DE602004003548T2

DE602004003548T2 - Fluoreszenzmikroskop mit LED-Lichtquelle und Steuereinheit zur Synchronisierung der Bildaufzeichnung mit dem Ein- und Ausschalten der Lichtquelle

Info

Publication number: DE602004003548T2
Application number: DE602004003548T
Authority: DE
Inventors: Hideaki 2-3 Endo
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-01-08
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2024-12-24
Also published as: EP1553436B1; JP4546741B2; DE602004003548D1; US20050152029A1; EP1553436A1; JP2005195940A; US7397602B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop, welches als Lichtquelle kleine lichtemittierende Elemente, beispielsweise eine Mehrzahl von LEDs verwendet.
Eine Fluoreszenzbeobachtung ist allgemein bekannt, bei der bestimmte Moleküle einer biologischen Zelle sichtbar gemacht werden und die Verteilung der Moleküle beobachtet werden kann.
Als Mikroskop für eine Fluoreszenzbeobachtung ist ein Fluoreszenzmikroskop bekannt geworden, welches Beleuchtungslicht (Anregungslicht), welches nur bestimmte Wellenlängenkomponenten hat, auf eine Probe richtet, um in der Probe erzeugte Fluoreszenz zu beobachten. Eine Quecksilberlampe, Halogenlampe oder dergleichen wird als Lichtquelle des Beleuchtungslichts im Fluoreszenzmikroskop verwendet und ein Wellenlängenselektionsfilter, der Anregungsfilter genannt wird, wird für das von der Lichtquelle emittierte Beleuchtungslicht verwendet, um die bestimmten Wellenlängenkomponenten des Beleuchtungslichts zu extrahieren, welches als Anregungslicht auf die Probe gerichtet wird.
Das oben beschriebene Fluoreszenzmikroskop benötigt Raum zur Anordnung verschiedener Filter und die Lichtquellen des Beleuchtungslichts sind groß und erzeugen große Wärmemengen und sind somit nicht einfach handhabbar.
In letzter Zeit wurden lichtemittierende Dioden (LEDs) hoher Helligkeit als kleine lichtemittierende Elemente entwickelt und – neben anderen – ist eine weißes Licht emittierende LED auf verschiedenen Gebieten als Beleuchtungslicht zur Anwendung gelangt. Weiterhin sind einige LEDs monochromatisch und verschiedene Emissionswellenlängen stehen zur Verfügung, so dass die Neigung besteht, sie als Lichtquelle für Beleuchtungslicht in einem Mikroskop zu verwenden, beispielsweise einem Fluoreszenzmikroskop. Die Verwendung von LEDs als Beleuchtungslichtquelle des Mikroskops lässt viele Vorteile erwarten, beispielsweise der Wegfall von Wartung, kleinere Beleuchtungsvorrichtungen, geringerer Energieverbrauch und eine Verringerung der Wärmeerzeugung, wobei die Vorteile einer geringeren Größe, längeren Lebensdauer und geringeren Wärmeerzeugung herangezogen werden, welche charakteristisch für LEDs sind.
Die japanische Patentanmeldungs-KOKAI-Veröffentlichung Nr. 2001-154103 hat die Verwendung von LEDs als Beleuchtungslichtquelle eines Mikroskops beschrieben, wobei eine Anordnung von weißen LEDs verwendet wird, um verschiedene Einstellungen während eines Lampenaustauschs zu beseitigen und eine Umschaltung zwischen Hellfeld-/Dunkelfeldbeobachtungen im Mikroskop kann durchgeführt werden, indem Beleuchtungsteile in der gleichen LED-Anordnung geändert werden, so dass eine Beleuchtungsvorrichtung erhalten wird, welche Platz einspart und befriedigende Betriebseigenschaften liefert. Die japanische Patentanmeldungs-KOKAI-Veröffentlichung Nr. 2002-131648 beschreibt, dass ein Wellenlängenband von ungefähr einigen -zig Nanometern der monochromatischen LED als Beleuchtung des Fluoreszenzmikroskopes verwendet wird, um ein Fluoreszenzmikroskop zu realisieren, welches den Anregungsfilter nicht benötigt und platzsparend ist. Die japanische Patentanmeldungs-KOKAI-Veröffentlichung Nr. 2002-131648 beschreibt weiterhin, dass die Anregungslichtbeleuchtung mittels LEDs mittels eines optischen Dunkelfeldsystems mit übertragenem oder einfallendem Licht implementiert wird, um eine hochempfindliche Fluoreszenzbeobachtung mit verbessertem Signal/Rauschabstand zu ermöglichen.
Da allerdings bei der Fluoreszenzbeobachtung mittels des Fluoreszenzmikroskops eine Probe verwendet wird, welche vorab mit verschiedenen Arten von Fluoreszenzfarben eingefärbt wurde, ist eine Beobachtungslichtmenge aufgrund einer Verschlechterung der Fluoreszenzfarben über die Zeit hinweg, was „Verblassen" genannt wird, nicht ausreichend.
