CN108220348A - 水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法 - Google Patents

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张逸菲
杨根生
郭钫元
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Abstract

本发明提供一种水稻愈伤组织不对称还原p‑苯丙酮类化合物的方法，包括：p‑苯丙酮类化合物标准品的制备、水稻组织提取、培养基的制备、水稻组织对底物的还原、水稻愈伤培养、培养液的缓冲、水稻愈伤对底物的不对称还原。本发明的原料利用常见的植物‑水稻的愈伤组织，本发明所利用的是水稻的种子和根部，其获取途经简单经济，反应试剂普及且成本低廉，反应条件简便且容易实现，对手性药物的制备及绿色化学的实现具有重大的经济和生态学意义。

Description

水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体讲，涉及水稻愈伤组织在改变药物手性方面 的应用及方法。
背景技术
植物是许多有价值产品的重要来源之一，可作为有用的基础材料。如：纤维 素，木材，橡胶等。此外它的次级代谢产物，如：萜类化合物、香豆素、蒽醌、 类黄酮及生物碱等可作为医药、香料、色素和农用化学品等。迄今为止，一些从 植物悬浮细胞得到的次级代谢物已能进行生产。然而，这些植物悬浮培养细胞所 能产生的次级代谢产物的量很少且很难积累，并已证明很难应用于工业生产。为 了克服这一难题，利用植物悬浮细胞对外源底物进行生物转化的研究就显得很意 义。植物细胞培养具有巨大的产生特定次生代谢产物的潜力。在植物细胞培养中， 一些重要的次生代谢产物并不形成和累积，但却保留了将外源底物转化为有用产 物的能力。植物悬浮细胞培养，固定化细胞培养，毛状根培养以及酶都可通过生 物转化产生有用化合物。
自从White PR和Gautheret RJ在1939年用实验方法建立了植物组织、细 胞培养技术以来，植物组织、细胞培养技术已发展成为一门精细的实验科学，利 用植物组织、细胞对羰基化合物进行生物还原的研究也越来越多。
由于底物或产物都对细胞有一定的毒害作用，所以使用植物全细胞还原底物 时出现得率不高的现象。野生型的植物组织或器官进行生物转化操作起来相对来 说是简单的。一般是以无菌水作为反应媒介，整个反应过程简单且节约成本。尽 管如此，但这一系统还是存在缺点的，比如不同季节不同区域的植物细胞催化活 力都有所不同。
随着地球资源的耗尽，反应试剂的价格的上涨，这使得合成药物的价格将更加昂贵。这就需要提供新的方法进行一些重要药物的生产，特别是一些化合物的手性药物中间体的制备。
发明内容
本发明提供一种水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，从而提 升制备手性药物中间体的能力及条件。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：
本发明提供水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，该方法包括 以下步骤：
(1)p-苯丙酮类化合物标准品的制备：取一定量的p-苯丙酮类化合物溶于 溶剂甲醇中分多次加入还原剂KBH4以一锅法在冰水浴中进行反应，以石油醚∶ 乙酸乙酯＝9∶1为展开剂点板，直至反应完全后，加适量冰水除去多余的还原剂 KBH4，再用稀HCl调节pH值至中性，用萃取剂无水乙醚萃取产物三次，每次 20ml萃取剂，之后加入无水MgSO4干燥，过滤旋蒸浓缩后得到底物标准品；
(2)水稻愈伤培养：将消毒后的水稻种子置于AA固体培养基中，放入全 天候气候培养箱中培养一周后，有幼苗生成；将幼苗取出后，把叶片剪成小片放 入加有生长素(3mg/1的NAA)的AA固体培养基，再培养两周后，有愈伤细 胞生成，将其转入续代培养基中(生长素含量减半)进行再培养三周后，提取愈 伤细胞，静置待用；
