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Hintergrund
der Erfindung
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a) Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung und die Verwendung
einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur oralen
Verabreichung von physiologisch aktiven Produkten und die intestinale
Abgabe dieser. Die physiologisch aktiven Produkte, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verabreicht werden, erlauben eine bessere systemische
Abgabe, immunologische Zuführung,
und es wurden verbesserte Nahrungs-, Ernährungs- und Therapieeigenschaften
gezeigt.
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b) Beschreibung des Standes
der Technik
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Der
konventionelle Weg einer Therapie mit Hilfe von Proteinen oder Peptidarzneimitteln
ist über
die parenterale Verabreichung (d. h. mittels Injektion). Dies geschieht
hauptsächlich
aufgrund des Mangels an Absorption derartiger Wirkstoffe in dem
Verdauungstrakt. Jedoch sind Injektionen schmerzhaft und manchmal
im Vergleich zu anderen Dosierungsarten schwierig zu verabreichen.
Die Folgsamkeit der Patienten ist ein wichtiger Gesichtspunkt gerade
deshalb, weil einige dieser Arzneimittel häufig von Jugendlichen oder
betagten Patienten eingenommen werden. Die orale Verabreichung ist
hinsichtlich der Akzeptanz der Patienten bevorzugt gegenüber den
Injektionen, gerade deshalb, weil sie weniger schmerzhaft und bequemer
für den
Patienten ist. Jedoch weist die Verabreichung von therapeutischen
Polypeptiden durch den Mangen-Darm-Trakt (GI) eine Anzahl von Problemen
wie beispielsweise den geringen pH-Wert im Magen, proteolytischen
Abbau des Arzneimittels im Dünndarm,
eine geringe Absorption durch die Dünndarm-Membran und eine begrenzte
Stabilität derartiger
Formulierungen, insbesondere als wässrige Lösung, die alle potentielle
Barrieren gegenüber
der Absorption der Polypeptide nach der oralen Administration darstellen,
auf.
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Jüngste Bemühungen,
um Polypeptide oral zu verabreichen, haben sich auf die Verwendung
von Absorptionsverbesserern konzentriert. Dies hat zu der Entdeckung
geführt,
dass eine Suspension von Natriumsalicylat in einem Überschuss
von Öl
die Absorption des menschlichen Wachstumshormones aus dem GI-Trakt
verbessern kann.
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Während die
Absorption durch diese Kombination verbessert ist, beträgt die Bioverfügbarkeit
lediglich bis zu etwa 10 bis 20 % des Proteins (bezogen auf die
intravenöse
Verabreichung), was immer noch recht gering ist. Im Ergebnis müssen größere Mengen
an Proteinen oral verabreicht werden, um das benötigte therapeutische Level
des Proteins im Plasma zur Verfügung
zu stellen. Dies ist ein besonderes Problem mit Proteinen und Polypeptiden,
welche, sogar mit der Einführung
der Biotechnologie, noch immer vergleichsweise limitiert zu erhalten
sind und ebenso komplexe chemische Einheiten darstellen, und im
Ergebnis sehr teuer sind. Zusätzlich
sind die flüssigen
oder halbfesten Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik schwierig
zusammenzustellen oder in einer Dosis für die orale Verabreichung zu
formulieren.
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Weitere
Aspekte können
ebenfalls betrachtet werden. Beim Säugetier muss der Proteinabbau
im Magen von geringerer Bedeutung sein, da es keine signifikante
Absorptionshemmung des Proteins in Individuen mit dem kompletter
gastrischer Atrophie von schädlichen
Anämien
gibt. Die Rolle des Magens als Reservoir ist von beträchtlicher
Bedeutung, da dieser eine anhaltende Einheit von Proteinen in dem
Zwölffinger-Darm nach
einem Mahl gewährleistet
und dadurch die intensive Vermischung mit Bauchspeicheldrüsensekret
zustande kommt. Die Kombination eines geringen pH-Wertes und Peptidaktivität führt wahrscheinlich
zur Denaturierung der meisten Nahrungsproteine, wodurch Bindungen,
die anfällig
gegenüber
weiterer Hydrolyse im Dünndarm
sind, der weiteren Hydrolyse ausgesetzt werden.
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Die
Epithelien, welche den Magen-Darm-Trakt auskleiden, wirken ebenso
deutlich als Barriere zwischen der äußeren Umgebung und dem internen
Milieu des Körpers.
Diese enthalten selektive physiologische Mechanismen, um zum Teil
den Eintritt und Austritt von Molekülen aus dem Körper zu
kontrollieren, fungieren in einer Weise als Ventil mit biomechanischen
Eigenschaften bemerkenswert ähnlich
sind zu denen der Niere, einem weiteren Organ mit "Auslassventil"-Eigenschaften, wobei
der Begriff "Ventil" die aktiven metabolischen Prozesse,
die diese Funktion ausüben,
schmälert.
Das Darm-Epithel fungiert zu einem wichtigen Grad als physiologische
Barriere, eine bemerkenswerte Aufgabe für eine Einzelschicht von potentiell
zerbrechlichen Zellen, welche mit physiologisch und chemisch schädlichem
aufgenommenem Material bombardiert wird. Jedoch muss festgestellt
werden, dass diese keine "absolute" Barriere darstellt,
wie es häufig
angenommen wurde. Daher müssen ältere Konzepte,
dass intakte Proteine im gesamten Organismus nicht einfach in den
Blutkreislauf gelangen können,
dass der Eintritt über
den Magen-Darm-Trakt ausnahmslos hochselektiv ist und dass partikuläres Material ausnahmslos
ausgeschlossen ist, zugunsten einer wesentlich umsichtigeren und
komplexeren Anschauung der Barrierefunktion verworfen werden. Genauso
wie ihre unvollständige
physikalische Barrierefunktion fungieren die Epithelien des Magen-Darm-Traktes als immunologische
Barriere und enzymatische Barrieren und diese recht komplexen Mechanismen
sind ebenso zentral und untrennbar von Abwägungen hinsichtlich der Absorption
von Proteinen und Peptiden in deren intakter Form.
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Die
enzymatischen Barrieren von Peptiden und Proteinen über verschiedenartige
Wege wurden im Falle der oralen und enteralen Verabreichung studiert.
Der enzymatische Abbau vor (oder während) der Absorption stellt
zweifelsfrei das kritische Hindernis der Absorption von Peptid-Arzneimitteln
im Dünndarm
und eine Hauptbarriere der Absorption von Peptiden und Proteinen
durch den Magen-Darm-Trakt dar.
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Daher
ist für
die pharmazeutische Verabreichung von Peptiden über enterale Wege die Inhibierung von
Proteasen oder Peptidasen oder die Erfindung von Formulierungen,
welche Schutz gegenüber
derartigem Abbau vitaler Targets liefern, möglicherweise bedeutender als
absorptionsverbessernde Strategien. Obwohl die Teleologie vermieden
werden sollte, könnte
die Multiplizität
der Barrieremechanismen in dem Magen-Darm-Trakt eine evolutionäre Widerspiegelung von schwerwiegenden
Konsequenzen des unkontrollierten Zutritts von exogenem biologisch
aktivem Material widerspiegeln. Daher stellen diese Mechanismen
unweigerlich die beträchtliche
Schwierigkeit der Erfindung von wirksamen Verabreichungsmodi für Peptid-
und Proteinarzneimittel dar. Das Konzept einer verdauenden Oberfläche mit
einer Schutzfunktion deutet darauf hin, dass an der Grenzfläche gebundene
Proteasen und Peptidasen eine Rolle als "hydrolytische" Barriere haben und die "physiologische Barriere" und die "immunologische Barriere", jede mit Schutzfunktion,
zu ergänzen,
wobei die cytoplasmatischen Peptidasen (lediglich) eine verdauende
Funktion haben. Dieses Modell gewinnt sogar noch mehr an Bedeutung,
wenn in großem
Maßstab
die Passage durch paracelluläre
Wege (angetrieben durch den Lösungsmittelwiderstand)
nachgewiesen wird, so dass die luminale und Oberflächenhydrolyse
(vor der paracellulären
Passage) hinsichtlich der Minimierung des Eintritts biologisch aktiver
Peptide von der partiellen Verdauung von diätetischen Proteinen in dem
Körper,
kritisch sein würde.
