durch den dritten Schritt unter Verwendung eines nicht-reaktiven organischen Lösungsmittels umgesetzt wurde und eines fünften Schritts erhalten werden kann, der Isolieren und Reinigen eines optisch aktiven Alkohols oder der acylierten Form eines optisch aktiven Alkohols aus dem Extrakt des vierten Schritts umfasst, wenn nötig außerdem gefolgt durch einen Hydrolyseschritt, was zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung führt.
Obwohl Beispiele von Körnchen oder Bohnen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, Körnchen wie beispielsweise Buchweizen, Bischofsholz, Reis, Weizen, Gerste, Mais, Hafer, Roggen, Borstenhirse, Hühner-Hirse, Hirse, Hiobsträne und Sorghum oder Bohnen wie beispielsweise Adsuki-Bohnen, Gartenbohnen bzw. weiße Bohnen, grüne Erbsen, grüne Bohnen und Sojabohnen umfassen, sind sie nicht auf diese beschränkt.
Bei der Extraktion eines wasserlöslichen Proteins im ersten erfindungsgemäßen Schritt, werden die Körnchen oder Bohnen zerkleinert, wobei große Stücke und Hülsen bzw. Schoten entfernt werden und die auf diese Weise erhaltenen fein zerkleinerten Körnchen oder Bohnen werden für 30 Minuten oder länger in Wasser, das 7–15-mal dem Gewicht des zerkleinerten Körnchen- oder Bohnenmehls entspricht, bei ungefähr 20–60°C und vorzugsweise ungefähr 40°C und einem pH-Wert von ungefähr 6–8 und vorzugsweise pH 7.0 extrahiert.
Es ist am wirksamsten für 45 Minuten zu extrahieren und selbst wenn länger als diese Zeit extrahiert wird, ändert sich die Menge des Extrakts nicht. Ist es notwendig den pH-Wert einzustellen, dann kann der pH-Wert auf den vorstehend erwähnten optimal Bereich unter Verwendung einer lebensmittelgeeigneten Säure wie beispielsweise H₂SO₄, HCl oder H₃PO₄ oder einer lebensmittelgeeigneten Base wie beispielsweise NaOH eingestellt werden. Der vorstehend erwähnte wasserlösliche Proteinextrakt oder Proteingerinnsel, der durch Abtrennen von Lebensmittelfaserbestandteilen aus diesem Extrakt durch Abkippen oder Abtrennzentrifugation erhalten wird, wird entweder direkt zu dem zweiten Schritt überführt, oder zu dem zweiten Schritt überführt nachdem er durch Sprühtrocknen, Gefriertrocknen oder Vakuumtrocknen und so weiter in ein Pulver umgebildet wurde und dann nötigenfalls erneut gelöst wird.
Ist es jedoch notwendig eine große Proteinmenge zu behandeln, dann wird das vorstehend erwähnte Proteingerinnsel einer Behandlung am isoelektrischen Punkt unter Verwendung einer lebensmittelgeeigneten Säure, wie beispielsweise H₂SO₄, HCl oder H₃PO₄ oder einer lebensmittelgeeigneten Base, wie beispielsweise NaOH unterzogen, gefolgt durch Abtrennen der Molke durch Dekantieren oder Abtrenn-Zentrifugation, um Proteingerinnsel zu erhalten. Diese isoelektrische Präzipitation wird zu dem Zweck ausgeführt, um das wasserlösliche Protein zu konzentrieren, wobei nach der Behandlung die Wirkungen ähnlich zu dem gezeigten Fall sind, bei dem ein wasserlöslicher Proteinextrakt durch unmittelbares Sprühtrocknen und so weiter in ein Pulver umgebildet wird. Die Aufgabe den pH-Wert einer isoelektrischen Punkt-Präzipitation auszuwählen besteht darin die Fraktion mit der größten präzipitierten Menge zu wählen und befindet sich im Fall von Sojabohnen- und grünen Erbsenprotein in der Nähe von pH 4.5 und im Fall von Buchweizen bei einem pH-Wert von 9.5. Es werden 5–10-fach das Gewicht von Wasser zu dem Gerinnsel zugegeben, gefolgt durch Zerkleinern unter Verwendung eines Mixers oder Rührers, um eine Proteinaufschlämmung herzustellen, und Neutralisation (pH-Wert 6–8), um eine neutrale Aufschlämmung zu erhalten. Nach Umsetzten dieser Aufschlämmung durch Sprühtrocknen, Gefriertrocknen oder Vakuumtrocknen und so weiter in ein Pulver in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, wird das Pulver erneut gelöst und zu dem zweiten Schritt überführt.
Um jedoch eine Deaktivierung durch thermische Denaturierung eines Proteins hinsichtlich der Erwärmungsbedingungen während des Sprühtrocknens zu verhindern, namentlich des in den Umwandlungsprozess einbezogenen Enzyms, muss die Temperatur auf eine Temperatur eingestellt werden, die die Temperatur des Proteinextrakts selbst daran hindert 80°C zu übersteigen.
In dem zweiten Schritt umfassen die Schritte bzw. Verfahren zum Immobilisieren des extrahierten Proteins beispielsweise: 1) einen Trägerkopplungsschritt, wobei das extrahierte Protein an einen wasserlöslichen Träger gekoppelt wird, bspw. ein Derivat eines Polysaccharids, wie beispielsweise Cellulose, Dextran oder Agarose und Polyacrylamidgel; 2) einen Kreuzvernetzungsschritt, wobei das extrahierte Protein durch Ausbilden von Vernetzungsbindungen zwischen den extrahierten Proteinen unter Verwendung eines Reagenzes mit mindestens zwei funktionellen Gruppen immobilisiert wird; und 3) einen Einkapselungsschritt, wobei das extrahierte Protein entweder in die Feinmatrix eines Gels wie beispielsweise Arginat, Stärke, Konjak (Devil's Tongue Jelly), Polyacrylamidgel oder ein Gel aus Polyvinylalkohol und so weiter (Matrixtypen) eingebaut wird oder mit einer semipermeablen Beschichtung (Mikrokapseltyp) beschichtet wird. Jede dieser Immobilisierungsschritte kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein Einkapselungs-Immobilisierungsschritt unter Verwendung des Salzes von Alginsäure, die aus dem Seetang extrahiert wird, ist umweltfreundlich und stellt das einfachste Immobilisierungsverfahren dar, wodurch es das am meisten bevorzugte Verfahren ist.
