WO2019053255A1 - Verfahren zur untersuchung einer multispektralen probe, steuereinheit hierfür und mikroskop-anordnung - Google Patents

Verfahren zur untersuchung einer multispektralen probe, steuereinheit hierfür und mikroskop-anordnung Download PDF

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WO2019053255A1
WO2019053255A1 PCT/EP2018/075058 EP2018075058W WO2019053255A1 WO 2019053255 A1 WO2019053255 A1 WO 2019053255A1 EP 2018075058 W EP2018075058 W EP 2018075058W WO 2019053255 A1 WO2019053255 A1 WO 2019053255A1
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filter
light source
filter device
multispectral
filters
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PCT/EP2018/075058
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Inventor
Frank Sieckmann
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/361—Optical details, e.g. image relay to the camera or image sensor
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining a multispectral sample using a fluorescence microscope, a control unit for carrying out the method and a microscope assembly with a fluorescence microscope.
  • imaging techniques are used to obtain images of objects to be examined.
  • light emitted by an object in particular fluorescent light
  • the light recorded by the camera can be spectrally split.
  • spectral imaging it is possible, for example, to use filters which filter or pass through specific spectral regions and are introduced into a beam path.
  • filters which filter or pass through specific spectral regions and are introduced into a beam path.
  • acousto-optical filters, prisms, grids or diffractive optics are also suitable here, for example.
  • light sources with, for example, up to four different colors can be used.
  • the so-called. "ORCA flash 4.0" of Hamamatsu according to data sheet (cf.
  • individual filters can be successively introduced into the beam path, and when the filter is inserted, the object can then be illuminated and a picture taken be recorded. Then another filter can be set.
  • spectral ranges can be distinguished or discriminated. For example, with two or three filter cubes the spectral resolution is limited. When using color cameras, the incident light is divided into several chips, so that only part of the full intensity of each chip is eliminated. This leads to a deterioration of the signal-to-noise ratio or signal-to-noise ratio.
  • Different, wavelength-dependent intensities of the excitation light also require a different exposure time on the camera side. This leads to further delays and also to signal distortions, since the exposure times can be of different lengths.
  • the invention is based on a method for investigating a
  • the imaging optics may in particular comprise a lens and a tube for imaging the sample and in particular also an eyepiece (or a suitable adapter for an image recording device).
  • a multispectral light source which is actuated by means of a trigger signal, then the sample to be examined is illuminated, and by means of a
  • Image pickup device a generated by the imaging optics of light emitted from the sample beam path (or imaging beam path) is detected.
  • a filter device is introduced between the imaging optics and the image recording device, which has a plurality of different movable filters, which are each assigned to a different wavelength range and either between the imaging optics and the
  • a trigger signal generated and above the multispectral light source is triggered.
  • the light source is triggered by the filter device.
  • an intensity of each wavelength range used is the
  • the movement of the filter device can in particular continuously or also
  • sections are continuously made.
  • the latter means that the filter device is moved, for example, by one or more filters, then stopped and then moved on again.
  • Under a continuous, in particular a continuously continuous, movement is to be understood in particular a movement without stop or intermediate stop. This can preferably take place in that the filter device has a filter disk which rotates through the beam path with an uninterrupted movement.
  • Filter device generated trigger signal and the subsequent start of the image recording can be added very quickly to each filter an associated image of the sample. In particular, this is not a central one
  • the filter device can on this Way are also moved at a relatively high speed, whereby the individual filters are introduced in particular successively in the beam path. This allows you to take pictures of objects with high spatial and temporal resolution.
  • such a method can be used very easily in fluorescence microscopes - in particular light microscopes, also inverse microscopes, in question - by a suitable
  • Filter device possibly with a suitable control unit, retrofitted.
  • the image acquisition by means of the image capture device is started by a further trigger signal, which is generated by the multispectral light source, after the multispectral light source (by the
  • Image pickup device by the trigger signal or another
  • Trigger signal which is generated by the filter device is started. Then, the filter device or an associated trigger signal triggers both the light source and the image pickup device directly from each. Depending on the situation, a common triggering signal given to the light source and the image pickup device can be used here. It is also conceivable to use two separate trigger signals. That way is
  • Image recording device possible, for example, after each circulation or even after a certain number of cycles of the filter device. It is advantageous if light is emitted by the multispectral light source when triggered in accordance with at least one predetermined parameter.
  • predetermined parameters are in particular the following: a predetermined wavelength range, a predetermined intensity, a predetermined period of time and a predetermined time.
  • the light source can in particular have different lamps with different colors, for example LEDs with different wavelengths, in particular in the form of a multi-color LED lamp house.
  • the multispectral light source also has a filter device with a plurality of filters, so that
  • Such a filter device can then also have a filter disk, which can then be synchronized in particular with the other filter disk.
  • the at least one predetermined parameter then becomes
  • the predetermined multiple filter suitably individually for at least one, but in particular all, the predetermined multiple filter. This allows a very individual
  • the predetermined intensity ie the illumination intensity
  • wavelength-dependent illumination intensity may be dependent on the sample on the one hand, so a given fluorochrome, for example, light up weaker than another. Then a higher illumination intensity would allow a better signal-to-noise ratio or a shorter one
  • Exposure time (i.e., another predetermined amount of time).
  • wavelength-dependent illumination intensity may depend on the experiment, so that a particular fluorochrome may be too high
  • Illumination intensity may also be dependent on the system itself, because the smaller the illumination intensity, the longer the exposure time required for good image capture and the slower it should be then move the filter device to reach the required exposure time.
  • the predetermined time periods or the image acquisition times may depend on several systemic boundary conditions and are for the
  • Image pick-up device and the speed of movement or rotation of the filter device (the faster the filter device rotates, the shorter the possible exposure time which can be set for a particular filter).
  • a control unit in which the at least one parameter is stored and by means of which the light is emitted in accordance with the at least one parameter.
  • a control unit may in particular also be part of the light source or be integrated in it. In this way, no intermediate PC or the like (the above-mentioned master unit) is necessary, but the program for exposing the sample is integrated directly into the light source, whereby a much faster operation is possible.
  • a control unit can preferably also be used for other functions of the microscope arrangement used, for example for the image recording apparatus and / or the
  • Filter device it is also conceivable to use separate control units for the individual components. As already mentioned, it is preferred if a filter device as a
  • the coding of the filter device for the individual filters with regard to the predetermined positions can preferably be effected by means of encoders for triggering and / or at least one encoder for a synchronization.
  • encoders can be designed, for example, as magnets, which then emits the trigger signal, for example when a suitable sensor is reached. This allows a particularly simple and above all time on the movement of the
  • Filter device coordinated triggering, for example, the multispectral light source.
  • a sender for a synchronization can, for example, using the sensor for triggering the trigger, each time or after a certain number of cycles, for example when a filter disk is used in a filter device, a synchronization with the other donors. It is also conceivable, a second donor to
  • a filter device which has at least three, preferably at least five, more preferably at least seven, different filters. It is also conceivable, however, a different number of filters such as eight or nine. Due to a larger number of filters, one can better discrimination of the wavelengths can be achieved, resulting in an overall better spatial and temporal resolution in image acquisition.
  • the image recording device used is at least one camera, which is designed in particular as a single-chip camera. This is then in particular a so-called gray scale camera. In this way, better results are achieved because the full intensity of the light impinges on the chip and is not distributed among different chips.
  • a triggering of the illumination of the sample by means of the multispectral light source and / or starting the image acquisition by means of an interruption means is temporarily interrupted if necessary.
  • interrupting means may, for example, be a switch for interrupting a signal line which is used to trigger the multispectral light source or the image recording apparatus.
  • Filter device can be easily moved and does not have to start again, but unnecessary image recordings are avoided, so that in the meantime, for example, the sample and / or lens can be changed or adjusted.
  • desired light pattern is generated with desired parameters of the multispectral light source, so that an associated image using the
  • Image pickup device is added.
  • the light patterns can differ from filter to filter. It is even conceivable that in addition a distinction is made after each revolution, for example, a filter disk. Likewise, especially the speed of
  • Filter device can be varied. Such a program can be from a Users are then specified, so that when taking pictures everything
  • the invention furthermore relates to a control unit for use with a microscope arrangement comprising a fluorescence microscope with imaging optics for generating a beam path (or optical path).
  • Imaging beam path a multi-spectral light source operable by a trigger signal, an image pickup device, and a
  • Filter device comprising a plurality of different movable filters, each associated with a different wavelength range, respectively
  • imaging optics and the image pickup device optionally be introduced between the imaging optics and the image pickup device, and each having a coding with respect to a
  • Control unit is set up to carry out an inventive method when used with the microscope arrangement
  • all components required for the method can be controlled with such a control unit, particularly preferably within the framework of a fully automatic, programmable sequential control, in which image captures are finally triggered by the filter device in a specific trigger or triggering sequence.
  • a control unit particularly preferably within the framework of a fully automatic, programmable sequential control, in which image captures are finally triggered by the filter device in a specific trigger or triggering sequence.
  • the filter device sending a trigger to the control unit and then bringing the intensity of the light source and its color to a pre-set level, the sample can be exposed and then at a certain pre-programmed interval and in a certain manner the image pickup device controlled ,
  • Filter device is triggered, previously involved in the firmware of the
  • Components can be loaded so that the process of the procedure can continue autonomously (ie without PC) and also at maximum speed.
  • the control unit or the programs loaded into the control unit and the components involved should preferably also be dynamically interchangeable, ie the programs can be replaced or modified, for example as a function of an event.
