DE60128685T2

DE60128685T2 - Zusammensetzungen, die mit vegf/vegf und angiopoietin/tie rezeptor-funktionen interferieren

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Publication number: DE60128685T2
Application number: DE60128685T
Authority: DE
Inventors: Gerhard Siemeister; Martin Haberey; Karl-Heinz Thierauch
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-20
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2021-06-21
Also published as: HUP0302779A3; WO2001097850A2; MEP13708A; NO20026152D0; US20040147449A1; JP2003535910A; CA2411236A1; WO2001097850A3; NO20026152L; CY1107717T1; SK542003A3; DE60128685D1; DK1292335T3; AU784231B2; HRP20030041A2; ATE363291T1; BG107396A; KR20080068151A; EE200200706A; YU97202A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Kombination von Substanzen, die die biologische Tätigkeit des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) bzw. des VEGF-Rezeptorsystems behindern (Verbindung I), und Substanzen, die die biologische Funktion der Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme stören (Verbindung II), zur Inhibierung der Vaskularisierung und für die Behandlung von Krebs.
Proteinliganden und Rezeptortyrosinkinasen, die spezifisch die Funktion von Endothelzellen regulieren, sind wesentlich sowohl an physiologischer als auch an pathogener Angiogenese beteiligt. Diese Ligand/Rezeptorsysteme schließen die Familien von vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) und Angiopoietin (Ang) und ihre Rezeptoren, die VEGF-Rezeptorfamilie und die Familie von Tyrosinkinasen mit immunoglobulinähnlichen Domänen und Domänen mit Homologie zum epidermalen Wachstumsfaktor (Tie) ein. Die Mitglieder der beiden Familien von Rezeptortyrosinkinasen werden hauptsächlich auf Endothelzellen exprimiert. Die VEGF-Rezeptorfamilie schließt Flt1 (VEGF-R1), Flk1/KDR (VEGF-R2) und Flt4 (VEGF-R3) ein. Diese Rezeptoren werden von den Mitgliedern der mit VEGF verwandten Wachstumsfaktoren erkannt, da es sich bei den Liganden von Flt1 um VEGF und Plazentawachstumsfaktor (Placenta Growth Factor, PIGF) handelt, während Flk1/KDR VEGF, VEGF-C und VEGF-D bindet, und es sich bei den Liganden von Flt4 um VEGF-C und VEGF-D handelt (Nicosia, Am. J. Pathol. 153, 11–16, 1998). Die zweite Familie von endothelzellenspezifischen Rezeptortyrosinkinasen wird durch Tie1 und Tie2 (auch als Tek bekannt) vertreten. Während Tie1 ein Orphan-Rezeptor bleibt, wurden die drei sezernierten Glykoproteinliganden von Tie2, Ang1, Ang2 und Ang3/Ang4 entdeckt (Davis et al., Cell 87, 1161–1169, 19:6; Maisonpierre et al., Science 277, 55–60, 1997; Valenzuela et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1904–1909, 1999; Patente: US 5.521.073 ; US 5.650.490 ; US 5.814.464 ).
Die entscheidende Rolle des VEGF und seiner Rezeptoren bei der Entwicklung der Blutgefäße wurde in den Untersuchungen über gerichtete Gendesaktivierung illustriert. Selbst die heterozygote Unterbrechung des VEGF Gens hatte fatale Mängel in der Vaskularisierung zur Folge (Carmeliet et al., Nature 380, 435–439, 1996; Ferrara et al., Nature 380, 439–442, 1996). Mäuse, die homozygote Unterbrechungen entweder im Flt1- oder im Flk1/KDR-Gen tragen, sterben in der Mitte der Schwangerschaft an akuten Gefäßdefekten. Die Phänotypen unterscheiden sich jedoch darin, daß Flk1/KDR Knockoutmäusen sowohl Endothelzellen als auch ein sich entwickelndes hämatopoietisches System fehlen (Shalaby et al. Nature 376, 62–66, 1995), während Flt1-defiziente Mäuse normalhämatopoietische Vorfahren haben und über Endothelzellen verfügen, die sich nicht zu funktionsfähigen Gefäßen zusammenschließen (Fong et al., 376, 66–70, 1995). Eine Unterbrechung des Flt4-Gens, dessen umfangreiche embryonale Expression bei Erwachsenen auf die Lymphgefäße beschränkt ist, zeigte eine wesentliche Rolle von Flt4 für das Umgestalten und die Entwicklung der Primärgefäßnetze in größere Blutgefäße während der frühen Entwicklung des Herz-Kreislauf-Systems (Dumont et al., Science 282, 946–949, 1998). Im Einklang mit der lymphatischen Expression von Flt4 im Erwachsenen führte eine Überexpression von VEGF-C in der Haut transgener Mäuse zu einer lymphatischen, jedoch nicht vaskulären, Proliferation der Endothelzellen und zur einer Vergrößerung der Blutgefäße (Jeltsch et al., Science 276, 1423–1425, 1997). Außerdem wurde berichtet, daß VEGF-C im Mäusehornhaut-Angiogenesemodell und im Angiogenesemodell der Chorioallantoismembrane des Hühnerembryos eine Gefäßneubil dung induziert (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14389–14394, 1998).
Bei der zweiten Klasse endothelzellenspezifischer Rezeptortyrosinkinasen wurde ebenfalls gefunden, daß sie entscheidend an der Bildung und Instandhaltung des Gefäßsystems beteiligt sind. Mäuse, denen Tie1 fehlt, sterben an Ödem und Blutungen, die auf den schlechten strukturellen Zustand der Endothelzellen des Mikrogefäßsystems zurückzuführen sind (Sato et al., Nature 376, 70–74, 1995; Rodewald u. Sato, Oncogene 12, 397–404, 1996). Der Tie2-Knock-out-Phänotyp ist durch nicht voll ausgebildete Gefäße gekennzeichnet, denen die verzweigten Netze und periendotheliale Stützzellen fehlen (Sato et al., Nature 376, 70–74, 1995; Dumont et al., Genes Dev. 8, 1897–1909, 1994). Eine gezielte Desaktivierung des Tie2-Liganden Ang1 führte ebenso wie die Überexpression von Ang2, eines inhibierenden Liganden, zu Phänotypen, die dem Tie2-Knock-out ähneln (Maisonpierre et al., Science 277, 55–60, 1997; Suri et al., Cell 87, 1171–1180). Andererseits wurde nach transgener Überexpression von Ang1 eine vermehrte Vaskularisierung beobachtet (Suri et al., Science 282, 468–471, 1998; Thurstonen et al., Science 286, 2511–2514, 1999).
Die Ergebnisse von Untersuchungen zu Expression des angiogenen Wachstumfaktors in der Entwicklung des Corpus luteum (Maisonpierre et al., Science 277, 55–60, 1997; Goede et al. Lab. Invest. 78, 1385–1394, 1998), Untersuchungen zur Blutgefäßentwicklung in der Netzhaut (Alon et al., Nature Med. 1, 1024–1028, 1995; Benjamin et al., Entwicklung 125, 1591–1598, 1998) und Gentargeting-Experimenten und Transgen-Experimente mit Tie2, Ang1 und Ang2 deuten auf eine grundlegende Rolle des Angiopoietin/Tie-Rezeptorsystems bei der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und umgebenden Perizyten oder glatten Muskelzellen hin. Man nimmt an, daß Ang1, das von den Periendothelzellen ex primiert wird und im Erwachsenen konstitutiv exprimiert zu werden scheint, vorhandene reife Gefäße stabilisiert. Ang2, der natürliche Antagonist von Ang1, das von Endothelzellen an Stellen sich neu entwickelnder Gefäße exprimiert wird, scheint das Lösen der Kontakte zwischen Endothelzellen und Periendothelzellen zu vermitteln, was in Kooperation mit Initiatoren der Angiogenese wie VEGF eine Remodellierung und ein Sprießen der Gefäße und in Abwesenheit von VEGF eine Rückbildung der Gefäße erlaubt (Hanahan, Science 277, 48–50, 1997).