In dem dritten Schritt werden nachfolgend Beispiele von Enzymumwandlungsverfahren bzw. schritten zum Erhalten eines optisch aktiven Alkohols oder der acylierten Form eines optisch aktiven Alkohols aus einem als das Rohmaterial dienenden Substrat, beschrieben.

(1) Ein Verfahren zum Erhalten eines optisch aktiven Alkohols umfassend, selektives Oxidieren eines Substrats in der Form von einem Enantiomer eines racemischen Alkohols, um ein Keton zu erhalten und dem anderen Enantiomer zu gestatten als optisch aktiver Alkohol nicht-reagiert zu verbleiben.
(2) Ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Alkohols umfassend, eine asymmetrische Reduktion eines Substrats in der Form eines Ketonmoleküls.
(3) Ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Alkohols umfassend, eine asymmetrische Hydrolyse eines Substrats in der acylierten Form eines racemischen Alkohols.
(4) Ein Verfahren zum Erhalten eines optisch aktiven Alkohols umfassend, eine dreidimensionale Acylierung von einem Enantiomer eines Substrats in der Form eines racemischen Alkohols in einem organischen Lösungsmittel durch Acylhalogen oder Vinylacetat.

In diesen Reaktionen:
Bei der asymmetrischen Reduktionsreaktion, die das Ketonmolekül von (2) als Substrat verwendet, nimmt die Reinheit mit der Zeit ab, da die asymmetrische Reduktionsreaktion der Enzymumwandlung ohne 100% zu erreichen stoppt, sofern eine Extraktionsbehandlung an der Reaktionslösung nicht ausgeführt wird, sobald die Reaktion angehalten hat oder bevor sie anhält. Obwohl es somit notwendig ist den Anhaltezeitpunkt der Reaktion gemäß des Körnchen- oder Bohnentyps zu bestimmen und wenn die Reaktion bei einer Umwandlungsrate von ungefähr 20% anhält, dann sind die sterische Konfiguration und die optische Reinheit des sich ergebenden optisch aktiven Alkohols zu dem von dem Fall (1) unter Verwendung eines racemischen Alkohols für das Substrat gleich. In der Reaktion von (3), die eine acylierte Form eines racemischen Alkohols für das Substrat verwendet, ist es notwendig den Anhaltezeitpunkt der Reaktion gemäß der Körnchen- oder Bohnentypen zu bestimmen, da die optische Reinheit abnimmt, wenn die Umwandlungseffizienz 20% übersteigt. Obwohl die Ausbeute in dem Fall eines Anhaltens der Reaktion bei einer Umwandlungsrate von ungefähr 20% gering ist, ist die sterische Konfiguration und optische Reinheit des sich ergebenden optisch aktiven Alkohols ähnlich zu dem Fall von (1), in dem ein racemischer Alkohol als das Substrat verwendet wird. Zusätzlich gestattet die Reaktion von (4), die eine asymmetrische Acylierung durch eine asymmetrische Acylierungsreaktion verwendet, das Erhalten eines optisch aktiven Alkohols durch weiteres Hydrolysieren der acylierten Form, die aus der asymmetrischen Acylierungsreaktion hervorgeht. Da jedoch die optische Reinheit abnimmt, wenn die Umwandlungsrate der asymmetrischen Acylierungsreaktion ungefähr 20% übersteigt, ist es notwendig den Anhaltezeitpunkt der Reaktion gemäß des Körnchen- oder Bohnentyps zu bestimmen. Wird die Acylierungsreaktion bei einer Umwandlungsrate von ungefähr 20% angehalten, dann ist die sterische Konfiguration und optische Reinheit des sich ergebenden optisch aktiven Alkohols, der durch die folgende Hydrolyse erhalten wird, zu dem Fall von (1) ähnlich, der einen racemischen Alkohol als das Substrat verwendet. Erfindungsgemäß ist das Verfahren von (1) zum Erhalten optisch aktiven Alkohols durch selektives Oxidieren von einem Enantiomer unter Verwendung eines racemischen Alkohols als das Substrat, hinsichtlich von Ausbeute und so weiter, das am meisten bevorzugte. Die geeignete Reaktionstemperatur der vorstehend erwähnten Schritte (1) bis (4) liegt bei ungefähr 25–45°C und vorzugsweise 30–40°C und diese Reaktionen werden am meisten bevorzugt bei ungefähr 35°C ausgeführt. Außerdem kann bei den vorstehend erwähnten Reaktionen von (1) bis (4) Methanol oder Ethanol als ein nicht polares Lösungsmittel verwendet werden, obwohl Wasser als ein polares Lösungsmittel oder Aceton verwendet werden kann, wobei das polare Lösungsmittel Wasser das am meisten bevorzugte Lösungsmittel ist. Obwohl organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Benzen, Toluen, Heptan, Isopropylalkohol (trocken) und so weiter bei der Reaktion von (4) verwendet werden können, wird Benzen bevorzugt verwendet. Obwohl die Reaktionszeit gemäß des Substrats, des Ursprungs des wasserlöslichen Proteins und dem Reaktionstyp verschieden ist, beträgt sie ungefähr 2–15 Tage und die Reaktionen (2) bis (4) werden, wie vorher beschrieben, an dem Punkt der Umwandlungsrate angehalten, wenn sie ungefähr 20% erreicht hat.
Außerdem setzen sich die durch diese Reaktionen erhaltenen optisch aktiven Alkohole, abhängig von den Wirkungen der Substituentengruppen der Substrate, aus der S Form oder R-Form zusammen.
Nicht reaktive Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat, Diethylether und Dichlormethan können als organische Lösungsmittel für die Extraktion in dem vierten Schritt verwendet werden.
