JP4913296B2 - 光学活性アルコール及びその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医農薬品等の原料として重要な新規光学活性アルコール、光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体およびそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬、農薬などの分野において、光学異性体間に著しい生理活性の相違があることが認識され、近年、光学活性体の重要性が益々高まっている。このような状況を踏まえ、種々の光学活性中間体の開発が望まれている。
これまでに、ラセミ体２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体についての製造例が報告されている（CA53;276a）。しかし、その光学活性体について未だ合成された例は知られていない。
また、特開平９−２８９８９７号公報には光学活性ｐ位ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体の合成の可能性を示唆する記載があるが、ｍ位ニトロ基置換体については同公報の製法で製造可能か否かは全く不明であった。
【０００３】
一方、微生物を利用してケトン体から光学活性なアルコールを得る方法、即ち酵素不斉還元技術を用いた光学活性中間体の合成法については以前より検討が行われている。例えば、前記反応にはパン酵母を代表とする微生物が最もよく用いられている。
また、近年、種々のケトン体から、光学活性なアルコールを合成する方法が開発されている（例えば有機合成協会誌Vol.59,659-669(2001)）。しかし、開示された化合物が限定された化合物のみで未だ充分とは言えない。その中でも、Tetrahedron,Vol.54,13059-13072(1998)には、光学活性ｐ位ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体の酵素不斉還元による合成法が報告されている。しかし、ｍ位ニトロ基置換体については何ら記載されていない。
すなわち、酵素反応の性格上、極めて高い基質選択的ゆえに、現状では、ｍ位置換体に応用できうるか全くわからないのが現状であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、医農薬品等の原料として重要且つ新規な光学活性アルコール、光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体およびそれらの製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、新規な光学活性アルコールを開発すべく鋭意検討を行った結果、酵素不斉還元により、新規な光学活性アルコールを製造できることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
一般式１（式中、Ｘはハロゲン原子を示す）で示される光学活性アルコール、（Ｒ）−２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体、
【化５】
および、一般式２（式中、Ｘはハロゲン原子を示す）で示される光学活性アルコール、（Ｓ）−２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体、
【化６】
さらに、一般式３
【化７】
（式中、Ｘはハロゲン原子を示す）で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノン誘導体を、一般式４
【化８】
（式中、Ｘはハロゲン原子を示し、＊は光学活性を表す。）で示される光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体に変換する能力を有する微生物菌体又は培養上清若しくはそれらの処理物を上記一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換２−ハロゲン置換アセトフェノンに接触せしめ、一般式４の光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体を採取する光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体の製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
一般式１で示される（Ｒ）−２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体、一般式２で示される（Ｓ）−２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体、一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノンおよび一般式４で示される光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体において、Ｘはハロゲン原子を示し、具体的には、塩素原子、臭素原子等が例示される。また、一般式４で示される光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体において、＊印は光学活性体であることを表す。
【０００８】
原料となる一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノン誘導体はｍ−ニトロアセトフェノンを定法によりハロゲン化することで合成可能である（例えばJ.Pharm.Sci.,Vol.56,28-32,1967,）。
本発明において使用する一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノンを一般式４で示される光学活性２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体に不斉還元する能力を有する微生物は、本反応を触媒し、一般式４で示される光学活性２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体を製造する能力を有する微生物菌体又は培養上清若しくはそれらの菌体処理物であればその種類及び起源を問わない。
【０００９】
一般に、本反応を触媒する微生物は、以下の方法によって見出すことができる。適当な培地、例えば、グリセロール30ｇ／Ｌ、酵母エキス10ｇ／Ｌ、ペプトン5ｇ／Ｌ 、ＫＨ2ＰＯ4 11g／ＬおよびＫ2ＨＰＯ4 3g／Ｌの組成からなる培地またはポテトデキスロース培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を殺菌後、微生物を植え、20℃〜40℃で２日間〜1週間振とう培養する。その後、菌体を遠心分離等の手段により集菌し、０．１〜１．０％の一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノンを含むリン酸緩衝液に適宜懸濁し、２〜３日間３０℃で振とう反応する。その際、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び／又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）及び／又はグルコースを含んだ反応液を用いることで反応の進行を促進することができる。
【００１０】
さらに、集菌された菌体をアセトン処理又は真空乾燥により乾燥したものを用いることも反応を促進させる場合がある。反応終了後の反応液は、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、生成した一般式４の光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体を高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製 Chiralcel OD）又はガスクロマトグラフィー（カラム：クロムパック社製 CP-Chirasil DEX CB 0.25mmID X 25M）により分析し、その光学純度および収率を測定する。この手法により、本反応を触媒する微生物を見出すことが可能である。
【００１１】
＜高速液体クロマトクロマトグラフィー分析条件＞
カラム；ダイセル化学工業株式会社製 Chiralcel OD
移動層；イソプロパノール/ｎ−ヘキサン＝１０：９０
流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；２４５ｎｍ
溶出順序；Ｒ体、Ｓ体の順で溶出される。
【００１２】
＜ガスクロマトグラフィー分析条件＞
カラム：クロムパック社製 CP-Chirasil DEX CB 0.25mmID X 25M
注入温度；２３０℃
検出温度；２３０℃
キャリアーガス；ヘリウム
カラム温度；１８０℃
検出；ＦＩＤ
溶出順序；Ｓ体、Ｒ体の順で溶出される。
【００１３】