Um somit die Bestrahlung mit Anregungslicht nur während der Beobachtung oder des Fotografierens zuzulassen, ist vorderhalb der Beleuchtungslichtquelle ein mechanischer Verschluss angeordnet und der mechanische Verschluss wird außer während der Beobachtung oder des Fotografierens geschlossen, um das Anregungslicht abzublocken, so dass das Verblassen der Fluoreszenz verringert wird. Der Grund dafür, dass hierfür der mechanische Verschluss verwendet wird, beruht auf den Tatsachen, dass es nicht notwendig ist, den Verschluss in einer kurzen Zeitdauer zu öffnen und zu schließen, da eine Quecksilberlampe oder Halogenlampe, welche als herkömmliche Lichtquelle verwendet wird, Zeit zur erneuten Lichtabgabe benötigt, nachdem sie einmal abgeschaltet worden ist und da die Lampe Zeit benötigt, um ihre Lichtemission zu stabilisieren.
Die US-Patentanmeldungs-Veröffentlichung Nr. 2002/181095 beschreibt ein anderes Beispiel einer Mikroskopvorrichtung, welche eine herkömmliche Lampenlichtquelle in Kombination mit einem hin- und hergehenden Verschluss verwendet.
Die US-PS 6,154,282 beschreibt eine Anordnung, bei der eine herkömmliche Lampe der Lichtquelle durch eine lichtemittierende Diode ersetzt ist, wobei eine Intensitätsmodulation oder Dämpfung elektronisch ohne die Notwendigkeit für einen Verschluss erreicht werden kann.
Nichts desto weniger verbleibt als Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Fluoreszenzmikroskopvorrichtung zu schaffen, mit der die Leistungsausnutzung und Mikroskopleistungsfähigkeit optimiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung schafft ein Fluoreszenzmikroskop mit den im Anspruch 1 angegebenen Merkmalen. Bevorzugte Merkmale der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche. Die vorliegende Erfindung schafft ein Fluoreszenzmikroskop, welches ein Verblassen einer Probe aufgrund unnötiger Bestrahlung mit Anregungslicht verringern kann und welche auch eine Leistungseinsparung erreichen kann.
Ein Fluoreszenzmikroskop gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung weist auf: eine Lichtquelle mit einem kleinen lichtemittierenden Element; ein optisches Beleuchtungssystem, welches Licht von der Lichtquelle auf einen Probe führt; ein optisches Beobachtungssystem, welchem von der Probe emittierte Fluoreszenz zugeführt wird; einen Abbilder, der die von dem optischen Beobachtungssystem herangeführte Fluoreszenz abbildet; und eine Steuerung, welche Licht an/Licht aus des kleinen lichtemittierenden Elementes synchron mit dem Abbildungszeitverhalten des Abbilders steuert.
Diese Zusammenfassung der Erfindung beschreibt nicht notwendigerweise alle notwendigen Merkmale, so dass die Erfindung auch eine Unterkombination dieser beschriebenen Merkmale sein kann.
Die Erfindung lässt sich besser aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Zusammenschau mit der beigefügten Zeichnung verstehen, in der:
1 eine Darstellung ist, welche schematisch den Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops in einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
2 eine Darstellung ist, die schematisch den Aufbau einer Steuerung zur Verwendung in der ersten Ausführungsform zeigt;
3 ein Zeitdiagramm zur Erläuterung der Arbeitsweise der ersten Ausführungsform ist;
4 ein Zeitdiagramm zur Erläuterung der Arbeitsweise einer ersten Abwandlung der ersten Ausführungsform ist;
5 ein Zeitdiagramm zur Erläuterung der Arbeitsweise einer zweiten Abwandlung der ersten Ausführungsform ist;
6 eine Darstellung ist, die schematisch den Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt; und
7A und 7B Darstellungen sind, die schematisch den Aufbau von wesentlichen Teilen des Fluoreszenzmikroskops gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigen.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
(Erste Ausführungsform)
1 ist eine Darstellung, die schematisch den Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
In 1 ist eine Probe S auf einer Stufe 1 angeordnet. Die Stufe 1 ist in der Lage, sich in Richtung einer optischen Achse vertikal zu bewegen (Pfeilrichtung in der Zeichnung), so dass auf die Probe S fokussiert werden kann.
Eine Objektivlinse 3 ist oberhalb der Stufe 1 im Nahbereich der Probe S angeordnet. Eine Mehrzahl von Objektivlinsen 3 (nur zwei hiervon sind in der Zeichnung dargestellt) mit unterschiedlichen Vergrößerungen ist in einem Revolver 2 gehalten und die gewünschte Objektivlinse 3 wird wahlweise in dem optischen Beobachtungspfad a durch Betätigung des Revolvers 2 positioniert.
Eine Sammellinse 5 und ein Anregungsfilter 6, die ein optisches Beleuchtungssystem bilden, sind in einem optischen Pfad von Licht angeordnet, das von einer LED 4 als kleines lichtemittierendes Element emittiert wird, welches eine Beleuchtungslichtquelle ist. Die Sammellinse 5 wandelt das Licht von der LED 4 in paralleles Licht. Der Anregungsfilter 6 überträgt Licht mit einem Wellenlängenband, das zur Anregung der Probe S notwendig ist, aus dem Licht, welches durch die Sammellinse 5 getreten ist.
Auf dem optischen Pfad des Lichts, welches durch den Anregungsfilter 6 getreten ist, ist ein dichroitischer Spiegel 7 in einer Position angeordnet, welche den optischen Beobachtungspfad a schneidet. Der dichroitische Spiegel 7 hat Eigenschaften dahingehend, Licht, welches durch den Anregungsfilter 6 gelaufen ist, und welches das zur Anregung der Probe S notwendige Wellenlängenband hat, zu reflektieren und von der Probe S emittierte Fluoreszenz durchzulassen.