Obwohl am meisten bevorzugt wird, eine Kieselgelchromatographie oder Kieselgel-Dünnschichtchromatographie für das Isolations- und Reinigungsverfahren in dem fünften Schritt, wie in dem Japanischen Patent 2804247 (Reaktion einen immobilisierten Biokatalysator verwendend) beschrieben, zu verwenden, kann ein Isolations- und Reinigungsverfahren verwendet werden, das vor Einreichen der vorliegenden Erfindung bekannt war, wie beispielsweise ein Isolations- und Reinigungsverfahren, bei dem ein Teil der produktreichen Reaktionslösung aus dem Reaktionstank entfernt wird, die Reaktionslösung zu einem Kristallisationstank überführt wird, der auf die Präzipitationstemperatur des Produkts eingestellt wird, um das Produkt zu präzipitieren, wobei Substrat zu der Ausgangs- bzw. Mutterflüssigkeit nach Abtrennen durch Filtration zugegeben wird, die Lösung in den Reaktionstank zurückgeführt wird und eine Reihe von Reaktionsverfahren wiederholt werden, um das Produkt in dem Kristallisationstank in der Form einer Suspension anzureichern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen der Reaktionszeit und der Bildungsumwandlungsrate (S)-1-(2-Naphthyl)ethanols durch eine biologische Umwandlung zu 2-Acetonaphthon aufzeigt, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1-(2-Naphthyl)ethanol des Substratrecamats in der Form von 1-(2-Naphthyl)ethanols begleitet.
2 ist eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen der Reaktionszeit und der Bildungsumwandlungsrate für jeden des 1. bis 3. Zyklus der Reaktion von 1 zeigt, in dem die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen immobilisierten wasserlöslichen Proteins, wenn es ununterbrochen verwendet wird, dargestellt wird.
Die beste Art und Weise die Erfindung auszuführen
Obwohl das Folgende eine ausführliche Erläuterung der vorliegenden Erfindung, basierend auf deren Beispiele, bereitstellt, wird dies lediglich zum Zweck einer Erläuterung bereitgestellt und sollte nicht verstanden werden die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Alkohols durch selektives Oxidieren von einem Enantiomer eines racemischen Alkohols als Substrat von (1)
Beispiel 1 wasserlösliches Protein von grünen Erbsen)
Grüne Erbsen werden in einem ersten Schritt zerkleinert, die Hülsen entfernt und eine wasserlösliche Proteinkomponente von grünen Erbsen wird für ungefähr 45 Minuten in 9 Gewichtanteilen destillierten Wassers (ungefähr 40°C), bei einem pH-Wert von ungefähr 7.0, der unter Verwendung von NaOH auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt wird, gelöst. Die Lebensmittelfaser, die präzipitierte Komponente, wird entfernt und das Protein wird einer Präzipitation am isoelektrischen Punkt unterzogen, in dem der wasserlösliche Proteinanteil auf saure Bedingungen (ungefähr pH-Wert 4.5) gebracht wird. Nach erneutem Lösen des Proteinpräzipitats mit destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7.0, wird an der sich ergebenden wasserlöslichen Proteinlösung von grünen Erbsen (Probenkonzentration: 5.0%) eine Sprühtrocknungsbehandlung durchgeführt, um pulverisiertes Protein von grünen Erbsen zu erzeugen. Außerdem wird durch Lösen von Natriumarginat in einer wässrigen Lösung unter Verwendung von Sterilisationsbedingungen und einer Temperatur von 121°C für 20 Minuten eine wässrige Natriumarginatlösung hergestellt.
Nachfolgend werden, in dem zweiten Schritt, 200 ml destillierten Wassers entsprechend dem zehnfachen Gewichtsäquivalents zu 20 g Proteinpulver von grünen Erbsen zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 250 ml einer 5% wässrigen Natriumarginatlösung, die dem 1,5-fachen Gewichtsäquivalent entspricht und bis zur Einheitlichkeit gerührt. Die sich ergebende vermischte Natriumarginatlösung von grünen Erbsen wird in eine 0,6% wässrige Calciumchloridlösung, unter Verwendung einer Spritze und so weiter, getropft, um Calciumarginatgelkügelchen herzustellen, die Protein grüner Erbsen im immobilisierten Zustand beinhalten. Weiterhin wird die Kügelchenschicht verfestigt, in dem ihr gestattet wird für mindestens 5 Stunden in einer 0,6% wässrigen Calciumchloridlösung zu stehen.
Fortführend, werden in dem dritten Schritt die Calciumarginatgelkügelchen von grünen Erben ausreichend mit destilliertem Wasser gewaschen, um die wässrige Calciumchloridlösung zu entfernen, gefolgt durch die Zugabe einer Reaktionslösung in der Form destillierten Wassers entsprechend dem 20-fachen Gewichtsäquivalent des verwendeten Proteinpulvers grüner Erbsen (400 ml). Nachdem unter Verwendung eines Schüttelinkubators mit konstanter Temperatur die Temperatur des destillierten Wassers auf 35°C eingestellt wurde, wurden Substratalkohole in der Form von 1-(2-Bromphenyl)ethanol, 1-(2-Chlorphenyl)ethanol, 1-(2-Methylphenyl)ethanol, 1-(2-Methoxyphenyl)ethanol, 1-(2-Nitrophenyl)ethanol, 1-Phenylethanol und 1-(2-Naphthyl)ethanol zugegeben, gefolgt durch eine Substratumwandlung durch Einstellen der entsprechenden Bedingungen des Schüttelinkubators auf 55 Upm.
In dem vierten Schritt, dem nach grobem Abtrennen der Kügelchen und dem Reaktionslösungsmittelanteil und ausreichendem Waschen der Kügelchen mit einem Lösungsmittel, wie beispielsweise destilliertem Wasser, die Fertigstellung der Reaktion folgt, wobei der Reaktionslösungsmittelanteil die Waschlösungsmittelflüssigkeit beinhaltet, wobei das Reaktionssubstrat und das Reaktionsprodukt mit Diethylether extrahiert wurde. Außerdem wurde nach einem Waschen der Etherschicht mit gesättigter Lauge bzw. Kochsalzlösung, die Etherschicht dehydriert und mit Natriumsulfat getrocknet und wurde stehen gelassen.