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Prinzipiell
können
potentielle Wege durch die Epithelien hindurch eingeteilt werden
in (a) transzelluläre (einschließlich carrier-vermittelter
Mechanismen und endocytotischer Mechanismen; ebenso auf Diffussion
beruhendem Wege entweder durch Wasserkanäle oder Lipid-reiche Teile
der Membran) und (b) paracellulär
(einschließlich
der Passage durch "tight" junctions und extrusiver
Zonen hindurch, welche beide während
der natürlichen
Zellumwandlung und infolge von physiologischen und chemischen Verletzungen
auftretend gebildet werden).
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Es
ist eine allgemeine Meinung, dass die Absorption von intakten Peptiden
oder Proteinen aus der Nahrung von geringfügiger direkter ernährungsphysiologischer
Signifikanz aufgrund der kleinen Mengen, welche absorbiert werden
im Vergleich zu den Mengen von freien Aminosäuren, welche in den Blutkreislauf
eintreten, ist. Jedoch gibt es zwei Gründe, weshalb die Absorption
dieser Moleküle
in ihrer intakten Form nützlich ist
oder sein könnte.
Der erste ist die Aufnahme von Antigenen über den M-Zellweg. Dieser ist
ein grundlegender Teil des natürlichen
Prozesses der Akquisition der mucosalen Immunität. Der zweite kann potentiell
für therapeutische
Zwecke ausgenutzt werden. Abgesehen von der relativen Einfachheit,
Sicherheit (das heißt,
sterile Instrumente sind nicht notwendig), nicht-invasiven Natur
und der Akzeptanz des oralen Weges verglichen mit dem parenteralen
oder rektalen Wegen der Patienten, kann der enterale Weg günstiger
großen
Zugang zu der Leber liefern (relevant im Falle der Insulin-Verabreichung).
Andererseits kann der Zugang von einigen intakten Pepitiden und
Proteinen in den Blutkreislauf nachteilig sein, obwohl der tatsächliche
Nachweis hierfür zum
jetzigen Zeitpunkt nicht vollständig
erbracht ist und viele Behauptungen pathologischer Konsequenzen von
Nahrungsproteinen oder Peptiden auch nicht mehr als auf Anekdoten
oder subjektiven Beweisen basieren. Trotz dieser Vorbehalte ist
die Magen-Darm-Nahrungsmittelallergie mittlerweile ein akzeptiertes
Phänomen
und die Absorption intakter Proteine, um Zugang zu den sub-epithelialen
Mastzellen zu erhalten, ist Teil dieses Mechanismus'.
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Wirkungsvolle
biologische Effekte von absorbierten intakten Proteinen sind natürlich nicht
auf immunologische Effekte beschränkt.
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Agenzien,
welche die intestinale Absorption verbessern, sind von besonderer
Bedeutung auf dem Gebiet der oralen Verabreichung von biologisch
aktiven Peptiden und Proteinen für
verschiedenartige Anwendungen. Ein gültiger Einwand gegenüber der
Verwendung derartiger Enhancer beruht auf der Tatsache, dass diese
im Wesentlichen Membran- oder Junction-schädigende Agenzien sind. Enhancer,
insbesondere mit chronischer Verwendung, haben wahrscheinlich toxische
Effekte und fördern
den Zutritt von ungewünschten
Molekülen.
Dass die Verabreichung von Tryptophan, welches toxische Effekte
durch einen drastischen Anstieg an paracellulärer Permeabilität hervorrufen
kann, ist ein verblüffendes
Resultat. Es ist möglich,
dass einige Individuen besonders empfindlich gegenüber Tryptophan
sind.
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Die
Anwendung des Liposomeneinschlusses, um die Peptide und Proteine
vom Abbau zu fördern,
ist untersucht worden, und spätere
Resultate wurden als enttäuschend
angesehen. Ein weiterer Ansatz, um den Lipid-löslichen Weg zu verwenden, beispielsweise
mittels transcellulare Diffusion, ist es, das Peptid oder Protein
in einer Mikroemulsion zu formulieren. Eine große Anstrengung ist unternommen
worden, um Wege zu finden, Insulin oral verabreichbar zu machen.
Beinahe jede Anstrengung war erfolgreich, allerdings mit einem sehr
begrenzten Ausmaß.
Eine Wasser-in-Öl-Mikroemulsion
enthaltend Cholesterin, Lecithin und eine Fettsäure in kritischen Anteilen,
welche die Zusammensetzung von Chylomikronen simulieren, wurde entwickelt. Unglücklicherweise
wurde die Glaubwürdigkeit
dieser Entdeckungen in Frage gestellt, als sich nachträglich herausstellte,
dass eine Charge der Formulierung mit Glibenclamid verunreinigt
war.
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Aus
der Literatur geht eindeutig hervor, dass die anale Verabreichung
von Proteinen in einer größeren Absorption
und Gewebeanreicherung resultiert als sie es bei der oralen Verabreichung
der gleichen Dosis tut. Dies wirft die Frage auf, wie auch die Aufnahme über den
oralen Weg verbessert werden kann. Das Potential könnte darin
liegen, zumindest die oralen Aufnahmewerte auf die, welche rektal
erreicht werden, zu erhöhen. Verschiedene
Methoden zum Schutz von pharmakologisch aktiven Peptiden und Proteinen
vor der Wirkung des Darmes wurden in Erwägung gezogen einschließlich enterischer
und ähnlicher
schützender
Beschichtung, Co-Verabreichung mit Antisäuren und Enzym-Inhibitoren und die
Verabreichung im Inneren von bakteriellen Zellen und lebenden Nahrungsmitteln
(Bioverkapselung).
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Beispielsweise
stieg die Aufnahme von HRP (Meerretich-Peroxidase) an, wenn diese
der Regenbogenforelle mit dem Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor gemeinsam
gegeben wird. In der gleichen Studie stellt sich heraus, dass die
gemeinsame Verabreichung des künstlichen
Detergenz Mega-9 zu einer beinahe doppelt so hohen Anwesenheit der
HRP verglichen mit den Kontrollen führte. Die gesteigerten Proteinkonzentrationen wurden
aufgrund der Gelatinisierung der Darmverkleidung und einem konsequenten
Anstieg der Protein-Enterocyten-Interaktionen
erreicht. Ebenso kann es sein, dass die Integrität der GI-Epithelien unterbrochen wurde, was die
transcellulare Aufnahme erlaubt. Mega-9, oral intubiert mit dem
rekombinanten Wachstumshormon (rbGH) und einer Anti-Säure, steigert das
Wachstumsverhalten des Coho-Lachses über eine 7-wöchige Versuchsperiode
im Vergleich zu Fischen, dem das Wachstumshormon (GH) alleine verabreicht
wurde.
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Detergenzien
(L-lyso-phosphatidylcholin) wurden ebenfalls gemeinsam mit einem
Gonadotropin-Freisetzungshormon-Agonisten (GnRHA) während induzierter
Ovulationsstudien am Kohlenfisch A. fimbria, als Maßstab zur
jeweiligen Maximierung der GI-Absorption und Steigerung des Magen-pHs
verabreicht. Die orale Intubierung eines Goldfisches mit Lachs-Hypophysen-Extrakt
und 0,2 % Polyacrylsäure
bewirkte das Gegenteil.
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Das
Antibiotikum Monensin wurde als Enhancer-Agens untersucht. Der rationale
Hintergrund der Auswahl dieser Verbindung lag in dessen Eignung,
den Transfer von Pinocytose-Proteinen zwischen Vesikeln und dem
lysosomalen Compartment zu vermindern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass
Monensin den pH-Wert von sauren Compartimenten innerhalb einer Vielzahl
von Zellen anhebt. Es wurde jedoch kein Effekt hinsichtlich der
HRP-Absorption beobachtet. Die Verwendung von biologisch abbaubaren
Mikropartikeln zur Verkapselung und dadurch zum Schutz der Proteine
vor Abbauprozessen wurde unter Verwendung komplexer Proteinmakromoleküle untersucht.