In den pathologischen Szenarien, die mit einer anomalen Gefäßneubildung assoziiert sind, wurde eine erhöhte Expression der angiogenen Wachstumfaktoren und ihrer Rezeptoren beobachtet. Die meisten festen Tumoren exprimieren hohe Niveaus an VEGF, und die VEGF-Rezeptoren treten überwiegend in den Endothelzellen der das maligne Gewebe umgebenden bzw. der in das maligne Gewebe eindringenden Gefäße auf (Plate et al., Cancer Res. 53, 5822–5827, 1993). Eine Störung von VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsystemen mit VEGF-neutralisierenden Antikörpern (Kim et al., Nature 362, 841–844, 1993), einer retroviralen Expression der dominant negativen VEGF-Rezeptorvarianten (Millauer et al., Nature 367, 576–579, 1994), rekombinante VEGF-neutralisierende Rezeptorvarianten (Goldman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8795–8800, 1998) oder niedermolekulare Inhibitoren der VEGF-Rezeptortyrosinkinase (Fong et al., Cancer Res. 59, 99–106, 1999; Wedge et al., Cancer Res. 60, 970–975, 2000; Wood et al. Cancer Res. 60, 2178–2189, 2000) oder auf VEGF bzw. das VEGF-Rezeptorsystem zielende zytotoxische Mittel (Arora et al., Cancer Res. 59, 183–188, 1999; EP 0696456A2 ) führte zu einem reduzierten Tumorwachstum und einer verminderten Tumorvaskularisierung. Viele Tumore wurden durch Störung von VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsystem gehemmt, andere waren jedoch nicht betroffen (Millauer et al., Cancer Res. 56, 1615–1620, 1996). Sowohl menschliche Tumore als auch experimentelle Tumor-Xenografts enthalten eine große Anzahl an noch nicht vollständig ausgebildeten Blutgefäßen, die noch keine Periendothelzellen rekrutiert haben. Der Anteil an noch nicht ausgereiften Gefäßen liegt bei langsam wachsendem Prostatakrebs im Bereich von 40% und beim schnell wachsenden Glioblastom im Bereich von 90%. Eine selektive Vernichtung der unreifen Blutgefäße der Tumore wurde beim. Entzug von VEGF durch Herunterregulieren der VEGF-Transgenexpression in einem C6-Glioblastom-Xenograftmodell beobachtet. Dieses Ergebnis stimmt mit der Funktion von VEGF als für das Überleben von Endothelzellen wichtiger Faktor überein. In ähnlicher Weise führte ein Abstellen der VEGF-Expression als Folge einer Androgenablationstherapie zu selektivem apoptotischem Tod der Endothelzellen in den Gefäßen, denen eine Schutzabdeckung aus Periendothelzellen fehlte. Im Gegensatz dazu waren die Gefäße, die einen VEGF-Entzug überstanden, von Periendothelzellen bedeckt (Benjamin et al., J. Clin. Invest. 103, 159–165, 1999).
Die Beobachtung einer erhöhten Expression von Tie-Rezeptoren im Endothelium von metastatisierenden Melanomen (Kaipainen et al., Cancer Res. 54, 6571–6577, 1994), in Brustkarzinomen (Salven et al., Br. J. Cancer 74, 69–72, 1996) und in in Gegenwart des dominant-negativen VEGF-Rezeptors kultivierten Tumorxenografts (Millauer et al., Cancer Res. 56, 1615–1620, 1996) sowie einer erhöhten Expression von Flt4-Rezeptoren im Endothel der Lymphome und Brustkarzinome umgebenden Lymphgefäße (Jussila et al., Cancer Res. 58, 1599–1604, 1998) und von VEGF-C in verschiedenen menschlichen Tumorproben (Salven et al., Am. J. Pathol. 153, 103–108, 1998) legt nahe, daß diese endothelspezifischen Wachstumfaktoren und Rezeptoren Kanditaten für alternative Pfade sind, die die Gefäßneubildung in Tumoren vorantreiben. Die beträchtliche Hochregulierung der Ang2-Expression schon in Tumoren im Frühstadium wurde als Abwehrmechanismus des Wirts gegen eine ursprüngliche Kooptierung vorhandener Blutgefäße durch den sich entwickelnden Tumor interpretiert. In Ermangelung von VEGF unterlaufen die kooptierten Gefäße eine Rückbildung, die eine Nekrose in der Tumormitte zur Folge hat. Im Gegensatz dazu wird durch die hypoxische Hochregulierung der VEGF-Expression zusammen mit einer erhöhten Expression von Ang2 die Tumorvaskularisierung und das Tumorwachstum am Rand des Tumors gerettet und unterstützt (Holash et al., Science 284, 1994–1998, 1999; Holash et al., Oncogene 18, 5356–5362, 1999).
Es wurde gezeigt, daß eine Störung der Funktion des Tie2-Rezeptors durch aus der extrazellulären ligandenbindenden Domäne bestehende Angiopoietin-neutralisierende Tie2-Varianten, zu einer Hemmung des Wachstums und der Vaskularisierung der experimentellen Tumore führt (Lin et al., J. Clin. Invest. 103, 159–165, 1999; Lin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8829–8834, 1998; Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185–3191, 1999). Ein Vergleich der Auswirkungen der Störung mit den endothelspezifischen Rezeptortyrosinkinasepfaden mittels parakriner Expression der jeweiligen extrazellulären Rezeptordomänen auf dem gleichen Zellhintergrund zeigte eine Hemmung des Tumorwachstums bei Blockade des VEGF-Rezeptorsystems beziehungsweise des Tie2-Rezeptorsystems (Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185–3191, 1999).
Es ist bekannt, daß die Hemmung des VEGF bzw. des VEGF-Rezeptorsystems durch verschiedene Methoden bei den meisten experimentellen Tumoren lediglich zu einer Verlangsamung des Wachstums führte (Millauer et al., Nature 367, 576–579, 1994; Kim et al., Nature 362, 841–844, 1993; Millauer et al., Cancer Res. 56, 1615–1620, 1996; Goldman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8795–8800, 1998; Fong et al., Cancer Res. 59, 99–106, 1999; Wedge et al., Cancer Res. 60, 970–975, 2000; Wood et al. Cancer Res. 60, 2178–2189, 2000; Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185–3191, 1999). Selbst bei Erhöhung der therapeutischen Dosen wurde ein Plateauniveau der therapeutischen Wirksamkeit erreicht (Kim et al., Nature 362, 841–844, 1993; Wood et al. Cancer Res. 60, 2178–2189, 2000). Ähnliche Ergebnisse wurden bei einer Störung des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems beobachtet (Lin et al., J. Clin. Invest. 103, 159–165, 1999; Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8829–8834, 1998; Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185–3191, 1999).
Es besteht jedoch ein großer Bedarf an Verfahren zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit von antiangiogenen Verbindungen.
Bei der Suche nach Verfahren zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit der antiangiogenen Verbindungen wurden unerwarteterweise überragende Antitumoreffekte beobachtet, wenn man die Hemmung von VEGF bzw. von VEGF-Rezeptorsystemen mit der Störung der biologischen Funktion der Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme kombinierte. Bei der den beobachteten überlegenen Wirkungen zugrundeliegenden Wirkungsweise könnte es sich darum handeln, daß durch die Störung der biologischen Funktion der Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme die Wechselwirkung von Endothelzellen und Periendothelzellen der vorhandenen reifen Tumorgefäße destabilisiert wird, wodurch das Endothel gegenüber den gegen den VEGF bzw. die VEGF-Rezeptorsysteme gerichteten Verbindungen empfindlich wird.
Basierend auf dieser unerwarteten Feststellung stellt die vorliegende Erfindung die Kombination der Störung der Funktion von VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsystemen mit der Störung der Funktion von Angiopoietin/Tie-Rezeptorsystemen für die Inhibierung von Vaskularisierung und Tumorwachstum bereit.
Die pharmazeutische Zusammensetzung besteht aus zwei Komponenten: Verbindung I hemmt die biologische Aktivi tät eines oder mehrerer VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsysteme oder besteht aus zytotoxischen Mitteln, die über Erkennung von VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsystemen auf das Endothel zielen. Verbindung II behindert die biologische Funktion eines oder mehrerer Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme oder besteht aus zytotoxischen Mitteln, die auf das Endothel zielen, indem sie Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme erkennen. Alternativ dazu hemmt Verbindung I die biologische Aktivität eines oder mehrerer VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsysteme oder des Angiopoietin/Tie-Rezeptorsystems und Verbindung II besteht aus zytotoxischen Mitteln, die auf das Endothel zielen, indem sie ein oder mehrere VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsysteme oder Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme erkennen. Targeting bzw. Modulation der biologischen Aktivitäten von VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsystemen und Angiopietin/Tie-Rezeptorsystemen lassen sich mit