(3)培养液的缓冲：将制备好的培养液加入一定浓度的缓冲液，调节pH 值为弱酸性；
(4)水稻愈伤对底物的不对称还原：取2-6g水稻叶片的愈伤细胞加入20ml 缓冲后的培养液中摇床48h后加入10-16mg底物进行反应，4天后取出，离心萃 取。
进一步地，p-苯丙酮类化合物选自对甲基苯丙酮、对乙基苯丙酮、对氯苯丙 酮或对溴苯丙酮。
进一步地，p-苯丙酮类化合物的投入质量与溶剂体积之比为1∶10-1∶15。
进一步地，培养基选用AA培养基，培养基的质量与水的体积之比为 1∶25-1∶30。
进一步地，水稻组织的加入量为5g。
进一步地，底物的浓度为0.008g/ml。
进一步地，摇床转速为85-160r/min。
进一步地，缓冲液的pH值为7.0，缓冲液的浓度为0.1M，调节后的培养液的 pH值为5.8-6.0。
进一步地，反应温度为25-30℃。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明的原料利用常见的植物-水 稻的愈伤组织，本发明所利用的是水稻的种子和根部，其获取途经简单经济，反 应试剂普及且成本低廉，反应条件简便且容易实现，对手性药物的制备及绿色化 学的实现具有重大的经济和生态学意义。
附图说明
图1是四种p-苯丙酮类化合物的S-型标准曲线图。
图2是水稻叶片愈伤组织加入量对反应影响的示意图。
图3是底物加入量对水稻叶片愈伤组织还原产率影响的示意图。
图4是光照对反应影响的示意图。
图5是以Tris-HCl作为缓冲液时，其浓度对反应影响的示意图。
图6是水稻愈伤对底物还原能力的示意图。
图7是水稻愈伤的重复利用度的示意图。
具体实施方式
下面结合附图，通过具体的实施案例对本发明的技术方案做进一步的阐述。
本发明的所有实施例所用到的材料和仪器如下第1点所述。
1.材料和仪器
1.1试验材料及来源
水稻(浙大种植)；
对甲基苯丙酮、对乙基苯丙酮、对氯苯丙酮、对溴苯丙酮(瑞尔丰化工有限 公司)；
MS、AA、N6培养基(杭州百思生物技术有限公司)；
正己烷、色谱正己烷(国药集团化学试剂有限公司)；
色谱异丙醇(天津科密欧有限公司)；等。
1.2实验仪器、型号及来源
本发明所采用的实验主要仪器及设备如表1所示。
表1
本发明所采用的实验方法如下第2点所述。
2.实验方法
2.1分析方法
将定容后样品用于液相色谱分析，检测条件如下：
色谱柱：手性OB-H柱(0.46cm×25cm)；流动相：正己烷：异丙醇95：5(v/v)；流量1ml/min；紫外检测波长λ＝220nm；柱温：35℃；进样量为10μL。
2.2数据处理
还原产物醇的产率可由下式计算：
式中，Ms：底物酮的分子量；Mp：产物醇的分子量；q：反应初始时底物酮的质 量；P：反应结束时产物醇的质量。
产物手性醇的对映体过剩值由下式计算：
式中，R：R型产物的浓度；S：S型产物的浓度。
实施例1：标准品的制备。
取5g对氯苯丙酮溶于50ml甲醇中分多次加入KBH4一锅法在冰水浴中进 行反应，以石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1为展开剂点板，直至反应完全后，加适量冰 水除去多余的KBH4，再用稀HCl调节pH值至中性，用无水乙醚萃取产物每次约 20ml，萃取三次。之后加入无水MgSO4干燥，过滤旋蒸浓缩后得到对氯苯丙醇 标准品。
对溴苯丙酮、对甲基苯丙酮、对乙基苯丙酮可采用同上方法得到相应的标准 品。四种底物的标准曲线如图1所示。
实施例2：考量不同取材部位对产率和ee值的影响。
将水稻种子用清水冲洗以除去表面污渍，在75％乙醇里浸泡0.5min，取出用 无菌水冲洗2次后放入10％NaClO溶液中浸泡20min后取出，无菌水冲洗多次后， 将取5g水稻种子(湿重)放入20mlpH 5.8(用NaOH或Tris调pH)的培养基并分 别加入0.5g/l的不同(对甲基苯丙酮、对乙基苯丙酮、对氯苯丙酮、对溴苯丙酮) 反应5天后，离心，萃取，旋蒸，定容，液相色谱检测。同样的方法，取培养出 生根的水稻苗，考察叶片、根、茎对不同底物的还原能力。
结果如表2所示：
表2：水稻的不同取材部位对反应影响