そのような微生物としては、特に制限はないが、代表的なものとして、アブシディア（Absidia）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、オウレオバシディーム（Aureobasidium）属、ブラケセレア（Blakeslea）属、ボトリヨティニア（Botryotinia）属、カルダリオマイセス（Caldariomyces）属、セファロアスカス（Cephaloascus）属、カエトミィーム（Chaetomium）属、クーニングハメレラ（Cunninghamella） 属、ディポダスカス（Dipodascus）属、 エンドマイセス（Endomyces）属、ガラクトマイセス（Galactomyces）属、 ゲオトリカム（Geotrichum）属、ジベレラ（Gibberella）属、ヘリコステリューム（Helicostylum）属、ルーコスポリディーム（Leucosporidium）属、モルティレラ（Mortierella）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フィコマイセス（Phycomyces）属、ピシオシス（Pythiopsis）属、リゾプス（Rhizopus）属、スシタリディーム（Scytalidium）属、シネファラストラム（Syncephalastrum）属、サーモマイセス（Thermomyces）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、トリコセシーム（Trichothecium）属、バートシリューム（Verticillium）属およびジゴリンガス（Zygorhynchus）属等に属する微生物が挙げられる。
【００１４】
アブシディア（Absidia）属に属する微生物としては、例えば、Absidia atrospora IFO 9471、Absidia glauca IFO 4002、Absidia glauca IFO 4003およびAbsidia spinosa IFO 5873等が、アスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物としては、例えば、Aspergillus flavus IFO 5324、Aspergillus niger IAM 3008およびAspergillus sojae IAM 2703等が、オウレオバシディーム（Aureobasidium）属に属する微生物としては、例えば、Aureobasidium pullulans IFO 4464等が、ブラケセレア（Blakeslea）属に属する微生物としては、例えば、Blakeslea trispora IFO 5989等が、ボトリヨティニア（Botryotinia）属に属する微生物としては、例えば、Botryotinia fuckeliana IAM 5126等が、カルダリオマイセス（Caldariomyces）属に属する微生物としては、例えば、Caldariomyces fumago ATCC 11925等が、セファロアスカス（Cephaloascus）属に属する微生物としては、例えば、Cephaloascus albidus IFO 30596等が、カエトミィーム（Chaetomium）属に属する微生物としては、例えば、Chaetomium semispirale IFO 8363等が、クーニングハメレラ（Cunninghamella）属に属する微生物としては、例えば、Cunninghamella echinulata var.elegans IFO 4446およびCunninghamella echinulate IFO 6334等が、ディポダスカス（Dipodascus）属に属する微生物としては、例えば、Dipodascus aggregatus IFO 10816、Dipodascus ambrosiae IFO 10801、Dipodascus australiensis IFO 10805、Dipodascus capitatus IFO 10819、Dipodascus capitatus IFO 10820、Dipodascus capitatus IFO 1197、Dipodascus geniculatus IFO 10806、Dipodascus macrosporus IFO 10807、Dipodascus magnusii IFO 10808、Dipodascus magnusii IFO 110、Dipodascus magnusii IFO 4600、Dipodascus magnusii JCM 6360、Dipodascus magnusii JCM 6868、Dipodascus ovetensis IFO 1201、Dipodascus ovetensis JCM 6358、Dipodascus spicifer IFO 10809およびDipodascus tetrasperma IFO 10810等が、エンドマイセス（Endomyces）属に属する微生物としては、例えば、Endomyces decipiens IFO 0102等が、ガラクトマイセス（Galactomyces）属に属する微生物としては、例えば、Galactomyces citri-aurantii IFO 10821、Galactomyces geotrichum JCM 1945、Galactomyces geotrichum JCM 6359、Galactomyces reessii IFO 10823およびGalactomyces reessii JCM 1942等が、ゲオトリカム（Geotrichum）属に属する微生物としては、例えば、Geotrichum armillariae JCM 2454、Geotrichum candidum IFO 4597、Geotrichum capitatum JCM 3908、Geotrichum eriense JCM 3912、Geotrichum fermentans JCM 2467、Geotrichum fermentans JCM 2468、Geotrichum fragrans JCM 1749、Geotrichum klebahnii JCM 3913およびGeotrichum rectangulatum JCM 1750等が、ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物としては、例えば、Gibberella fujikuroi IFO 5268等が、ヘリコステリューム（Helicostylum）属に属する微生物としては、例えば、Helicostylum nigricans IFO 8091等が、ルーコスポリディーム（Leucosporidium）属に属する微生物としては、例えば、Leucosporidium scotti IFO 9474等が、モルティレラ（Mortierella）属に属する微生物としては、例えば、Mortierella humicola IFO 8188およびMortierella isabellina IFO 7824等が、ムコール（Mucor）属に属する微生物としては、例えば、Mucor javanicus IFO 4572等が、ニューロスポラ（Neurospora）属に属する微生物としては、例えば、Neurospora crassa IFO 6067およびNeurospora sitophila IFO 6069等が、ペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物としては、例えば、Penicillium carescens IFO 7108およびPenicillium citrium IAM 7008等が、フィコマイセス（Phycomyces）属に属する微生物としては、例えば、Phycomyces nitens IFO 9422等が、ピシオシス（Pythiopsis）属に属する微生物としては、例えば、Pythiopsis cymosa ATCC 26880等が、リゾプス（Rhizopus）属に属する微生物としては、例えば、Rhizopus microsporus IFO 4767およびRhizopus microsporus IFO 4768等が、スシタリディーム（Scytalidium）属に属する微生物としては、例えば、Scytalidium flavobrunneum JCM 6268、Scytalidium infestans IFO 32370およびScytalidium terminale IFO 6396等が、シネファラストラム（Syncephalastrum）属に属する微生物としては、例えば、Syncephalastrum racemosum IFO 4816等が、サーモマイセス（Thermomyces）属に属する微生物としては、例えば、Thermomyces lanuginosus IFO 9738等が、トリコデルマ（Trichoderma）属に属する微生物としては、例えば、Trichoderma longibrachiatum IFO 4847およびTrichoderma viride IFO 5720等が、トリコセシーム（Trichothecium）属に属する微生物としては、例えば、Trichothecium roseum IFO 4839等が、バートシリューム（Verticillium）属に属する微生物としては、例えば、Verticillium fungicola IFO 30616等が、ジゴリンガス（Zygorhynchus）属に属する微生物としては、例えば、Zygorhynchus exponens var.smithii IFO 6665等が例示される。
【００１５】
なお、ＩＦＯ、ＪＣＭ、ＩＡＭおよびＡＴＣＣにより番号が付された菌株は、財団法人 発酵研究所、理化学研究所 微生物系統保存施設、東京大学 分子細胞生物学研究所およびアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手することができる。
また、これらの微生物から単離した酵素遺伝子を各種宿主ベクター系に導入した遺伝子操作微生物の利用も可能である。
【００１６】