(a) Verbindungen, die Rezeptortyrosin-Kinasetätigkeit hemmen,
(b) Verbindungen, die die Ligandenbindung an Rezeptoren hemmen,
(c) Verbindungen, die Aktivierung der intrazellulären Signalpfade der Rezeptoren hemmen,
(d) Verbindungen, die die Expression eines Liganden oder eines Rezeptors des VEGF- oder Tie-Rezeptorsystems hemmen oder aktivieren,
(e) Verabreichungssystemen wie Antikörpern, Liganden, mit hoher Affinität bindenden Oligonukleotiden oder Oligopeptiden, oder Liposomen, die zytotoxische Mittel oder gerinnungsinduzierende Mittel gezielt an das Endothel verabreichen, indem sie VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsysteme oder Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme erkennen,
(f) Verabreichungssystemen wie Antikörpern, Liganden, mit hoher Affinität bindenden Oligonukleotiden oder Oligopeptiden, oder Liposomen, die auf das Endothel zielen und Nekrose oder Apoptose induzieren

Bei den in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthaltenen Verbindungen kann es sich um niedermolekulare Substanzen, Oligonukleotide, Oligopeptide, rekombinante Proteine, Antikörper oder Konjugate oder Fusionproteine davon handeln. Ein Beispiel für einen Inhibitor ist ein niedermolekulares Molekül, das eine Rezeptortyrosinkinase desaktiviert, indem es sich an das katalytische Zentrum bindet und dieses besetzt, so daß die biologische Aktivität des Rezeptors verringert wird. Kinasehemmer sind im Stand der Technik bekannt (Sugen: SU5416, SU6668; Fong et al. (1999), Cancer Res. 59, 99–106; Vajkoczy et al., Proc. Am. Associ. Cancer Res. San Francisco (2000), Abstract ID 3612; Zeneca: ZD4190, ZD6474; Wedge et al. (2000), Cancer Res. 60, 970–975; Parke-Davis PD0173073, PD0173074; Johnson et al., Proc. Am. Associ. Cancer Res., San Franzisco (2000), Abstract ID 3614; Dimitroff et al. (1999), Invest. New Drugs 17, 121–135). Ein Beispiel für einen Antagonisten ist ein rekombinantes Protein oder ein Antikörper, der sich so an einen Liganden bindet, daß eine Aktivierung des Rezeptors durch den Liganden verhindert wird. Ein anderes Beispiel für einen Antagonisten ist ein Antikörper, der sich so an den Rezeptor bindet, daß eine Aktivierung des Rezeptors verhindert wird. Ein Beispiel für eine die Expression modulierende Substanz ist eine Antisense-RNA oder ein Ribozym, die/das die Expression eines Liganden oder eines Rezeptors steuert. Ein Beispiel für ein gezielt wirkendes zytotoxisches Mittel ist ein Fusionsprotein eines Liganden mit einem bakteriellem Toxin oder einem Pflanzentoxin wie Pseudomonas-Exotoxin A, Diphtherietoxin oder Ricin A. Ein Beispiel für ein gezielt wirkendes gerinnungsinduzierendes. Mittel ist ein Konjugat eines Einzelkettenantikörpers mit einem Gewebefaktor. Ligandenbindende Inhibitoren wie neutralisierende Antikörper, die im Stand der Technik bekannt sind, werden von Genentech (rhuMAbVEGF) und von Presta et al. (1997), Cancer Res. 57, 4593–4599 beschrieben. Ligandenbindende Rezeptordomänen werden von Kendall und Thomas (1993), Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 90, 10705–10709; von Goldman et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 95, 8795–8800 und von Lin et al. (1997), J. Clin. Invest. 100, 2072–2078 beschrieben. Weiterhin wurden dominant-negative Rezeptoren von Millauer et al. (1994), Nature 367, 567–579 beschrieben.
Rezeptorblockierende Antikörper wurden von Imclone (cp1C11, US 5.874.542 ) beschrieben. Außerdem sind antagonistische Ligandenmutanten (Siemeister et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 95, 4625–4629) bekannt. Hochaffine liganden- oder rezeptorbindende Oligonukleotide wurden von NeXstar (NX-244) und von Drolet et al. (1996), Nat. Biotech 14, 1021–1025 beschrieben. Weiterhin wurden kleine Moleküle und Peptide beschrieben.
Als Expressionsregulatoren wurden Antisense-Oligonukleotide und Ribozyme (RPI, Angiozyme^TM, siehe RPI-Homepage) beschrieben.
Als Beispiele für Delivery/Targeting-Systeme wurden Ligand/Antikörper-Toxin-Fusionsproteine oder Konjugate (Arora et al. (1999), Cancer Res. 59, 183–188 und Olson et al. (1997), Int. J. Cancer 73, 865–870), das Targeting von Endothelzellen durch Liposome (Spragg et al. (1997), Prog. National. Acad. Sci, U. S. A 94, 8795–8800 und das Targeting von Endothelzellen plus die Gerinnungsinduktion (Ran et al., (1998), Cancer Res. 58, 4646–4653) beschrieben.
Kleine Moleküle, die die Tätigkeit der Rezeptortyrosin-Kinase hemmen, sind zum Beispiel Moleküle der allgemeinen Formel I
in welcher
r für 0 bis 2 steht,
n für 0 bis 2 steht;
R₃ und R₄

a) jeweils unabhängig voneinander für Niederalkyl stehen,
b) zusammen eine Brücke der Formel II bilden,
wobei die Bindung über die beiden terminalen C-Atome erfolgt und

c) zusammen eine Brücke der Teilformel III bilden
wobei eines oder zwei der Ringglieder T₁, T₂, T₃, T₄ für Stickstoff steht/stehen und die anderen für CH stehen und die Bindung über die Atome T₁ und T₄ erfolgt;