  • control unit or the programs loaded into the control unit and the components involved should preferably also link events back so that external programs or components can be informed about the status of the sequence.
  • the invention further relates to a microscope assembly comprising a fluorescence microscope with an imaging optics for generating a
  • a beam path (or imaging beam path), a multispectral light source, which is actuated by means of a trigger signal, an image pickup device and a filter device having a plurality of different movable filters, each associated with a different wavelength range, each optionally between the imaging optics and the image pickup device can be introduced, and in each case a coding with respect to a
  • the filter device between imaging optics and the image pickup device is introduced or introduced.
  • the filter device is exchangeable. In this way, the microscope assembly can be used for different applications with different requirements, with only the filter device to be replaced, the light source and the
  • Image pickup device can still be used.
  • Control unit and the microscope arrangement according to the invention is on the referred to above explanations of the method according to the invention, which apply here accordingly.
  • FIG. 1 shows schematically a microscope arrangement according to the invention in a preferred embodiment with which a method according to the invention can be carried out.
  • FIG. 2 shows schematically an image acquisition system as part of a
  • FIG. 3 schematically shows an image acquisition system as part of a
  • FIG. 4 schematically shows a filter device as part of a microscope arrangement according to the invention in a further preferred embodiment.
  • FIG. 5 schematically shows a light source as part of a device according to the invention
  • Microscope arrangement in a further preferred embodiment.
  • FIG. 6 shows by way of example a program with different parameters for light for a multispectral light source.
  • FIG. 7 schematically shows a filter device as part of a microscope arrangement according to the invention in a further preferred embodiment in different positions.
  • FIG. 1 schematically shows a microscope arrangement according to the invention in a preferred embodiment.
  • the microscope arrangement 300 in this case has an image recording system 200 and a fluorescence microscope 100, which are used together.
  • the fluorescence microscope 100 has a microscope body 110 which, in particular, has other components or components which are not relevant here in detail.
  • a tube may have, an imaging optics 120 of the microscope with at least one lens and an adapter 130 on.
  • a sample carrier 140 is shown with a sample 150 to be observed thereon. The sample 150 is placed under the objective.
  • the imaging system 200 includes a multispectral light source 210, for example in the form of a multi-color LED lamp house
  • Filter device 220 for example with a filter disc, and a
  • Image pickup device 230 for example in the form of a single-chip camera on.
  • the filter device 220 also includes, by way of example, a driver or motor 227 for moving the filter device and individual filters contained therein.
  • a driver or motor 227 for moving the filter device and individual filters contained therein.
  • each of these three components is provided with its own integrated control unit 218, 228 and 238, respectively, which can be used to control certain functions, as will be explained in more detail later. It is understood that only one common control unit can be used.
  • the imaging system 200 is now positioned relative to the fluorescence microscope 100 such that the multispectral light source 210 can illuminate the sample 150 and that light emitted from the sample 150 along an optical beam path 160 of the fluorescence microscope from the
  • Imaging device 230 can be detected.
  • the filter device 220 is arranged such that in each case a separate filter can be located in the beam path 160, as will be explained in more detail below.
  • two signals or trigger signals S1 and S2 are shown, which show the triggering of the multispectral light source 210 and the image recording device 230, starting from the filter device 220.
  • suitable triggering or suitable triggering at the right time a continuous image acquisition series can be created.
  • an interrupting means 260 here in the form of a switch, is provided to interrupt the signal S1. This can be used to prevent the light source being triggered, i. to illuminate the sample 150 is excited. In the case of the triggering cascade shown here, the triggering or
  • FIG. 2 schematically shows an image acquisition system 200 as part of a
  • the filter disk 221 can, for example, be moved, in particular rotated, by means of the drive 227 shown in FIG.
  • a rotation direction R of the filter disc 221 here by way of example in a clockwise direction, is indicated. Both the direction of rotation and the rotational speed can be set in particular to a desired value and, in particular, the
  • Rotation speed also adjusted or adjusted during operation.
  • the filters 222 may be, for example, recesses in the
  • Filter disc 221 act, in which corresponding filter elements, such as glass, are introduced. It is understood that filters and the associated
  • Recesses or openings not only circular, as shown here by way of example, but also in other forms, such as elliptical or rectangular, may be formed.
  • the individual filters 222 are different, i. you can
  • the beam path 160 is shown here by three arrows. Of the
  • the multispectral light source 210 initially illuminates the sample 150 and light emitted by the sample 150, in particular fluorescent light, then passes through one of the filters 222 in the image pickup device 230, in which then an image of the sample 150 is recorded or generated.
  • each of the filters 222 can be selectively and separately introduced into the beam path 160 by the rotation of the filter disk 221. Since the filter disk 221 can be continuously rotated, there is a respective filter only for a certain amount
  • FIG. 3 schematically shows an image acquisition system as part of a
  • Each encoder 223 is assigned to one of the filters 222. In this way, a coding is generated with respect to a predetermined position in the beam path.
  • a sensor 225 is arranged, which can also be part of the filter device, by means of which it can be recognized when one of the sensors during the rotation of the filter disk 221 reaches this sensor 225 or is moved past this.
  • the encoders can be coded. This can be done for example by asymmetric arrangement. In FIG. 3, this coding is due to the different orientation of the encoders 223
  • the filtering device 220 for example using the mentioned control unit 228, can now, based on the recognition of the coded encoder 223 generated by the sensor 225 a signal Sl and to the multispectral
  • Light source 210 are transmitted.
  • the signal Sl can be transmitted when which filter will enter the beam path.
  • the rotational speed of the filter disk 222 can be taken into account.
  • the encoders themselves are not encoded, but encoding is generated only in the formation of the signal Sl, for example based on the order of the encoder 223, in which they are moved past the sensor 225.
  • the multispectral light source can then emit light in accordance with the signal Sl light according to parameters predetermined for each of the filters.
  • the multispectral light source 210 and thus the illumination of the sample are thus triggered by the filter device in this way.
  • the multispectral light source can in turn - as already mentioned - for example, represent a broadband light source with downstream filters. These filters can then be adjusted accordingly, for example by means of a suitable filter wheel, when triggered.
  • the multispectral light source 210 may then also, for example, using the aforementioned control unit 218, also generate a signal (eg, another triggering signal), here the signal S2, which is applied to the
  • Image pickup device 230 is transmitted.
  • the signal S2 it can be communicated when the multispectral light source will emit light, so that the image pickup device can detect light emitted from the sample accordingly, i. the detection of the light emitted by the sample is triggered in this way.
  • the signal Sl - if it contains appropriate information - from the multispectral light source 210 simply to the Image pickup device 230 is passed. Likewise, however, a separate, suitable signal can be generated.
  • FIG. 4 schematically shows a filter device as part of a microscope arrangement according to the invention in a further preferred embodiment
  • the encoders 223 are here not shown symbolically in coded form, but with an exemplary placement on the filter disk 221.
  • the encoders 223 may be formed, for example, in the form of magnets which, when moving past the sensor 225 an individual
  • a further encoder 224 is mounted on the filter disk 221, which can serve for synchronization.
  • this further encoder 224 is designed in the form of two, juxtaposed magnets, which is a specific one
  • Signal pattern in the sensor 225 can cause.
  • a Hall sensor as a sensor 225 for example, a double pulse train is caused. In this way, it is particularly easy to assign the individual encoders 223 due to their order to the individual filters.
  • the filter disk 221 can also, for example, another encoder in the manner of the encoder 224 on the other or
  • the encoder 224 (shown as a double magnet) is also included. In this way, the signal Sl can be formed, which indicates when which filter will be introduced into the beam path.
  • FIG. 5 schematically shows a light source as part of a microscope arrangement according to the invention in a further preferred embodiment
  • the multispectral light source 210 is supplied with the signal S1 and the signal S2 is output, as has already been explained in more detail with reference to FIG.
  • a PC 240 is now displayed with screen. This is to be explained by way of example, how a program P can be generated, which can then be stored in the light source 210 (or the control unit already mentioned).
  • Such a program P indicates with which parameters light is to be emitted at which filter of the multispectral light source 210 when it is triggered.
  • the filters a to h (correspondingly fewer or more in the case of a different number of filters)
  • one user can in each case specify a value for various parameters in order to generate the program P, which is then stored in the multispectral light source 210 or its Control unit can be deposited. If necessary, i. when triggered by the filter device, then light is emitted according to the program.
  • light is not emitted by the light source for each filter which is next introduced into the beam path.
  • This can also be varied from revolution to rotation of the filter disk.
  • only the filter a may emit light with the predetermined parameters, for the next three revolutions only the filter b and so on.
  • a plurality of light pulses are emitted, each with different parameters, so as a greater variety of possible
  • the desired program can be designed individually according to the wishes or needs of a user or an experiment.
  • FIG. 6 shows by way of example such a program for a light source with different parameters for the individual filters.
  • a time duration or pulse duration ⁇ t, a wavelength or a wavelength range ⁇ and an intensity I are plotted as predeterminable parameters for light to be emitted by the multispectral light source via the individual filters a to h, as already mentioned.
  • the duration or pulse duration and the associated intensity (of a light pulse) can be matched to one another, wherein a shorter pulse duration can be compensated, for example, by a higher intensity.
  • Each of these parameters can be specified individually for each of the filters and stored as a program in the light source. It is expedient here to match the individual parameters to one another in such a way that the image recordings finally generated are as similar as possible.