本発明において、これらの微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宜添加される。また、高い酵素活性を得るために、例えば、アセトフェノン等のケトン基あるいはカルボニル基を持つ化合物等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することが有効である場合がある。その培養は常法に従って行えばよく、例えば、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４０℃の範囲にて好気的に６時間〜１０日間培養する。また、静置培養で同様に培養することで高い酵素活性を得ることができる場合がある。
【００１７】
このようにして得られた微生物は、培地中で培養して得られる培養物をそのままか若しくは該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる微生物菌体又は培養上清、さらにはそれらの処理物の形で、一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換２−ハロゲン置換アセトフェノンと接触せしめ、一般式４の光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体を採取することにより、光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体製造することができる。
【００１８】
該処理物としては、変換反応を触媒する活性を示す限り、その使用形態は特に限定されず、乾燥菌体、アセトン等で処理した菌体、菌体の破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、粗酵素、精製酵素等が挙げられる。
【００１９】
微生物菌体、菌体培養液、それらの処理物を反応に供するに際しては、これらを適当な担体に固定化して用いることができる。例えば、架橋したアクリルアミドゲル、多糖類などで包括したり、イオン交換樹脂、珪藻土、セラミックなどの固体担体に物理的、化学的に固定化することができる。固定化して用いることにより、触媒活性が上昇する場合があるばかりではなく、反応終了後の触媒の分離／回収およびその再利用が容易になる。
さらに、通常これら触媒は１種類用いるが、同様な能力を有する２種以上のそれを混合して用いることも可能である。
【００２０】
本発明において、不斉還元反応による一般式４の光学活性２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体の生産は、以下の方法で行うことができる。
必要に応じて補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋及び／又はＮＡＤＰ＋）及び／又はグルコース、シュークロース、エタノール、メタノール等のエネルギー源の存在下、水又は緩衝液等の反応溶媒中で一般式３のｍ−ニトロ基置換アセトフェノン誘導体に上記の微生物菌体、菌体培養液、菌体処理物あるいはこれら微生物により生産される酵素等を接触させることにより行うことができる。そして、反応温度、必要により反応液のｐＨを制御しながら反応を行う。場合によっては反応の途中で反応基質（ｍ−ニトロ基置換アセトフェノン又はその塩）及び／又は前記補酵素、エネルギー源を適宜加え、反応を継続させてもよい。補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋）及び／又はグルコース、シュークロース、エタノール、メタノール等のエネルギー源等を加えることで目的化合物の収率が向上する場合が多い。
【００２１】
反応液の基質濃度は、０．０１〜５０質量％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．０５〜３０質量％が好ましい。
反応液中の微生物菌体等の濃度は、通常、０．００１〜２０質量％であり、好ましくは０．００５〜１０質量％である。
反応液のｐＨは用いる酵素の至適ｐＨ等を考慮し、総合的に決定され、特に制限はないが、一般的にはｐＨ４〜１１の範囲であり、好ましくはｐＨ５〜９である。また、反応が進行するに従いｐＨが変化してくる場合があるが、この場合は適当なｐＨ調整剤この場合は適当な中和剤、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、硫酸水溶液等を添加して最適pHに調整することが望ましい。
【００２２】
反応温度は用いる触媒の至適温度によって適宜決定されるもので特に制限はないが、０〜60℃が好ましく、５〜50℃がより好ましい。
反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、ｍ−ニトロ基置換アセトフェノン誘導体あるいはその塩の溶解を促進させるために有機溶媒あるいは界面活性剤を含んだ系でも反応を行うことができる。
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
【００２３】
界面活性剤としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等のアニオン界面活性剤、アルキルピリジニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド等のカチオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキル（フェニル）エーテル、ポリオキシエチレンアルキル（フェニル）エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（スパン系界面活性剤）、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（トゥイーン系界面活性剤）、ポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（トリトン系界面活性剤）、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン等の両性界面活性剤等を適宜使用できる。
【００２４】
また、これらの有機溶媒あるいは界面活性剤を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上することも多い。
反応時間は、通常、１時間〜１０日間、好ましくは３時間〜１週間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
【００２５】
尚、以上のような基質濃度、補酵素濃度、酵素濃度、ｐＨ、温度、溶媒、反応時間及びその他の反応条件はその条件における反応収率等を考慮して目的とする光学活性２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体が最も多く採取できる条件を適宜選択することが望ましい。
【００２６】
反応終了混合液からの目的物の単離は除菌後、濃縮、抽出、蒸留、カラム分離または結晶化等通常の公知の方法によって行うことができる。
例えば、必要に応じてｐＨを調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類、ヘキサン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、ブタノール、イソブタノール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒等一般的な溶媒により抽出分離することができる。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
＜実施例１＞
グリセロール30ｇ／Ｌ、酵母エキス10ｇ／Ｌ、ペプトン5ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 11g／ＬおよびＫ2ＨＰＯ4 3g／Ｌからなる培地１０ｍｌを試験管に分注し、１２１℃、１５分間加熱滅菌した後、表１に示す菌株を接種し、３０℃で２〜７日間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて集菌した。
【００２８】
集菌した菌体に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）１ｍｌ、ＮＡＤＨ ３．４ｍｇ、１０％２−クロロ−ｍ−ニトロアセトフェノンを含む酢酸エチル溶液１０μｌを加え、３０℃で２４時間反応させた。
【００２９】
反応終了後、同量に酢酸エチルを加え、２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールで抽出した。芒硝で抽出液を乾燥後、ガスクロマトグラフィー（カラム；CP-Chirasil DEX CB 0.25mmID X 25M ,クロムパック社製）で生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定した。結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
＜実施例２＞
ポテトデキスロース培地（Difco社製）１０ｍｌを試験管に分注し、１２１℃、１５分間加熱滅菌した後、表２に示す菌株を接種し、３０℃で２〜７日間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて集菌した。実施例１と同様に反応及び分析を行い、生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定した。結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】
＜実施例３＞