In diesen Studien, die mit HGG an dem atlantischen Lachs Salmo salar
angestellt wurden, war die Anwesenheit des Proteins im Plasma infolge
der oralen Intubation stark verlängert
(bis zu 8 Wochen), wodurch vorgeschlagen werden kann, dass das eingeschlossene
HGG Zugang über
paracelluläre,
ebenso wie auch transcelluläre
Wege erhalten hat, was zu der anhaltenden Anwesenheit im Plasma führt. GH
wurde ebenfalls in der geschützten
Form verabreicht, wobei das Molekül in eine Polymermatrix eingebracht
wurde, welche unter sauren Bedingungen intakt blieb, jedoch unter
den alkalischen Bedingungen des Darmes abgebaut wurde. Mit der Nahrung
verabreicht steigerte das eingeschlossene GH das Wachstum der Regenbogenforelle über das
bei der Kontrolle beobachtete. Ein alternatives Verfahren zum Schutz
von oral verabreichten Pharmazeutika, die bei der Beimpfung von
Fischen verwendet wurden, ist deren Verabreichung mit einem anderen
Organismus. Im Hinblick auf die bioaktiven Proteine wurde diese
Strategie nur bei einer Gelegenheit unter Verwendung rekombinanter
Hefen für
Regenbogenforellen GH geprüft.
In einer eleganten Studie führte
die Fütterung
von gestreiften Meerbarben mit Nahrungsmitteln, denen für GH-rekombinante
Hefen zugegeben waren, zu einer signifikanten Wachstumsrate der
behandelten Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Dieses Verfahren
ist jedoch auf diese Organismen begrenzt, wie beispielsweise auf
Hefen, welche in der Lage sind, rekombinante Produkte in deren unmodifizierter
Form zu lagern. Die jüngste Vergangenheit
hat ebenfalls Zeugnis darüber
abgelegt, dass die Entwicklung einer Anzahl von genetisch veränderten
Pflanzen, die Gene von pharmazeutischem Interesse exprimieren, entwickelt
wurden. Studien haben eine aufrecht erhaltende Bioaktivität von auf
Pflanzen basierenden rekombinanten Produkten gezeigt, wenn diese
oral verabreicht werden. Ähnliche
Verfahren für
die Verabreichung von auf Aqua-Kultur bezogenen produktionsorientierten
Proteinen würden
aufgrund ihrer Herstellungsökonomie
sehr attraktiv sein.
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Entwicklungen
in dem Bereich der Biotechnologie haben Hilfsmittel zur Produktion
von beinahe unbeschränkten
Mengen von bioaktiven Peptiden und Proteinen in wirtschaftlich brauchbaren
Mengen zur Verfügung
gestellt. Daher ist es absehbar, dass die natürliche Permeabilität von Lebewesen,
einschließlich
denen des menschlichen Darms, als Hilfsmittel für die Verabreichung von Peptiden
und Proteinwirkstoffen, um Einfluss auf physiologische Kontrollprozesse
zu erhalten, verwendet wird. Offensichtlich orientierte Anwendungsgebiete
der Erfindung umfassen die kontrollierte Reproduktion, Wachstumsbeschleunigung,
Verbesserung des Immunsystems, therapeutische und ernährungsphysiologische
Verbesserung.
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Der
orale Weg zur Impfung liefert signifikante Vorteile, indem er Laborkosten
senkt, zeitsparend ist, die Möglichkeiten
der Kreuz-Kontamination mit Nadeln senkt und keine aufwendige Handhabung
beansprucht, oder die Entsorgung von Behandlungsflüssigkeiten
benötigt.
In Anbetracht der vorliegenden Zusammenfassung kann jedoch die orale
Impfung nur auf Basis antigener Verbindungen in Betracht gezogen
werden. Versuche mit synthetischen Virus-Impfstoffen, basierend
auf Peptiden, in höheren
Wirbeltieren wurden als erfolgreich dargestellt, obwohl gegenteilige
Ergebnisse in großen
Feldversuchen auftraten. Für
Impfprogramme ist es vorstellbar, dass Impfstoffe mit rekombinanten
Untereinheiten, die aus Glycoprotein/Nukleoproteinen bestehen, in
die Nahrung eingebracht werden können.
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Eine
Strategie, die Infektionen in allen Individuen kontrollieren könnte, wäre jede
Art der Immunisierung, die den Transport und somit die Übertragung
von Mikroben verhindert oder im Wesentlichen verhindert. Im Falle
der Immunisierung von jungen Kindern mit Haemophilus influenzae,
beispielsweise mit Polysaccharid-Konjugaten der Gruppe b wurde festgestellt,
dass die Übertragung
von etwa 4% auf weniger als 1 % vermindert wurde, eine mögliche Erklärung für die gleichzeitige
Immunität
der Herde. Falls ein Impfstoff die Kolonisation von Mikroben verhindern
könnte,
wäre zu
erwarten, dass ein derartiger Impfstoff beinahe alle Infektionen
der gleichen Art von Mikroben in den immunisierten Patienten oder
Tieren verhindern könnte.
Da auch nicht immunisierte Patienten Mikroben von anderen akquirieren
müssen,
sollte ein Impfstoff, der die Übertragung
reduziert, die Infektionen in immunisierten ebenso wie auch nicht
immunisierten Patienten vermindern. In der Tat könnte ein aggressives Immunisierungsprogramm,
gepaart mit antibiotischer Behandlung von nachgewiesenen Überträgern, in
der Lage sein, das Reservoir dieser Organismen zu eliminieren.
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Der
bestimmende Faktor der spezifischen Immunität auf der Oberfläche der
Magenschleimhaut ist das sekretorische IgA (S-IgA), welches physiologisch
und funktionell von den Bestandteilen des Immunsystems des Kreislaufssystems
getrennt ist. Die mukosale S-IgA-Antwort wird vorwiegend von dem
allgemeinen mukosalen Immunsystem (CMIS) eingeleitet, in dem Immunogene
von spezialisierten lymphepithelialen Strukturen, allgemein als
Mukose-assoziiertes Lymphgewebe (MALT) bezeichnet, aufgenommen werden.
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Daher
kann die Immunisierung in dem Darm die mukosale Immunität in den
oberen Atemwegen und umgekehrt auslösen. Die am besten bekannten
MALT-Strukturen sind die intestinalen Peyer'schen Platten. Weiterhin ist es wichtig
anzumerken, dass die orale Immunisierung eine Antigen-spezifische
IgG-Antwort in der Körperregion
zusätzlich
zu den mukosalen IgA-Antikörpern
auslöst.
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Die
meisten löslichen,
nicht-replizierenden Antigene sind schlechte mukosale Immunogene,
besonders über
den peroralen Weg, wahrscheinlich weil die Verdauungsenzyme diese
abbauen und diese wenig oder keinen Tropismus für das Darmassoziierte Lymphgewebe
(GALT) haben. Eine beachtenswerte Ausnahme ist das Choleratoxin
(CT). CT ist ein wirkungsvolles mukosales Immunogen, wahrscheinlich
aufgrund der GM1 gangliosid-Bindungseigenschaft seiner Bindungs-Untereinheit,
CTB, welches es ihm ermöglicht,
von M-Zellen der Peyer'schen
Platten aufgenommen zu werden und zu den darunter liegenden immunokompetenten
Zellen zu gelangen. Um zusätzlich
ein gutes mukosales Immunogen zu sein, ist CT ein Förderer,
der die mukosale Immunogenität
von anderen löslichen
Antigenen, die mit ihm gemeinsam verabreicht werden, verstärkt. Ebenso
verbleibt es in gewisser Weise kontrovers, da reines oder rekombinantes
CTB höchst
wahrscheinlich diese Eigenschaften nicht aufweist, wenn es über den
Magen (i.g.) als ein Verstärker
verabreicht wird. Sehr kleine Mengen (< 1 mg) von intaktem CT können jedoch
synergistisch mit CTB als oraler Verstärker wirken. Diese Ergebnisse
können
die offensichtlich verstärkende
Aktivität
von vielen kommerziellen Präparationen
von CTB, die gewöhnlich
kleine Mengen von CT enthalten, erklären.
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Während die
Entdeckung von Peptidverbindungen, die einen Nährwert und therapeutischen
Wert haben, in den letzten Jahren stark anstieg, so weist die Entwicklung
von brauchbaren physiologisch aktiven Versorgungssystemen für viele
dieser Komponenten die oft nachgewiesene Problematik auf. Der Magen-Darm-Trakt
sekretiert eine Vielzahl von Stoffen, die Polypeptide metabolisieren.