Die Objektivlinse 3 liegt in dem Reflektionslichtpfad des dichroitischen Spiegels 7. Die Objektivlinse 3 kondensiert und richtet Anregungslicht, welches vom dichroitischen Spiegel 7 reflektiert wurde, auf die Probe S. Das Anregungslicht veranlasst, dass die Probe S Licht erzeugt, welches gegenüber der Wellenlänge des Anregungslichts zur längeren Wellenlängenseite hin verschoben ist.
Ein Sperrfilter 8 und ein optischer Pfadumschalter 9, welche ein optisches Beobachtungssystem bilden, sind in einem optischen Übertragungspfad des dichroitischen Spiegels 7 angeordnet. Der Sperrfilter 8 unterbindet Licht mit Ausnahme des Lichts mit einem Band der Fluoreszenz, um ein Beobachtungsbild mit einem zufriedenstellenden Signal-/Rauschabstand zu erhalten. Ein optischer Pfadumschaltmotor 13 zum Betrieb des optischen Pfadumschalters 9 ist mit dem optischen Pfadumschalter 9 verbunden. Der optische Pfadumschalter 9 erlaubt, dass der optische Pfad des Beobachtungsbilds auf ein Okular 10 in dem optischen Beobachtungssystem oder auf eine CCD-Kamera 11 als Abbildungsmittel umgeschaltet wird.
Mit der LED 4 ist ein LED-Treiber 14 verbunden. Der LED-Treiber 14 führt eine Antriebssteuerung für Licht ein/Licht aus der LED 4 durch.
Mit der CCD-Kamera 11 ist eine Kamerasteuerung 15 verbunden. Die Kamerasteuerung 15 führt verschiedene Steuerungen für die CCD-Kamera 11 durch.
Mit dem optischen Pfadumschaltmotor 13, dem LED-Treiber 14 und der Kamerasteuerung 15 ist eine Steuerung 16 verbunden. Die Steuerung 16 weist einen allgemein bekannten CPU-Schaltkreis auf. Wie in 2 gezeigt, so hat die Steuerung 16 einen CPU-Hauptanteil 161, ein ROM 162, welches ein Programm zur Steuerung des Systems gespeichert hat, ein RAM 163 mit einem flüchtigen Speicher oder dergleichen zur Speicherung von Daten, die zur Steuerung notwendig sind, einen Oszillator (nicht gezeigt), der zur Steuerung eines I/O-Anschlusses 164 für Eingabe/Ausgabe von Steuersignalen und der gesamten Steuerung 16 notwendig ist und bekannte Peripherieschaltkreise, beispielsweise ein Adressendecoder. Der CPU-Hauptanteil 161, das ROM 162, das RAM 163 und der I/O-Anschluss 164 sind durch einen Datenbus 165 verbunden. Eine Steuerung erfolgt von dem I/O-Anschluss 164 über Peripherie-Vorrichtungen einschließlich des optischen Pfadumschaltermotors 13, des LED-Treibers 14 und der Kamerasteuerung 15.
Mit der Steuerung 16 ist eine Steuereinheit 17 verbunden. Die Steuereinheit 17 weist verschiedene Betätigungsschalter (nicht gezeigt) auf, welche von einem Benutzer betätigt werden. Der Benutzer betätigt die Betätigungsschalter, so dass der LED-Treiber 14 mit der Antriebssteuerung für Licht ein/Licht aus der LED 4 beginnt und beispielsweise über die Steuerung 16 kann der optische Pfadumschaltermotor 13 eine Steuerung durchführen, um den optischen Beobachtungspfad des optischen Pfadumschalters 9 zu ändern und die Kamerasteuerung 15 kann Fotografierzeitpunkt und Belichtungszeit der CCD-Kamera 11 betreiben.
Eine Arbeitsweise der Ausführungsform mit dem obigen Aufbau wird nun beschrieben.
Für den Fall einer visuellen Fluoreszenzbeobachtung bewegt, wenn der Beobachter einen Fluoreszenzbeobachtungs-Modusschalter (nicht gezeigt) an der Steuereinheit 17 drückt, die Steuerung 16 ein Prisma (nicht gezeigt) in dem optischen Pfadumschalter 9 mittels des optischen Pfadumschaltermotors 13, um den optischen Beobachtungspfad auf die Seite des Okulars 10 zu schalten. Gleichzeitig wird die LED 4 der Beleuchtungslichtquelle vom LED-Treiber 14 eingeschaltet.
Wenn die LED 4 Licht emittiert, wird dieses Licht von der Sammellinse 5 in paralleles Licht umgewandelt und der Anregungsfilter 6 überträgt Licht mit einem Wellenlängenband, das zur Anregung der Probe S notwendig ist. Dieses Licht wird dann vom dichroitischen Spiegel 7 reflektiert und über die Objektivlinse 3 auf die Oberfläche der Probe S gerichtet.
In der Probe S durch das Anregungslicht erzeugtes Licht läuft durch den dichroitischen Spiegel 7 und tritt in den Sperrfilter 8 ein, wo Licht anders als Licht mit dem Fluoreszenzband abgeblockt wird. Somit erreicht die Fluoreszenz das Okular 10 über den optischen Pfadumschalter 9 und wird visuell als Fluoreszenzbeobachtungsbild beobachtet.