グリセロール30ｇ／Ｌ、酵母エキス10ｇ／Ｌ、ペプトン5ｇ／Ｌ 、ＫＨ2ＰＯ4 11g／ＬおよびＫ2ＨＰＯ4 3g／Ｌからなる培地１０ｍｌを試験管に分注し、１２１℃、１５分間加熱滅菌した後、表３に示す菌株を接種し、３０℃で２〜７日間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて集菌した。菌体をアセトンで３回洗浄し、アセトン処理菌体とした。
【００３４】
５．３２ｍｇの２−クロロ−ｍ−ニトロアセトフェノン、１００ｍＭ ＮＡＤＨ溶液 １７．７ｍｇおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに表１に示すアセトン処理菌体１５ｍｇを懸濁させ、３０℃で２４時間反応させた。実施例１と同様に分析を行い、生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定した。結果を表３に示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】
＜実施例４＞
実施例３と同様の培地２０００ｍｌでGeotrichum candidum IFO 4597を30℃で48時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて集菌した。この湿菌体を同質量の０．０４％２−メルカプトエタノールおよび０．１ｍＭジチオトレイトールを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）に懸濁させ、フレンチプレス（２０００ｋｇ／ｃｍ2）により２回破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、上清を回収した。その上清に４％硫酸プロタミン前記５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液溶液を同量加え、２〜５℃で一晩撹拌した。翌日、生じた不溶物を遠心分離で除去し、70％飽和まで硫酸アンモニウムを加え、２〜５℃で一晩放置した。得られた沈殿を遠心分離で回収し、前記５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解させ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で２〜５℃中、透析した。透析後の硫安分画溶液を５’ＡＭＰセファロース４Ｂ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製、乾燥質量0.25g）カラムに供した。１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）でカラムを洗浄後、同リン酸緩衝液に０．２ｍＭになるようにＮＡＤ+を溶解させた溶液で溶出させ、活性画分を酵素溶液とした。
【００３７】
５．３２ｍｇの２−クロロ−ｍ−ニトロアセトフェノン、１００ｍＭ ＮＡＤＨ溶液 １７．７ｍｇおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）０．９ｍｌに得られた酵素溶液０．１ｍｌを加え、３０℃で２４時間反応させた。実施例１と同様に分析を行い、生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定したところ、Ｒ体９９％ee以上であった。
【００３８】
＜実施例５＞
実施例３と同様の培地２０００ｍｌでDipodascus magnusii JCM 6360を30℃で48時間振とう培養した。培養終了後、実施例４と同様に透析まで処理し、硫安分画溶液を得た。実施例４の酵素溶液の代わりに硫安分画溶液を用いる以外は同様に反応させ、２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定したところ、Ｒ体９９％ee以上であった。
【００３９】
＜実施例６＞
実施例３と同様に調整したDipodascus magnusii JCM 6360株のアセトン粉末１００ｍｇおよびＮＡＤＨ ３０ｍｇを０．１Ｍ ＨＥＰＳ緩衝液（ｐＨ７）３ｍｌに懸濁および溶解させた後、１５ｍｇの２−クロロ−ｍ−ニトロアセトフェノンを９０μｌのメチルアルコールに溶解させたものを加え、３０℃で３日間反応させた。反応終了後、１．５ｍｌの酢酸エチルで抽出した。この抽出液を実施例１と同様に分析を行い、生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度およびその濃度をを測定したところ、９９％ｅｅ以上の、Ｒ−２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノール９．３ｍｇが存在することが確認できた。
【００４０】
＜実施例７＞
実施例６で得られた２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールは1H-NMRを用いたMosher法（J. A. Dale, H. S. Mosher, J. Am. Chem. Soc.,95,512(1973)）により絶対配置を決定した。以下に、手順と結果を示す。試料を2分割して、一方を市販のキラル誘導体化試薬(+)-R-メトキシトリフルオロメチルフェニル酢酸クロライド（(+)-R-MTPA・Cl）によりR-MTPAエステルとした。２分割した試料のもう一方を市販のキラル誘導体化試薬(-)-S-メトキシトリフルオロメチルフェニル酢酸クロライド（(-)-S-MTPA・Cl）によりS-MTPAエステルとした。R-MTPAエステルとS-MTPAエステルをそれぞれ、重水素化クロロホルムに溶解して、Varian社製フーリエ変換核磁気共鳴（FT-NMR）装置 UNITY INOVA 500 （1H共鳴周波数499.818MHz）にて室温で1H NMRスペクトルを測定した。CH2およびCHは以下のように観測された。
【００４１】
〔(+)-R-MTPAエステル1H NMR (499.818MHz, CDCl3, RT)δ6.156ppm（dd，J=4Hz，8Hz，1H，CH），3.836（dd，J=8Hz，12Hz，1H，CH2），3.762（dd，J=4Hz，12Hz，1H，CH2）〕
【００４２】
〔(-)-S-MTPAエステル1H NMR (499.818MHz, CDCl3, RT)δ6.208ppm（dd，J=5Hz，7Hz，1H，CH），3.818（dd，J=7Hz，12Hz，1H，CH2），3.756（dd，J=5Hz，12Hz，1H，CH2）〕
【００４３】
R-MTPAエステルとS-MTPAエステルの1H-NMRスペクトルのケミカルシフトを比較した結果、試料である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールはR体であることを確認した。
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、医農薬品等の原料として重要な新規な光学活性アルコール、光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体およびそれらの製造方法が提供される。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医農薬品等の原料として重要な新規光学活性アルコール、光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体およびそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬、農薬などの分野において、光学異性体間に著しい生理活性の相違があることが認識され、近年、光学活性体の重要性が益々高まっている。このような状況を踏まえ、種々の光学活性中間体の開発が望まれている。
これまでに、ラセミ体２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体についての製造例が報告されている（CA53;276a）。しかし、その光学活性体について未だ合成された例は知られていない。
また、特開平９−２８９８９７号公報には光学活性ｐ位ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体の合成の可能性を示唆する記載があるが、ｍ位ニトロ基置換体については同公報の製法で製造可能か否かは全く不明であった。
【０００３】
一方、微生物を利用してケトン体から光学活性なアルコールを得る方法、即ち酵素不斉還元技術を用いた光学活性中間体の合成法については以前より検討が行われている。例えば、前記反応にはパン酵母を代表とする微生物が最もよく用いられている。
また、近年、種々のケトン体から、光学活性なアルコールを合成する方法が開発されている（例えば有機合成協会誌Vol.59,659-669(2001)）。しかし、開示された化合物が限定された化合物のみで未だ充分とは言えない。その中でも、Tetrahedron,Vol.54,13059-13072(1998)には、光学活性ｐ位ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体の酵素不斉還元による合成法が報告されている。しかし、ｍ位ニトロ基置換体については何ら記載されていない。
すなわち、酵素反応の性格上、極めて高い基質選択的ゆえに、現状では、ｍ位置換体に応用できうるか全くわからないのが現状であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、医農薬品等の原料として重要且つ新規な光学活性アルコール、光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体およびそれらの製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、新規な光学活性アルコールを開発すべく鋭意検討を行った結果、酵素不斉還元により、新規な光学活性アルコールを製造できることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