  • FIG. 7 schematically shows a filter device as part of a microscope arrangement according to the invention in a different preferred embodiment in different positions. From left to right are included
  • a chip 231 which may be part of the image recording device 230, in particular in the form of a single-chip camera, is shown, as it passes through one of the filters 222 is visible or how it can detect light that passes through this filter.
  • the chip 231 is for the first time completely within the opening of the filter, at time t2 it is in the middle of the opening and at time t3 it is completely in the opening for the last time. During the time difference t3-tl so the chip can be fully illuminated.
  • the parameters for the light to be emitted by the multispectral light source in particular the duration or pulse length, can be applied to them
  • Time difference are aligned in order to obtain optimum quality for image acquisition.
  • the time t1 can also be used, for example, as a parameter for the light to be emitted, both directly and as a reference for a start time of a light pulse.
  • the proposed method or the corresponding microscope arrangement can accommodate approximately 900 image spectra (for example Flash4 2048 ⁇ 8 pp) with a spectral spread of nine wavelength ranges (ie new filters). For example, with 200 images, each with 2048 x 1024 pp and a filter disk with ten different filters, 20 full spectra per second with a spectral spread of ten
  • Wavelength ranges are recorded.
  • time-lapse recording or “timelapse imaging” becomes possible.
  • the different, wavelength-dependent quantum yields of a chip used can be compensated by carrying out a test measurement without a sample but with a filter disk.
  • the chip can be measured in terms of its sensitivity with respect.
  • the intensity of the light source can be adjusted so that weakly light-emitting samples are automatically illuminated more intensely, preferably in such a way that sets a good signal-to-noise ratio on the camera.
  • time-lapse imaging a quantitative, spectrally resolved time-lapse recording
  • multispectral light source for image acquisition can run directly and can thus achieve a maximum and constant speed.
  • the experiment once set, is essentially determined only by the rotational speed of the filter disk. If it rotates more slowly, the recording frequency of the image recording device automatically decreases without the multispectral light source or its parameters changing.
  • an experiment may initially run relatively slowly (ie, few spectra per second, but also less sample loading) and then, for example, a certain event occurs, the rotational speed can be increased to obtain a higher spectral time resolution.
  • a particular filter position is a pattern of

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer multispektralen Probe (150) unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops mit einer Abbildungsoptik, wobei mittels einer multispektralen Lichtquelle (210), die mittels eines Auslösesignals betätigbar ist, die zu untersuchende Probe (150) beleuchtet wird, wobei mittels einer Bildaufnahmevorrichtung (230) ein durch die Abbildungsoptik (120) aus von der Probe (150) emittiertem Licht erzeugter Strahlengang (160) erfasst wird, wobei zwischen die Abbildungsoptik (120) und die Bildaufnahmevorrichtung (230) eine Filtervorrichtung (220) eingebracht wird, die mehrere verschiedene bewegbare Filter (222) aufweist, die jeweils einem unterschiedlichen Wellenlängenbereich zugeordnet sind und jeweils wahlweise zwischen die Abbildungsoptik (120) und die Bildaufnahmevorrichtung (230) einbringbar sind, wobei den mehreren verschiedenen bewegbaren Filtern (222) jeweils eine Kodierung hinsichtlich einer vorgegebenen Position in Bezug auf den Strahlengang (160) zugeordnet ist, und wobei unter Verwendung der Kodierung durch die Filtervorrichtung (20) jeweils bei Erreichen der vorgegebenen Position der Filter (222) ein Auslösesignal (S1) erzeugt und darüber die multispektrale Lichtquelle (210) ausgelöst wird, wobei daraufhin eine Intensität eines jeweils verwendeten Wellenlängenbereichs der multispektralen Lichtquelle (210) auf einen vorgegebenen Wert eingestellt wird, und wobei mittels der Bildaufnahmevorrichtung (230) für den jeweiligen Filter (222) jeweils bei Erreichen der vorgegebenen Position eine Bildaufnahme gestartet wird, sowie eine Steuereinheit und eine Mikroskop-Anordnung.

Description

Verfahren zur Untersuchung einer multispektralen Probe, Steuereinheit hierfür und Mikroskop-Anordnung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer multispektralen Probe unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops, eine Steuereinheit zur Durchführung des Verfahrens sowie eine Mikroskop-Anordnung mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.
Stand der Technik
In der Mikroskopie werden bildgebende Verfahren eingesetzt, um Bilder von zu untersuchenden Objekten zu erhalten. Hierzu wird oftmals auch von einem Objekt emittiertes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, mittels einer Kamera erfasst. Um genauere Informationen bzw. bessere Bilder zu erhalten, kann das mittels der Kamera aufgenommene Licht spektral aufgeteilt werden. Solche Verfahren sind auch unter dem Begriff "Spectral Imaging" bekannt. Hierzu können beispielsweise Filter verwendet werden, die bestimmte spektrale Bereiche filtern bzw. durchlassen und in einen Strahlengang eingebracht werden. Neben einfachen Glasfiltern und Filterwürfeln kommen hier beispielsweise auch akustooptische Filter, Prismen, Gitter oder diffraktive Optiken in Frage. Auch können Lichtquellen mit beispielsweise bis zu vier verschiedenen Farben verwendet werden. Als Kamera kommt beispielsweise die sog. "ORCA-flash 4.0" von Hamamatsu in Frage. Gemäß Datenblatt (vgl.
https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0080E l 1440- 22CU tec.pdf) können dabei nacheinander einzelne Filter in den Strahlengang eingebracht werden, und bei eingebrachtem Filter kann dann eine Beleuchtung des Objekts vorgenommen und ein Bild aufgenommen werden. Anschließend kann ein anderer Filter eingestellt werden.
Diese Systeme haben jedoch einige Nachteile. So dauert bei Verwendung einzelner Filter das Umschalten zwischen verschiedenen Filtern verhältnismäßig lange. Je nachdem, wie das Mikroskop, an welchem das "Spectral Imaging" durchgeführt werden soll, beschaffen ist, gestaltet sich eine Nachrüstung oftmals aufwändig, was sich zudem in hohen Kosten niederschlägt, und ist manchmal auch gar nicht möglich.
Zudem können relativ wenig spektrale Bereiche unterschieden bzw. diskriminiert werden. So ist beispielsweise mit zwei oder drei Filterwürfeln die spektrale Auflösung begrenzt. Beim Einsatz von Farbkameras wird das einfallende Licht auf mehrere Chips aufgeteilt, so dass auf jeden Chip nur ein Teil der vollen Intensität entfällt. Dies führt zu einer Verschlechterung des Signal-Rausch-Abstandes bzw. Signal-Rausch-Verhältnisses.
Beim Einsatz herkömmlicher Verfahren gibt es zudem meist ein gewisses
Übersprechen (Cross Talk), sodass ein Wellenlängenbereich zum Signal beitragen kann, der gar nicht von dem gewünschten Fluoreszenz-Farbstoff stammt, was zu Messfehlern führt. Auch die Zeitauflösung ist gerade bei langen Umschaltzeiten für schnell ablaufende Vorgänge beispielsweise in lebenden Zellen meist zu gering.
Unterschiedliche, wellenlängenabhängige Intensitäten des Anregungslichts erfordern zudem eine unterschiedliche Belichtungszeit auf der Kameraseite. Dies führt zu weiteren Verzögerungen und auch zu Signalverfälschungen, da die Belichtungszeiten unterschiedlich lang sein können.
Vor diesem Hintergrund stellt sich daher die Aufgabe, eine Möglichkeit anzugeben, spektral aufgelöste Bilder eines Objektes besser und/oder schneller zu erfassen.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden ein Verfahren zur Untersuchung einer multispektralen Probe, eine Steuereinheit und eine Mikroskop-Anordnung mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zur Untersuchung einer
multispektralen Probe unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops mit einer Abbildungsoptik. Die Abbildungsoptik kann dabei insbesondere ein Objektiv und einen Tubus zur Abbildung der Probe und insbesondere auch ein Okular (bzw. einen geeigneten Adapter für eine Bildaufnahmevorrichtung) umfassen. Mittels einer multispektralen Lichtquelle, die mittels eines Auslösesignals betätigbar ist, wird dann die zu untersuchende Probe beleuchtet, und mittels einer
Bildaufnahmevorrichtung wird ein durch die Abbildungsoptik von aus der Probe emittiertem Licht erzeugter Strahlengang (bzw. Abbildungsstrahlengang) erfasst. Dabei wird zwischen die Abbildungsoptik und die Bildaufnahmevorrichtung eine Filtervorrichtung eingebracht, die mehrere verschiedene bewegbare Filter aufweist, die jeweils einem unterschiedlichen Wellenlängenbereich zugeordnet sind und jeweils wahlweisezwischen die Abbildungsoptik und die
Bildaufnahmevorrichtung einbringbar sind, Dies bedeutet also, dass die Filter einzeln in den Strahlengang einbringbar sind, um nur Licht, das den betreffenden Filter passiert, zu erfassen. Erfindungsgemäß ist nun vorgesehen, dass den mehreren verschiedenen bewegbaren Filtern jeweils eine Kodierung hinsichtlich einer vorgegebenen Position in Bezug auf den Strahlengang (bzw. Abbildungsstrahlengang) zugeordnet ist, und dass unter Verwendung der Kodierung durch die Filtervorrichtung jeweils bei Erreichen der vorgegebenen Position der Filter ein Auslösesignal erzeugt und darüber die multispektrale Lichtquelle ausgelöst wird. Dies bedeutet also, dass durch die Filtervorrichtung die Lichtquelle ausgelöst wird. Daraufhin wird dann eine Intensität eines jeweils verwendeten Wellenlängenbereichs der
multispektralen Lichtquelle auf einen vorgegebenen Wert eingestellt. Mittels der Bildaufnahmevorrichtung wird zudem für den jeweiligen Filter jeweils bei
Erreichen der vorgegebenen Position eine Bildaufnahme gestartet. Die Bewegung der Filtervorrichtung kann dabei insbesondere kontinuierlich oder auch
abschnittsweise kontinuierlich vorgenommen werden. Letzteres bedeutet, dass die Filtervorrichtung beispielsweise um einen oder mehrere Filter bewegt, dann gestoppt und dann wieder weiter bewegt wird. Unter einer kontinuierlichen, insbesondere einer kontinuierlich fortlaufenden, Bewegung ist dabei insbesondere eine Bewegung ohne Stopp oder Zwischenstopp zu verstehen. Dies kann vorzugsweise dadurch erfolgen, dass die Filtervorrichtung eine Filterscheibe aufweist, die durch den Strahlengang mit einer ununterbrochenen Bewegung rotiert.