Für den Fall eines Fotografierens des Fluoreszenzbeobachtungsbildes bewegt, wenn der Beobachter einen Fotografiermodusschalter (nicht gezeigt) an der Steuereinheit 17 drückt, die Steuerung 16 das Prisma (nicht gezeigt) in dem optischen Pfadumschalter 9 mittels des optischen Pfadumschaltermotors 13, um den optischen Beobbachtungspfad auf die Seite der CCD-Kamera 11 zu ändern. Gleichzeitig wird die LED 4 von dem LED-Treiber 14 einmal ausgeschaltet und die Vorbereitung für den Fotografiervorgang ist abgeschlossen.
Ausgehend von diesem Zustand wird das Beobachtungsbild fotografiert. Der Ablauf in diesem Fall wird unter Bezug auf 3 beschrieben.
Wenn der Beobachter einen Fotografierstartschalter an der Steuereinheit 17 drückt, gibt die Steuerung 16 an die Kamerasteuerung 15 eine Anweisung aus, die Belichtungszeit festzusetzen, so dass die LED 4 nur einmal für eine extrem kurze Zeit t1 mittels des LED-Treibers 14 eingeschaltet wird (Periode A in 3). Die Zeit zum Leuchtenlassen der LED 4 ist vorher festgelegt und während dieser Lichtabgabezeit führt die CCD-Kamera 11 eine Fotometrie für eine optimale Belichtungseinstellung während des Fotografiervorgangs durch. Wünschenswerterweise ist die Beleuchtungszeit t1 für die Fotometrie unter Berücksichtigung von Dunkelrauschen und anderem elektrischen Rauschen der CCD-Kamera 11 so kurz als möglich.
Danach verwendet die Kamerasteuerung 15 fotometrische Informationen der CCD-Kamera 11, um die zum Fotografieren optimale Belichtungszeit zu berechnen und benachrichtigt die Steuerung 16 über die berechnete Belichtungszeit (Periode B in 3). Während dieser Periode ist die LED 4 aus.
Unter Steuerung durch die Steuerung 16 gibt die LED 4 Licht durch den LED-Treiber 14 nur während einer Zeit t2 entsprechend der Belichtungszeit ab, welche von der Kamerasteuerung 15 mitgeteilt wurde und das aufgenommene Fluoreszenzbeobachtungsbild wird von der CCD-Kamera 11 über die Kamerasteuerung 15 geladen (Periode C in 3).
Wie oben beschrieben, wird eine LED 4 mit ausreichender Ansprechgeschwindigkeit und Helligkeitsstabilität als Beleuchtungslichtquelle des Mikroskops verwendet, so dass beispielsweise dann, wenn das Fluoreszenzbeobachtungsbild von der CCD-Kamera 11 fotografiert wird, die LED 4 nur für eine Periode entsprechend der fotometrischen Zeit für die optimale Belichtungseinstellung während des Fotografiervorgangs eingeschaltet werden kann und für eine Abbildungsperiode entsprechend der optimalen Beleuchtungszeit, welche abhängig von der fotometrischen Information festgesetzt wurde, so dass eine Anregungslichtbeleuchtung ermöglicht wird. Dies erlaubt, dass die LED 4 effektiv nur für die minimal benötigte Zeit im Vergleich zu einem Fall Licht abgibt, wo eine Quecksilberlampe oder eine Halogenlampe als herkömmliche Lichtquelle mit einem mechanischen Verschluss kombiniert wird und wo das Anregungslicht nur durch Betätigung des mechanischen Verschlusses abgeblockt wird. Dies erlaubt eine erhebliche Verringerung von unnötigem Verblassen der Fluoreszenzprobe S und eine erhebliche Verringerung im Energieverbrauch, so dass sich Energieeinsparungen ergeben.
Da weiterhin die Beleuchtung mit Anregungslicht ein-/ausgeschaltet werden kann, indem Licht ein/Licht aus der LED 4 gesteuert wird, lassen sich fehlerhafte Bedienungen im Vergleich zu dem herkömmlichen Fall beseitigen, wo der mechanische Verschluss verwendet wird. Weiterhin ist die LED 4 hinsichtlich Bedienbarkeit überlegen und kann als Beleuchtungslichtquelle klein gemacht werden, so dass geringere Kosten und geringere Größe des gesamten Mikroskops erreicht werden können.
(Erste Abwandlung)
Eine erste Abwandlung der ersten Ausführungsform wird unter Bezug auf 4 beschrieben.
Das bei der ersten Abwandlung angewendete Fluoreszenzmikroskop ist das gleiche wie bei der 1 und auf 1 wird somit hier vollinhaltlich Bezug genommen.
Bei der Fluoreszenzbeobachtung gibt es ein Verfahren, welches Zeitrafferfotografie genannt wird, um beispielsweise Änderungen in einer biologischen Probe über die Zeit hinweg zu fotografieren.
Wenn ein derartiges Fotografierverfahren gewünscht ist, gibt, wenn der Beobachter einen Zeitrafferfotografiestartschalter (nicht gezeigt) an der Steuereinheit 17 drückt, die Steuerung 16 wie oben beschrieben an die Kamerasteuerung 15 eine Anweisung aus, die Belichtungszeit festzusetzen, so dass die LED 4 nur während einer extrem kurzen Zeit t11 (Periode A in 4) Licht abgibt und eine Fotometrie wird für die optimale Belichtungseinstellung während des Fotografierens durchgeführt.