一般式１（式中、Ｘはハロゲン原子を示す）で示される光学活性アルコール、（Ｒ）−２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体、
【化５】
および、一般式２（式中、Ｘはハロゲン原子を示す）で示される光学活性アルコール、（Ｓ）−２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体、
【化６】
さらに、一般式３
【化７】
（式中、Ｘはハロゲン原子を示す）で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノン誘導体を、一般式４
【化８】
（式中、Ｘはハロゲン原子を示し、＊は光学活性を表す。）で示される光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体に変換する能力を有する微生物菌体又は培養上清若しくはそれらの処理物を上記一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換２−ハロゲン置換アセトフェノンに接触せしめ、一般式４の光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体を採取する光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体の製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
一般式１で示される（Ｒ）−２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体、一般式２で示される（Ｓ）−２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体、一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノンおよび一般式４で示される光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体において、Ｘはハロゲン原子を示し、具体的には、塩素原子、臭素原子等が例示される。また、一般式４で示される光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体において、＊印は光学活性体であることを表す。
【０００８】
原料となる一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノン誘導体はｍ−ニトロアセトフェノンを定法によりハロゲン化することで合成可能である（例えばJ.Pharm.Sci.,Vol.56,28-32,1967,）。
本発明において使用する一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノンを一般式４で示される光学活性２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体に不斉還元する能力を有する微生物は、本反応を触媒し、一般式４で示される光学活性２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体を製造する能力を有する微生物菌体又は培養上清若しくはそれらの菌体処理物であればその種類及び起源を問わない。
【０００９】
一般に、本反応を触媒する微生物は、以下の方法によって見出すことができる。適当な培地、例えば、グリセロール30ｇ／Ｌ、酵母エキス10ｇ／Ｌ、ペプトン5ｇ／Ｌ 、ＫＨ2ＰＯ4 11g／ＬおよびＫ2ＨＰＯ4 3g／Ｌの組成からなる培地またはポテトデキスロース培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を殺菌後、微生物を植え、20℃〜40℃で２日間〜1週間振とう培養する。その後、菌体を遠心分離等の手段により集菌し、０．１〜１．０％の一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換アセトフェノンを含むリン酸緩衝液に適宜懸濁し、２〜３日間３０℃で振とう反応する。その際、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び／又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）及び／又はグルコースを含んだ反応液を用いることで反応の進行を促進することができる。
【００１０】
さらに、集菌された菌体をアセトン処理又は真空乾燥により乾燥したものを用いることも反応を促進させる場合がある。反応終了後の反応液は、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、生成した一般式４の光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体を高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製 Chiralcel OD）又はガスクロマトグラフィー（カラム：クロムパック社製 CP-Chirasil DEX CB 0.25mmID X 25M）により分析し、その光学純度および収率を測定する。この手法により、本反応を触媒する微生物を見出すことが可能である。
【００１１】
＜高速液体クロマトクロマトグラフィー分析条件＞
カラム；ダイセル化学工業株式会社製 Chiralcel OD
移動層；イソプロパノール/ｎ−ヘキサン＝１０：９０
流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；２４５ｎｍ
溶出順序；Ｒ体、Ｓ体の順で溶出される。
【００１２】
＜ガスクロマトグラフィー分析条件＞
カラム：クロムパック社製 CP-Chirasil DEX CB 0.25mmID X 25M
注入温度；２３０℃
検出温度；２３０℃
キャリアーガス；ヘリウム
カラム温度；１８０℃
検出；ＦＩＤ
溶出順序；Ｓ体、Ｒ体の順で溶出される。
【００１３】
そのような微生物としては、特に制限はないが、代表的なものとして、アブシディア（Absidia）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、オウレオバシディーム（Aureobasidium）属、ブラケセレア（Blakeslea）属、ボトリヨティニア（Botryotinia）属、カルダリオマイセス（Caldariomyces）属、セファロアスカス（Cephaloascus）属、カエトミィーム（Chaetomium）属、クーニングハメレラ（Cunninghamella） 属、ディポダスカス（Dipodascus）属、 エンドマイセス（Endomyces）属、ガラクトマイセス（Galactomyces）属、 ゲオトリカム（Geotrichum）属、ジベレラ（Gibberella）属、ヘリコステリューム（Helicostylum）属、ルーコスポリディーム（Leucosporidium）属、モルティレラ（Mortierella）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フィコマイセス（Phycomyces）属、ピシオシス（Pythiopsis）属、リゾプス（Rhizopus）属、スシタリディーム（Scytalidium）属、シネファラストラム（Syncephalastrum）属、サーモマイセス（Thermomyces）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、トリコセシーム（Trichothecium）属、バートシリューム（Verticillium）属およびジゴリンガス（Zygorhynchus）属等に属する微生物が挙げられる。
【００１４】
アブシディア（Absidia）属に属する微生物としては、例えば、Absidia atrospora IFO 9471、Absidia glauca IFO 4002、Absidia glauca IFO 4003およびAbsidia spinosa IFO 5873等が、アスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物としては、例えば、Aspergillus flavus IFO 5324、Aspergillus niger IAM 3008およびAspergillus sojae IAM 2703等が、オウレオバシディーム（Aureobasidium）属に属する微生物としては、例えば、Aureobasidium pullulans IFO 4464等が、ブラケセレア（Blakeslea）属に属する微生物としては、例えば、Blakeslea trispora IFO 5989等が、ボトリヨティニア（Botryotinia）属に属する微生物としては、例えば、Botryotinia fuckeliana IAM 5126等が、カルダリオマイセス（Caldariomyces）属に属する微生物としては、例えば、Caldariomyces fumago ATCC 11925等が、セファロアスカス（Cephaloascus）属に属する微生物としては、例えば、Cephaloascus albidus IFO 