In dem fünften Schritt schließlich wird unter Verwendung eines Verdampfers die Diethyletherschicht entfernt und das optisch aktive Alkohol-Testprodukt wurde von dem Reaktionssubstrat und dem Reaktionsprodukt mit einem Entwicklungslösungsmittel, das Hexan und Ethylacetat in einem Verhältnis von 9:1 beinhaltet unter Verwendung einer Kieselgelchromatographie einer Siebnummer bzw. Porengröße von 70–230 isoliert und gereinigt.
Die sterische Konfiguration des isolierten optisch aktiven Alkohols wurde unter Bezugnahme auf die Literatur (J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 (1995), 1295–1298 und Photochemistry, 30 (11), 3595–3597) durch einen Vergleich zwischen dem Wert (+ oder –) und dem Drehwinkel des sich ergebenden optisch aktiven Alkohols erhalten. Die Retentionszeit der S-Form und R-Form der sterischen Konfigurationen des Substrats, die sich aus (±)-1-(4-Bromphenyl)ethanol und (±)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol zusammensetzen, wurden durch Hochdruck Flüssig Chromatographie (HPLC) Analysebedingungen einer chiralen Zelle 03 von 0,46 cm im Durchmesser × 25 cm (Daicel Chemical Industries) bestätigt: 30°, UV 254 nm, Eluat: Hexan:2-Propanol = 9:1 und Flussrate von 0,5 ml/Min. und Substrate die sich aus (±)-1-(4-Metoxyphenyl)ethanol und (±)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol zusammensetzen konnten unter Verwendung der Hochdruck Flüssig Chromatographie (HPLC) Analysebedingungen einer chiralen Zelle OB von 0,46 cm im Durchmesser × 25 cm (Daicel Chemical Industries) bestätigt werden, 30°, UV 254 nm, Eluat: Hexan:2-Propanol = 9:1 und einer Flussrate von 1,0 ml/Min.. Der Unterschied zwischen den Integralverhältnissen beider in der HPLC erscheinenden Spiegelbilder der sterischen Konfigurationen von der S-Form und der R-Form, wurden als die optische Reinheit (e.e = Enantiomerüberschuss) bestimmt.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Geräteanalyse wurden die Retentionszeiten von (±)-1-(4-Bromphenyl)ethanol für die S-Form zu 10,447 und für die R- Form zu 11,031, jene von (±)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol für die S-Form zu 9,936 und für die R-Form 10,355, jene von (±)-1-Phenylethanol für die S-Form 11,958 und für die R-Form 13,133, jene von (±)-1-(4-Naphthyl)ethanol für die S-Form 15,693 und für die R-Form 17,049, jene von (±)-1-(4-Metoxyphenyl)ethanol für die S-Form 9,165 und für die R-Form 10,781 und jene (±)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol für die S-Form 18,923 und für die R-Form 19,562, bestätigt wurden. Zusätzlich wurden die Retentionszeiten von 4-Bromacetphenon, 4-Chloracetophenon, 4-Methoxyacetphenon und 4-Nitroacetophenon, die durch Oxidation von jedem Substrat gebildet werden, auf ähnliche Weise auf 13,122; 10,304; 17,169 beziehungsweise 37,0208 bestätigt.
Synthese von (S)-1-(4-Bromphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem grünen Erbsenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Bromphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 8 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Bromacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1(4-Bromphenyl)ethanol begleitet, um 114 mg von (S)-1(4-Bromphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 57% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 88% e.e. wurde erhalten. Der Reaktionsverlauf und Zeit wurden bei Reaktionsabschluss durch GC unter Verwendung des Hitachi Modells G-3500 Gaschromatographen unter Bedingungen mit einem Trägergas bestimmt: He bei 0,48 ml/Min., Spaltverhältnis: 1/55, Ofentemperatur: 150°C, Einlasstemperatur: 250°C, Ausgangstemperatur. 250°C, Druck: 136, Flussratenwert: 42, Analysesäule: TC-5HT 0,25 mm I. D. × 30 M df (GL Science).
Synthese von (S)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem grünen Erbsenprotein für das Substrat (±)-1-(4Chlorphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 8 Tage um die biologische Umwandlung zu 4-Chloracetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1-(4-(Chlorphenyl)ethanol begleitet, um 84 mg von (S)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 42% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 87% e.e. wurde erhalten.
Synthese von (S)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem grünen Erbsenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 7 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Methoxyacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol begleitet, um 96 mg von (S)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 48% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 95% e.e. wurde erhalten. Weiterhin waren die HPLC-Bedingungen auf eine Flussrate von 1,0 ml/min. eingestellt, während die GC-Bedingungen auf eine Ofentemperatur von 190°C eingestellt waren.
Synthese von (R)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem grünen Erbsenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 4 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Nitroacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (S)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol begleitet, um 76 mg von (R)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 38% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 54% e.e. wurde erhalten. Die HPLC-Bedingungen wurden auf eine Flussrate von 0,5 ml/Min. eingestellt, während die GC-Bedingungen auf eine Ofentemperatur von 190°C eingestellt wurden.
Synthese von (S)-1-Phenylethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem grünen Erbsenprotein für das Substrat (±)-1-Phenylethanol (201 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 6 Tage, um die biologische Umwandlung zu Acetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1-Phenylethanol begleitet, um 122 mg von (S)-1-Phenylethanol mit einer Ausbeute von 61% zu erhalten. Eine optische Reinheit von 98% e.e. wurde erhalten.
Synthese von (R)-1-(2-Naphthyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem grünen Erbsenprotein für das Substrat (±)-1-(2-Naphthyl)ethanol (201 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 4 Tage, um die biologische Umwandlung zu 2-Acetonnaphton zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1-(2-Naphtyl)ethanol begleitet, um 100 mg von (S)-1-(2-Naphthyl)ethanol mit einer Ausbeute von 50% mit einer optischen Reinheit von 99% e.e. oder größer (siehe 1) zu erhalten.