Danach verwendet die Kamerasteuerung 15 die fotometrische Information der CCD-Kamera 11, um die für das Fotografieren optimale Belichtungszeit zu berechnen und teilt der Steuerung 16 diese Belichtungszeit mit (Periode B in 4).
Nachfolgend veranlasst die Steuerung 16 die LED 4, Licht während einer Zeit t12 entsprechend der gegebenen Belichtungszeit als Fotografierperiode abzugeben und das von der CCD-Kamera 11 aufgenommene Fluoreszenzbeobachtungsbild wird geladen (Periode C in 4). Danach wird der gleiche Ablauf wiederholt (Periode D in 4), und zwar in bestimmten Intervallen über eine bestimmte Periode hinweg (Periode E in 4).
Auch bei der ersten Abwandlung wird die LED 4 als Beleuchtungslichtquelle verwendet und die Anregungslichtbeleuchtung wird durch Leuchtenlassen der LED 4 nur für eine Periode entsprechend der fotometrischen Zeit für die optimale Beleuchtungseinstellung und für die Abbildungsperiode entsprechend der optimalen Belichtungszeit durchgeführt, welche gemäß der fotometrischen Information festgesetzt wurde, wohingegen die LED 4 während einer Berechnungsperiode der Belichtungszeit (Periode B in 4) und für eine Ruheperiode (Periode D in 4) zwischen den Abbildungsperioden ausgeschaltet ist, so dass die gleichen Effekte wie bei der ersten Ausführungsform erhaltbar sind.
Die Intervalle und die Anzahl von Fotografien können hierbei vorab im ROM 162 innerhalb der Steuerung 16 gespeichert sein oder können von dem Beobachter unter Verwendung eines Fotografierzustandsetzschalters in der Steuereinheit 17 festgesetzt werden.
(Zweite Abwandlung)
Eine zweite Abwandlung der vorliegenden Ausführungsform wird unter Bezug auf 5 beschrieben.
Das bei der zweiten Abwandlung verwendete Fluoreszenzmikroskop ist das gleiche wie bei 1 und auf 1 wird hier insoweit vollinhaltlich Bezug genommen.
Wenn es gewünscht ist, eine Mehrzahl von Bildern der gleichen Probe mit unterschiedlichen Belichtungen aufzunehmen, wird ein Verfahren verwendet, welches „Autobracket-Fotografie" genannt wird. Bei dem Fotografierverfahren gemäß der zweiten Abwandlung werden in einem Durchgang Bilder aufgenommen, deren Be lichtungszeiten sich ausgehend von einem bestimmten Belichtungswert in langen und kurzen Richtungen geringfügig unterscheiden. In diesem Fall wählt die Beobachtungsperson beispielsweise beliebig die Anzahl von aufzunehmenden Bildern und die Unterschiede in den jeweiligen Belichtungszeiten.
Wenn das Fotografieverfahren gemäß der zweiten Abwandlung gewünscht wird, drückt der Beobachter einen Autobracket-Fotografie-Startschalter (nicht gezeigt) an der Steuereinheit 17 und die Steuerung 16 gibt, wie oben beschrieben, an die Kamerasteuerung 15 eine Anweisung aus, die Belichtungszeit zu setzen, so dass die LED 4 nur für eine extrem kurze Zeitdauer t21 (Periode A in 5) leuchtet und eine Fotometrie wird für die optimale Belichtungseinstellung während des Fotografierens durchgeführt.
Danach verwendet die Kamerasteuerung 15 die fotometrische Information der CCD-Kamera 11, um die für das Fotografieren optimale Belichtungszeit zu berechnen und teilt der Steuerung 16 die Belichtungszeit mit (Periode B in 5).
Nachfolgend erhält die Steuerung 16 Zeiten t22a, t22b, t22c, t22d, t22e, welche bezüglich einer gegebenen Belichtungszeit um Zeitdifferenzen -2α, -α, 1, α, 2α unterschiedlich sind und die LED 4 leuchtet während dieser Zeiten t22a, t22b, t22c, t22d, t22e als Abbildungsperioden und dann werden die von der CCD-Kamera 11 aufgenommenen Fluoreszenzbeobachtungsbilder geladen. In diesem Fall sind die jeweiligen berechneten Abbildungsperioden in 5 mit C₁ bis C₅ bezeichnet und die Ruheperioden zwischen den Abbildungsperioden sind in 5 mit D bezeichnet.
Somit wird auch bei dieser Vorgehensweise die LED 4 als Beleuchtungslichtquelle verwendet und die Anregungslichtbeleuchtung wird durch Leuchtenlassen der LED 4 nur für eine Periode entsprechend der fotometrischen Zeit für die optimale Belichtungseinstellung und für die Abbildungsperiode entsprechend der optimalen Belichtungszeit durchgeführt, welche abhängig von der fotometrischen Information gesetzt worden ist, wohingegen die LED 4 während einer Berechnungsperiode der Belichtungszeit (Periode B in 5B) und während einer Ruheperiode (Periode D in 5) zwischen den Abbildungsperioden ausgeschaltet ist, so dass die gleichen Effekte wie bei der oben beschriebenen ersten Ausführungsform erhaltbar sind.