30596等が、カエトミィーム（Chaetomium）属に属する微生物としては、例えば、Chaetomium semispirale IFO 8363等が、クーニングハメレラ（Cunninghamella）属に属する微生物としては、例えば、Cunninghamella echinulata var.elegans IFO 4446およびCunninghamella echinulate IFO 6334等が、ディポダスカス（Dipodascus）属に属する微生物としては、例えば、Dipodascus aggregatus IFO 10816、Dipodascus ambrosiae IFO 10801、Dipodascus australiensis IFO 10805、Dipodascus capitatus IFO 10819、Dipodascus capitatus IFO 10820、Dipodascus capitatus IFO 1197、Dipodascus geniculatus IFO 10806、Dipodascus macrosporus IFO 10807、Dipodascus magnusii IFO 10808、Dipodascus magnusii IFO 110、Dipodascus magnusii IFO 4600、Dipodascus magnusii JCM 6360、Dipodascus magnusii JCM 6868、Dipodascus ovetensis IFO 1201、Dipodascus ovetensis JCM 6358、Dipodascus spicifer IFO 10809およびDipodascus tetrasperma IFO 10810等が、エンドマイセス（Endomyces）属に属する微生物としては、例えば、Endomyces decipiens IFO 0102等が、ガラクトマイセス（Galactomyces）属に属する微生物としては、例えば、Galactomyces citri-aurantii IFO 10821、Galactomyces geotrichum JCM 1945、Galactomyces geotrichum JCM 6359、Galactomyces reessii IFO 10823およびGalactomyces reessii JCM 1942等が、ゲオトリカム（Geotrichum）属に属する微生物としては、例えば、Geotrichum armillariae JCM 2454、Geotrichum candidum IFO 4597、Geotrichum capitatum JCM 3908、Geotrichum eriense JCM 3912、Geotrichum fermentans JCM 2467、Geotrichum fermentans JCM 2468、Geotrichum fragrans JCM 1749、Geotrichum klebahnii JCM 3913およびGeotrichum rectangulatum JCM 1750等が、ジベレラ（Gibberella）属に属する微生物としては、例えば、Gibberella fujikuroi IFO 5268等が、ヘリコステリューム（Helicostylum）属に属する微生物としては、例えば、Helicostylum nigricans IFO 8091等が、ルーコスポリディーム（Leucosporidium）属に属する微生物としては、例えば、Leucosporidium scotti IFO 9474等が、モルティレラ（Mortierella）属に属する微生物としては、例えば、Mortierella humicola IFO 8188およびMortierella isabellina IFO 7824等が、ムコール（Mucor）属に属する微生物としては、例えば、Mucor javanicus IFO 4572等が、ニューロスポラ（Neurospora）属に属する微生物としては、例えば、Neurospora crassa IFO 6067およびNeurospora sitophila IFO 6069等が、ペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物としては、例えば、Penicillium carescens IFO 7108およびPenicillium citrium IAM 7008等が、フィコマイセス（Phycomyces）属に属する微生物としては、例えば、Phycomyces nitens IFO 9422等が、ピシオシス（Pythiopsis）属に属する微生物としては、例えば、Pythiopsis cymosa ATCC 26880等が、リゾプス（Rhizopus）属に属する微生物としては、例えば、Rhizopus microsporus IFO 4767およびRhizopus microsporus IFO 4768等が、スシタリディーム（Scytalidium）属に属する微生物としては、例えば、Scytalidium flavobrunneum JCM 6268、Scytalidium infestans IFO 32370およびScytalidium terminale IFO 6396等が、シネファラストラム（Syncephalastrum）属に属する微生物としては、例えば、Syncephalastrum racemosum IFO 4816等が、サーモマイセス（Thermomyces）属に属する微生物としては、例えば、Thermomyces lanuginosus IFO 9738等が、トリコデルマ（Trichoderma）属に属する微生物としては、例えば、Trichoderma longibrachiatum IFO 4847およびTrichoderma viride IFO 5720等が、トリコセシーム（Trichothecium）属に属する微生物としては、例えば、Trichothecium roseum IFO 4839等が、バートシリューム（Verticillium）属に属する微生物としては、例えば、Verticillium fungicola IFO 30616等が、ジゴリンガス（Zygorhynchus）属に属する微生物としては、例えば、Zygorhynchus exponens var.smithii IFO 6665等が例示される。
【００１５】
なお、ＩＦＯ、ＪＣＭ、ＩＡＭおよびＡＴＣＣにより番号が付された菌株は、財団法人 発酵研究所、理化学研究所 微生物系統保存施設、東京大学 分子細胞生物学研究所およびアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手することができる。
また、これらの微生物から単離した酵素遺伝子を各種宿主ベクター系に導入した遺伝子操作微生物の利用も可能である。
【００１６】
本発明において、これらの微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宜添加される。また、高い酵素活性を得るために、例えば、アセトフェノン等のケトン基あるいはカルボニル基を持つ化合物等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することが有効である場合がある。その培養は常法に従って行えばよく、例えば、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４０℃の範囲にて好気的に６時間〜１０日間培養する。また、静置培養で同様に培養することで高い酵素活性を得ることができる場合がある。
【００１７】
このようにして得られた微生物は、培地中で培養して得られる培養物をそのままか若しくは該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる微生物菌体又は培養上清、さらにはそれらの処理物の形で、一般式３で示されるｍ−ニトロ基置換２−ハロゲン置換アセトフェノンと接触せしめ、一般式４の光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体を採取することにより、光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体製造することができる。
【００１８】
該処理物としては、変換反応を触媒する活性を示す限り、その使用形態は特に限定されず、乾燥菌体、アセトン等で処理した菌体、菌体の破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、粗酵素、精製酵素等が挙げられる。
【００１９】
微生物菌体、菌体培養液、それらの処理物を反応に供するに際しては、これらを適当な担体に固定化して用いることができる。例えば、架橋したアクリルアミドゲル、多糖類などで包括したり、イオン交換樹脂、珪藻土、セラミックなどの固体担体に物理的、化学的に固定化することができる。固定化して用いることにより、触媒活性が上昇する場合があるばかりではなく、反応終了後の触媒の分離／回収およびその再利用が容易になる。
さらに、通常これら触媒は１種類用いるが、同様な能力を有する２種以上のそれを混合して用いることも可能である。
【００２０】
本発明において、不斉還元反応による一般式４の光学活性２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体の生産は、以下の方法で行うことができる。