Als nächstes werden die Ergebnisse der vorstehend erwähnten optisch aktiven Alkohole, die unter Verwendung immobilisierten grünen Erbsenproteins als optischer Abtrennkatalysator synthetisiert wurden, in der folgenden Tabelle gezeigt.
Auf der Basis des Vorstehenden wurde festgestellt, dass das wasserlösliche Protein grüner Erbsen als ein optischer Abtrennkatalysator wirksam ist, um Synthesezwischenprodukte auf dem Gebiet von Feinchemikalien zu synthetisieren, wodurch ermöglicht wird sowohl sicher als auch einfach die R-Form oder die S-Form von optisch aktiven Alkoholen mit hoher Reinheit zu erhalten.
Beispiel 2 (Sojabohnenprotein)
Der erste Schritt der Extraktion des wasserlöslichen Sojabohnenproteins und der zweite Schritt der Immobilisierung waren die gleichen wie in Beispiel 1. In dem dritten Schritt wurden nach dem Waschen der Sojabohnen-Calciumarginatgelkügelchen mit destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 35°C die racemischen Substratalkohole bestehend aus 1-(2-Bromphenyl)ethanol, 1-(2-Chlorphenyl)ethanol, 1-(2-Methylphenyl)ethanol, 1-82-Methoxyphenyl)ethanol, 1-(2-Nitrophenyl)ethanol und 1-(2-Naphthylphenyl)ethanol zugegeben, gefolgt durch die Substratumwandlung durch entsprechendes Einstellen der Bedingungen des Schüttelinkubators auf 55 Upm. Nach Durchlaufen des vierten und fünften Schritts unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie jenen, die für das grüne Erbsenprotein verwendet wurden, wurde die Auswertung der sich ergebenden optisch aktiven Alkohole in der gleichen Weise, wie während der Auswertung des grünen Erbsenproteins, ausgeführt.
Synthese von (R)-1-(4-Bromphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem Sojabohnenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Bromphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 2 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Bromacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (S)-1-(4-Bromphenyl)ethanol begleitet, um 108 mg von (R)-1-(4-Bromphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 54% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 88% e.e. wurde erhalten. Die Gerätebedingungen waren die gleichen wie für das immobilisierte grüne Erbsenprotein.
Synthese von (R)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem Sojabohnenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 3 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Chloracetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (S)-1-(4-Chlorphenly)ethanol begleitet, um 102 mg von (R)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol mit einer Reinheit von 51% zu erhalten. Eine optische Reinheit von 96% e.e. wurden erhalten.
Synthese von (R)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem Sojabohnenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 5 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Methoxyacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (S)-1-(4-Methoxyhenyl)ethanol begleitet, um 96 mg von (R)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 48% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 97% e.e. wurde erhalten.
Synthese von (S)1-(4-Nitrophenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem Sojabohnenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 4 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Nitroacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1-(4-Nitrohenyl)ethanol begleitet, um 90 mg von (S)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 45% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 99% e.e. wurde erhalten.
Als nächstes werden die Ergebnisse der vorstehend erwähnten optisch aktiven Alkohole, die unter Verwendung des immobilisierten Sojabohnenproteins als optischem Abtrennkatalysator synthetisiert wurden, in der folgenden Tabelle gezeigt.
Auf der Basis des Vorstehenden wurde festgestellt, dass das wasserlösliche Sojabohnenprotein als ein optischer Abtrennkatalysator wirksam ist, um Synthesezwischen produkte in dem Gebiet von Feinchemikalien zu synthetisieren, wodurch ermöglicht wird, sowohl sicher als auch einfach die R-Form oder die S-Form optisch aktiver Alkohole mit hoher Reinheit zu erhalten.
Beispiel 3 (Buchweizenprotein)
In dem ersten Schritt bei der Extraktion von wasserlöslichem Buchweizenprotein wurde nach einem Entfernen der Lebensmittelfaser durch gleichartiges Behandeln wie das grüne Erbsenprotein von Beispiel 1, unter alkalischen Bedingungen (ungefähr pH-Wert 9.5) eine isoelektrische Präzipitation ausgeführt, um unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie bei grünem Erbsenprotein wasserlösliches Buchweizenprotein zu erhalten. In dem zweiten Schritt wurde das Verfahren von Beispiel 1 ausgeführt, um Buchweizenprotein-Calciumarginatgelkügelchen zu erhalten. In dem dritten Schritt, wurde nachdem die Temperatur des destillierten Wassers auf 35°C eingestellt wurde, der racemische Substratalkohol in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 für den racemischen Substratalkohol, zugegeben, gefolgt durch eine Auswertung der optisch aktiven Alkohole, die durch ein Durchlaufen des vierten und fünften Schritts erhalten wurden.
Synthese von (R)-1-(4-Bromphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem Sojabohnenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Bromphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 11 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Bromacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (S)-1-(4-Bromphenyl)ethanol begleitet, um 114 mg von (R)-1-(4-Bromphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 57% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 88% e.e. wurde erhalten.
Synthese von (R)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem Sojabohnenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 13 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Chloracetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (S)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol begleitet, um 116 mg von (R)-1-(4-Chlorphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 58% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 91% e.e. wurde erhalten.
Synthese von (R)-4-Methoxyphenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem Sojabohnenprotein für das Substrat (±)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 6 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Methoxyacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (S)-1-(4-Methoxyhenyl)ethanol begleitet, um 112 mg von (R)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 46% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 99% e.e. wurde erhalten.
Synthese von (S)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol
Die biochemische Umwandlungsreaktion von immobilisiertem Sojabohnenprotein für das Substrat (±)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol (200 mg) erfordert, wie hierin gezeigt, 17 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Nitroacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1-(4-Nitrohenyl)ethanol begleitet, um 50 mg von (S)-1-(4-Nitrophenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 25% zu erhalten. Eine optische Reinheit mit 99% e.e. wurde erhalten.