Durch die Auslösung der multispektralen Lichtquelle durch ein von der
Filtervorrichtung erzeugtes Auslösesignal und dem anschließenden Starten der Bildaufnahme kann besonders schnell zu jedem Filter ein zugehöriges Bild der Probe aufgenommen werden. Insbesondere ist auf diese Weise keine zentrale
Mastereinheit mehr nötig, durch welche eine Bewegung der Filtervorrichtung und eine Bildaufnahme gesteuert und koordiniert werden. Solche bislang verwendeten Mastereinheiten erfordern zudem eine Rückbestätigung der einzelnen
Komponenten vor der Auslösung, was einen weiteren Zeitverlust bringen würde, der mit dem vorgeschlagenen Verfahren vermieden wird. Zudem ist eine manuelle Umschaltung von Filtern nicht mehr nötig. Die Filtervorrichtung kann auf diese Weise zudem mit verhältnismäßig hoher Geschwindigkeit bewegt werden, wodurch die einzelnen Filter insbesondere nacheinander in den Strahlengang eingebracht werden. Dies ermöglicht damit Bildaufnahmen von Objekten mit hoher Orts- und Zeitauflösung. Zudem kann ein solches Verfahren sehr einfach bei Fluoreszenz-Mikroskopen - hier kommen insbesondere Lichtmikroskope, auch inverse Mikroskope, in Frage - verwendet werden, indem eine geeignete
Filtervorrichtung, ggf. mit geeigneter Steuereinheit, nachgerüstet wird.
Vorteilhafterweise wird die Bildaufnahme mittels der Bildaufnahmevorrichtung durch ein weiteres Auslösesignal, das von der multispektralen Lichtquelle erzeugt wird, gestartet , nachdem die multispektrale Lichtquelle (durch die
Filtervorrichtung bzw. das davon erzeugte Auslösesignal) ausgelöst bzw.
getriggert wurde. Auf diese Weise wird eine Kaskade zur Aufnahme eines Bildes der Probe ausgelöst. Die Bildaufnahmevorrichtung wird dabei also nur indirekt durch die Filtervorrichtung ausgelöst. Auf diese Weise wird jedoch ermöglicht, die Belichtung und die Bildaufnahme optimal aufeinander abzustimmen.
Alternativ ist es auch bevorzugt, wenn die Bildaufnahme mittels der
Bildaufnahmevorrichtung durch das Auslösesignal oder ein weiteres
Auslösesignal, das von der Filtervorrichtung erzeugt wird, gestartet wird. Dann löst also die Filtervorrichtung bzw. ein zugehöriges Auslösesignal sowohl die Lichtquelle als auch die Bildaufnahmevorrichtung jeweils direkt aus. Je nach Situation kann hier ein gemeinsames Auslösesignal, das an die Lichtquelle und die Bildaufnahmevorrichtung gegeben wird, verwendet werden. Denkbar ist aber auch, zwei getrennte Auslösesignale zu verwenden. Auf diese Weise ist
beispielsweise eine einfachere Synchronisierung von Lichtquelle und
Bildaufnahmevorrichtung möglich, beispielsweise nach jedem Umlauf oder auch nur nach einer bestimmten Anzahl an Umläufen der Filtervorrichtung. Es ist von Vorteil, wenn von der multispektralen Lichtquelle bei Auslösung Licht gemäß wenigstens einem vorbestimmten Parameter emittiert wird. Als solche Parameter kommen insbesondere die folgenden in Frage: ein vorbestimmter Wellenlängenbereich, eine vorbestimmte Intensität, eine vorbestimmte Zeitdauer und ein vorbestimmter Zeitpunkt. Die Lichtquelle kann hierzu insbesondere verschiedene Lampen mit unterschiedlichen Farben aufweisen, beispielsweise also LEDs mit verschiedenen Wellenlängen, insbesondere in Form eines Multifarben- LED-Lampenhauses. Ebenso denkbar ist es, dass die multispektrale Lichtquelle ebenfalls eine Filtervorrichtung mit mehreren Filtern aufweist, sodass
beispielsweise aus weißem Licht verschiedene Farben bzw. Wellenlängen erzeugt werden können. Eine solche Filtervorrichtung kann dann ebenso eine Filterscheibe aufweisen, die dann insbesondere mit der anderen Filterscheibe synchronisiert sein kann. Der wenigstens eine vorbestimmte Parameter wird dann
zweckmäßigerweise individuell für wenigstens einen, insbesondere aber alle, der mehreren Filter vorgegeben. Dies ermöglicht eine besonders individuelle
Abstimmung einer jeden Bildaufnahme. Beispielsweise können auf diese Weise verschiedene, nötige Beleuchtungsdauern für verschiedene Wellenlängenbereiche bzw. Farben eingestellt werden, um so möglichst gleichmäßige Bildaufnahmen zu erhalten.
Die vorbestimmte Intensität, also die Beleuchtungsintensität, ist dabei im
Allgemeinen für verschiedene Wellenlängen nicht gleich hoch. Die
wellenlängenabhängige Beleuchtungsintensität kann zum einen abhängig von der Probe sein, so kann ein bestimmtes Fluorochrom beispielsweise schwächer leuchten als ein anderes. Dann würde eine höhere Beleuchtungsintensität ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis ermöglichen bzw. eine kürzere
Belichtungsdauer (d.h. eine andere vorbestimmte Zeitdauer). Die
wellenlängenabhängige Beleuchtungsintensität kann zum anderen abhängig vom Experiment sein, so kann ein bestimmtes Fluorochrom bei einer zu hohen
Beleuchtungsintensität ausbleichen. Die wellenlängenabhängige
Beleuchtungsintensität kann zudem abhängig vom System selbst sein, denn je kleiner die Beleuchtungsintensität ist, umso länger ist möglicherweise die für eine gute Bildaufnahme erforderliche Belichtungsdauer und umso langsamer sollte sich dann die Filtervorrichtung bewegen, damit die erforderliche Belichtungsdauer erreicht wird.
Die vorbestimmten Zeitdauern bzw. die Bildaufnahmedauern können von mehreren, systemischen Randbedingungen abhängen und sind für die
unterschiedlichen Wellenlängen im Allgemeinen nicht gleich lang. Sie hängen z.B. ab von der Form der Filter (rund oder nicht rund), von der Anzahl der Filter (je mehr Filter in der Filtervorrichtung vorhanden sind, umso kleiner müssen die Filter sein; je kleiner die Filter sind, umso kürzer ist das Zeitfenster, in dem die Bildaufnahmevorrichtung von einem bestimmten Filter Licht empfängt und umso kürzer ist daher die mögliche Belichtungsdauer, die an der
Bildaufnahmevorrichtung eingestellt werden darf) und von der Bewegungs- oder Drehgeschwindigkeit der Filtervorrichtung (je schneller sich die Filtervorrichtung dreht, umso kürzer ist daher die mögliche Belichtungsdauer, welche für einen bestimmten Filter eingestellt werden kann).
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn eine Steuereinheit verwendet wird, in welcher der wenigstens eine Parameter hinterlegt wird und mittels welcher das Licht gemäß dem wenigstens einen Parameter emittiert wird. Eine solche Steuereinheit kann dabei insbesondere auch Teil der Lichtquelle sein bzw. in dieser integriert sein. Auf diese Weise ist kein zwischengeschalteter PC oder dergleichen (die eingangs erwähnte Mastereinheit) nötig, sondern das Programm zur Belichtung des Probe ist direkt in der Lichtquelle integriert, wodurch ein deutlich schnellerer Betrieb ermöglicht wird. Darüberhinaus kann eine solche Steuereinheit bevorzugt auch für weitere Funktionen der verwendeten Mikroskop-Anordnung verwendet werden, beispielsweise für die Bildaufnahmevorrichtung und/oder die
Filtervorrichtung. Denkbar ist jedoch auch, für die einzelnen Komponenten separate Steuereinheiten zu verwenden. Wie bereits erwähnt, ist es bevorzugt, wenn als Filtervorrichtung eine
Filterscheibe verwendet wird. Dann kann insbesondere deren Rotationsgeschwindigkeit wie gewünscht bzw. auf einen gewünschten Wert eingestellt werden. Dies ermöglicht eine individuelle Anpassung der Bildaufnahme, insbesondere aber auch eine Veränderung der Aufnahmegeschwindigkeiten sowohl für verschiedene zu beobachtende Proben als auch während der
Beobachtung nur einer Probe.