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Beispielhaft
für solche
katabolischen Stoffe sind Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypolypeptidasen,
Aminopolypeptidasen und Dipeptidasen. Polypeptide, die dem Katabolismus
in dem Magen und Dünndarm
entkommen, werden durch die Zellen, die den Magen-Darm-Trakt auskleiden,
zum Eingang des Kreislaufsystems transportiert, welches absorbierte
Polypeptide zu der Leber transportiert. Die absorbierten Polypeptide
werden einem weiteren Abbau durch eine Vielzahl von metabolischen
Prozessen in der Leber unterworfen. Ein derartiger Abbau von absorbierten
Stoffen aus dem Blut in der Leber, bevor derartige Materialien in
den allgemeinen systemischen Blutkreislauf gelangen, ist in der
Pharmazie als "der
erste Überführungseffekt" bekannt.
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Aus
diesem Grunde müssen
die meisten, wenn gar nicht alle dieser Komponenten parenteral,
wie beispielsweise subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal injiziert
werden. Da die meisten Patienten sich parenterale Arzneimittelformulierungen
nicht selbst verabreichen können,
ist es häufig
notwendig, dass Arzneimittel dieses Typs ambulant verabreicht werden,
was zu zusätzlichen
Kosten, die mit deren Verwendung verbunden sind, führt.
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Darauf
aufbauend auf der Annahme, dass die orale Verabreichung bioaktiver
Peptide und Proteine gegenüber
einigen tierischen Spezies wie beispielsweise gegenüber gezüchteten
und aquakulturierten Spezies den Nutzen mit sich bringt, könnte es
als vorteilhaft angesehen werden, die Aufnahme von pharmazeutischen Formulierungen
zu verbessern.
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Aus
diesem Grunde besteht dringender Bedarf für ein neues, effizientes, kosteneffektives
und nicht invasives Verfahren zur Verabreichung an Patienten und
Tieren einer Zusammensetzung, die Nahrungsmittel und therapeutisch
wirksame Zusammensetzungen, insbesondere Peptide enthält, die
andererseits ungeeignet für
die orale Verabreichung sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung
zur oralen Verabreichung an einem Mensch oder einem Tier, einschließlich Säugetieren,
Vögeln,
Insekten und Fischen zur intestinalen Abgabe eines physiologisch
aktiven Agens zur Verfügung
zu stellen, wobei diese Zusammensetzung ein neutralisierendes Agens,
das zur Anhebung des im Magen herrschenden pH-Wertes auf Werte zwischen
6,5 bis 9 in dem Verdauungssystem des Tieres geeignet ist, um die
chemische Denaturierung des besagten physiologisch aktiven Agens
zu verhindern, einen Inhibitor von Verdauungsenzymen zur Verhinderung
der enzymatischen Verdauung des besagten physiologisch aktiven Agens,
und eines die Aufnahme verstärkenden
Agens, das die intestinale Absorption eines physiologisch aktiven
Agens erhöht,
ist. Die Erfindung basiert ebenso auf der Entdeckung, dass die Kombination
dieser drei Agentien zusätzliche
und synergistische intestinale Abgabe und Aufnahme liefert, wenn
sie gleichzeitig verwendet werden.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung
der Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung
von intestinalen mikrobiellen Infektionen in einem Tier, welches
die Verabreichung einer ausreichenden Menge einer Zusammensetzung
gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst, wobei das physiologisch aktive Agens ein antimikrobielles
Agens ist.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Zusammensetzung zur oralen Verabreichung an
einem Tier zur intestinalen Abgabe eines physiologisch aktiven Agens
zur Verfügung
gestellt, wobei die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zumindest
ein neutralisierendes Agens in einer Konzentration zwischen etwa
1 bis 60 Gew.-%, einen enzymatischen Inhibitor in einer Konzentration
von etwa 1 bis 50 Gew.-% und das die Aufnahme fördernde Agens in einer Konzentration
zwischen etwa 0,1 bis 50 Gew.-% vorhanden ist, enthält.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
umfasst weiter ein physiologisch aktives Agens ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus therapeutischen Agenzien, Ernährungsprodukten,
Mucopolysacchariden, Lipiden, Kohlenhydraten, Steroiden, Hormonen,
Wachstumshormon (GH), Wachstumshormon abgebendes Hormon (growth
hormone releasing hormone, GHRH), epithelialem Wachstumsfaktor,
vaskulärem
endothelialem Wachstums- und Permeabilitätsfaktor (vascular endothelial
growth and permeability factor (VEGPF), Nervenwachstumsfaktor (nerve
growth factor), Cytokinen, Interleukinen, Interferonen, GMCSF, hormonähnlichem
Produkt, neurologischem Faktor, neurotropem Faktor, Neurotransmitter,
Neuromodulator, Enzym, Antikörper,
Peptid, proteinartiges Fragment, Vaccin, Zusatzstoff, ein Antigen,
immunstimulierender oder -inhibierender Faktor, hämatopoetischer
Faktor, Antikrebsprodukt, antiinflammatorisches Agens, antiparasitäre Verbindung,
antimikrobielles Agens, Nukleinsäurefragment,
Plasmid-DNA-Vektor, Zellprolieferationsinhibitor oder -aktivator,
Zelldifferenzierungsfaktor, Blutgerinnungsfaktor, Immunglobulin,
antiangiogenetisches Produkt, negative selektive Marker oder "Suizid"-Agens, toxische
Verbindung, Antiangiogenese-Agens, Polypeptid, Antikrebs-Agens,
Säureproduktions-Medikamente
und Histamin H2-Rezeptor Antagonist.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
umfasst ein neutralisierendes Agens, das in einer Menge vorhanden
ist, die ausreichend ist zur Neutralisierung des Abbaus durch Säure in dem
Verdauungssystem des Wirts-Tieres, um die Abgabe eines physiologisch
aktiven Agens zu dem Tierdarm zu gestatten, wobei das neutralisierende
Agens aus der Gruppe bestehend aus Antisäuren, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat,
Natriumcitrat, Natriumhydrogencarbonat, Calciumphosphat, Calciumcarbonat,
Magnesiumsalzen, Magnesiumcarbonat, Magnesiumtrisilikat, Magnesiumhydroxid,
Magnesiumphosphat, Magnesiumoxid, Bismuthsubcarbonat und Kombinationen
davon ausgewählt
sein kann.
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Die
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ein neutralisierendes
Agens umfassen, welches ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumcarbonat in einer Konzentration
von 10 bis 20 Gew.-% und Calciumcarbonat in einer Konzentration
von 10 bis 20 Gew.-% bezogen auf die Zusammensetzung.
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Erfindungsgemäß wird eine
Zusammensetzung zur Verfügung
gestellt, die zumindest einen Enzyminhibitor in einer Menge umfasst,
die ausreichend ist, um den Abbau des physiologisch aktiven Agens
durch Verdauungsenzyme in dem Verdauungssystem eines Menschen oder
Tieres im Wesentlichen zu verhindern und um die Abgabe des besagten
physiologisch aktiven Agens zu dem Darm des Menschen oder Tieres
zu gestatten.
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Der
Inhibitor der Verdauungsenzyme kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend
aus Antiproteasen, Eialbumin, Inhibitoren auf Pflanzenbasis aus Ölsaaten,
Sojabohnen, Kidneybohnen, Saubohnen, Reiskleie, Weizenkleie, Ethylendiamintetraacetat,
alpha-1-Antitrypsin,
Albumin, Ovalbumin und Proteosomen.
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Die
Zusammensetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung kann Pepsininhibitoren, Enteropeptidase-Inhibitoren und/oder
Albumin in einer Konzentration zwischen 10 bis 20 Gew.-% enthalten.
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Die
Zusammensetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung kann ein Aufnahmeverstärkendes
Agens enthalten, welches aus Gallensalz, Saponin, Deoxycholat, Natriumsalicylat,
Natriumlaurylsulfat, Ölsäure, Linolsäure, Monoolein,
Lecithin, Lysolecithin, Polyoxyethylen-Sorbitanester, p-t-Octylphenoxypolyoxyethylen, N-lauryl-fi-D-maltopyranosid,
1-Dodecylazacycloheptan-2-azon und Phosphorlipiden bestehen kann.
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Das
die Aufnahme-verstärkende
Agens kann das Natriumdeoxycholat in einer Konzentration zwischen 1
bis 5 % sein.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann weiterhin mindestens einen zusätzlichen Bestandteil ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Ethylendiamintetraacetat, Konservierungsmitteln,
Antioxidantien, Farbstoffen, Bindern, Tracern, einem oder mehreren
Süßungsmitteln,
oberflächenaktiven
Mitteln, Trennmitteln, Aromastoffen, Mehl, Bohnen, Hefe, Brauereihefe,
Mineralöl,
Pflanzenöl,
tierisches Öl,
Gleitmittel, Salbe und Kombinationen davon enthalten.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, dass das physiologisch
aktive Agens bei der Abgabe in dem Mensch- oder Tierdarm von dem
Darm zur systemischen Abgabe absorbiert wird oder einen effektiven
physiologischen Effekt auf die Darmwand ausübt.