₁

₆

₂

₆

₂

₆

₂

₆

₃

₆

₂

₁

₂

Ein bevorzugtes Salz ist das Salz einer organischen Säure, besonders ein Succinat.
Diese Verbindungen können in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung vorzugsweise als Verbindung I oder II eingesetzt werden.
Verbindungen, die die Phosphorylierung von Tyrosin beziehungsweise die anhaltende Angiogenese stoppen, was eine Verhinderung des Wachstums und der Ausbreitung des Tumors zur Folge hat, sind zum Beispiel Anthranylsäure derivate der allgemeinen Formel IV
in welcher
A für eine Gruppe =NR² steht,
W für Sauerstoff, Schwefel, zwei Wasserstoffatome oder die Gruppe =NR⁸ steht,
Z für die Gruppe =NR¹⁰ oder =N-, -N(R¹⁰)-(CH₂)_q-, geradkettiges oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl steht oder für die Gruppe
steht oder A, Z und R¹ zusammen die Gruppe
bilden,
m, n und o für 0 bis 3 stehen,
q für 1 bis 6 steht,
R_a, R_b, R_c, R_d, R_e, R_f unabhängig voneinander für Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl oder die Gruppe =NR¹⁰ stehen, und/oder R_a und/oder R_b zusammen mit R_c und/oder R_d oder R_c zusammen mit R_e und/oder R_f eine Bindung bilden, oder bis zu zwei Gruppen R_a–R_f eine Brücke mit jeweils bis zu 3 C-Atomen mit R¹ oder R² bilden,
X für eine Gruppe =NR⁹ oder =N- steht,
Y für eine Gruppe -(CH₂)_p steht, p für eine ganze Zahl 1 bis 4 steht,
R¹ für unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiertes, C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Alkoxy, das gegebenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiert ist, oder für unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Heteroaryl steht,
R² für Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl steht oder mit R_a–R_f zusammen mit Z oder R₁ eine Brücke mit bis zu 3 Ringatomen bildet,
R³ für monocyclisches oder bicyclisches, unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene, C₁-C₆- Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy oder Hydroxy substituiertes Aryl oder Heteroaryl steht,
R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiertes C₁-C₆-Alkoxy, C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Carboxyalkyl steht, oder R⁵ und R⁶ zusammen die Gruppe
bilden,
R⁸, R⁹ und R¹⁰ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl stehen,
sowie ihre Isomere und Salze.
Diese Verbindungen können auch vorzugsweise als Verbindungen I oder II in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt können Verbindungen der allgemeinen Formel V
in welcher
R¹ für eine Gruppe
steht,
in welcher R⁵ für Chlor, Brom oder die Gruppe -OCH₃ steht,
in welcher R⁷ für -CH₃ oder Chlor steht,
in welcher R⁶ für -CH₃, Fluor, Chlor oder -CF₃ steht,
in welcher R⁴ für Fluor, Chlor, Brom, -CF₃, -N=C, -CH₃, -OCF₃ oder -CH₂OH steht,
in welcher R⁶ für -CH₃ oder Chlor steht,
R² für Pyridyl oder die Gruppe
steht
und
R³ für Wasserstoff oder Fluor steht, sowie ihre Isomere und Salze als Verbindungen I oder II in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eingesetzt werden.
Diese Verbindungen haben die gleichen Eigenschaften wie bereits oben für die Verbindungen IV erwähnt und können für die Behandlung von angiogenen Krankheiten verwendet werden. Die Zusammensetzungen enthalten Verbindungen der allgemeinen Formeln I, IV und V, alleine oder in der Kombination.
Die obenerwähnten Verbindungen werden auch als Gegenstand innerhalb der erfindungsgemäßen Kombinationen beansprucht.
Ein weiteres Beispiel für ligandenbindende Inhibitoren sind Peptide und DNA-Sequenzen, die für solche Peptide kodieren, die für die Behandlung von angiogenen Krankheiten eingesetzt werden. Solche Peptide und DNA-Sequenzen sind in Seq. ID Nr. 1 bis 59 des Sequenzprotokolls angeführt. Es wurde gezeigt, daß das Hauptinteresse Seq. ID Nr. 34 und 34a gilt.
Bei einer sequentiellen therapeutischen Anwendung können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen gleichzeitig oder getrennt angewendet werden.
Ebenfalls als Gegenstand der vorliegenden Erfindung beansprucht werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Verbindung I und/oder II wenigstens eine der Seq. ID Nr. 1–59 enthalten. Am wertvollsten sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Verbindung I und/oder II Seq. ID Nr. 34a enthalten, und pharmazeutische Zusammensetzungen entsprechend den Ansprüchen, die als Verbindung I und/oder II wenigstens eine der folgenden enthalten: sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF-Konjugat und/oder L19-scFv-tTF-Konjugat.
Weitere bevorzugte Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Verbindung I und/oder II mindestens ein kleines Molekül der allgemeinen Formel I, der allgemeinen Formel IV und/oder der allgemeinen Formel V enthalten.
Die am meisten bevorzugte Verbindung, die als Verbindung I oder II in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eingesetzt werden kann, ist (4-Chlorphenyl)[4(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat.
Beanspruchte Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind daher auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Verbindung I (4-Chlorphenyl)[4(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat, sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF-Konjugat und/oder L19-scFv-tTF-Konjugat und als Verbindung II (4-Chlorphenyl)[4(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat, sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF-Konjugat und/oder L19-scFv-tTF-Konjugat enthalten, mit der Maßgabe, daß Verbindung I nicht mit Verbindung II identisch ist, und die am meisten bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als Verbindung I (4-Chlorphenyl)[4(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat und als Verbindung II sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF-Konjugat und/oder L19-scFv-tTF-Konjugat enthalten; pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Verbindung I mAB 4301-42-35 und als Verbindung II sTie2 und/oder scFv-tTF-Konjugat enthalten; pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Verbindung I scFv-tTF-Konjugat und als Verbindung II sTie2 und/oder mAB 4301-42-35 enthalten; pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Verbindung I L19-scFv-tTF-Konjugat und als Verbindung II sTie2 enthalten.
Die niedermolekularen Verbindungen, Proteine und DNA exprimierenden Proteine, wie oben erwähnt, können als Medikament alleine oder in der Form von Formulierungen für die Behandlung von Tumoren, Krebs, Psoriasis, Arthritis wie z. B. rheumatoider Arthritis, Hämangiomen, Angiofibromen, Augenkrankheiten wie z. B. diabetischer Retinopathie, neovaskulärem Glaukom, Nierenkrankheiten wie z. B. Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie, maligner Nephrosklerose, thrombotischer Mikroangiopathie, Transplantatabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotischen Krankheiten wie z. B. Leberzirrhose, proliferativen Krankheiten von Mesangialzellen, Arteriosklerose und Schädigungen von Nervengewebe eingesetzt werden.
Die Behandlung der beschädigten Nervengewebe mit der erfindungsgemäßen Kombination verhindert die schnelle Bildung von Narben in der beschädigten Stelle. Es gibt somit keine Narbenbildung, bevor die Axons miteinander kommunizieren. Eine Rekonstruktion der Nervenbindungen ist deshalb sehr viel einfacher.
Weiter können die erfindungsgemäßen Kombinationen zum Unterdrücken der Entstehung von Aszites bei Patienten verwendet werden. Es ist auch möglich, VEGF-Ödeme zu unterdrücken. Für den Gebrauch der erfindungsgemäßen Kombinationen als Medikament werden die Verbindungen als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert. Neben dem Wirkstoff bzw. den Wirkstoffen enthalten diese Formulierungen pharmazeutisch unbedenkliche, organisch oder anorganisch inerte Träger wie Wasser, Gelatine, Gummiarabikum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Pflanzenöle, Polyalkylenglykole usw. Diese pharmazeutischen Zubereitungen können in fester Form, z. B. als Tabletten, Pillen, Zäpfchen, Kapseln, oder in flüssiger Form, z. B. als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen angewendet werden.
Falls erforderlich enthalten die Zusammensetzungen weiterhin Zusätze wie Konservierungsmittel, Stabilisa toren, Tenside oder Emulgatoren, Salze zum Einstellen des osmotischen Drucks und/oder Puffer.
Diese Anwendungen werden ebenfalls als Gegenstand der vorliegenden Erfindung beansprucht, ebenso wie die Formulierungen der Wirkstoffe.
Für die parenterale Anwendung eignen sich insbesondere Injektionslösungen oder -suspensionen, vor allem wäßrige Lösungen des Wirkstoffs in polyhydroxyethoxyliertem Rhizinusöl.
Als Zusatzstoffe können auch Träger wie Salze der Gallussäure oder Tier- oder Pflanzenphospholipide, sowie Mischungen davon und Liposome oder Bestandteile davon eingesetzt werden.
Für die orale Anwendung eignen sich insbesondere Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Talk und/oder Kohlenwasserstoffträgern oder -bindemitteln wie Lactose, Mais- oder Kartoffelstärke. Die orale Anwendung kann auch in der Form einer Flüssigkeit wie Saft, der gegebenenfalls einen Süßstoff enthält, erfolgen.
Die Wirkstoffdosis hängt von der Verwendung der Verbindung, dem Alter und dem Gewicht des Patienten sowie von der Form und dem Fortschreiten der Krankheit ab.
Die Tagesdosis des Wirkstoffs beträgt 0,5–1000 mg, insbesondere 50–200 mg. Die Dosis kann als Einzeldosis oder als zwei oder mehr Dosen pro Tag verabreicht werden.
Diese Formulierungen und Anwendungsformen sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Die kombinierte Störung der Funktion von VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsystemen und Angiopoietin/Tie-Rezeptor systemen kann gleichzeitig oder aufeinanderfolgend durchgeführt werden, so daß die biologische Reaktion auf die Störung des einen Liganden/Rezeptorsystems mit der biologischen Reaktion auf die Störung des zweiten Liganden/Rezeptorsystems überlappt. Alternativ dazu kann die kombinierte Störung der Funktion von VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsystemen und Angiopoietin/Tie-Rezeptorsystemen und das Targeting von zytotoxischen Mitteln über VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsysteme oder über Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme gleichzeitig oder aufeinanderfolgend durchgeführt werden, so daß die biologische. Reaktion auf die funktionelle Störung eines Liganden/Rezeptorsystems zeitlich mit dem Targeting der zytotoxischen Mittel überlappt.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Substanz, die funktionell sowohl VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsysteme als auch Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme stört, oder die sowohl auf VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsysteme als auch Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme zielt.
VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsysteme schließen die Liganden VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF und die Rezeptortyrosinkinasen VEGF-R1 (Flt1), VEGF-R2 (KDR/Flk1), VEGF-R3 (Flt4) und ihre Corezeptoren (d. h. Neuropilin-1) ein. Angiopoietin/Tie-Rezeptorsysteme schließen Ang1, Ang2, Ang3/Ang4 und mit Angiopoietin verwandte Polypeptide, die an Tie1 oder an Tie2 binden, und die Rezeptortyrosinkinasen Tie1 und Tie2 ein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können für medizinische Zwecke eingesetzt werden. Solche Krankheiten sind zum Beispiel Krebs, Krebsmetastasen, Angiogenese einschließlich Retinopathie und Psoriasis. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral oder mittels Verfahren der Gentherapie angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren, Krebs, Psoriasis, Arthritis wie z. B. rheumatoider Arthritis, Hämangiomen, Angiofibromen, Augenkrankheiten wie z. B. diabetischer Retinopathie, neovaskulärem Glaukom, Nierenkrankheiten wie z. B. Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie, maligner Nephrosklerose, thrombotischer Mikroangiopathie, Transplantatabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotischen Krankheiten wie z. B. Leberzirrhose, proliferativen Krankheiten von Mesangialzellen, Arteriosklerose, Schädigungen von Nervengewebe, Unterdrückung der Entstehung von Aszites in Patienten und Unterdrückung von VEGF-Ödemen.
Die folgenden Beispiele zeigen die Durchführbarkeit der offenbarten Erfindung, ohne daß hierdurch die Erfindung auf die offenbarten Beispiele eingeschränkt wird.
Beispiel 1
Die überlegene Wirkung auf Hemmung des Tumorwachstums durch eine Kombination der Hemmung von VEGF A bzw. des VEGF-Rezeptorsystems zusammen mit Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems über separate Eingriffsmodi wurde in einem Modell mit Xenografts des humanen A375v-Melanoms demonstriert.