Die Kodierung der Filtervorrichtung für die individuellen Filtern hinsichtlich der vorgegebenen Positionen kann vorzugsweise durch Geber zur Auslösung und/oder wenigstens einen Geber für eine Synchronisation erfolgen. Solche Geber können beispielsweise als Magnete ausgebildet sein, die dann beispielsweise bei Erreichen eines geeigneten Sensors ein das Auslösesignal abgibt. Dies ermöglicht eine besonders einfache und vor allem auch zeitlich auf die Bewegung der
Filtervorrichtung abgestimmte Auslösung beispielsweise der multispektralen Lichtquelle. Mittels eines Gebers für eine Synchronisation kann, beispielsweise auch unter Verwendung des Sensors für die Geber zur Auslösung, bei jedem oder immer nach eine bestimmten Anzahl an Umläufen, wenn beispielsweise eine Filterscheibe in einer Filtervorrichtung verwendet wird, eine Synchronisation mit den übrigen Gebern erfolgen. Denkbar ist auch, einen zweiten Geber zur
Synchronisation auf der anderen Seite der Filterscheibe vorzusehen, um
beispielsweise die Scheibe auswuchten zu können. Ebenso denkbar ist, nur den Geber zur Synchronisation ohne individuell den Filtern zugeordneten Gebern zu verwenden. Hier kann dann beispielsweise nach einer Eichung mit dem einzelnen Geber und Zeitablauf und Berücksichtigung der Rotationsgeschwindigkeit erkannt werden, wann der jeweilige Filter in den Strahlengang eintritt. Hier können dann also auch Bruchteile von Umläufen berücksichtigt werden.
Vorteilhafterweise wird eine Filtervorrichtung verwendet, die wenigstens drei, bevorzugt wenigstens fünf, weiter bevorzugt wenigstens sieben, verschiedene Filter aufweist. Denkbar ist jedoch auch eine andere Anzahl an Filter wie beispielsweise acht oder neun. Durch eine größere Anzahl an Filtern kann eine bessere Diskriminierung der Wellenlängen erreicht werden, was zu einer insgesamt besseren Orts- und Zeitauflösung bei der Bildaufnahme führt.
Es ist besonders bevorzugt, wenn als Bildaufnahmevorrichtung wenigstens eine Kamera verwendet wird, die insbesondere als Single-Chip-Kamera ausgebildet ist. Hierbei handelt es sich dann insbesondere um eine sog. Grauwert-Kamera. Auf diese Weise werden bessere Ergebnisse erzielt, da die volle Intensität des Lichts auf den Chip auftrifft und nicht auf verschiedene Chips verteilt wird. Vorzugsweise wird eine Auslösung der Beleuchtung der Probe mittels der multispektralen Lichtquelle und/oder ein Starten der Bildaufnahme mittels eines Unterbrechungsmittels bei Bedarf zeitweise unterbrochen. Ein solches
Unterbrechungsmittel kann im einfachsten Fall beispielsweise als Schalter zum Unterbrechen einer Signalleitung sein, welche zur Auslösung der multispektralen Lichtquelle bzw. der Bildaufnahmevorrichtung verwendet wird. Die
Filtervorrichtung kann dabei einfach weiter bewegt werden und muss nicht von neuem anlaufen, jedoch werden unnötige Bildaufnahmen vermieden, sodass in der Zwischenzeit beispielsweise die Probe und/oder Objektiv gewechselt oder verstellt werden kann.
Mit dem vorgeschlagenen Verfahren ist es also insbesondere möglich, zur
Aufnahme von Bildern einer Probe ein bestimmtes Programm vorzugeben, bei dem die Filtervorrichtung mit einer bestimmten Geschwindigkeit bewegt wird und bei Einbringen eines jeweiligen Filters in den Strahlengang ein jeweils
gewünschtes Lichtmuster mit gewünschten Parametern von der multispektralen Lichtquelle erzeugt wird, sodass ein zugehöriges Bild mittels der
Bildaufnahmevorrichtung aufgenommen wird. Die Lichtmuster können sich dabei von Filter zu Filter unterscheiden. Denkbar ist sogar auch, dass zusätzlich eine Unterscheidung nach jeder Umdrehung beispielsweise einer Filterscheibe getroffen wird. Ebenso kann insbesondere die Geschwindigkeit der
Filtervorrichtung variiert werden. Ein solches Programm kann von einem Benutzer dann vorgegeben werden, sodass bei der Bildaufnahme alles
automatisiert ablaufen kann.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Steuereinheit zur Verwendung mit einer Mikroskop-Anordnung umfassend ein Fluoreszenz-Mikroskops mit einer Abbildungsoptik zur Erzeugung eines Strahlengangs (bzw.
Abbildungsstrahlengangs) , eine multispektrale Lichtquelle, die mittels eines Auslösesignals betätigbar ist, einer Bildaufnahmevorrichtung und einer
Filtervorrichtung, die mehrere verschiedene bewegbare Filter aufweist, die jeweils einem unterschiedlichen Wellenlängenbereich zugeordnet sind, jeweils
wahlweisezwischen die Abbildungsoptik und die Bildaufnahmevorrichtung einbringbar sind, und denen jeweils eine Kodierung hinsichtlich einer
vorgegebenen Position in Bezug auf den Strahlengang zugeordnet ist, Die
Steuereinheit ist dabei dazu eingerichtet, bei Verwendung mit der Mikroskop- Anordnung ein erfindungsgemäßes Verfahren durchzuführen,
Mit einer solchen Steuereinheit können insbesondere alle für das Verfahren benötigten Komponenten gesteuert werden, besonders bevorzugt auch im Rahmen einer vollautomatischen, programmierbaren Ablaufsteuerung, bei welcher in einer bestimmten Trigger- bzw. Auslösereihenfolge letztlich durch die Filtervorrichtung Bildaufnahmen ausgelöst werden. Also kann z.B., indem die Filtervorrichtung einen Trigger an die Steuereinheit sendet und diese dann die Intensität der Lichtquelle und dessen Farbe auf ein voreingestelltes Niveau bringt, die Probe damit belichtet und dann in einem bestimmten, vorprogrammierten Intervall und in einer bestimmten Weise die Bildaufnahmevorrichtung gesteuert werden.
Dabei ist hervorzuheben, dass der Ablauf, welcher durch den Trigger der
Filtervorrichtung ausgelöst wird, zuvor in die Firmware der beteiligten
Komponenten (z.B. Kamera und LED-Lampe) geladen werden können, damit der Ablauf des Verfahrens im Weiteren autonom (d.h. ohne PC) und zudem mit maximaler Geschwindigkeit ablaufen kann. Die Steuereinheit, bzw. die in die Steuereinheit und die beteiligten Komponenten geladenen Programme sollten vorzugsweise zudem dynamisch austauschbar sein, d.h. es können die Programme z.B. in Abhängigkeit eines Ereignisses ersetzt oder modifiziert werden.
Die Steuereinheit, bzw. die in die Steuereinheit und die beteiligten Komponenten geladenen Programme sollten vorzugsweise zudem Events zurückkoppeln, damit externe Programme oder Komponenten über den Zustand des Ablaufes informiert werden können.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Mikroskop-Anordnung umfassend ein Fluoreszenz-Mikroskops mit einer Abbildungsoptik zur Erzeugung eines
Strahlengangs (bzw. Abbildungsstrahlengangs), eine multispektrale Lichtquelle, die mittels eines Auslösesignals betätigbar ist, einer Bildaufnahmevorrichtung und einer Filtervorrichtung, die mehrere verschiedene bewegbare Filter aufweist, die jeweils einem unterschiedlichen Wellenlängenbereich zugeordnet sind, jeweils wahlweise zwischen die Abbildungsoptik und die Bildaufnahmevorrichtung einbringbar sind, und denen jeweils eine Kodierung hinsichtlich einer
vorgegebenen Position in Bezug auf den Strahlengang zugeordnet ist, und eine erfindungsgemäßen Steuerungseinheit. Dabei ist die Filtervorrichtung zwischen Abbildungsoptik und die Bildaufnahmevorrichtung eingebracht oder einbringbar.
Besonders bevorzugt ist es auch, wenn die Filtervorrichtung austauschbar ausgebildet ist. Auf diese Weise kann die Mikroskop -Anordnung für verschiedene Anwendungen mit verschiedenen Anforderungen verwendet werden, wobei nur die Filtervorrichtung ausgetauscht werden muss, die Lichtquelle und die
Bildaufnahmevorrichtung können weiterhin verwendet werden. Bezüglich weiterer Ausgestaltungen und Vorteile der erfindungsgemäßen
Steuereinheit sowie der erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung sei auf die vorstehenden Erläuterungen zum erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen, die hier entsprechend gelten.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der
Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Mikroskop-Anordnung in einer bevorzugten Ausführungsform, mit welcher ein erfindungsgemäßes Verfahren durchführbar ist.
Figur 2 zeigt schematisch ein Bildaufnahmesystem als Teil einer
erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer bevorzugten
Aus f üh rungs f o rm .
Figur 3 zeigt schematisch ein Bildaufnahmesystem als Teil einer
erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer weiteren bevorzugten Aus f üh rungs f o rm . Figur 4 zeigt schematisch eine Filtervorrichtung als Teil einer erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform. Figur 5 zeigt schematisch eine Lichtquelle als Teil einer erfindungsgemäßen
Mikroskop-Anordnung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform.