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Ebenso
kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung
es einem physiologisch aktiven Agens, wenn dieses einem Menschen-
oder Tierdarm verabreicht wird erlauben, einen physiologischen Effekt
auf den Inhalt des Darmes auszuüben.
Die Applikation kann weiterhin verwendet werden, um den Nahrungstransport
durch den Darm oder die Behandlung von Infektionskrankheiten zu
stimulieren.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist das physiologisch aktive Agen geeignet, um eine mukosale oder
systemische Immunantwort in dem Wirts-Menschen oder -Tier gegen
Schleimhaut-Infektionskrankheiten auszulösen. Es wird die Verwendung
einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur Immunisierung
eines Trägers
gegenüber
mukosalen Mikroorganismen zur Verfügung gestellt, welches die
orale Verabreichung an dem jetzt in einer immunisierenden Menge
des mikrobiellen Oberflächenproteins
in Form von abgetöteten
ganzen Mikroorganismen, einem Lysat von Mikroorganismen oder eines
isolierten Antigens oder eines immunologischen Fragments davon umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Zusammensetzung zur
oralen Verabreichung an einen Wirt, bevorzugt zur Verabreichung
in den Darm (Magen, Verdauungstrakt) oder einen Wirt zur Verfügung, um diesen
zu schützen
oder um eine Immunantwort gegenüber
den mikrobiellen Infektionen auszulösen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines
Medikamentes zur Behandlung intestinaler mikrobieller Infektionen
an einem Tier zur Verfügung
gestellt, welche das Verabreichen der Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung, die ein antimikrobielles Agens in einer Menge, die ausreichend
für therapeutische
Effektivität
ist, umfasst.
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Die
mikrobiellen Infektionen können
durch Mikroorganismen ausgelöst
werden, die ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pilzen, Hefen, Viren,
Staphylokokken, Streptokokken, Mikrokokken, Peptokokken, Peptostreptokokken,
Enterokokken, Bazillen, Clostridium, Lactobazillus, Listeria, Erysipelothrix, Propionibakterium,
Eubakterium, Corynobakterium, Mycoplasmen, Ureaplasmen, Streptomyces,
Haemophilus, Nesseria, Eikenellus, Moraxellus, Actinobazillus, Pasteurella,
Bakteroide, Fusobakterien, Prevotella, Porphyromonas, Veillonella,
Treponema, Mitsuokella, Capnocytophaga, Campylobacter, Klebsiella,
Chlamydia und Koliformen.
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Das
antimikrobielle Agens, welches zur Behandlung der mikrobiellen Infektionen
verwendet wird, kann aus der Gruppe ausgewählt sein bestehend aus Antibiotika,
Bacteriocinen, Lantibiotika, Probiotika, Antipilzmittel, Antimykotika,
antiparasitären
Mitteln, Aminoglycosiden, Vancomycin, Rifampin, Lincomycin, Chloramphenicol
und des Fluorquinol, Penicillin, beta-Lactame, Amoxicillin, Ampicillin,
Azlocillin, Carbencillin, Mezlocillin, Nafcillin, Oxacillin, Piperazillin,
Ticarcillin, Ceftazidim, Ceftizoxim, Ceftriaxon, Cefuroxim, Cephalexin,
Cephalothin, Imipenen, Aztreonam, Gentamicin, Netilmicin, Tobramycin,
Tetracycline, Sulfonamide, Niacrolide, Erythromicin, Clarithromicin,
Azithromycin, Polymyxin B, Clindamycin Antibiotika sowie Kombinationen
dieser.
-
Die
Erfindung stellt ebenso die Verwendung einer Zusammensetzung zur
Herstellung eines Medikamentes zur syntemischen Verabreichung zur
Verfügung,
welche die orale Verabreichung eines therapeutischen Agens zur Behandlung
von gesundheitlichen Beeinträchtigungen
eines Tieres, die ferner einen geeigneten pharmazeutischen Träger umfassen
kann, zur Verfügung.
-
Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann bei der Herstellung von Medikamenten oder Nahrungsmitteln verwendet
werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Verbesserung der intestinalen Aufnahme
beim Menschen oder Tier zur Verfügung
gestellt, welches die orale Verabreichung einer physiologisch effektiven
Menge eines physiologisch aktiven Agens umfasst.
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Zum
Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe wie nachfolgend
definiert.
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Der
Begriff "therapeutisches
Agens" wird im allgemeinen
Sinne verwendet und umfasst Behandlungsagenzien, prophylaktische
Agenzien, Ersatzagenzien und mikrobielle Agenzien.
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Der
Begriff "allgemeines
Immunsystem der Magenschleimhaut" bezieht
sich auf die Tatsache, dass die Immunisierung an jeder Stelle der
Magenschleimhaut eine Immunantwort an allen anderen Stellen der
Magenschleimhaut hervorrufen kann.
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Die
Begriffe "Protein", "Peptid" und "Polypeptid" beziehen sich auf
beide, die natürlich
vorkommenden chemischen Einheiten und die strukturell ähnlichen
bioaktiven Äquivalente,
erhalten von entweder endogenen, exogenen oder synthetischen Quellen
und werden unter der Bedeutung von Polymeren von Aminosäuren verknüpft über eine
Verbindung des Amidtyps, bekannt als Peptidbindung, verwendet.
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Der
Begriff "strukturell ähnliche
bioaktive Äquivalente" bedeutet ein Polypeptid
mit einer Aminosäurensequenz,
welche – obwohl
nicht identisch mit dem natürlich
vorkommenden Peptid – in
der Struktur ausreichend ähnlich
ist, um im Wesentlichen äquivalente
therapeutische Wirkung hervorzurufen im Hinblick auf den Effekt,
der von dem natürlichen
Peptid selbst hervorgerufen wird.
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Unter
dem Begriff "therapeutisch
effektive Menge" eines
Medikamentes ist eine ausreichende Menge einer Verbindung gemeint,
um den angestrebten therapeutischen Nutzen zu erreichen in einem
vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis, anwendbar
bei jeglicher medizinischer Behandlung. Es wird jedoch verstanden
werden, dass die gesamte tägliche
Dosis des Medikamentes und der Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung durch den behandelnden Arzt unter Einbeziehung des medizinischen
Beurteilungsvermögens
festgelegt werden wird. Die spezifische therapeutische effektive
Höhe der
Dosis für
jeden besonderen Patienten wird von einer Vielzahl von Faktoren
einschließlich
der zu behandelnden Krankheit und der Schwere der Krankheit, der Aktivität der verwendeten
Verbindung, der verwendeten spezifischen Zusammensetzung, dem Alter,
dem Körpergewicht,
der generellen Gesundheit, dem Geschlecht und der Ernährung des
Patienten, der Zeit der Verabreichung, des Verabreichungsweges und
der Ausscheiderate der verabreichten spezifischen Komponente, der
Dauer der Behandlung, der Arzneimittel, die in Kombination oder übereinstimmenden
spezifischen Verbindungen gegeben werden und ähnlicher Faktoren, die auf
dem Gebiet der Medizin bekannt sind, variieren. Beispielsweise ist
es auf diesem Gebiet sehr wohl bekannt, mit geringeren Dosen als
benötigt
zu beginnen, um den gewünschten
therapeutischen Effekt zu erreichen und die Dosis graduell zu steigern,
bis der gewünschte Effekt
erreicht ist.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
den Einfluss von ansteigendem Natriumdeoxycholat (g Natriumdeoxycholat/kg
Bypass-Cocktail) auf die Gewichtszunahme der Regenbogenforelle in
allen Tanks;
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2 zeigt
den Einfluss von ansteigendem Natriumdeoxycholat (g Natriumdeoxycholat/kg
Bypass-Cocktail) auf die Gewichtszunahme der Regenbogenforelle in
den außergewöhnlichen
Tanks;
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3 zeigt
den prozentualen Anstieg des Gewichts von Bachsaiblingen in bST-supplementiertem
Bypass-Cocktail mit ansteigenden Spiegeln von Natriumdeoxycholat;
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4 zeigt
die Gewichtszunahme von Fischen der Kontrolle und injizierten Fischen;
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5 zeigt
die Inhibitionskurve für
gefriergetrocknetes Ovalbumin von der OraljectTM-Formulierung;
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6 zeigt
die Inhibitionskurve für
rote Kidneybohnen der OraljectTM-Formulierung;
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7 zeigt
die Inhibitionskurve für
Sojabohnen der OraljectTM-Formulierung;
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8 zeigt
die Inhibitionskurve für
Saubohnen der OraljectTM-Formulierung;
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9 zeigt
die Inhibitionskurve für
EDTA der OraljectTM-Formulierung;
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10 zeigt
die Inhibitionskurve der Weizenkleie der OraljectTM-Formulierung;
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11 zeigt
die Inhibitionskurve für
sprühgetrocknetes
Ovalbumin der OraljectTM-Formulierung;
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12 zeigt
die Inhibitionskurve für
kombinierte Inhaltsstoffe der OraljectTM-Formulierung;
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13 zeigt
die Standardkurve für
HRP in dem Plasma von Regenbogenforellen; und
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14 zeigt
den Effekt der OraljectTM auf die HRP-Aufnahme.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verabreichung von therapeutischen
Proteinen und Polypeptiden in oraler Dosierungsform. Die Erfindung
liefert eine gesteigerte Absorption durch den Magen-Darm-Trakt und stark
verbesserte Bioverfügbarkeit
der Proteine/Peptide im Vergleich zu den Formulierungen aus dem
Stand der Technik. Die Erfindung ist sowohl bei der humanen als
auch der veterinären
Ernährung,
Therapie und Behandlung von Nutzen. Wie hierin und in den anhängigen Ansprüchen verwendet,
umfasst der Begriff "Polypeptide" Proteine und Peptide,
ebenso wie Polypeptide nach dem Schutzbereich der Erfindung fallen.