由上表可知：水稻种子和根部的还原能力较强，而水稻茎则基本无还原能力， 故排除水稻的茎部，水稻叶具备还原能力，但还原能力较弱，因此以水稻种子和 根部以及叶片作为后续试验的生物转化材料。
实施例3：水稻愈伤的培养及对底物的不对称还原。
3.1水稻愈伤的培养
将消毒后水稻种子置于AA固体培养基中，放入全天候气候培养箱中培养一 周后，有幼苗生成。
将幼苗取出后，把叶片剪成小片放入加有生长素的AA、MS、N6固体培养 基(3mg/l的NAA)，再培养两周后，有愈伤细胞生成，将其转入续代培养基 中(生长素含量减半)进行再培养，待用。同时对水稻的根、茎进行如上相同方 法的愈伤组织培养。
3.2水稻不同部位的愈伤对底物的不对称还原
分别取2g叶片、根、茎的水稻愈伤细胞加入20ml MS液体培养基中震摇2 d后加入10mg底物进行反应，4d后取出，离心萃取获得的溶液进行液相色谱分 析。
表3：不同培养基对反应的影响
其中，水稻a、水稻b、水稻c分别表示MS、AA、N6培养基。
根据表3的数据可以得出，水稻叶片的最佳植物培养为AA培养基。但是， 对于不同的底物，不同的培养基仍然存在差异。同样的实验方法对水稻的茎、和 根的愈伤组织做了考察，也有相似的发现，培养基对于水稻的不同部位的愈伤组 织的还原能力有不同的影响，而且不同的具体化合物，也不相同。这表明培养和 水稻的不同部位和不同的化合物之间存在一个最适合的配对关系。另外，对于愈 伤组织和直接水稻的组织对化合物的还原能力也不同，例如水稻茎本身直接进行 还原，几乎没有还原能力，但是对于茎的愈伤组织，却表现好的还原能力。
实施例4：考量水稻组织加入量对不对称还原能力的影响。
以对氯苯丙酮为例，按实施例4的条件进行反应，培养基为AA培养基，叶 片愈伤组织加入量对产物和ee值的影响如图2所示。
由图2可知水稻产率都随着植物加入量的增加而增大，当其加入量达到5g 时产率达到最大值为74.41％，之后再增大水稻量还原产率反而下降，这是由于 组织因生长所需营养产生竞争关系，为提供其正常生长所需能量消耗过多，用于 生物转化所需能量减少，故其产率随着水稻加入量的增加而降低。同时还原产物 ee值变化不大。
实施例5：考量底物浓度对反应结果的影响。
按实施例3的条件进行反应(水稻叶片愈伤组织)，培养基为AA培养基， 加入不同量底物进行反应，反应结果如图3所示，由图3可知，底物的浓度为 0.008g/ml最为适宜，当底物浓度增加时，四种底物产率均随底物加入量的增加 而降低，可见底物对植物组织有一定的毒害作用，而ee随底物加入量变化不大。
实施例6：考量摇床摇速对还原产率的及ee值的影响。
按实施例4(水稻叶片的愈伤组织)的方法进行反应，考察摇床转速对产率 的影响，发现，摇床转速对产率也有较大影响，在转速低于85r/min时，水稻组 织粘于瓶底，使其不能于底物充分接促，不利于反应进行；而当摇速高于160r/min 时，多块水稻组织因相互碰撞而粉碎，等反应结束后成泥状物质，组织结构严重 破坏也不利于反应进行。故转速应控制在85-160r/min为宜。
实施例7：考量反应温度对还原产率的及ee值的影响(水稻叶片的愈伤组织)。
温度也是影响还原产率的一个重要因素，当温度低于25℃时，AA培养基中 部分物质析出，且在摇动过程中不能于溶液混匀，必然影响水稻组织正常生长还 原；而当温度升高到30℃以上时，溶液容易染菌，水稻组织易变质产生一些不 友好的怪味。故反应最适温度应控制在25-30℃之间。
实施例8：考量光照条件对反应结果的影响(水稻叶片的愈伤组织)。
光照不仅影响植物细胞的生长还能影响植物次级代谢。故现以对氯苯丙酮为 例在全日光照和无光条件下对水稻的还原能力考察，结果如图4所示。由图4 可知，水稻全日光照条件下产率70.56％远大于暗环境条件产率18.34％，因此水 稻的反应条件应选择在光照环境下进行。
实施例9：考量不同缓冲液浓度对反应结果的影响(水稻叶片的愈伤组织)。
将配好的AA培养基分别用不同浓度的Tris-HCl(pH 7.0)调pH至5.8，分 别加入四种底物，以水稻叶片组织还原对氯苯丙酮为例，其结果如图5所示。