Figur 6 zeigt beispielhaft ein Programm mit verschiedenen Parametern für Licht für eine multispektrale Lichtquelle.
Figur 7 zeigt schematisch eine Filtervorrichtung als Teil einer erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform in verschiedenen Positionen.
In Figur 1 ist schematisch eine erfindungsgemäße Mikroskop-Anordnung in einer bevorzugten Ausführungsform dargestellt. Die Mikroskop-Anordnung 300 weist dabei ein Bildaufnahmesystem 200 und ein Fluoreszenz-Mikroskop 100 auf, welche zusammen verwendet werden.
Das Fluoreszenz-Mikroskop 100 weist beispielhaft einen Mikroskopkörper 110, der insbesondere weitere, hier im Einzelnen nicht relevante, Bauteile bzw.
Baugruppen, wie insbesondere einen Tubus, aufweisen kann, eine Abbildungsoptik 120 des Mikroskops mit zumindest einem Objektiv und einen Adapter 130 auf. Zudem ist ein Probenträger 140 mit einer darauf befindlichen, zu beobachtenden Probe 150 gezeigt. Die Probe 150 ist dabei unter dem Objektiv platziert.
Das Bildaufnahmesystem 200 weist eine multispektrale Lichtquelle 210, beispielsweise in Form eines Multifarben-LED-Lampenhauses, eine
Filtervorrichtung 220, beispielsweise mit einer Filterscheibe, und eine
Bildaufnahmevorrichtung 230, beispielsweise in Form einer Single-Chip-Kamera, auf. Die Filtervorrichtung 220 weist zudem beispielhaft einen Antrieb bzw. einen Motor 227 auf, um die Filtervorrichtung und damit darin enthaltene, einzelne Filter zu bewegen. Beispielhaft ist für jede dieser drei Komponenten jeweils eine eigene, integrierte Steuereinheit 218, 228 bzw. 238 vorgesehen, die dazu verwendet werden können, gewisse Funktionen zu steuern bzw. durchzuführen, wie sie später noch detaillierter erläutert werden sollen. Es versteht sich, dass auch nur eine gemeinsame Steuereinheit verwendet werden kann.
Das Bildaufnahmesystem 200 ist nun derart in Bezug zum Fluoreszenz-Mikroskop 100 angeordnet, dass die multispektrale Lichtquelle 210 die Probe 150 beleuchten kann und dass von der Probe 150 emittiertes Licht entlang eines Strahlengangs (bzw. Abbildungsstrahlengangs) 160 des Fluoreszenz-Mikroskops von der
Bildaufnahmevorrichtung 230 erfasst werden kann. Dabei ist die Filtervorrichtung 220 derart angeordnet, dass sich jeweils ein separater Filter in dem Strahlengang 160 befinden kann, wie nachfolgend noch näher erläutert wird. Weiterhin sind zwei Signale bzw. Auslösesignale Sl und S2 eingezeichnet, die die Auslösung der multispektralen Lichtquelle 210 und der Bildaufnahmevorrichtung 230, ausgehend von der Filtervorrichtung 220 zeigen. Durch geeignete Auslösung bzw. geeignetes Triggern zum richtigen Zeitpunkt kann so eine kontinuierliche Bildaufnahmeserie erstellt werden. Für die nähere Funktionsweise sei auf die noch folgenden Ausführungen verwiesen.
Zudem ist ein Unterbrechungsmittel 260, hier in Form eines Schalters vorgesehen, um das Signal Sl zu unterbrechen. Hiermit kann unterbunden werden, dass die Lichtquelle ausgelöst, d.h. zum Beleuchten der Probe 150 angeregt wird. Bei der hier gezeigten Auslöse-Kaskade wird auf diese Weise auch die Auslösung bzw.
Starten der Bildaufnahme mittels der Bildaufnahmevorrichtung unterbunden. Die Filtervorrichtung kann nun weiterhin in Bewegung sein, allerdings kann diese Unterbrechung genutzt werden, um beispielsweise den Probenträger 140 und damit die Probe 150 zu verschieben oder das Objektiv 120 zu wechseln. In Figur 2 ist schematisch ein Bildaufnahmesystem 200 als Teil einer
erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer bevorzugten
Ausführungsform, wie die auch in Bezug auf Figur 1 schon erläutert wurde, in einer anderen Ansicht dargestellt. Insbesondere ist hier als Teil der
Filtervorrichtung 220 einer Filterscheibe 221 (bzw. ein Filterrad) gezeigt, welches im gezeigten Ausführungsbeispiel acht separate Filter 222 aufweist, die am Rand der Filterscheibe 221 angeordnet sind. Der Übersichtlichkeit halber ist jedoch nur einer dieser Filter 222 mit einem Bezugszeichen versehen. Die Filterscheibe 221 kann beispielsweise mittels des in Figur 1 gezeigten Antriebs 227 bewegt, insbesondere rotiert werden. Hierzu ist eine Rotationsrichtung R der Filterscheibe 221, hier beispielhaft im Uhrzeigersinn, angegeben. Sowohl die Rotationsrichtung als die Rotationsgeschwindigkeit können dabei insbesondere auf einen gewünschten Wert eingestellt und, insbesondere die
Rotationsgeschwindigkeit, auch während des Betriebs verstellt bzw. angepasst werden.
Bei den Filtern 222 kann es sich beispielsweise um Ausnehmungen in der
Filterscheibe 221 handeln, in welche entsprechende Filterelemente, beispielsweise aus Glas, eingebracht sind. Es versteht sich, dass Filter und die zugehörigen
Ausnehmungen bzw. Öffnungen nicht nur kreisrund, wie hier beispielhaft gezeigt, sondern auch in anderen Formen, beispielsweise elliptisch oder rechteckig, ausgebildet sein können. Die einzelnen Filter 222 sind dabei unterschiedlich, d.h. sie können
unterschiedliche Farben aufweisen bzw. für unterschiedliche Wellenlängen bzw. Wellenlängenbereiche von Licht durchlässig sein.
Der Strahlengang 160 ist hier durch drei Pfeile dargestellt. Von der
multispektralen Lichtquelle 210 emittiertes Licht beleuchtet zunächst die Probe 150 und von der Probe 150 emittiertes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, gelangt dann durch einen der Filter 222 in die Bildaufnahmevorrichtung 230, in welcher dann ein Bild der Probe 150 aufgenommen bzw. erzeugt wird.
Wie anhand der Figur 2 zu sehen ist, kann jeder der Filter 222 wahlweise und separat in den Strahlengang 160 eingebracht werden, und zwar durch die Rotation der Filterscheibe 221. Da die Filterscheibe 221 kontinuierlich bewegt bzw. rotiert werden kann, befindet sich ein jeweiliger Filter immer nur für eine gewisse
Zeitdauer in dem Strahlengang, bevor - nach einer gewissen Zeitdauer, in welcher kein Licht durch die Filtervorrichtung hindurchgelassen wird - der nächste Filter in den Strahlengang eintritt. In diesem Zusammenhang sei auch auf die Figur 7 und die zugehörige Beschreibung verwiesen.
In Figur 3 ist nun schematisch ein Bildaufnahmesystem als Teil einer
erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform dargestellt. Auf der Filterscheibe 221 sind - im Vergleich zu Figur 2 - nunmehr zusätzlich Geber 223 angebracht, von denen der
Übersichtlichkeit halber nur einer mit einem Bezugszeichen versehen ist.
Jeder Geber 223 ist dabei einem der Filter 222 zugeordnet. Auf diese Weise wird eine Kodierung hinsichtlich einer vorgegebenen Position im Strahlengang erzeugt. Neben der Filterscheibe 221 ist ein Sensor 225 angeordnet, der auch Teil der Filtervorrichtung sein kann, mittels dessen erkannt werden kann, wann einer der Geber während der Rotation der Filterscheibe 221 diesen Sensor 225 erreicht bzw. an diesem vorbeibewegt wird. Hierzu können die Geber kodiert sein. Dies kann beispielsweise durch asymmetrische Anordnung erfolgen. In Figur 3 ist diese Kodierung durch die unterschiedliche Ausrichtung der die Geber 223
darstellenden Symbole gezeigt. Auf diese Weise ist es möglich, zu erkennen, wann welcher der Filter 222 in den Strahlengang eintreten wird. Von der Filtervorrichtung 220, beispielsweise unter Verwendung der erwähnten Steuereinheit 228, kann nun, basierend auf der Erkennung der kodierten Geber 223 durch den Sensor 225 ein Signal Sl erzeugt und an die multispektrale
Lichtquelle 210 übermittelt werden. In dem Signal Sl kann dabei übermittelt werden, wann welcher Filter in den Strahlengang eintreten wird. Hierzu kann auch die Rotationsgeschwindigkeit der Filterscheibe 222 berücksichtigt werden.
Denkbar ist dabei auch, dass die Geber selbst nicht kodiert sind, sondern eine Kodierung erst bei der Bildung des Signals Sl erzeugt wird, beispielsweise basierend auf der Reihenfolge der Geber 223, in welcher sie am Sensor 225 vorbeibewegt werden.