Es sei festzuhalten, dass die Ruheperiode (Periode D in 5) zwischen den Abbildungsperioden wünschenswerterweise so kurz gemacht wird, dass die Bedingung erfüllt ist, dass die Zeit zum Abschließen der Vorbereitung für den nächsten Fotogra fierdurchgang der CCD-Kamera 11 vorliegt. Weiterhin können die Werte der Belichtungszeitdifferenzen α und die Anzahl von Fotografiervorgängen im RAM 162 innerhalb der Steuerung 16 vorab gespeichert werden oder sie können vom Beobachter unter Verwendung des Fotografierzustandsetzschalters in der Steuereinheit 17 festgesetzt werden.
(Zweite Ausführungsform)
Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf 6 beschrieben.
6 ist eine Darstellung, welche schematisch den Aufbau des Fluoreszenzmikroskops gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei gleiche Teile wie in 1 gleiche Bezugszeichen haben.
Die zweite Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform dahingehend, dass ein Durchlicht-Beleuchtungssystem als Beleuchtungsmittel zusätzlich zu der LED 4 für die Fluoreszenzbeobachtung hinzugefügt ist. In 6 werden eine Quecksilberlampe, eine Halogenlampe oder dergleichen als eine Durchlichtbeleuchtungslichtquelle 21 als zweite Lichtquelle verwendet.
Eine Durchlichtbeleuchtungssammellinse 22 und ein Reflektionsspiegel 23 sind in einem optischen Pfad des Lichts angeordnet, das von der Durchlichtbeleuchtungslichtquelle 21 emittiert wird. Die Durchlichtbeleuchtungssammellinse 22 wandelt das Licht von der Durchlichtbeleuchtungslichtquelle 21 in paralleles Licht. Der Reflektionsspiegel 23 reflektiert das parallele Licht von der Durchlichtbeleuchtungssammellinse 22, so dass die Durchlichtbeleuchtung der Probe S von unten her ermöglicht ist.
Eine Durchlichtsteuerung 24 ist mit der Durchlichtbeleuchtungslichtquelle 21 verbunden. Die Durchlichtsteuerung 24 steuert gemäß einer Anweisung von der Steuerung 16 die von der Durchlichtbeleuchtungslichtquelle 21 durchgeführte Durchlichtbeleuchtung.
Antriebsmotoren 25 und 26 sind für den dichroitischen Spiegel 7 und den Sperrfilter 8 vorgesehen, welche optische Elemente für die Fluoreszenzbeobachtung sind und die gemäß der Anweisung von der Steuerung 16 in den optischen Pfad hinein und aus diesem heraus gebracht werden können.
Bei der oben beschriebenen Ausgestaltung gibt, wenn ein Beobachtungsverfahren abweichend von der Fluoreszenzbeobachtung unter Verwendung von Durchlichtbeleuchtung angewendet wird, wenn der Beobachter einen Beobachtungsverfahrenänderungsschalter in die Steuereinheit 17 drückt, die Durchlichtbeleuchtungslichtquelle 21 kontinuierlich Licht über die Durchlichtsteuerung 24 ab, während die LED 4 über den LED-Treiber 14 unter Steuerung durch die Steuerung 16 ausgeschaltet ist. Der dichroitische Spiegel 7 und der Sperrfilter 8 sind mittels der Antriebsmotoren 25 und 26 aus dem optischen Pfad herausgebracht.
Wenn die LED 4 verwendet wird, die Fluoreszenzbeobachtung durchzuführen, ist, wenn der Beobachter den Beobachtungsverfahrenänderungsschalter an der Steuerungseinheit 17 drückt, die Durchlichtbeleuchtungslichtquelle 21 über die Durchlichtsteuerung 24 ausgeschaltet, während der dichroitische Spiegel 7 und der Sperrfilter 8 durch Antrieb der Motoren 25 und 26 unter Steuerung durch die Steuerung 16 wieder in den optischen Pfad gebracht werden. Weiterhin leuchtet die LED 4 über den LED-Treiber 14, um die Erzeugung des Anregungslichts für die Probe S zu beginnen.
Auf oben beschriebene Weise können synchron mit einer Änderung der Beobachtungsverfahren die optischen Elemente, beispielsweise der dichroitische Spiegel 7 und der Sperrfilter 8 in den optischen Pfad hinein und aus diesem heraus gebracht werden und die LED 4 der Beleuchtungslichtquelle kann eingeschaltet/ausgeschaltet werden. Somit kann auch bei einer Beobachtung anders als der herkömmlichen Fluoreszenzbeobachtung eine erhebliche Energieeinsparung im Vergleich zu herkömmlichen Mikroskopen erwartet werden, bei denen die kontinuierlich leuchtende Quecksilberlampe oder dergleichen nur vom mechanischen Verschluss abgeblockt wird. Weiterhin kann die Fluoreszenzbeobachtung aufgrund des Hochgeschwindigkeits-Ansprechverhaltens der LED 4 rasch begonnen werden, so dass, wenn das Beobachtungsverfahren mit der Durchlichtbelichtung kombiniert wird, die Beleuchtung ebenfalls rasch und wirksam geändert werden kann, wenn die Fluoreszenzbeobachtung zu anderen Beobachtungsverfahren geändert wird. Somit lassen sich vorteilhafte Effekte nicht nur hinsichtlich der Bedienbarkeit, sondern auch hinsichtlich Energieeinsparung erwarten.