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Die
Verbindungen und Zusammensetzungen des Gegenstandes der Erfindung
sind zur Verabreichung biologischer oder chemischer aktiver Agenzien
zu vielerlei Tieren wie beispielsweise Vögeln, Fischen, Säugetieren
(wie beispielsweise Primaten und insbesondere Menschen) und Insekten
geeignet. Das System ist insbesondere vorteilhaft zur Verabreichung
physiologischer, biologischer oder chemisch aktiver Agenzien, die sonst
abgebaut oder durch Bedingungen, die vorstehend beschrieben wurden,
weniger effektiv gemacht wurden, bevor das aktive Agens sein Zielgebiet
(d.h. das Gebiet, in dem das aktive Agens der abgebenden Zusammensetzung
freigesetzt werden soll) innerhalb des Körpers des Tieres, dem es verabreicht
wird, erreicht. Insbesondere sind die Verbindungen und Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung zur oralen Verabreichung aktiver Agenzien,
insbesondere derer, die üblicherweise
nicht oral verabreichbar sind, nützlich.
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Die
vorliegende Erfindung ist insbesondere nützlich für die Verabreichung von Polypeptiden
einschließlich
Proteinen, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf
therapeutische Agenzien, Ernährungsprodukte,
Mucopolysaccharide, Lipide, Kohlenhydrate, Steroide, Hormone, das
Wachstumshormon (GH), Wachstumshormon abgebendes Hormon (growth
hormone releasing hormone) (GHRH), epithelialen Wachstumsfaktor,
vaskuläre
endothelialem Wachstums- und Permeabilitätsfaktor (vascular endothelial
growth and permeability factor (VEGPF), Nervenwachstumsfaktor (nerve
growth factor), Cytokinen, Interleukinen, Interferonen, CMCSF, hormonähnlichem
Produkt, neurologischem Faktor, neurotropem Faktor, Neurotransmitter, Neuromodulator,
Enzym, Antikörper,
Peptid, proteinartiges Fragment, Vaccin, Adjuvanz, ein Antigen,
immunstimulierender oder -inhibierender Faktor, hämatopoietischer
Faktor, Antikrebsprodukt, antiinflammatorisches Agens, antiparasitäre Verbindung,
antimikrobielles Agens, Nukleinsäurefragment,
Plasmid-DNA-Vektor, Zellprolieferationsinhibitor oder -aktivator,
Zelldifferenzierungsfaktor, Blutgerinnungsfaktor, Immunoglobolin,
antiangiogenetisches Produkt, negative selektive Marker oder "Suidzid"-Agenzien, toxische
Verbindung, Antiangiogeneseagenz, Polypeptid, Antikrebsreagenz,
Nukleotide und dergleichen und strukturell ähnliche bioaktive Äquivalente
dieser.
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In Übereinstimmung
mit einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur oralen
Verabreichung und intestinaler Freisetzung einer Nahrungsmittelkomponente
oder eines therapeutischen Polypeptids, welches ausgestattet sein
kann, jedoch ohne Beschränkung
auf die hierin beschriebenen Produkte mit Desoxycholat und Saponinen
in einem Verhältnis,
um eine wesentlich verbesserte Absorption und systemische Bioverfügbarkeit
des Peptides durch die Magen-Darm-Schleimhaut des Wirtes zu erhalten,
zur Verfügung
zu stellen. Die Zusammensetzung umfasst ebenfalls ein pH-neutralisierendes
Agens; wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf Natriumcarbonat und
Calciumcarbonat und zumindest einen Inhibitor für Verdauungsenzyme, wie beispielsweise,
jedoch nicht beschränkt
auf Eialbumin. Diese Zusammensetzung ist bevorzugt fest, so dass
sie einfach bei der Formulierung oraler Zusammensetzungsformen zu
handhaben ist. Die Neutralisierung des pH ist in erster Linie deshalb
angestrebt, um den pH in dem Verdauungstrakt auf das Säure-Base-Gleichgewicht,
verglichen mit den meisten bekannten aktiven biologischen natürlichen oder
synthetischen Produkten herzustellen. Der pH des Verdauungstraktes
wird auf Werte zwischen 6,5 und 9 angehoben.
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Es
sollte selbstverständlich
sein, dass die vorstehende Arzneimittel-Liste lediglich zu illustrativen
Zwecken dient und nicht als eine alles umfassende Liste aller Arzneimittel,
die unter Verwendung der oralen Verabreichungszusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung nützlich
zusammengesetzt oder neu zusammengesetzt sein können. Weitere physiologisch
aktive Verbindungen, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung eingeschlossen sein können,
umfassen biologisch aktive Verbindungen wie beispielsweise Proteine,
Enzyme, Anti-Enzyme, Peptide, Catecholamine, Antihistamine, Schmerzmittel
und dergleichen. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung wird "biologisch" derart definiert,
dass er jegliche Ernährungs-
oder medizinisch nützliche
Zusammensetzung, abgeleitet aus einer biologischen Quelle und/oder
eines synthetisch pharmakologischen Äquivalents daraus wie beispielsweise
Insulin, Häm,
Heoglobin (bovines, humanes oder synthetisches) und Hormone, bedeutet; "Enzyme" oder "Enzymsystem" ist definiert als
jegliches Protein oder Proteinkonjugat, welches biologisch oder
synthetisch hergestellt ist und das als Biokatalysator fungiert,
zu bedeuten. Weitere medizinisch nützliche Zusammensetzungen,
die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise Globulin, eines oder
mehrere Glycoproteine wie beispielsweise Erythropoeitin, können ebenso
in die erfindungsgemäße Zusammensetzung
eingeschlossen sein.