Die humane Melanomzelllinie A375v wurde stabil transfiziert, so daß sie die extrazelluläre ligandenneutralisierende Domäne der humanen Tie2-Rezeptortyrosinkinase (sTie2; Verbindung II) überexprimierte (Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185–3191, 1999). Zur Kontrolle wurden A375v-Zellen stabil mit dem leeren Expressionsvektor (A375v/pCEP) transfiziert. Schweizer nu/nu-Mäusen wurden subkutan 1 × 10⁶ transfizierte A375v/sTie2- bzw. A375v/pCEP-Tumorzellen injiziert. Die Tiere, die Verbindung I erhalten hatten, wurden bis zu 38 Tage lang mit oralen Tagesdosen von 50 mg/kg des VEGF-Rezeptortyrosinkinasehemmers (4-Chlorphenyl)[4(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Wood et al., Cancer Res. 60, 2178–2189, 2000) behandelt. Verschiedene Behandlungverfahren sind in Tabelle 1 beschrieben. Das Tumorwachstum wurde durch Messen des größten Durchmessers und der Senkrechten dazu mit einer Schieblehre festgestellt. Tabelle 1

	Behandlungsverfahren
Behandlungsgruppe	(4-Chlorphenyl)[4(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Verbindung I)	sTie2 (Verbindung II)
Gruppe 1: A375v/pCEP	-	-
Gruppe 2: A375v/pCEP	+	-
Gruppe 3: A375v/sTie2	-	+
Gruppe 4: A375v/sTie2	+	+

Von den A375v/pCEP-Kontrollzellen abgeleitete Tumore erreichten ohne Behandlung (Gruppe 1) innerhalb von 24 Tagen eine Größe von ca. 250 mm² (mittlere Fläche) (1). Eine separate Behandlung mit dem VEGF-Rezeptor-Inhibitor (4-Chlorphenyl)[4(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Verbindung I, Behandlungsgruppe 2) oder separate Störung des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems mittels Expression von sTie2 (Verbindung II, Behandlungsgruppe 3) verzögerte das Heranwachsen der Tumore auf eine Größe von ca. 250 mm² auf jeweils 31 Tage. Kombinierte man die Störung des Angiopoietin/Tie2-Systems mittels Expression von sTie2 und die Störung des VEGF/VEGF-Rezeptorsystems mit dem Kinaseinhibitor (4-Chlorphenyl)[4(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Verbindung I + Verbindung II, Behandlungsgruppe 4), so verzögerte sich das Heranwachsen der Tumore auf eine Größe von ca. 250 mm² auf 38 Tage.
Dieses Resultat zeigt deutlich die überlegene Wirkung einer Kombination der Störung des VEGF-A/VEGF-Rezeptorsystems und des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems im Vergleich zu den separat angewandten Interventionsverfahren.
Beispiel 2
Die Kombination der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems mit der Neutralisierung von VEGF-A ist den separat angewendeten Interventionsverfahren bei der Hemmung des Tumorwachstums überlegen.

Von A375v/sTie2-Zellen und von A375v/pCEP-Zellen abgeleitete Tumore wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in Nacktmäusen induziert. Die die Verbindung 1 erhaltenden Tiere wurde über einen Zeitraum von 4 Wochen zweimal wöchentlich intraperitoneal mit Dosen von 200 μg des VEGF-A-neutralisierenden monoklonalen Antikörpers (mAb) 4301-42-35 behandelt (Schlaeppi et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125, 336–342, 1999). In Tabelle 2 sind verschiedene Behandlungverfahren beschrieben. Die Tiere wurden aus ethischen Erwägungen getötet, wenn die Tumore von Gruppe 1 ein Volumen von mehr als ca. 1000 mm³ aufwiesen. Das Tumorwachstum wurde durch Messen des größten Durchmessers und der Senkrechten dazu mit einer Schieblehre festgestellt. Tabelle 2

	Behandlungsverfahren
Behandlungsgruppe	mAb 4301-42-35 (Verbindung I)	sTie2 (Verbindung II)
Gruppe 1: A375v/pCEP	-	-
Gruppe 2: A375v/pCEP	+	-
Gruppe 3: A375v/sTie2	-	+
Gruppe 4: A375v/sTie2	+	+

Von den A375v/pCEP-Kontrollzellen abgeleitete Tumore erreichten ohne Behandlung (Gruppe 1) innerhalb von 28 Tagen eine Größe von ca. 1000 mm³. Die Tumore, die mit dem VEGF-A-neutralisierenden mAb 4301-42-35 behandelt wurden (Verbindung I, Behandlungsgruppe 2), wuchsen innerhalb von 28 Tagen zu einem Volumen von ca. 450 mm³ heran. Durch eine Störung des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems mittels Expression von sTie2 (Verbindung II, Behandlungsgruppe 3) wurde das Wachstum der Tumore innerhalb von 28 Tagen auf ein Volumen von ca. 600 mm² verringert. Eine Kombination der Störung des Angiopoietin/Tie2-System mittels Expression von sTie2 und des Neutralisierens von VEGF-A mittels mAb 4301-42-35 (Verbindung I + Verbindung II, Behandlungsgruppe 4) resultierte in einer Hemmung des Tumorwachstums auf ein Volumen von ca. 250 mm³ innerhalb von 28 Tagen.
Die überlegene Wirkung einer Kombination der Neutralisierung von VEGF-A und der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems durch separate Interventionsverfahren ist klar ersichtlich.
Beispiel 3
Die Kombination der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems mit dem Targeting eines gerinnungsinduzierenden Proteins über das VEGF/VEGF-Rezeptorsystem ist den separat angewendeten Interventionsverfahren bei der Hemmung des Tumorwachstums überlegen.

Von A375v/sTie2-Zellen und von A375v/pCEP-Zellen abgeleitete Tumore wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in Nacktmäusen induziert. Ein den humanen VEGF-A/VEGF-Rezeptor-I-Komplex ( WO 99/19361 ) spezifisch erkennender Einzelkettenantikörper (scFv) wurde in E. coli exprimiert und unter Anwendung von von Ran et al. (Cancer Res. 58, 4646–4653, 1998) beschriebenen Verfahren mit dem gerinnungsinduzierenden rekombinanten humanen "truncated tissue factor" (tTF) konjugiert. Als die Tumore eine Größe von ca. 200 mm³ erreicht hatten, wurden die Tiere, die Verbindung I erhielten, an Tag 0 und an Tag 4 mit intravenösen Dosen von 20 μg des scFv-tTF-Konjugats behandelt. In Tabelle 3 sind verschiedene Behandlungverfahren beschrieben. Die Tiere wurden aus ethischen Erwägungen getötet, wenn die Tumore von Gruppe 1 ein Volumen von mehr als ca. 1000 mm³ aufwiesen. Das Tumorwachstum wurde durch Messen des größten Durchmessers und der Senkrechten dazu mit einer Schieblehre festgestellt. Tabelle 3

	Behandlungsverfahren
Behandlungsgruppe	scFv-tTF-Konjugat (Verbindung I)	sTie2 (Verbindung II)
Gruppe 1: A375v/pCEP	-	-
Gruppe 2: A375v/pCEP	+	-
Gruppe 3: A375v/sTie2	-	+
Gruppe 4: A375v/sTie2	+	+

Von den A375v/pCEP-Kontrollzellen abgeleitete Tumore erreichten ohne Behandlung (Gruppe 1) innerhalb von 28 Tagen eine Größe von ca. 1000 mm³ (3). Die Tumore, die mit dem gerinnungsinduzierenden tTF, der über das scFv-tTF-Konjugat (Verbindung I, Behandlungsgruppe 2) auf den VEGF-A/VEGF-Rezeptor-I-Komplex gerichtet ist, behandelt wurden, wuchsen innerhalb von 28 Tagen auf ein Volumen von ca. 500 mm³ heran. Durch eine Störung des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems mittels Expression von sTie2 (Verbindung II, Behandlungsgruppe 3) wurde das Wachstum der Tumore innerhalb von 28 Tagen auf ein Volumen von ca. 600 mm² verringert. Eine Kombination der Störung des Angio poietin/Tie2-System mittels Expression von sTie2 mit dem Targeting des VEGF-Rezeptorkomplexes (Verbindung I + Verbindung II, Behandlungsgruppe 4) resultierte in einer Hemmung des Tumorwachstums auf ein Volumen von ca. 300 mm³ innerhalb von 28 Tagen.
Die überlegene Wirkung einer Kombination des Targeting des VEGF-A/VEGF-Rezeptor-I-Komplexes mit gerinnungsinduzierendem tTF und der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems durch separate Interventionsverfahren ist klar ersichtlich. Ähnliche Wirkungen sind bei Targeting von VEGF bzw. VEGF-Rezeptorsystemen mit zytotoxischen Mitteln zu erwarten.
Beispiel 4
Die Kombination der Störung der Funktion des VEGF/VEGF-Rezeptorsystems mit dem Targeting eines gerinnungsinduzierenden Proteins über das VEGF/VEGF-Rezeptorsystem ist den separat angewendeten Interventionsverfahren bei der Hemmung des Tumorwachstums überlegen.