Bei der zweiten Ausführungsform wird als Durchlichtbeleuchtungslichtquelle 21 die Quecksilberlampe oder Halogenlampe verwendet, es kann jedoch auch ein kleines lichtemittierendes Element, beispielsweise eine weiße LED verwendet werden. Wenn als Durchlichtbeleuchtungslichtquelle die weiße LED verwendet wird, kann die Beobachtung rasch ohne Rest-Durchlicht unmittelbar nach Beginn der Fluoreszenzbeob achtung geändert werden, da die Ausschaltzeit kürzer als bei einer Quecksilberlampe oder Halogenlampe ist. Die zweite Ausführungsform wurde unter der Annahme beschrieben, dass das Beobachtungsverfahren basierend auf Durchlicht, also anders als eine Fluoreszenzbeobachtung, in einem Hellfeld durchgeführt wird; es sind jedoch auch bekannte Beobachtungsverfahren mittels eines Endoskops wie Dunkelfeldbeobachtung, Polarisationsbeobachtung und Differentialinterferenzbeobachtung (Nomarski) bei der vorliegenden Erfindung von Vorteil. In diesem Fall können, wenn optische Elemente entsprechend dem jeweiligen Beobachtungsverfahren, beispielsweise eine Polarisationsplatte, ein Nomarski-Prisma und ein Dunkelfeld-Beobachtungskondensor elektrisch betrieben werden, so dass sie automatisch in und außerhalb des optischen Pfads während der Umschaltung von/auf die Fluoreszenzbeobachtung angeordnet werden können, die Beobachtungsverfahren effizient geändert werden, ohne dass der Beobachter sich um die Kombination der optischen Elemente kümmern muss.
(Dritte Ausführungsform)
Eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend beschrieben.
Die dritte Ausführungsform befasst sich mit dem Lichtaus-Zeitverhalten der LED 4, welche die Anregungslichtbeleuchtung durchführt. Die LED 4 wird bei der ersten und zweiten Ausführungsform im Moment des Fotografierens durch die CCD-Kamera 11 ausgeschaltet, jedoch ist die dritte Ausführungsform auf den Fall gerichtet, wo der Beobachter die Fluoreszenzbeobachtung mit dem nackten Auge durch das Okular 10 durchführt. Wenn das Anregungslicht, das während der Beobachtung abgegeben wird, jedes Mal dann blockiert wird, wenn der Beobachter nicht durch das Okular 10 blickt, das heißt jedes Mal dann, wenn die Beobachtung unterbrochen wird, lässt sich ein Verblassen der Probe verringern. Wenn jedoch in der Praxis die Beobachtung häufig und wiederholt wieder aufgenommen/unterbrochen wird, benötigt es Zeit und Arbeit, wenn ein Lichtaus-Schalter an der Schaltereinheit 17 betätigt werden muss, um jedes Mal die LED 4 auszuschalten und damit wird das Anregungslicht oft kontinuierlich abgegeben. Weiterhin kann ein Beobachter vergessen, das Anregungslicht zu unterbrechen, so dass die Probe unbeabsichtigt verblasst, was zu einer Probenverschwendung führt.
Bei der dritten Ausführungsform ist ein Sensor 31 in der Nähe eines Beobachtungsfensters 10a des Okulars 10 für den Beobachter angeordnet, wie in den 7A und 7B gezeigt. Wenn der Beobachter sein Gesicht nahe an das Beobachtungsfenster 10a des Okulars 10 heranbringt, gibt der Sensor 31 ein Signal mit einem Spannungspegel entsprechend EIN aus, während der Sensor 31 ein Signal mit einem Spannungspegel entsprechend AUS ausgibt, wenn der Beobachter sich entfernt. Das Signal vom Sensor 31 wird der Steuerung 16 zugeführt. Für den Sensor 31 werden bekannte Elemente verwendet, beispielsweise ein Infrarotsensor, der auf bewegliche Objekte in seiner Nähe reagiert und ein Fotodetektorelement, welches eine Verringerung der Menge an Umgebungslicht aufgrund des sich nähernden Gesichts erkennt. Weiterhin ist es, um zu verhindern, dass die LED 4 aufgrund von Änderungen der Lage des Gesichts des Beobachters unnötig ein-/ausschaltet, möglich, eine Funktion hinzuzufügen, um fehlerhafte Betätigungen zu verhindern, indem eine Hysterese-Charakteristik hinzugefügt wird, bei der die LED 4 eingeschaltet wird, nachdem das EIN-Signal eine bestimmte Zeit lang oder länger erkannt worden ist oder bei der die LED 4 nicht ausgeschaltet wird, wenn AUS nicht kontinuierlich über eine bestimmte Zeit hinweg erkannt worden ist, nachdem das Signal EIN einmal erkannt worden ist. Wenn das Signal EIN vom Sensor 31 erkannt wird, während die Fluoreszenzbeobachtung von dem Beobachtungsumschaltschalter an der Steuereinheit 17 unter Steuerung durch die Steuerung 16 gewählt wurde, gibt die LED 4 Licht über den LED-Treiber 14 ab und die LED 4 schaltet aus, wenn das Signal AUS erkannt wird.