Als nächstes werden die Ergebnisse der vorstehend erwähnten optisch aktiven Alkohole, die unter Verwendung des immobilisierten Sojabohnenproteins als optischem Abtrennkatalysator synthetisiert wurden, in der folgenden Tabelle gezeigt.
Auf der Basis des Vorstehenden wurde festgestellt, dass wasserlösliches Buchweizenprotein als ein optischer Abtrennkatalysator wirksam ist, um Synthesezwischenprodukte auf dem Gebiet von Feinchemikalien zu synthetisieren, wodurch ermöglicht wird, sowohl sicher als auch einfach die R-Form oder die S-Form von optisch aktiven Alkoholen mit hoher Reinheit zu erhalten.
Beispiel 4 (Wirksamkeit beständigen Recyclings von grünem Erbsen-, Sojabohnen und Buchweizenprotein)
Hinsichtlich der Wirksamkeit der ersten Runde des zweiten bis fünften Schritts unter Verwendung des, wie in den Beispielen 1 bis 3 gezeigt, im ersten Schritt hergestellten grünen Erbsen-, Sojabohnen- und Buchweizenproteins, wurde festgestellt, dass die als optische Abtrennkatalysatoren wirksamen Proteine, die als angemessene Synthesezwischenprodukte auf dem Gebiet von Feinchemikalien verwendet werden können, es ermöglichen sowohl sicher als auch einfach die R-Form oder S-Form von optisch aktiven Alkoholen mit hoher Reinheit zu erhalten. Beispiel 4 beschreibt die Ergebnisse einer Erfassung der Wirksamkeit wiederholten Recyclisieren (recycling) von immobilisiertem grünem Erbsen-, Sojabohnen- und Buchweizenprotein.
Wie in 2 gezeigt, wurde entsprechend der Ergebnisse von Beispiel 1 immobilisiertes grünes Erbsenprotein in der ersten Runde verwendet, um die R-Form des Racemats 1-(2-Naphthyl)ethanol zu 2-Acetonaphthon sterisch selektiv umzuwandeln und die übrige S-Form von 1-(2-Naphthyl)ethanol mit einer hohen optischen Reinheit von 99% e.e. oder höher zu synthetisieren. In dem vierten Schritt, dem der Abschluss der Reaktion folgt, wurde verwendetes, immobilisiertes grünes Erbsenprotein beständig recyclisiert und entsprechend der Ergebnisse wurde eine ähnliche Reaktion versucht, von dem dritten Schritt, wie in 2 gezeigt, ausgeht, wobei (S)-1-(2-Naphthyl)ethanol mit einer hohen Reinheit von 99% e.e. oder höher in ungefähr der halben Reaktionszeit der ersten Runde biosynthetisiert wurde. Außerdem wurde als ein Ergebnis in ähnlicher Weise eine dritte Runde der Reaktion versucht, wobei (S)-1-(2-Naphthyl)ethanol mit einer hohen optischen Reinheit von 99% e.e. oder höher in ungefähr 3/8 der Reaktionszeit biosynthetisiert wurde.
Als nächstes werden die Ergebnisse einer Synthese des Substrats 1-(2-Naphtyl)ethanol durch beständiges Recyclisieren immobilisierten grünen Erbsenproteins nachfolgend gezeigt.
Auf der Basis des Vorstehenden wurde festgestellt, dass das grüne Erbsenprotein als ein optischer Abtrennkatalysator wirksam ist, der Synthesezwischenprodukte auf dem Gebiet von Feinchemikalien synthetisiert, wodurch als Ergebnis einer möglichen Wiederverwendung eine großvolumige Synthese ermöglicht wird, und die R-Form oder S-Form von optisch aktiven Alkoholen sowohl sicher als auch einfach mit hoher Reinheit zu erhalten gestattet.
Außerdem erfordert in Beispiel 2 die biochemische Umwandlungsreaktion immobilisierten Sojabohnenproteins für das Substrat (±)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol (200 mg) 2 Tage, um die biologische Umwandlung zu 4-Methoxyacetophenon zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation von (R)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol begleitet, um 100 mg von (R)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol mit einer Ausbeute von 50% und einer optischen Reinheit von 99% e.e. oder höher, zu erhalten. In Beispiel 4 wurde als ein Ergebnis des Untersuchens einer ähnlichen Reaktion des im vierten Schritt verwendeten immobilisierten Sojabohnenproteins, das von Schritt 3 unter Verwendung des Substrats (±)-1-(4-Methoxyphenyl)ethanol wieder aufgenommen wurde, (R)-1-(4Methoxyphenyl)ethanol mit einer hohen optischen Reinheit von 99% e.e. oder höher in ungefähr der halben Reaktionszeit der ersten Runde biosynthetisiert. Außerdem wurde als Ergebnis des Versuchs einer dritten Runde der gleichen Reaktion (R)-1-(4Methoxyphenyl)ethanol mit einer hohen optischen Reinheit von 99% e.e. oder höher in der halben Reaktionszeit der ersten Runde biosynthetisiert.
Als nächstes werden die Ergebnisse einer Synthese des Substrats 1-(4-Methoxyphenyl)ethanol durch beständiges Recyclisieren immobilisierten Sojabohnenproteins nachfolgend gezeigt.
Auf der Basis des Vorstehenden wurde festgestellt, dass das Sojabohnenprotein als ein optischer Abtrennkatalysator wirksam ist, um Synthesezwischenprodukte auf dem Gebiet von Feinchemikalien zu synthetisieren, wodurch als ein Ergebnis einer möglichen Wiederverwendung eine großvolumige Synthese ermöglicht wird und die R-Form oder die S-Form von optisch aktiven Alkoholen sowohl sicher als auch einfach mit hoher Reinheit zu erhalten gestattet.