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Die
Menge des therapeutischen Polypeptides kann in Abhängigkeit
von verschiedenartigen Faktoren wie beispielsweise in Abhängigkeit
des zur Verfügung
gestellten Peptids, der zu behandelnden Krankheit, dem jeweiligen
Patienten und dergleichen in weiten Schranken variieren. Die Menge
wird eine therapeutisch wirksame Menge sein, worunter zu verstehen
ist, dass die Menge einen therapeutischen Effekt liefern wird, was mit
Hilfe der in der Medizin etablierten Methoden untersucht werden
kann.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung enterischer Beschichtungen,
die für
Tabletten und Kapseln verfügbar
sind. Enterische Beschichtungen werden in dem Magen intakt bleiben,
werden sich aber schnell auflösen,
nachdem sie in dem Dünndarm
angelangt sind, woraufhin sie den Wirkstoff an Stellen stromabwärts des
Dünndarmes
(beispielsweise dem Krummdarm und Dickdarm) freisetzen. Enterische
Beschichtungen sind dem Fachmann gut bekannt. Alternativ kann eine
orale Verabreichungskapsel, die den Wirkstoff kontrolliert freisetzt
hergestellt werden, um den Wirkstoff nach einer vorbestimmten Zeitdauer
freizusetzen und somit, nachdem die Kapsel in den Krummdarm oder
Dickdarm eingedrungen ist, kann diese verwendet werden, um die Formulierung
der vorliegenden Erfindung dort freizusetzen. Derartige Kapseln umfassen
das CHRONSETTM-Freisetzungshilfsmittel (ALZA
Corporation, Palo Alto, Californien) und das PulsincapTM-Freisetzungshilfsmittel
(R.P. Scherer Co.).
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Die
Zusammensetzung kann weiterhin ein Ionenpaar bildendes Reagenz umfassen,
wobei das molare Verhältnis
des Ionenpaar bildenden Reagenzes zu dem Wirkstoff von etwa 2 :
1 bis etwa 10 : 1 reicht. Das Ionenpaar bildende Reagenz wird deshalb
hinzugegeben, um die Lipophilie des gelösten physiologischen aktiven
Agens oder des Wirkstoffes zu steigern und dadurch dessen Membranpermeabilität zu verbessern.
Die Verbesserung der Lipophilie des Wirkstoffes kann ebenfalls einen
gewissen Schutz des Wirkstoffes vor enzymatischer Deaktivierung
ebenso wie vor Abbau des Peptides, der in vivo in der wässrigen
Umgebung des Magen-Darm-Traktes vorkommt, liefern. Typische Ionenpaar
bildende Reagenzien umfassen Natriumdecansulfonat, Natriumlaurylsulfonat
und Natriumbenzoat.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung optional von etwa
1% bis etwa 5% bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung
eines Darmschleimhautmembran-transportverbessernden Agens, Deoxycholat
enthalten. Derartige Agenzien fördern
die Absorption des therapeutischen Agens über das Darmgewebe in die intestinale
Mukosa und direkt in den Blutstrom des Probanden. Ebenso können Gewebetransport-verbessernde
Agenzien nützlich
für die
Verwendung der vorliegenden Zusammensetzung sein. Diese sind ausgewählt aus
essentiellen oder flüchtigen Ölen oder
aus nicht-toxischen, pharmazeutisch anwendbaren organischen oder
anorganischen Säuren
oder Salzen und Estern dieser. Essentielle oder flüchtige Öle, die
in der Zusammensetzung verwendet werden können, sind ausgewählt aus
Sojabohnenöl,
Saubohnenöl,
Reisöl,
Fischöl.
Das bevorzugte essentielle Öl
ist Fischöl.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung zusätzlich Agenzien
wie beispielsweise Konservierungsmittel und Antioxidantien enthalten.
Typische Konservierungsmittel umfassen Natriumbenzoat, Sorbinsäure und
die Methyl- und Propylester von para-Hydroxybenzoesäure (Parabene).
Charakteristische Antioxidantien umfassen butylierte Hydroxyanisole,
butylierte Hydroxytoluole, Nordihydroguaiaretinsäure, die Gallate wie beispielsweise
Propylgallat, Hydrochinon, Propylethylmethylguaethol und Alkylthiopropionate
oder wasserlösliche
Agenzien wie beispielsweise Alkanolamine, Alkohole und Propylenglykol.
Das am meisten bevorzugt Antixodans ist TenoxTM GT1
(1:1 Vitamin E-Sojabohnenöl),
vorliegend in einer Konzentration zwischen etwa 5 % bis etwa 25
% bezogen auf das Gesamtvolumen des Tröpfchens.
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Die
orale Absorption von rekombinantem humanem GH durch den Karpfen
ist um etwa das 1000-fache erhöht,
wenn dieses gemeinsam mit Deoxycholat gegeben wird.
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Um
die pharmazeutische Formulierung der vorliegenden Erfindung herzustellen,
werden die Bestandteile im trockenen Zustand gemeinsam gemischt,
woran anschließend
die kleine Menge des Öles
hinzugefügt wird.
Diese Verbindungen werden gemeinsam gemischt, bis eine homogene
Mischung der Bestandteile daraus resultiert. Die daraus resultierende
Feststoffformulierung kann in Tabletten gepresst werden und diese
mit einer geeigneten enterischen Beschichtung versehen werden. Alternativ
kann die Feststoffformulierung in einer Kapsel, gebildet aus Gelatine
oder dergleichen und beschichtet mit einer enterischen Verbindung
oder in einem Freisetzungshilfsmittel zur kontrollierten Freisetzung,
wie beispielsweise dem CHRONSETTM platziert werden.
Die Feststoffformulierung stellt ein Hilfsmittel zur leichten und
einfachen Herstellung einer Dosierungsform dar.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung:
Wirkstoff | 5
mg/ml |
Eialbumin | 10–20 % |
Natriumcarbonat | 10–20 % |
Calciumcarbonat | 10–20 % |
EDTA | 1–10 % |
Sojabohnen | 5–10 % |
Saubohnen | 5–10 % |
Reishülsen | 5–10 % |
Deoxycholat | 1–5 % |
Fischöl | 5–10 % |
Bierhefe | 1–5 % |
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Freisetzung von Hormonen
und Pharmazeutika an einem tierischen oder menschlichen Wirt zur
Verfügung
zu stellen.
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Auf
dem Gebiet der Viehzucht hat sich die Produktion von verschiedenen
Spezies von Fischen als besonders bedeutend herausgestellt. Die
Kontrolle der Reproduktionsphysiologie ist von besonderer Bedeutung. Der
erste Anhaltspunkt der Erfindung zur Manipulation der Fischreproduktion
durch das Füttern
bioaktiven Materials wurde von Studien geliefert, die sich mit Säugetieren
und amphibischen Hypophysen beschäftigten. Demnach wurde beobachtet,
dass der diätetische
Ersatz oder die Ergänzung
mit Hypophysenpräparationen die
Hochzeitsfärbung
des teilweise geschlechtsreifen Bitterlings Acheilognathus inter-medeium
einleitet, und den Eidurchmesser der Schmerle Misgurnus anguillicaudatus
erhöht,
was zur Ovulation und einer Verkürzung des
Brutintervalles um 10 bis 15 Tage bei dem Schwertträger Xiphophorus
helleri führt
und zu einer Vergrößerung der
Eigröße und einer
Induzierung früherer
Geschlechtsreife bei weiblichen Seeforellen Salvelinus fontinalis
führt.
In ähnlicher
Weise induzierte die orale Verabreichung von Lachs-Hypophysenextrakt
an dem Goldfisch C. auratus die Ovulation und gesteigerte Spermeation.
Die Bedeutung dieser Daten betrifft die begleitende Erhöhung von
Gonadotropin (sGtH) im Plasma von Lachsen, Testosteron und 17α-20fi-Diphydroxy-4-pregnan-3-on,
die eine wahrscheinliche endokrin basierende Erklärung für die beobachteten
Effekte von weiteren Hypophysenpräparationen während früherer Untersuchungen
(d.h. die Aufnahme von GtH) liefern.
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Aufgrund
der Probleme, welche der Verwendung von Hypophysenpräparationen
und teilweise gereinigten Hormonen anhaften, würde es unwahrscheinlich erscheinen,
dass derartige Präparationen
im Hinblick auf die Kontrolle der Reproduktion bei der Viehzucht
unter Verwendung des oralen Weges einen großen Nutzen bieten, so lange
diese nicht in einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung
formuliert sind. Eine relativ neue Innovation bei der Kontrolle
der Reifung war die Applikation des Gonadotropin-Freisetzungshormons. Viele der analogen
Formen des GnRH sind 50–100
mal effektiver bei der Auslösung
der Ovulation als die natürlichen
Formen und umfassen diese, welche D-Aminosäuren enthalten und haben terminale
Enden, die mit Ethylamid substituiert sind. Diese Manipulationen
haben den Effekt, dass sie den Widerstand des Moleküls gegenüber der
Proteolyse erhöhen.
GnRHs stimulieren die natürliche
Freisetzung des GtH, weisen eine Wirksamkeit in vielen Spezies auf,
sind vergleichsweise einfach herzustellen und aus diesen Gründen ökonomisch.