Von A375v/pCEP-Zellen abgeleitete Tumore wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in Nacktmäusen induziert. Die Tiere, die Verbindung I erhielten, wurden bis zu 28 Tage lang mit oralen Tagesdosen von 50 mg/kg des VEGF-Rezeptortyrosinkinasehemmers (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Wood et al., Cancer Res. 60, 2178–2189, 2000) behandelt. Verbindung II besteht aus einem den humanen VEGF-A/VEGF-Rezeptor-I-Komplex spezifisch erkennenden Einzelkettenantikörper (scFv) ( WO 99/19361 ), der in E. coli exprimiert und unter Anwendung von von Ran et al. (Cancer Res. 58, 4646–4653, 1998) beschriebenen Verfahren mit dem gerinnungsinduzierenden rekombinanten humanen "truncated tissue factor" (tTF) konjugiert wurde. Als die Tumore eine Größe von ca. 200 mm³ erreicht hatten, wurden die Tiere, die Verbindung 11 erhielten, an Tag 0 und an Tag 4 mit intravenösen Dosen von 20 μg des scFv-tTF-Konjugats behandelt. In Tabelle 4 sind verschiedene Behandlungsverfahren beschrieben. Die Tiere wurden aus ethischen Erwägungen getötet, wenn die Tumore von Gruppe 1 ein Volumen von mehr als ca. 1000 mm³ aufwiesen. Das Tumorwachstum wurde durch Messen des größten Durchmessers und der Senkrechten dazu mit einer Schieblehre festgestellt. Tabelle 4

	Behandlungsverfahren
Behandlungsgruppe	(4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Verbindung I)	sTie2 (Verbindung II)
Gruppe 1: A375v/pCEP	-	-
Gruppe 2: A375v/pCEP	+	-
Gruppe 3: A375v/pCEP	-	+
Gruppe 4: A375v/pCEP	+	+

Von den A375v/pCEP-Kontrollzellen abgeleitete Tumore erreichten ohne Behandlung (Gruppe 1) innerhalb von 28 Tagen eine Größe von ca. 1000 mm³ (4). Durch eine separate Behandlung mit dem VEGF-Rezeptorinhibitor (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Verbindung I, Behandlungsgruppe 2) wurde das Wachstum der Tumore auf ein Volumen von ca. 550 mm³ verringert. Tumore, die über das scFv-tTF-Konjugat (Verbindung II, Behandlungsgruppe 3) mit dem auf den VEGF-A/VEGF-Rezeptor-I-Komplex zielenden gerinnungsinduzierenden tTF behandelt wurden, wuchsen innerhalb von 28 Tagen auf ein Volumen von ca. 500 mm³ heran. Eine Kombination der Hemmung der VEGF-Rezeptortyrosinkinase mittels (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat mit dem Targeting des VEGF-Rezeptorkomplexes (Verbindung I + Verbindung II, Behandlungsgruppe 4) resultierte in einer Hemmung des Tumorwachstums auf ein Volumen von ca. 400 mm³ innerhalb von 28 Tagen.
Die überlegene Wirkung einer Kombination des Targeting des VEGF-A/VEGF-Rezeptor-I-Komplexes mit gerinnungsinduzierendem tTF und der Störung der Funktion des VEGF/VEGF-Rezeptorsystems durch separate Interventionsverfahren ist klar ersichtlich. Ähnliche Wirkungen sind bei Targeting von Angiopoietin/Tie-Rezeptorsystemen mit zytotoxischen Mitteln zu erwarten.
Beispiel 5
Die Kombination der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems mit dem endothelspezifischen Targeting eines gerinnungsinduzierenden Proteins ist den separat angewendeten Interventionsverfahren bei der Hemmung des Tumorwachstums überlegen.

Von A375v/sTie2-Zellen und von A375v/pCEP-Zellen abgeleitete Tumore wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in Nacktmäusen induziert. Ein Fusionsprotein (L19-scFv-tTF) bestehend aus dem spezifisch die onkofetale EDB-Domäne von Fibronektin erkennenden Einzelkettenantikörper L19 und der extrazellulären Domäne des Gewebefaktors, wurde wie von Nilsson et al. beschrieben. (Nat. Med., im Druck) in E. coli exprimiert. Daten zu L19-scFv-tTF wurden weiterhin von D. Neri und F. Nilsson vorgestellt (Meeting "Advances in the application of monoclonal antibodies in clinical oncology", Samos, Griechenland, 31. Mai – 2. Juni 2000). Als die Tumore eine Größe von ca. 200 mm³ erreicht hatten, wurden die Tiere, die Verbindung I erhielten, mit einer einzelnen intravenösen Dosis von 20 μg L19-scFv-tTF in 200 μl Kochsalzlösung behandelt. In Tabelle 5 sind verschiedene Behandlungsverfahren beschrieben. Die Tiere wurden aus ethischen Erwägungen getötet, wenn die Tumore von Gruppe 1 ein Volumen von mehr als ca. 1000 mm³ aufwiesen. Das Tumorwachstum wurde durch Messen des größten Durchmessers und der Senkrechten dazu mit einer Schieblehre festgestellt. Tabelle 5

	Behandlungsverfahren
Behandlungsgruppe	L19-scFv-tTF (Verbindung I)	sTie2 (Verbindung II)
Gruppe 1: A375v/pCEP	-	-
Gruppe 2: A375v/pCEP	+	-
Gruppe 3: A375v/sTie2	-	+
Gruppe 4: A375v/sTie2	+	+

Von den A375v/pCEP-Kontrollzellen abgeleitete Tumore erreichten ohne Behandlung (Gruppe 1) innerhalb von 28 Tagen eine Größe von ca. 1000 mm³ (5). Die Tumore, die mit dem gerinnungsinduzierenden L19-scFv-tTF behandelt wurden (Verbindung I, Behandlungsgruppe 2), wuchsen innerhalb von 28 Tagen auf ein Volumen von ca. 450 mm³ heran. Durch eine Störung des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems mittels Expression von sTie2 (Verbindung II, Behandlungsgruppe 3) wurde das Wachstum der Tumore innerhalb von 28 Tagen auf ein Volumen von ca. 600 mm² verringert. Kombination der Störung mit dem System Angiopoietin/Tie2 mittels des Ausdruckes von sTie2 und des Zielens des Endothels mit L19-scFv-tTF (Verbindung I + Verbindung II, Behandlungsgruppe 4) resultierte in einer Hemmung des Tumorwachstums auf ein Volumen von ca. 250 mm³ innerhalb von 28 Tagen.
Die überlegene Wirkung einer Kombination des Targeting des Endothels mit L19-scFv-tTF und der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems durch separate Interventionsverfahren ist klar ersichtlich.
Beispiel 6
Die Kombination der Störung der Funktion des VEGF/VEGF-Rezeptorsystems mit dem endothelspezifischen Targeting eines gerinnungsinduzierenden Proteins ist den separat angewendeten Interventionsverfahren bei der Hemmung des Tumorwachstums überlegen.

Von A375v/pCEP-Zellen abgeleitete Tumore wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in Nacktmäusen induziert. Die Tiere, die Verbindung I erhielten, wurden bis zu 28 Tage lang mit oralen Tagesdosen von 50 mg/kg des VEGF-Rezeptortyrosinkinasehemmers (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Wood et al., Cancer Res. 60, 2178–2189, 2000) behandelt. Verbindung II besteht aus L19-scFv-tTF Fusionsprotein, wie in Beispiel 5 beschrieben. Als die Tumore eine Größe von ca. 200 mm³ erreicht hatten, wurden die Tiere, die Verbindung I erhielten, mit einer einzelnen intravenösen Dosis von 20 μg L19-scFv-tTF in 200 μl Kochsalzlösung behandelt. In Tabelle 6 sind verschiedene Behandlungsverfahren beschrieben. Die Tiere wurden aus ethischen Erwägungen getötet, wenn die Tumore von Gruppe 1 ein Volumen von mehr als ca. 1000 mm³ aufwiesen. Das Tumorwachstum wurde durch Messen des größten Durchmessers und der Senkrechten dazu mit einer Schieblehre festgestellt. Tabelle 6

	Behandlungsverfahren
Behandlungsgruppe	(4Chlorphenyl) [4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Verbindung I)	L19-scFv-tTF (Verbindung II)
Gruppe 1: A375v/pCEP	-	-
Gruppe 2: A375v/pCEP	+	-
Gruppe 3: A375v/pCEP	-	+
Gruppe 4: A375v/pCEP	+	+