In Beispiel 3 erforderte die biochemische Umwandlungsreaktion des immobilisierten Buchweizenproteins für das Substrat (±)-1-(2-Naphthyl)ethanol (200 mg) 4 Tage, um die biologische Umwandlung zu 2-Acetonaphton zu durchlaufen, die die sterisch selektive Oxidation (R)-1-(2-Naphthyl)ethanol begleitet, um 100 mg von (S)-1-(2-Naphthyl)ethanol mit einer Ausbeute von 50% und einer optischen Reinheit von 99% e.e. oder höher zu erhalten. In Beispiel 4 wurde als ein Ergebnis eines Reagierens mit dem Substrat (±)-1-(2-Naphthyl)ethanol durch beständiges Recyclisieren von immobilisiertem Buchweizenprotein, das in diesem vierten Schritt von dem dritten Schritt verwendet wurde, optisch aktives (S)-1-(2-Naphthyl)ethanol mit einer optischen Reinheit von 99% e.e. oder höher erhalten, in dem ein Umwandlungsmechanismus, der (R)-1-(2-Naphthyl)ethanol sterisch selektiv zu 2-Acetonaphton in der gleichen Weise wie die erste Runde umsetzt. Kontinuierliches Recyclisieren immobilisierten Buchweizenproteins behielt die Wirksamkeit für mindestens drei Runden bei und es wurden keine Änderungen in der Reaktionszeit, chemischer Ausbeute oder optischer Reinheit beobachtet.
Als nächstes werden die Ergebnisse einer Synthese des Substrats 1-(2-naphthyl)ethanol durch kontinuierliches Recyclisieren von immobilisiertem Buchweizenprotein nachfolgend gezeigt. Auf der Basis des Vorstehenden wurde festgestellt, dass das Buchweizenprotein als ein optischer Abtrennkatalysator wirksam ist, um Synthesezwischenprodukte auf dem Gebiet von Feinchemikalien zu synthetisieren, wodurch als ein Ergebnis einer möglichen Wiederverwendung eine großvolumige Synthese ermöglicht wird und die R-Form oder die S-Form optisch aktiver Alkohole sowohl sicher als auch einfach zu erhalten gestattet.
Beispiel 5 (Weinstein-Buchweizenprotein)
Ein gemahlenes Pulver aus Weinstein-Buchweizenprotein wurde durch ein Sieb mit Netzstärke 12 geführt, um große Teilchen und Hülsen zu entfernen. Das auf diese Weise erhaltene wasserlösliche Protein des gemahlenen Pulvers wurde anschließend für 45 Minuten unter Verwendung einer Menge von destilliertem Wasser, die ungefähr 9 Gewichtsanteilen des Pulvers bei ungefähr 40°C entspricht und einem pH-Wert von 7.0, extrahiert. Die Lebensmittelfasern wurden von diesem Extrakt unter Verwendung eines Dekantiergefäßes abgetrennt, um ein Proteingerinnsel zu erhalten. 20 g diesen Proteingerinnsels wurden abgemessen, gefolgt von einem Aufbrechen in einem Mixer in 200 ml destillierten Wassers, das dem 10-fachen Gewicht des Proteingerinnsels entspricht, um eine Proteinaufschlämmung herzustellen.
Immobilisierte Kügelchen wurden unter Verwendung dieser Aufschlämmung in der gleichen Weise wie in dem zweiten Schritt von Beispiel 1 erhalten.
Synthese von (S)-1-Phenylethanol aus ±-1-Phenylethanol
Fortführend mit diesen immobilisierten Kügelchen als Katalysatoren, wurden 400 ml destillierten Wassers, das dem 20-fachen Gewicht von Weinstein-Buchweizengerinnsel entspricht, als Reaktionslösungsmittel zugegeben. Nachdem die Temperatur des destillierten Wassers unter Verwendung eines Schüttelkulturgefäßes mit konstanter Temperatur auf 35°C eingestellt wurde, wurden 201 mg von ±-1-Phenylethanol als Substrat zugegeben, wonach die Bedingungen des Kulturgefäßes auf 55 Upm eingestellt wurden und die Substratumwandlung für 8 Tage durchgeführt wurde. (S)-1-Phenylethanol wurde nach Durchlaufen des vierten und fünften Schritts unter ähnlichen wie bei grünem Erbsenprotein verwendeten Bedingungen, mit einer Umwandlungsrate von 50%, einer optischen Reinheit von 95% e.e. und einer Ausbeute von 42% erhalten. Die Ausbeute des gebildeten Acetophenons betrug 51% (102 mg).
Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Alkohols durch eine asymmetrische Reduktion unter Verwendung des Ketonmoleküls von (2) als Substrat
Beispiel 6 (Buchweizenprotein)
Immobilisierte Kügelchen wurden von gemahlenem Buchweizenpulver in der gleichen Wiese wie in Beispiel 2 erhalten.
Synthese von (S)-1-Phenylethanol aus Acetophenon
Fortführend unter Verwendung dieser immobilisierten Kügelchen als Katalysatoren, wurden 400 ml destillierten Wassers, das dem 20-fachen des Gewichts von Buchweizengerinnsel entspricht, als Reaktionslösungsmittel zugegeben. Nachdem die Temperatur des destillierten Wassers unter Verwendung eines Schüttelkulturgefäßes mit konstanter Temperatur auf 35°C eingestellt war, wurden 202 mg Acetophenon als Substrat zugegeben, wonach die Bedingungen des Kulturgefäßes auf 55 Upm eingestellt und die Substratumwandlung durchgeführt wurde. Bei dem vierten Schritt wurde das Umwandlungsprodukt mit Diethylether extrahiert und bei dem fünften Schritt wurde die Isolation und Reinigung unter Verwendung einer Kieselgelchromatographie (70–230 Siebstärke) und Hexan:Ethyl acetat = 9:1 für das Entwicklungslösungsmittel, durchgeführt. Das restliche Acetophenon betrug 50%. Die Reaktionsbedingungen, optische Reinheit, Ausbeute und sterische Konfiguration des sich ergebenden Phenylethanols werden in der folgenden Tabelle gezeigt.
Beispiel 7–12
Synthese von (S)-1-Phenylethanol aus Acetophenon
Die Substratumwandlung von Acetophenon wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 unter Verwendung von Bischofholzpulver, Gartenbohnenpulver, Hühner-Hirsepulver, Borstenhirsepulver und Weinstein-Buchweizenpulver ausgeführt. Das Übrige Acetophenon betrug 55%, 51%, 45%, 11% beziehungsweise 51%. Die Reaktionsbedingungen, Umwandlungsraten, optischen Reinheiten, Ausbeuten und sterischen Konfigurationen des sich ergebenden Phenylethanols werden in der folgenden Tabelle gezeigt.