Bei der dritten Ausführungsform leuchtet die LED 4 nur dann, wenn der Beobachter ein Fluoreszenzbild vom Beobachtungsfenster 10a des Okulars 10 aus betrachtet und zu anderen Zeiten ist es möglich, die LED 4 aktiv auszuschalten. Dies macht es möglich, unnötiges Anregungslicht zu beseitigen, welches auf die Probe 5 gerichtet wird, so dass ungewolltes Verblassen der Probe S vermieden wird. Da weiterhin die LED 4 automatisch ein-/ausgeschaltet wird, können Bedienungsfehler aufgrund des Beobachters im Fall von problematischen Bedienungen verhindert werden.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsformen begrenzt und verschiedene Abwandlungen können bei einer Implementierungsphase gemacht werden. Beispielsweise werden bei der ersten und zweiten Ausführungsform verschiedene Schalter in der Steuereinheit 17 verwendet, um die Vorgänge durchzuführen, welche mit der Änderung der optischen Beobachtungspfade und mit dem Fotografieren einhergehen; die gleichen Effekte können erhalten werden, wenn die Einstellungen über Kommunikationsbefehle, beispielsweise von einem Host-PC kommen, der mit der Steuerung 16 verbunden ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das kleine lichtemittierende Element mit befriedigender Ansprechgeschwindigkeit und Helligkeitsstabilität als Beleuchtungslichtquelle des Mikroskops verwendet, so dass das kleine lichtemittierende Element effektiv leuchtet, um eine Anregungslichtbestrahlung nur während einer minimal benötigten Periode während der Beobachtung oder Fotografie durchzuführen. Dies erlaubt eine Verringerung von unnötigem Verblassen einer Probe aufgrund unnötiger Anregungslichtbestrahlung und eine wesentliche Verringerung des Leistungsverbrauchs, so dass sich eine Energieeinsparung ergibt.
Weiterhin kann gemäß der vorliegenden Erfindung die Beleuchtung effizient und rasch geändert werden, wenn die Fluoreszenzbeobachtung zu anderen Beobachtungsverfahren umgeschaltet wird, was es möglich macht, vorteilhafte Effekte nicht nur bei der Handhabbarkeit, sondern auch bei der Energieeinsparung zu erreichen.
Weiterhin leuchtet bei der vorliegenden Erfindung das kleine lichtemittierende Element für die Anregungslichtbeleuchtung nur, wenn der Beobachter die Fluoreszenzbeobachtung durchführt, was ein Verblassen der Probe aufgrund einer verschwenderischen Anregungslichtbestrahlung verringert und eine Energieeinsparung mit sich bringt.
Die Erfindung ist durch die beigefügten Ansprüche definiert.

Claims

Ein Fluoreszenzmikroskop, aufweisend: eine Lichtquelle mit einer Licht emittierenden Diode (4); ein optisches Fluoreszenzerregungssystem (5, 6, 7), welches Fluoreszenzanregungslicht von der Licht emittierenden Diode (4) auf eine Probe leitet; ein optisches Beobachtungssystem (3, 7, 8, 9, 10), welchem von der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht zugeleitet wird; einen Abbilder (11), der das dem optischen Beobachtungssystem zugeleitete Fluoreszenzlicht abbildet; und eine Steuerung (16), welche das Einschalten/Ausschalten von Licht der Licht emittierenden Diode (4) synchron mit dem Abbildungszeitverhalten des Abbilders (11) steuert, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung (16) die Licht emittierende Diode (4) in einer fotometrischen Periode (t1, t11, t21) zur Durchführung einer Fotometrie zur Berechnung einer optimalen Belichtungszeit zum Fotografieren des Fluoreszenzbeobachtungsbildes und in einer Fotografierperiode (t2, t12, t22) zum Fotografieren des Fluoreszenzbeobachtungsbildes durch den Abbilder (11) einzuschalten vermag, wobei die Belichtungszeit basierend auf Informationen, die durch die Fotometrie erhalten wurden, berechnet wird; und die Licht emittierende Diode (4) während einer Periode von der Beendigung der fotometrischen Periode (t1, t11, t21) bis zum Beginn der Fotografierperiode (t2, t12, t22) einzuschalten vermag.
Das Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin aufweist: eine zweite Lichtquelle (21), die an einer zur Licht emittierenden Diode unterschiedlichen Position angeordnet ist; eine Beleuchtungseinheit (22, 23) zur Beleuchtung der Probe mit Licht von der zweiten Lichtquelle, wobei die Steuerung das Einschalten/Ausschalten von Licht der Licht emittierenden Diode (4) abhängig vom Beobachtungsverfahren an der Probe steuert.
Das Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin einen Fluoreszenzbeobachtungsdetektor (31) aufweist, der erkennt, ob ein Beobachter eine Fluoreszenzbeobachtung durchführt oder nicht, wobei die Steuerung das Einschalten/Ausschalten von Licht der Licht emittierenden Diode (4) abhängig von einem Ausgangssignal des Fluoreszenzbeobachtungsdetektors steuert.
Das Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Beobachtungssystem ein Okular (10) aufweist und dass der Fluoreszenzbeobachtungsdetektor erkennt, ob der Beobachter die Fluoreszenzbeobachtung mit dem Okular durchführt oder nicht.
Das Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzbeobachtungsdetektor ein Näherungssensor ist.