从图5可以看出，Tris-HCl在浓度为0.1摩尔/L的情况下，提高水稻的还原 能力为10-15左右，但是大于0.1之上，几乎丧失了还原能力，因此缓冲液选择 Tris-HCl，其浓度为0.1摩尔/L。
实施例10：愈伤细胞的不对称还原(水稻叶片的愈伤组织)。
取续代培养的水稻愈伤细胞2g，加入AA液体培养基震摇两天，使愈伤细 胞充分分散。再分别加入10mg四种底物，反应四天后取出，萃取后进行HPLC 检测，结果如图6所示。
由图6我们发现水稻愈伤对四种底物的还原能力几乎没有区别，产率在 30-40％之间，其产物均为单一S构型。
实施例11：愈伤细胞连续反应能力(水稻叶片的愈伤组织)。
实施例3反应后，过滤产物并用无菌水洗涤2-3次后，将愈伤组织放入新配 的植物培养基中，摇床震摇1天后加入10mg底物反应4天，萃取后与前次同时 进行HPLC检测。以水稻愈伤对对氯苯丙酮的还原为例，结果如图7所示。
由图7可知，愈伤组织能重复利用，第二次产率略低于第一次。产物均为单 一S构型，产率分别为38.76％和30.24％，但是当反应天数超过2周后，培养基 开始有异味，不能继续用于反应。

Claims (9)

1.水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：
(1)p-苯丙酮类化合物标准品的制备：取一定量的p-苯丙酮类化合物溶于溶剂甲醇中分多次加入还原剂KBH4以一锅法在冰水浴中进行反应，以石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1为展开剂点板，直至反应完全后，加适量冰水除去多余的还原剂KBH4，再用稀HCl调节pH值至中性，用萃取剂无水乙醚萃取产物三次，每次20ml萃取剂，之后加入无水MgSO4干燥，过滤旋蒸浓缩后得到底物标准品；
(2)水稻愈伤培养：将消毒后的水稻种子置于AA固体培养基中，放入全天候气候培养箱中培养一周后，有幼苗生成；将幼苗取出后，把叶片剪成小片放入加有生长素3mg/L的NAA的AA固体培养基，再培养两周后，有愈伤细胞生成，将其转入续代培养基中，进行再培养三周后，提取愈伤细胞，静置待用，所述续代培养基生长素含量减半；
(3)培养液的缓冲：将制备好的培养液加入一定浓度的缓冲液，调节pH值为弱酸性；
(4)水稻愈伤对底物的不对称还原：取2-6g水稻叶片的愈伤细胞加入20ml缓冲后的培养液中摇床48h后加入10-16mg底物进行反应，4天后取出，离心萃取。
2.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，p-苯丙酮类化合物选自对甲基苯丙酮、对乙基苯丙酮、对氯苯丙酮或对溴苯丙酮。
3.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，p-苯丙酮类化合物的投入质量与溶剂体积之比为1∶10-1∶15。
4.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，培养液选用AA培养基与水配置，AA培养基的质量与水的体积之比为1∶25-1∶30。
5.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，水稻组织的加入量为5g。
6.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，底物的浓度为0.008g/ml。
7.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，摇床转速为85-160r/min。
8.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，缓冲液的pH值为7.0，缓冲液的浓度为0.1M，调节后的培养液的pH值为5.8-6.0。
9.根据权利要求1所述的水稻愈伤不对称还原p-苯丙酮类化合物的方法，其特征是，反应温度为25-30℃。
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