Die multispektrale Lichtquelle kann dann gemäß dem Signal Sl Licht gemäß für jeden der Filter vorgegebenen Parametern emittieren. Die multispektrale
Lichtquelle 210 und damit die Beleuchtung der Probe werden auf diese Weise also durch die Filtervorrichtung ausgelöst. Die multispektrale Lichtquelle kann ihrerseits - wie bereits erwähnt - beispielsweise eine breitbandige Lichtquelle mit nachgeordneten Filtern darstellen. Diese Filter können dann, beispielsweise mittels eines geeigneten Filterrades, bei Auslösung entsprechend eingestellt werden. Die multispektrale Lichtquelle 210 wiederum kann dann, beispielsweise unter Verwendung der erwähnten Steuereinheit 218, ebenfalls ein Signal (bspw. ein weiteres Auslösesignal), hier das Signal S2, erzeugen, das an die
Bildaufnahmevorrichtung 230 übermittelt wird. Hier kann in dem Signal S2 übermittelt werden, wann die multispektrale Lichtquelle Licht emittieren wird, sodass die Bildaufnahmevorrichtung entsprechend von der Probe emittiertes Licht erfassen kann, d.h. die Erfassung des von der Probe emittierten Lichts wird auf diese Weise ausgelöst.
Denkbar ist dabei, dass das Signal Sl - sofern es entsprechende Informationen enthält - von der multispektralen Lichtquelle 210 einfach an die Bildaufnahmevorrichtung 230 weitergegeben wird. Ebenso kann jedoch ein eigenes, geeignetes Signal erzeugt werden.
In Figur 4 ist schematisch eine Filtervorrichtung als Teil einer erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
dargestellt. Insbesondere sind hier erneut die Filterscheibe 221 und der Sensor 225 gezeigt. Die Geber 223 sind hier nun nicht symbolhaft in kodierter Form dargestellt, sondern mit einer beispielhaften Platzierung auf der Filterscheibe 221. Die Geber 223 können dabei beispielsweise in Form von Magneten ausgebildet sein, die bei einem Vorbeibewegen an dem Sensor 225 ein individuelles
Signalmuster erzeugen.
Zudem ist ein weiterer Geber 224 auf der Filterscheibe 221 angebracht, der zur Synchronisierung dienen kann. Beispielhaft ist dieser weitere Geber 224 in Form zweier, nebeneinanderliegender Magnete ausgebildet, der ein spezifisches
Signalmuster in dem Sensor 225 hervorrufen kann. Im Falle eines Hallsensors als Sensor 225 wird beispielsweise eine Doppelpulsfolge hervorgerufen. Auf diese Weise ist es besonders einfach möglich, die einzelnen Geber 223 aufgrund ihrer Reihenfolge den einzelnen Filtern zuzuordnen.
Für Zwecke einer Auswuchtung der Filterscheibe 221 kann zudem beispielsweise ein weiterer Geber in Art des Gebers 224 auf der anderen bzw.
gegenüberliegenden Seite der Filterscheibe 221 vorgesehen sein. Weiterhin sind bei den einzelnen Filtern 222 nun verschiedene Buchstaben a, b, c, d, e, f, g und h eingezeichnet, die jeweils einem individuellen Filter 222 zugeordnet sind. In dem Diagramm im unteren Bereich der Figur 4 ist hierzu gezeigt, welche Geber in welcher Reihenfolge (über der Zeit t) bei einer vollen Umdrehung der Filterscheibe, startend bei der gezeigten Stellung, an dem Sensor 225
vorbeibewegt werden. Neben den acht Gebern 223, die den individuellen Filtern a bis h (hier startend bei g) zugeordnet sind, ist auch der Geber 224 (als doppelter Magnet gezeigt) dabei. Auf diese Weise kann das Signal Sl gebildet werden, in dem angegeben ist, wann welcher Filter in den Strahlengang eingebracht sein wird.
In Figur 5 ist nun schematisch eine Lichtquelle als Teil einer erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
dargestellt. Dabei wird der multispektrale Lichtquelle 210 das Signal Sl zugeführt und es wird das Signal S2 abgegeben, wie dies bereits in Bezug auf Figur 3 näher erläutert wurde.
Weiterhin ist nun ein PC 240 mit Bildschirm dargestellt. Damit soll beispielhaft erläutert werden, wie ein Programm P erzeugt werden kann, welches dann in der Lichtquelle 210 (bzw. der bereits erwähnten Steuereinheit) hinterlegt werden kann.
Ein solches Programm P gibt dabei an, mit welchen Parametern Licht bei welchem Filter von der multispektrale Lichtquelle 210 emittiert werden soll, wenn sie ausgelöst wird. Für jeden der Filter a bis h (entsprechend weniger oder mehr bei einer anderen Anzahl an Filtern) kann dabei von einem Benutzer jeweils ein Wert für verschiedene Parameter vorgegeben werden, um das Programm P zu erzeugen, das dann in der multispektrale Lichtquelle 210 bzw. deren Steuereinheit hinterlegt werden kann. Bei Bedarf, d.h. bei Auslösung durch die Filtervorrichtung, wird dann Licht entsprechend dem Programm emittiert.
Dabei kann auch vorgesehen sein, dass nicht für jeden Filter, der als nächstes in den Strahlengang eingebracht wird, von der Lichtquelle Licht emittiert wird. Dies kann auch von Umdrehung zu Umdrehung der Filterscheibe variiert werden. In einem extremen Fall kann beispielsweise während der ersten drei Umdrehungen nur für den Filter a Licht mit den vorbestimmten Parametern emittiert werden, für die nächsten drei Umdrehungen nur für den Filter b und so weiter. Weiterhin ist es möglich, dass während einer Zeitdauer, in welcher ein Filter in den Strahlengang eingebracht ist, mehrere Lichtpulse mit jeweils unterschiedlichen Parametern emittiert werden, um so eine größere Vielfalt an möglichen
Bildaufnahmen zu ermöglichen. Das gewünschte Programm kann dabei individuell nach den Wünschen oder Bedürfnissen eines Benutzers oder eines Experiments gestaltet werden.
In Figur 6 ist nun beispielhaft ein solches Programm für eine Lichtquelle mit verschiedenen Parametern für die einzelnen Filter dargestellt. Hierzu sind eine Zeitdauer bzw. Pulsdauer At, eine Wellenlänge bzw. ein Wellenlängenbereich λ sowie eine Intensität I als vorbestimmbare Parameter für von der multispektrale Lichtquelle zu emittierendes Licht jeweils über die einzelnen Filter a bis h, wie sie bereits erwähnt wurden, aufgetragen. Beispielsweise können die Zeitdauer bzw. Pulsdauer und die zugehörige Intensität (eines Lichtpulses) aufeinander abgestimmt werden, wobei eine kürzere Pulsdauer beispielsweise durch eine höhere Intensität ausgeglichen werden kann.
Jeder dieser Parameter kann für jeden der Filter individuell vorgegeben werden und als Programm in der Lichtquelle hinterlegt werden. Zweckmäßig ist es dabei, die einzelnen Parameter aufeinander so abzustimmen, dass die schließlich erzeugten Bildaufnahmen möglichst vergleichbar sind.
In Figur 7 ist schematisch eine Filtervorrichtung als Teil einer erfindungsgemäßen Mikroskop-Anordnung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform in verschiedenen Positionen dargestellt. Von links nach rechts sind dabei
verschiedene Positionen gezeigt, wenn sich die Filterscheibe 221, wie angedeutet, mit einer Rotationsrichtung R im Uhrzeigersinn bewegt. Dabei ist ein Chip 231, der Teil der Bildaufnahmevorrichtung 230, insbesondere in Form einer Single-Chip-Kamera, sein kann, gezeigt, so wie er durch einen der Filter 222 hindurch sichtbar ist bzw. wie er Licht, das durch diesen Filter hindurch fällt, erfassen kann.
Zum Zeitpunkt tl befindet sich der Chip 231 erstmals vollständig innerhalb der Öffnung des Filters, zum Zeitpunkt t2 befindet er sich in der Mitte der Öffnung und zum Zeitpunkt t3 befindet er sich letztmals vollständig in der Öffnung. Während der Zeitdifferenz t3-tl kann also der Chip vollständig beleuchtet werden. So können also die Parameter für das von der multispektralen Lichtquelle zu emittierende Licht, insbesondere die Zeitdauer bzw. Pulslänge, auf diese
Zeitdifferenz ausgerichtet werden, um eine optimale Qualität für die Bildaufnahme zu erhalten.
Sollte für eine gewünschte Pulsdauer eine längere Zeitdifferenz benötigt werden, so müsste die Rotationsgeschwindigkeit der Filterscheibe reduziert werden.
Denkbar ist jedoch auch die Erhöhung der Intensität des entsprechenden
Lichtpulses. Der Zeitpunkt tl kann beispielsweise auch als Parameter für das zu emittierende Licht herangezogen werden, sowohl direkt als auch als Referenz für einen Startzeitpunkt eines Lichtpulses.
Mit dem vorgeschlagenen Verfahren bzw. der entsprechender Mikroskop- Anordnung können beispielsweise ca. 900 Bildspektren (z.B. Flash4 2048 x 8 pp) mit einer spektralen Aufspreizung von neun Wellenlängenbereichen (also neuen Filtern) aufgenommen werden. Bei 200 Bildern mit jeweils 2048 x 1024 pp und einer Filterscheibe mit zehn verschiedenen Filtern können beispielsweise 20 volle Spektren pro Sekunde mit einer spektralen Aufspreizung von zehn
Wellenlängenbereichen aufgenommen werden. Insofern wird spektral aufgelöste Zeitraffer-Aufnahme (bzw. "timelapse Imaging") möglich.