必要に応じて補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋及び／又はＮＡＤＰ＋）及び／又はグルコース、シュークロース、エタノール、メタノール等のエネルギー源の存在下、水又は緩衝液等の反応溶媒中で一般式３のｍ−ニトロ基置換アセトフェノン誘導体に上記の微生物菌体、菌体培養液、菌体処理物あるいはこれら微生物により生産される酵素等を接触させることにより行うことができる。そして、反応温度、必要により反応液のｐＨを制御しながら反応を行う。場合によっては反応の途中で反応基質（ｍ−ニトロ基置換アセトフェノン又はその塩）及び／又は前記補酵素、エネルギー源を適宜加え、反応を継続させてもよい。補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋）及び／又はグルコース、シュークロース、エタノール、メタノール等のエネルギー源等を加えることで目的化合物の収率が向上する場合が多い。
【００２１】
反応液の基質濃度は、０．０１〜５０質量％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．０５〜３０質量％が好ましい。
反応液中の微生物菌体等の濃度は、通常、０．００１〜２０質量％であり、好ましくは０．００５〜１０質量％である。
反応液のｐＨは用いる酵素の至適ｐＨ等を考慮し、総合的に決定され、特に制限はないが、一般的にはｐＨ４〜１１の範囲であり、好ましくはｐＨ５〜９である。また、反応が進行するに従いｐＨが変化してくる場合があるが、この場合は適当なｐＨ調整剤この場合は適当な中和剤、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、硫酸水溶液等を添加して最適pHに調整することが望ましい。
【００２２】
反応温度は用いる触媒の至適温度によって適宜決定されるもので特に制限はないが、０〜60℃が好ましく、５〜50℃がより好ましい。
反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、ｍ−ニトロ基置換アセトフェノン誘導体あるいはその塩の溶解を促進させるために有機溶媒あるいは界面活性剤を含んだ系でも反応を行うことができる。
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
【００２３】
界面活性剤としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等のアニオン界面活性剤、アルキルピリジニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド等のカチオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキル（フェニル）エーテル、ポリオキシエチレンアルキル（フェニル）エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（スパン系界面活性剤）、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（トゥイーン系界面活性剤）、ポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（トリトン系界面活性剤）、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン等の両性界面活性剤等を適宜使用できる。
【００２４】
また、これらの有機溶媒あるいは界面活性剤を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上することも多い。
反応時間は、通常、１時間〜１０日間、好ましくは３時間〜１週間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
【００２５】
尚、以上のような基質濃度、補酵素濃度、酵素濃度、ｐＨ、温度、溶媒、反応時間及びその他の反応条件はその条件における反応収率等を考慮して目的とする光学活性２−ハロゲン置換−１−（ｍ−ニトロフェニル）アルコール誘導体が最も多く採取できる条件を適宜選択することが望ましい。
【００２６】
反応終了混合液からの目的物の単離は除菌後、濃縮、抽出、蒸留、カラム分離または結晶化等通常の公知の方法によって行うことができる。
例えば、必要に応じてｐＨを調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類、ヘキサン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、ブタノール、イソブタノール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒等一般的な溶媒により抽出分離することができる。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
＜実施例１＞
グリセロール30ｇ／Ｌ、酵母エキス10ｇ／Ｌ、ペプトン5ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 11g／ＬおよびＫ2ＨＰＯ4 3g／Ｌからなる培地１０ｍｌを試験管に分注し、１２１℃、１５分間加熱滅菌した後、表１に示す菌株を接種し、３０℃で２〜７日間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて集菌した。
【００２８】
集菌した菌体に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）１ｍｌ、ＮＡＤＨ ３．４ｍｇ、１０％２−クロロ−ｍ−ニトロアセトフェノンを含む酢酸エチル溶液１０μｌを加え、３０℃で２４時間反応させた。
【００２９】
反応終了後、同量に酢酸エチルを加え、２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールで抽出した。芒硝で抽出液を乾燥後、ガスクロマトグラフィー（カラム；CP-Chirasil DEX CB 0.25mmID X 25M ,クロムパック社製）で生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定した。結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
＜実施例２＞
ポテトデキスロース培地（Difco社製）１０ｍｌを試験管に分注し、１２１℃、１５分間加熱滅菌した後、表２に示す菌株を接種し、３０℃で２〜７日間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて集菌した。実施例１と同様に反応及び分析を行い、生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定した。結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】
＜実施例３＞
グリセロール30ｇ／Ｌ、酵母エキス10ｇ／Ｌ、ペプトン5ｇ／Ｌ 、ＫＨ2ＰＯ4 11g／ＬおよびＫ2ＨＰＯ4 3g／Ｌからなる培地１０ｍｌを試験管に分注し、１２１℃、１５分間加熱滅菌した後、表３に示す菌株を接種し、３０℃で２〜７日間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて集菌した。菌体をアセトンで３回洗浄し、アセトン処理菌体とした。
【００３４】
５．３２ｍｇの２−クロロ−ｍ−ニトロアセトフェノン、１００ｍＭ ＮＡＤＨ溶液 １７．７ｍｇおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに表１に示すアセトン処理菌体１５ｍｇを懸濁させ、３０℃で２４時間反応させた。実施例１と同様に分析を行い、生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定した。結果を表３に示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】
＜実施例４＞
実施例３と同様の培地２０００ｍｌでGeotrichum candidum IFO 4597を30℃で48時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて集菌した。この湿菌体を同質量の０．０４％２−メルカプトエタノールおよび０．１ｍＭジチオトレイトールを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）に懸濁させ、フレンチプレス（２０００ｋｇ／ｃｍ2）により２回破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、上清を回収した。その上清に４％硫酸プロタミン前記５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液溶液を同量加え、２〜５℃で一晩撹拌した。翌日、生じた不溶物を遠心分離で除去し、70％飽和まで硫酸アンモニウムを加え、２〜５℃で一晩放置した。得られた沈殿を遠心分離で回収し、前記５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解させ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で２〜５℃中、透析した。透析後の硫安分画溶液を５’ＡＭＰセファロース４Ｂ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製、乾燥質量0.25g）カラムに供した。１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）でカラムを洗浄後、同リン酸緩衝液に０．２ｍＭになるようにＮＡＤ+を溶解させた溶液で溶出させ、活性画分を酵素溶液とした。
【００３７】