Synthese von (S)-1-(2-Naphthyl)ethanol aus 2-Acetonaphton
Beispiel 13 (Weinstein-Buchweizenproteinpulver)
300 g eines Weinstein-Buchweizenpulvers werden in 2000 ml Wasser für 45 Minuten bei 40°C extrahiert, gefolgt durch eine Abtrennung der wasserlöslichen Komponente bei 7000 Upm/Min. für 20 Minuten durch Zentrifugation. Immobilisierte Kügelchen wurden anschließend aus dem sich ergebenden Präzipitat (fest) in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Wird die Reaktion für 4 Tage in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 unter Verwendung von 203 mg 2-Acetonaphthon als Substrat durchgeführt, dann wurde (S)-1-(2-Naphthyl)ethanol mit einer Ausbeute von 11% (105 mg) biosynthetisiert. Als ein Ergebnis bei Durchführen einer HPLC-Analyse von (S)-1-(2-Naphthyl)ethanol unter Verwendung einer chiralen Zelle OB (Daicel Chemical Industries) in einem Entwicklungslösungsmittel von Hexan:2-Propanol = 9:1, nach Einstellen der Flussrate auf 0,5 cm³/Min. und einer optischen Extinktion auf 254 nm, konnte eine Extinktion von 99% des S Alkohols mit einer Retentionszeit von 20,8 Minuten bestätigt werden, während eine Extinktion von 0,1% des R Alkohols mit einer Retentionszeit von 23,8 Minuten bestätigt wurde.
Industrielle Anwendbarkeit
Hohe Reinheit von R- oder S-Formen von optisch aktiven Alkoholen, die in ausreichender Weise als Katalysatoren verwendet werden können, um Synthesezwischenprodukte auf dem Gebiet von Feinchemikalien zu synthetisieren, können sowohl sicher als auch einfach durch Kombination erhalten werden, wobei ein erster Schritt Extrahieren eines wasserlöslichen Proteins aus Körnchen oder Bohnen umfasst, einen zweiten Schritt, der eine Immobilisierung des vorstehend erwähnten Proteins umfasst, einen dritten Schritt, der Ausführen einer Enzym vermittelten Umwandlungsreaktion an einem Substrat umfasst, das als das Rohmaterial unter Verwendung des vorstehend erwähnten immobilisierten Proteins als Katalysator, dient, einen vierten Schritt, der ein Extrahieren des durch den dritten Schritt umgesetzten vorstehend erwähnten Reaktionssubstrats und das Reaktionsprodukt mit organischem Lösungsmittel umfasst, und eine fünften Schritt, der ein Isolieren und Reinigen optisch aktiven Alkohols oder der acetylierten Form eines optisch aktiven Alkohols von dem Reaktionssubstrat und Reaktionsprodukt umfasst, das im vierten Schritt extrahiert wurde, gefolgt durch zusätzliche Hydrolyse falls notwendig.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Alkohols umfassend, einen ersten Schritt, der Extrahieren der wasserlöslichen Proteine aus Körnern oder Bohnen umfasst, wobei die wasserlöslichen Proteine ein Enzym einschließen, dass ein Substrat ausgewählt aus einem racemischen Alkohol, einem Keton und einer acylierten Form eines racemischen Alkohols in einen optisch aktiven Alkohol umwandeln kann, einen zweiten Schritt, der Immobilisieren der vorstehend angeführten Proteine umfasst, einen dritten Schritt, der eine Enzym vermittelte Umwandlungsreaktion des Substrats umfasst, das als Rohmaterial unter Verwendung des Enzyms als Katalysator mit einem nicht polaren oder polaren Lösungsmittel dient, einen vierten Schritt, der Extrahieren des durch den dritten Schritt unter Verwendung eines nicht reaktionsfähigen organischen Lösungsmittels umgewandelten Reaktionsgemischs umfasst, und einen fünften Schritt, der Isolieren und Reinigen eines optisch aktiven Alkohols oder der acylierten Form eines optisch aktiven Alkohols aus dem Extrakt des vierten Schritts umfasst, der zusätzlich, wenn notwendig von einem Hydrolyseschritt gefolgt wird.
Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Alkohols nach Anspruch 1, worin der Katalysator ein wasserlösliches Protein ist, das aus Körnern, wie beispielsweise Buchweizen, Bischofsholz, Reis, Weizen, Gerste, Mais, Hafer, Roggen, Borstenhirse, Hühner-Hirse, Hirse, Hiobsträne und Sorgho, oder Bohnen wie beispielsweise Adsuki-Bohnen, weißen Bohnen, grünen Erbsen, grünen Bohnen und Sojabohnen extrahiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Alkohols nach Anspruch 1, worin das Substrat einer Enzymumwandlung in dem dritten Schritt ein racemischer Alkohol ist und eines seiner Enantiomere selektiv oxidiert wird, um ein Keton zu erhalten, so dass das andere Enantiomer nicht reagiert als ein optisch aktiver Alkohol zurückbleibt.
Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Alkohols nach Anspruch 1, worin das Substrat einer Enzymumwandlung in dem dritten Schritt ein Keton ist und wobei die Herstellung durch asymmetrische Reduktion ausgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Alkohols nach Anspruch 1, worin das Substrat einer Enzymumwandlung in dem dritten Schritt eine acylierte Form eines racemischen Alkohols ist und wobei die Herstellung durch asymmetrische Hydrolyse ausgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Alkohols nach Anspruch 1, worin die Enzymumwandlung des dritten Schritts durch selektive Acylierung eines der Enantiomere eines racemischen Alkohols unter Verwendung von Acylhalogenid oder Vinylacetat ausgeführt wird, wobei der Extrakt in dem vierten Schritt die acylierte Form eines optisch aktiven Alkohols ist und wobei ein Hydrolyseschritt nach dem fünften Schritt eingeführt wird.