Von den A375v/pCEP-Kontrollzellen abgeleitete Tumore erreichten ohne Behandlung (Gruppe 1) innerhalb von 28 Tagen eine Größe von ca. 1000 mm³ (6). Durch eine separate Behandlung mit dem VEGF-Rezeptorinhibitor (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat (Verbindung I, Behandlungsgruppe 2) wurde das Wachstum der Tumore auf ein Volumen von ca. 550 mm³ verringert. Tumore, die mit dem auf das Endothel zielenden gerinnungsinduzierenden L19-scFv-tTF (Verbindung II, Behandlungsgruppe 3) behandelt wurden, wuchsen innerhalb von 28 Tagen auf ein Volumen von ca. 450 mm³ heran. Eine Kombination der Hemmung der VEGF-Rezeptortyrosinkinase mittels (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat mit dem Targeting des VEGF-Rezeptorkomplexes (Verbindung I + Verbindung II, Behandlungsgruppe 4) resultierte in einer Hemmung des Tumorwachstums auf ein Volumen von ca. 200 mm³ innerhalb von 28 Tagen.
Die überlegene Wirkung einer Kombination des Targeting des Endothels mit L19-scFv-tTF und der Störung der Funktion des VEGF/VEGF-Rezeptorsystems durch separate Interventionsverfahren ist klar ersichtlich.
Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die überlegene Wirkung einer Kombination der Störung des VEGF/VEGF-Rezeptorsystems mittels eines spezifischen Tyrosinkinaseinhibitors und der Störung des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems mittels einer löslichen Rezeptordomäne auf die Hemmung des Tumorwachstums (die Behandlungsverfahren der Gruppen 1–4 sind in Tabelle 1 angeführt). Die Abkürzungen haben die folgende Bedeutung: mock, con. = Behandlungsgruppe 1 mock + VEGF-A = Behandlungsgruppe 2 sTIE2 – cl13 = Behandlungsgruppe 3 sTIE2 – cl13 + VEGF – A = Behandlungsgruppe 4
2 zeigt die überlegene Wirkung einer Kombination der VEGF-Neutralisation und der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems auf die Hemmung des Tumorwachstums, verglichen mit separaten Interventionsverfahren (die Behandlungsverfahren der Gruppen 1–4 sind in Tabelle 2 angeführt).
3 zeigt die überlegene Wirkung einer Kombination des gerinnungsinduzierenden tTF, der über das scFv-tTF-Konjugat auf den VEGF/VEGF-Rezeptor-I-Komplex gerichtet ist, und der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems auf die Hemmung des Tumorwachstums, verglichen mit separaten Interventionsverfahren (die Behandlungsverfahren der Gruppen 1–4 sind in Tabelle 3 angeführt).
4 zeigt die überlegene Wirkung einer Kombination des gerinnungsinduzierenden tTF, der über das scFv-tTF-Konjugat auf den VEGF/VEGF-Rezeptor-I-Komplex gerichtet ist, und der Störung der Funktion des VEGF/VEGF-Rezeptorsystems mittels des VEGF Rezeptortyrosinkinaseinhibitors (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat auf die Hemmung des Tumorwachstums, verglichen mit separaten Interventionsverfahren (die Behandlungsverfahren der Gruppen 1–4 sind in Tabelle 4 angeführt).
5 zeigt die überlegene Wirkung einer Kombination des Targeting des Endothels durch das gerinnungsinduzierende L19-scFv-tTF-Fusionsprotein und der Störung der Funktion des Angiopoietin/Tie2-Rezeptorsystems auf die Hemmung des Tumorwachstums, verglichen mit separaten Interventionsverfahren (die Behandlungsverfahren der Gruppen 1–4 sind in Tabelle 5 angeführt).
6 zeigt die überlegene Wirkung einer Kombination des Targeting des Endothels durch das gerinnungsinduzierende L19-scFv-tTF-Fusionsprotein und der Störung der Funktion des VEGF/VEGF-Rezeptorsystems mittels des VEGF Rezeptortyrosinkinaseinhibitors (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat auf die Hemmung des Tumorwachstums, verglichen mit separaten Interventionsverfahren (die Behandlungsverfahren der Gruppen 1–4 sind in Tabelle 6 angeführt). Sequenzprotokoll