Zudem können die unterschiedlichen, wellenlängenabhängigen Quantenausbeuten eines verwendetet Chips ausgeglichen werden, indem eine Testmessung ohne Probe, aber mit Filterscheibe durchgeführt wird. Wenn die Intensitäten der verschiedenen Wellenlängen der Lichtquelle bekannt und auch die jeweilige Filterkennlinie bekannt sind, so kann der Chip hinsichtlich seiner Empfindlichkeit bzgl. der Wellenlängen eingemessen werden. Zudem kann die Intensität der Lichtquelle so angepasst werden, dass schwach Licht emittierende Proben automatisch stärker beleuchtet werden, vorzugsweise derart, dass sich auf der Kamera ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis einstellt.
Des Weiteren ist es möglich, insbesondere bei günstigen experimentellen
Randbedingungen, dass sich die Intensitäten automatisch so einstellen, dass alle Kanäle der spektralen Aufnahme die gleiche Belichtungszeit erfordern.
Dadurch, dass sowohl die Empfindlichkeit des Chips als auch die Filterkennlinien und auch die Intensitäten bekannt sind, wird auch eine quantitative, spektral aufgelöste Zeitraffer-Aufnahme (bzw. "timelapse Imaging") möglich.
Ein weiterer Vorteil ist, dass, nachdem die Mikroskop-Anordnung einmal entsprechend eingestellt wurde, der Gesamtablauf ohne externe Software (z.B. Windows) auskommt. Die Auslöse-Kaskade von Filtervorrichtung über
multispektrale Lichtquelle zur Bildaufnahme kann direkt ablaufen und kann somit eine maximale und konstante Geschwindigkeit erreichen.
Das Experiment, einmal eingestellt, wird im Wesentlichen nur noch durch die Umlaufgeschwindigkeit der Filterscheibe bestimmt. Dreht sie sich langsamer, so sinkt die Aufnahmefrequenz der Bildaufnahmevorrichtung automatisch ab, ohne dass sich die multispektrale Lichtquelle bzw. deren Parameter verändern.
Dies ermöglicht neue Experimentarten, so kann z.B. ein Experiment anfangs verhältnismäßig langsam laufen (d.h. wenige Spektren pro Sekunde, dadurch aber auch eine geringere Probenbelastung) und dann, wenn beispielsweise ein bestimmtes Ereignis eintritt, kann die Rotationsgeschwindigkeit gesteigert werden, um eine höhere spektrale Zeitauflösung zu erhalten.
Es ist auch möglich, dass eine bestimmte Filterposition ein Muster von
Programmen startet, also nicht nur eines sondern mehrere Programme. Dies setzt voraus, dass sich der entsprechende Filter über einen ausreichend langen
Zeitabschnitt„über" dem Chip befindet, dieser Chip also auch entsprechend beleuchtet werden kann. Indem mehrere Programme bzw. Programmabläufe in der Lichtquelle bzw. deren Steuereinheit abspeichert werden, welche zur Laufzeit umschaltbar sind, kann man erreichen, dass die spektralen Bildaufnahme-Bedingungen über die Zeit des Experimentablaufs verändert werden können, und zwar derart, dass zu verschiedenen Zeitpunkten eines Experiments verschiedene Programmabläufe in der multispektrale Lichtquelle aktiviert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung einer multispektralen Probe (150) unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops (100) mit einer Abbildungsoptik (120),
wobei mittels einer multispektralen Lichtquelle (210), die mittels eines Auslösesignals betätigbar ist, die zu untersuchende Probe (150) beleuchtet wird, wobei mittels einer Bildaufnahmevorrichtung (230) ein durch die
Abbildungsoptik (120) aus von der Probe (150) emittiertem Licht erzeugter Strahlengang (160) erfasst wird,
wobei zwischen die Abbildungsoptik (120) und die
Bildaufnahmevorrichtung (230) eine Filtervorrichtung (220) eingebracht wird, die mehrere verschiedene bewegbare Filter (222) aufweist, die jeweils einem unterschiedlichen Wellenlängenbereich zugeordnet sind und jeweils wahlweise zwischen die Abbildungsoptik (120) und die Bildaufnahmevorrichtung (230) einbringbar sind,
dadurch gekennzeichnet, dass den mehreren verschiedenen bewegbaren Filtern (222) jeweils eine Kodierung hinsichtlich einer vorgegebenen Position in Bezug auf den Strahlengang (160) zugeordnet ist, und
dass unter Verwendung der Kodierung durch die Filtervorrichtung (20) jeweils bei Erreichen der vorgegebenen Position der Filter (222) ein Auslösesignal (Sl) erzeugt und darüber die multispektrale Lichtquelle (210) ausgelöst wird, wobei daraufhin eine Intensität (I) eines jeweils verwendeten
Wellenlängenbereichs (λ) der multispektralen Lichtquelle (210) auf einen vorgegebenen Wert eingestellt wird, und wobei mittels der Bildaufnahmevorrichtung (230) für den jeweiligen Filter (222) jeweils bei Erreichen der vorgegebenen Position eine Bildaufnahme gestartet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bildaufnahme mittels der
Bildaufnahmevorrichtung (230) durch ein weiteres Auslösesignal (S2), das von der multispektralen Lichtquelle (210) erzeugt wird, gestartet wird , nachdem die multispektrale Lichtquelle (210) ausgelöst wurde, oder wobei die Bildaufnahme mittels der Bildaufnahmevorrichtung (230) durch das Auslösesignal (Sl) oder ein weiteres Auslösesignal, das von der Filtervorrichtung (220) erzeugt wird, gestartet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei von der multispektralen
Lichtquelle (210) bei Auslösung Licht gemäß wenigstens einem vorbestimmten Parameter (At, λ, I, tl) emittiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der wenigstens eine Parameter ausgewählt wird aus: einem vorbestimmten Wellenlängenbereich(A), einer vorbestimmten Intensität (At), einer vorbestimmten Zeitdauer(At) und einem vorbestimmten Zeitpunkt (tl).
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der wenigstens eine
vorbestimmte ParameterfAt, λ, I, tl) individuell für wenigstens einen der mehreren Filter (222) vorgegeben wird.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei als
Filtervorrichtung (220) eine Filterscheibe (221) verwendet wird, deren
Rotationsgeschwindigkeit insbesondere auf einen gewünschten Wert eingestellt wird.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei als
Filtervorrichtung (220) eine Filtervorrichtung mit wenigstens drei, bevorzugt wenigstens fünf, weiter bevorzugt wenigstens sieben, verschiedenen Filtern (222) verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei als
Bildaufnahmevorrichtung (230) wenigstens eine Kamera, die insbesondere als Single-Chip-Kamera ausgebildet ist, verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Auslösung der Beleuchtung der Probe (150) mittels der multispektralen Lichtquelle (210) und/oder ein Starten der Bildaufnahme mittels der Bildaufnahmevorrichtung (230) mittels eines Unterbrechungsmittels (260) bei Bedarf zeitweise
unterbrochen werden.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die
Filtervorrichtung (220) durchgehend kontinuierlich oder abschnittsweise kontinuierlich bewegt wird.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei als
multispektrale Lichtquelle (210) mehrere LEDs mit verschiedenen Wellenlängen verwendet werden.
12. Steuereinheit (218) zur Verwendung mit einer Mikroskop-Anordnung (300) umfassend ein Fluoreszenz-Mikroskops (100) mit einer Abbildungsoptik (120) zur Erzeugung eines Strahlengangs (160), eine multispektrale Lichtquelle (210), die mittels eines Auslösesignals betätigbar ist, einer
Bildaufnahmevorrichtung (230) und einer Filtervorrichtung (220), die mehrere verschiedene bewegbare Filter (222) aufweist, die jeweils einem unterschiedlichen Wellenlängenbereich zugeordnet sind, jeweils wahlweisezwischen die
Abbildungsoptik (120) und die Bildaufnahmevorrichtung (230) einbringbar sind, und denen jeweils eine Kodierung hinsichtlich einer vorgegebenen Position in Bezug auf den Strahlengang (160) zugeordnet ist,
wobei die Steuereinheit (218) dazu eingerichtet ist, bei Verwendung mit der Mikroskop-Anordnung (300) ein Verfahren nach einem der vorstehenden
Ansprüche durchzuführen.
13. Mikroskop-Anordnung (300) umfassend ein Fluoreszenz-Mikroskops (100) mit einer Abbildungsoptik (120) zur Erzeugung eines Strahlengangs (160), eine multispektrale Lichtquelle (210), die mittels eines Auslösesignals betätigbar ist, einer Bildaufnahmevorrichtung (230) und einer Filtervorrichtung (220), die mehrere verschiedene bewegbare Filter (222) aufweist, die jeweils einem unterschiedlichen Wellenlängenbereich zugeordnet sind, jeweils wahlweise zwischen die Abbildungsoptik (120) und die Bildaufnahmevorrichtung (230) einbringbar sind, und denen jeweils eine Kodierung hinsichtlich einer
vorgegebenen Position in Bezug auf den Strahlengang zugeordnet ist, und eine Steuereinheit (218) nach Anspruch 12,
wobei die Filtervorrichtung (220) zwischen Abbildungsoptik (120) und Bildaufnahmevorrichtung (230) eingebracht ist oder einbringbar ist.
14. Mikroskop-Anordnung (300) nach Anspruch 13, wobei die
Filtervorrichtung (220) austauschbar ausgebildet ist.
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