５．３２ｍｇの２−クロロ−ｍ−ニトロアセトフェノン、１００ｍＭ ＮＡＤＨ溶液 １７．７ｍｇおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）０．９ｍｌに得られた酵素溶液０．１ｍｌを加え、３０℃で２４時間反応させた。実施例１と同様に分析を行い、生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定したところ、Ｒ体９９％ee以上であった。
【００３８】
＜実施例５＞
実施例３と同様の培地２０００ｍｌでDipodascus magnusii JCM 6360を30℃で48時間振とう培養した。培養終了後、実施例４と同様に透析まで処理し、硫安分画溶液を得た。実施例４の酵素溶液の代わりに硫安分画溶液を用いる以外は同様に反応させ、２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度を測定したところ、Ｒ体９９％ee以上であった。
【００３９】
＜実施例６＞
実施例３と同様に調整したDipodascus magnusii JCM 6360株のアセトン粉末１００ｍｇおよびＮＡＤＨ ３０ｍｇを０．１Ｍ ＨＥＰＳ緩衝液（ｐＨ７）３ｍｌに懸濁および溶解させた後、１５ｍｇの２−クロロ−ｍ−ニトロアセトフェノンを９０μｌのメチルアルコールに溶解させたものを加え、３０℃で３日間反応させた。反応終了後、１．５ｍｌの酢酸エチルで抽出した。この抽出液を実施例１と同様に分析を行い、生成物である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度およびその濃度をを測定したところ、９９％ｅｅ以上の、Ｒ−２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノール９．３ｍｇが存在することが確認できた。
【００４０】
＜実施例７＞
実施例６で得られた２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールは1H-NMRを用いたMosher法（J. A. Dale, H. S. Mosher, J. Am. Chem. Soc.,95,512(1973)）により絶対配置を決定した。以下に、手順と結果を示す。試料を2分割して、一方を市販のキラル誘導体化試薬(+)-R-メトキシトリフルオロメチルフェニル酢酸クロライド（(+)-R-MTPA・Cl）によりR-MTPAエステルとした。２分割した試料のもう一方を市販のキラル誘導体化試薬(-)-S-メトキシトリフルオロメチルフェニル酢酸クロライド（(-)-S-MTPA・Cl）によりS-MTPAエステルとした。R-MTPAエステルとS-MTPAエステルをそれぞれ、重水素化クロロホルムに溶解して、Varian社製フーリエ変換核磁気共鳴（FT-NMR）装置 UNITY INOVA 500 （1H共鳴周波数499.818MHz）にて室温で1H NMRスペクトルを測定した。CH2およびCHは以下のように観測された。
【００４１】
〔(+)-R-MTPAエステル1H NMR (499.818MHz, CDCl3, RT)δ6.156ppm（dd，J=4Hz，8Hz，1H，CH），3.836（dd，J=8Hz，12Hz，1H，CH2），3.762（dd，J=4Hz，12Hz，1H，CH2）〕
【００４２】
〔(-)-S-MTPAエステル1H NMR (499.818MHz, CDCl3, RT)δ6.208ppm（dd，J=5Hz，7Hz，1H，CH），3.818（dd，J=7Hz，12Hz，1H，CH2），3.756（dd，J=5Hz，12Hz，1H，CH2）〕
【００４３】
R-MTPAエステルとS-MTPAエステルの1H-NMRスペクトルのケミカルシフトを比較した結果、試料である２−クロロ−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールはR体であることを確認した。
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、医農薬品等の原料として重要な新規な光学活性アルコール、光学活性ｍ−ニトロ基置換−１−フェネチルアルコール誘導体およびそれらの製造方法が提供される。
Claims (3)
- 一般式３
- 微生物が、アブシディア（Absidia）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、オウレオバシディーム（Aureobasidium）属、ブラケセレア（Blakeslea）属、ボトリヨティニア（Botryotinia）属、カルダリオマイセス（Caldariomyces）属、セファロアスカス（Cephaloascus）属、カエトミィーム（Chaetomium）属、クーニングハメレラ（Cunninghamella） 属、ディポダスカス（Dipodascus）属、 エンドマイセス（Endomyces）属、ガラクトマイセス（Galactomyces）属、 ゲオトリカム（Geotrichum）属、ジベレラ（Gibberella）属、ヘリコステリューム（Helicostylum）属、ルーコスポリディーム（Leucosporidium）属、モルティレラ（Mortierella）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フィコマイセス（Phycomyces）属、ピシオシス（Pythiopsis）属、リゾプス（Rhizopus）属、スシタリディーム（Scytalidium）属、シネファラストラム（Syncephalastrum）属、サーモマイセス（Thermomyces）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、トリコセシーム（Trichothecium）属、バートシリューム（Verticillium）属およびジゴリンガス（Zygorhynchus）属の群から選択される請求項１記載の方法。
- 微生物が、Absidia atrospora、Absidia glauca、Absidia glauca、Absidia spinosa、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Aspergillus sojae、Aureobasidium pullulans、Blakeslea trispora、Botryotinia fuckeliana、Caldariomyces fumago、Cephaloascus albidus、Chaetomium semispirale、Cunninghamella echinulata var.elegans、Cunninghamella echinulate、Dipodascus aggregatus、Dipodascus ambrosiae、Dipodascus australiensis、Dipodascus capitatus、Dipodascus capitatus、Dipodascus capitatus、Dipodascus geniculatus、Dipodascus macrosporus、Dipodascus magnusii、Dipodascus magnusii、Dipodascus magnusii、Dipodascus magnusii、Dipodascus magnusii、Dipodascus ovetensis、Dipodascus ovetensis、Dipodascus spicifer、Dipodascus tetrasperma、Endomyces decipiens、Galactomyces citri-aurantii、Galactomyces geotrichum、Galactomyces geotrichum、Galactomyces reessii、Galactomyces reessii、Geotrichum armillariae、Geotrichum candidum、Geotrichum capitatum、Geotrichum eriense、Geotrichum fermentans、Geotrichum fermentans、Geotrichum fragrans、Geotrichum klebahnii、Geotrichum rectangulatum、Gibberella fujikuroi、Helicostylum nigricans、Leucosporidium scotti、Mortierella humicola、Mortierella isabellina、Mucor javanicus、Neurospora crassa、Neurospora sitophila、Penicillium carescens、Penicillium citrium、Phycomyces nitens、Pythiopsis cymosa、Rhizopus microsporus、Rhizopus microsporus、Scytalidium flavobrunneum、Scytalidium infestans、Scytalidium terminale、Syncephalastrum racemosum、Thermomyces lanuginosus、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma viride、Trichothecium roseum、Verticillium fungicolaおよびZygorhynchus exponens var.smithiiから選択される請求項２記載の方法。
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