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine Kombination von Verbindung I und Verbindung II, wobei Verbindung I und Verbindung II wenigstens eine der folgenden umfassen (i) eine Verbindung der allgemeinen Formel I
in welcher r für 0 bis 2 steht, n für 0 bis 2 steht; R₃ und R₄ a) jeweils unabhängig voneinander für Niederalkyl stehen, b) zusammen eine Brücke der Formel II bilden,
wobei die Bindung über die beiden terminalen C-Atome erfolgt und m für 0 bis 4 steht; oder c) zusammen eine Brücke der Teilformel III bilden
wobei eines oder zwei der Ringglieder T₁, T₂, T₃, T₄ für Stickstoff steht/stehen und die anderen für CH stehen und die Bindung über die Atome T₁ und T₄ erfolgt; G für C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkylen oder C₂-C₆-Alkenylen; oder durch Acyloxy oder Hydroxy substituiertes C₂-C₆-Alkylen oder C₃-C₆-Alkenylen; -CH₂-O-, -CH₂-S-, -CH₂-NH-, -CH₂-O-CH₂-, -CH₂-S-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂, Oxa (-O-), Thia (-S-) oder Imino (-NH-) steht, A, B, D, E und T unabhängig voneinander für N oder CH stehen, mit der Maßgabe, daß nicht mehr als drei dieser Substituenten für N stehen, Q für Niederalkyl, Niederalkyloxy oder Halogen steht, R₁ und R₂ unabhängig voneinander für H oder Niederalkyl stehen, X für Imino, Oxa oder Thia steht; Y für Wasserstoff, unsubstituiertes oder substituiertes Aryl, Heteroaryl oder unsubstituiertes oder substituiertes Cycloalkyl steht; und Z für Amino, mono- oder disubstituiertes Amino, Halogen, Alkyl, substituiertes Alkyl, Hydroxy, verethertes oder ver estertes Hydroxy, Nitro, Cyano, Carboxy, verestertes Carboxy, Alkanoyl, Carbamoyl, N-mono- oder N,N-disubstituiertes Carbamoyl, Amidino, Guanidino, Mercapto, Sulfo, Phenylthio, Phenyl-niederalkylthio, Alkyl-Phenyl-thio, Phenylsulfinyl, Phenyl-niederalkyl-sulfinyl, Alkylphenylsulfinyl, Phenylsulfonyl, Phenyl-niederalkan-sulfonyl oder Alkylphenylsulfonyl steht, wobei, wenn mehr als ein Rest Z vorhanden ist (m ≥ 2), die Substituenten Z gleich oder verschieden voneinander sind, und wobei die mit einem Pfeil gekennzeichneten Bindungen Einfachbindungen oder Doppelbindungen sind; oder ein N-Oxid der Verbindung, wobei ein oder mehrere N-Atome ein Sauerstoffatom tragen, oder ein Salz davon; und/oder (ii) eine Verbindung der allgemeinen Formel IV
in welcher A für eine Gruppe =NR² steht, W für Sauerstoff, Schwefel, zwei Wasserstoffatome oder die Gruppe =NR⁸ steht, Z für die Gruppe =NR¹⁰ oder =N-, -N(R¹⁰)-(CH₂)_q-, geradkettiges oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl steht oder für die Gruppe
steht oder A, Z und R¹ zusammen die Gruppe
bilden, m, n und o für 0 bis 3 stehen, q für 1 bis 6 steht, R_a, R_b, R_c, R_d, R_e, R_f unabhängig voneinander für Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl oder die Gruppe =NR¹⁰ stehen, und/oder R_a und/oder R_b zusammen mit R_c und/oder R_d oder R_c zusammen mit R_e und/oder R_f eine Bindung bilden, oder bis zu zwei Gruppen R_a–R_f eine Brücke mit jeweils bis zu 3 C-Atomen mit R¹ oder R² bilden, X für eine Gruppe =NR⁹ oder =N- steht, Y für eine Gruppe -(CH₂)_p steht, p für eine ganze Zahl 1 bis 4 steht, R¹ für unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiertes, C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Alkoxy, das gegebenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiert ist, oder für unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Heteroaryl steht, R² für Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl steht oder mit R_a–R_f zusammen mit Z oder R₁ eine Brücke mit bis zu 3 Ringatomen bildet, R³ für monocyclisches oder bicyclisches, unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy oder Hydroxy substituiertes Aryl oder Heteroaryl steht, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiertes C₁-C₆-Alkoxy, C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Carboxyalkyl steht, oder R⁵ und R⁶ zusammen die Gruppe
bilden, R⁸, R⁹ und R¹⁰ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl stehen, sowie ihre Isomere und Salze; und/oder (iii) eine Verbindung der allgemeinen Formel V
in welcher R¹ für eine Gruppe
steht in welcher R⁵ für Chlor, Brom oder die Gruppe -OCH₃ steht,
in welcher R⁷ für -CH₃ oder Chlor steht,
in welcher R⁶ für -CH₃, Fluor, Chlor oder -CF₃ steht, in welcher R⁴ für Fluor, Chlor, Brom, -CF₃, -N=C, -CH₃, -OCF₃ oder -CH₂OH steht, in welcher R⁶ für -CH₃ oder Chlor steht, R² für Pyridyl oder die Gruppe
steht und R³ für Wasserstoff oder Fluor steht, sowie ihre Isomere und Salze; und/oder (iv) SEQ ID Nr. 1–59, sTie2, mAB 4301-42-35, ein scFv-tTF-Konjugat und/oder ein L19-scFv-tTF-Konjugat, mit der Maßgabe, daß Verbindung I nicht mit Verbindung II identisch ist.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 1, enthaltend als Verbindung I und/oder II wenigstens eine der SEQ ID Nr. 1–59.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend als Verbindung I und/oder II SEQ ID Nr. 34a.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend als Verbindung I und/oder II wenigstens eine der folgenden: sTie2, mAB 4301-42-35, ein scFv-tTF-Konjugat und/oder ein L19-scFv-tTF-Konjugat.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, enthaltend als Verbindung I und/oder II wenigstens eine Verbindung der allgemeinen Formel I
in welcher r für 0 bis 2 steht, n für 0 bis 2 steht; R₃ und R₄ a) jeweils unabhängig voneinander für Niederalkyl stehen, b) zusammen eine Brücke der Formel II bilden,
wobei die Bindung über die beiden terminalen C-Atome erfolgt und m für 0 bis 4 steht; oder c) zusammen eine Brücke der Teilformel III bilden
wobei eines oder zwei der Ringglieder T₁, T₂, T₃, T₄ für Stickstoff steht/stehen und die anderen für CH stehen und die Bindung über die Atome T₁ und T₄ erfolgt; G für C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkylen oder C₂-C₆-Alkenylen; oder durch Acyloxy oder Hydroxy substituiertes C₂-C₆-Alkylen oder C₃-C₆-Alkenylen; -CH₂-O-, -CH₂-S-, -CH₂-NH-, -CH₂-O-CH₂-, -CH₂-S-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂, Oxa (-O-), Thia (-S-) oder Imino (-NH-) steht, A, B, D, E und T unabhängig voneinander für N oder CH stehen, mit der Maßgabe, daß nicht mehr als drei dieser Substituenten für N stehen, Q für Niederalkyl, Niederalkyloxy oder Halogen steht, R₁ und R₂ unabhängig voneinander für H oder Niederalkyl stehen, X für Imino, Oxa oder Thia steht; Y für Wasserstoff, unsubstituiertes oder substituiertes Aryl, Heteroaryl oder unsubstituiertes oder substituiertes Cycloalkyl steht; und Z für Amino, mono- oder disubstituiertes Amino, Halogen, Alkyl, substituiertes Alkyl, Hydroxy, verethertes oder ver estertes Hydroxy, Nitro, Cyano, Carboxy, verestertes Carboxy, Alkanoyl, Carbamoyl, N-mono- oder N,N-disubstituiertes Carbamoyl, Amidino, Guanidino, Mercapto, Sulfo, Phenylthio, Phenyl-niederalkylthio, Alkyl-Phenyl-thio, Phenylsulfinyl, Phenyl-niederalkyl-sulfinyl, Alkylphenylsulfinyl, Phenylsulfonyl, Phenyl-niederalkan-sulfonyl oder Alkylphenylsulfonyl steht, wobei, wenn mehr als ein Rest Z vorhanden ist (m ≥ 2), die Substituenten Z gleich oder verschieden voneinander sind, und wobei die mit einem Pfeil gekennzeichneten Bindungen Einfachbindungen oder Doppelbindungen sind; oder ein N-Oxid der Verbindung, wobei ein oder mehrere N-Atome ein Sauerstoffatom tragen, oder ein Salz davon; und/oder eine Verbindung der allgemeinen Formel IV
in welcher A für eine Gruppe =NR² steht, W für Sauerstoff, Schwefel, zwei Wasserstoffatome oder die Gruppe =NR⁸ steht, Z für die Gruppe =NR¹⁰ oder =N-, -N(R¹⁰)-(CH₂)_q-, geradkettiges oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl steht oder für die Gruppe
steht oder A, Z und R¹ zusammen die Gruppe
bilden, m, n und o für 0 bis 3 stehen, q für 1 bis 6 steht, R_a, R_b, R_c, R_d, R_e, R_f unabhängig voneinander für Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl oder die Gruppe =NR¹⁰ stehen, und/oder R_a und/oder R_b zusammen mit R_c und/oder R_d oder R_c zusammen mit R_e und/oder R_f eine Bindung bilden, oder bis zu zwei Gruppen R_a–R_f eine Brücke mit jeweils bis zu 3 C-Atomen mit R¹ oder R² bilden, X für eine Gruppe =NR⁹ oder =N- steht, Y für eine Gruppe -(CH₂)_p steht, p für eine ganze Zahl 1 bis 4 steht, R¹ für unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiertes, C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Alkoxy, das gegebenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiert ist, oder für unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Heteroaryl steht, R² für Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl steht oder mit R_a–R_f zusammen mit Z oder R₁ eine Brücke mit bis zu 3 Ringatomen bildet, R³ für monocyclisches oder bicyclisches, unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy oder Hydroxy substituiertes Aryl oder Heteroaryl steht, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder unsubstituiertes oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogene substituiertes C₁-C₆-Alkoxy, C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Carboxyalkyl steht, oder R⁵ und R⁶ zusammen die Gruppe
bilden, R⁸, R⁹ und R¹⁰ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl stehen, sowie ihre Isomere und Salze; und/oder eine Verbindung der allgemeinen Formel V
in welcher R¹ für eine Gruppe
steht wobei R⁵ für Chloro, Brom oder die Gruppe -OCH₃ steht,
wobei R⁷ für -CH₃ oder Chlor steht,
wobei R⁸ für -CH₃, Fluor, Chlor oder -CF₃ steht, wobei R⁴ für Fluor, Chlor, Brom, -CF₃, -N=C, -CH₃, -OCF₃ oder -CH₂OH steht, wobei R⁶ für -CH₃ oder Chlor steht, R² für Pyridyl oder die Gruppe
steht und R³ für Wasserstoff oder Fluor steht, sowie ihre Isomere und Salze.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, enthaltend als Verbindung I und/oder II (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend als Verbindung I (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat, SEQ ID Nr. 1–59, sTie2, mAB 4301-42-35, ein scFv-tTF-Konjugat und/oder ein L19-scFv-tTF-Konjugat und als Verbindung II (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat, SEQ ID Nr. 1–59, sTie2, mAB 4301-42-35, ein scFv-tTF-Konjugat und/oder ein L19-scFv-tTF-Konjugat, mit der Maßgabe, daß Verbindung I nicht mit Verbindung II identisch ist.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, enthaltend als Verbindung I (4-Chlorphenyl)[4-(4-pyridylmethyl)phthalazin-1-yl]ammoniumhydrogensuccinat und als Verbindung II SEQ ID Nr. 1–59, sTie2, mAB 4301-42-35, ein scFv-tTF-Konjugat und/oder ein L19-scFv-tTF-Konjugat.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, enthaltend als Verbindung I mAB 4301-42-35 und als Verbindung II sTie2 und/oder ein scFv-tTF-Konjugat.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, enthaltend als Verbindung I ein scFv-tTF-Konjugat und als Verbindung II sTie2 und/oder mAB 4301-42-35.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, enthaltend als Verbindung I ein L19-scFv-tTF-Konjugat und als Verbindung II sTie2.
Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren, Krebs, Psoriasis, Arthritis wie z. B. rheumatoider Arthritis, Hämangiomen, Angiofibromen, Augenkrankheiten wie z. B. diabetischer Retinopathie, neovaskulärem Glaukom, Nierenkrankheiten wie z. B. Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie, maligner Nephrosklerose, thrombotische Mikroangiopathie, Transplantatabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotischen Krankheiten wie z. B. Leberzirrhose, proliferativen Krankheiten von Mesangialzellen, Arteriosklerose, Schädigungen von Nervengewebe, Unterdrückung der Entstehung von Aszites in Patienten und Unterdrückung von VEGF-Ödemen.