Darüber
hinaus sind diese Peptide über
einen weiten Temperaturbereich stabil und zeigen eine nicht variierende
Wirksamkeit. Bedeutsamerweise sind diese Peptide für eine undefinierte
Zeitperiode stabil, vorausgesetzt diese werden unter sterilen Bedingungen
bei Temperaturen unterhalb von –20%
gelagert. Als solche stellen GnRHAs exzellente Kandidaten-Moleküle für die Verwendung
bei dem oralen Ansatz zur Kontrolle der Reproduktion dar. Tatsächlich wurden
ausreichend experimentelle Beweise gesammelt, so dass die diätetische
Freisetzung von GnRHAs mit oder ohne Dopamin-Agonisten mittlerweile
als ein Verfahren zur Kontrolle der letzten Stadien der Reifung
von Fischen angesehen wird. Obwohl sie teurer als traditionelle
Verfahren (Injektion, Implantation) ist, liefert die diätetische
Verabreichung den Vorteil, stressfrei zu sein. Dieser Vorteil bei
der reproduktiven Biotechnologie ist besonders für Spezies, die verwundbar bei
der Handhabung und/oder zu klein für eine sichere Injektion (d.h.
bei zur Zierde gehaltenen Arten), besonders nützlich. Zusätzlich liefert die chronische
Behandlung mit GnRHAs Hilfsmittel, um die frühere Reife einzuleiten, was
bei der Herstellung von Rogen als vorteilhaft angesehen wird, oder
zur Verwendung mit Zuchtbecken zur Geschlechtsänderung geeignet ist.
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Ebenso
wie die Kontrolle der Reproduktion liefern Studien unter Verwendung
von Hypophysen als Nahrungsergänzungsmittel
einen frühen
Hinweis auf die Möglichkeit
der Manipulation des Wachstums von Knochenfischen unter Verwendung
von oralen Verabreichungstechniken. Daher wurde untersucht, dass
die Fütterung
von Guppys Lebistes reticulatus mit einem Puder des Hypophysenvorderlappens
zu einem signifikant gesteigerten Wachstumsverhalten im Vergleich
zu den Kontrollen führte.
Ebenso wurde ein 50%iger Anstieg der Länge, was bei den Schwertträgern, die
ausschließlich
mit getrockneten Hypophysenvorderlappen von Geburt an gefüttert wurden,
beobachtet, während
weitere Experimente eine Verdoppelung des Gewichtes und eine Verdreifachung
in der Länge
von Seeforellen, die 2 × wöchentlich
mit Hypophysenvorderlappen gefüttert
wurden, zeigten. Die Behandlung von kultivierten Knochenfischen
mit dem Wachstumshormon (GH) und verwandten Peptiden liefert eine
Vielzahl von potentiellen Vorteilen, und verschiedene Studien haben
bestätigt, dass
oral verabreichtes GH nicht nur in den Blutstrom eintritt, sondern
auch die Wachstumsrate der Fische steigert. Der Nachschub von rekombinantem
GH ist derzeit stabil und die Produktion könnte bei gesteigerter Nachfrage
um ein Vielfaches gesteigert werden. Darüber hinaus sind derartige rekombinante
Proteine kosteneffektiv, wenn sie im industriellen Maßstab hergestellt
werden und können
leicht in kommerzielle Nahrungsmittel eingearbeitet werden. Während die
strukturelle Integrität
des GH-Moleküls
als Precursor für
post-translational modifizierte Formen von Bedeutung sein kann,
so können
Verfahren zur Verbesserung der strukturellen Integrität des Moleküls oder
Wirksamkeit einen Nutzen aus Sicht der oralen Verabreichungsmethode
liefern. Die Beschreibung von wachstumsfördernden Fragmenten des GH-Moleküls kann
ebenso Produkte zur Verfügung stellen,
die eine größere Stabilität gegenüber dem
luminalen Abbau aufweisen.
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Eine
besondere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung zur Verfügung zu
stellen und die Verwendung, die es erlaubt, den oralen Weg zur Impfung,
was den signifikanten Vorteil mit sich bringt, dadurch, dass es
Laborkosten reduziert, zeitsparend ist, die Möglichkeiten der Cross-Kontamination
mit Nadeln einschränkt
und dadurch, dass es keine aufwendige Handhabung oder Entsorgung
oder Behandlungsflüssigkeiten
bedarf.
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Der
in erster Linie bestimmende Faktor der spezifischen Immunität der Darmoberfläche ist
das sektorische IgA (S-IgA), welches physiologisch und funktionell
unterschiedlich von den Komponenten des Immunsystems des Blutkreislaufes
ist. S-IgA-Antikörper-Antworten
können
lokal durch die Applikation von geeigneten Immunogenen an einer
besonderen Stelle des Darmes eingeleitet werden. Der Großteil der
mukosalen S-IgA-Antwort resultiert jedoch in der Immunität, die über das
gemeinsame mukosale Immunsystem (CMIS) generiert wird, indem Immunogene
von spezialisierten lympho-epithelialen Strukturen, allgemein bekannt
als Mukosa-assoziiertes Lymphgewebe (MALT), aufgenommen werden.
Die besten immunologischen lympho-epithelialen Strukturen sind das
Darm-assoziierte Lymphgewebe (GALT) wie beispielsweise die intestinalen
Peyer'schen Platten.
Andere strukturell und funktionell ähnliche Lymphoidfolikel kommen
an anderen mukosalen Oberflächen
vor, einschließlich
denen des Verdauungstraktes.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann ein Wirt durch orale Verabreichung von bakteriellen
Protein-Immunogenen, bevorzugt gemischt mit einem Adjuvanz wie beispielsweise
Choleratoxin (CT) immunisiert werden. Selbstverständlich ist
das Adjuvanz, die Menge an Choleratoxin, welches verwendet wird,
nicht giftig für
den Wirt.
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Die
Fähigkeit
eines Impfstoffes, um gegenüber
mikrobieller Besiedelung zu schützen,
wird hierdurch zur Verfügung
gestellt und bedeutet, dass die aktive Komponente gegen eine Krankheit
nicht nur in dem immunisierten Wirt, sondern durch Eliminierung
der Übertragung
zwischen immunisierten Individuen, schützt und das Pathogen und somit
jegliche Krankheit, die es hervorruft, von der gesamten Population
eliminiert wird.
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Die
orale Verabreichung kann ebenso Vergiftungen, welche von der Verabreichung
von Mikroben herrühren,
verhindern, so dass die Impfung gegen beides – mikrobielle Besiedlung und
Sepsis – (systemische
Infektion) schützen
kann.
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Beispielsweise
ist PspA ein bevorzugtes Antigen für pneumokokkale Infektionen.
In der veröffentlichten
internationalen Patentanmeldung WO 92/14488, deren gesamter Inhalt
durch Bezugnahme hier mit eingebracht ist, sind DNA-Sequenzen für das PspA-Gen
von S. pneumoniae R×1,
die Herstellung einer verkürzten Form
von PspA mittels Gentechnik und der Nachweis, dass derartig verkürzte Formen
von PspA-Mäusen,
die mit lebenden Pneumokokken in Kontakt gebracht wurden, Schutz
verleiht, beschrieben.
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Von
den Sequenzen des PspA-Gens wurde gezeigt, dass PspA-Proteine von
variabler Größe sind
(in etwa 70 kDa). Die C-terminalen 37% des Moleküls sind größtenteils aus den 20 Aminosäuren-repeats
zusammengesetzt, die eine Bindestelle ausbilden, die es dem PspA
erlaubt, an die Phosphocholinreste der Lipoteichonsäuren des
Pneumokokkos zu binden. Der zentrale Bereich des PspA ist reich
an Prolinen und ist mutmaßlich
der Teil des Moleküls,
der durch die Zellwand hindurchgelangt. Die Sequenz der N-terminalen
80% des Moleküls
ist größtenteils
beta-helical und enthält
die Region des PspA, die Antikörper,
die schützend
gegenüber
der Sepsis sind, auslösen
kann. Obwohl PspAs allgemein zumindest leicht voneinander verschieden sind,
gibt es ausreichende Querreaktivität untereinander, so dass Antikörper oder
eine immunologische Antwort gegenüber einem PspA wirksam gegenüber den
PspAs aller Pneumokokken sind. Darüber hinaus kann die Immunisierung
mit einem PspA entweder gegen den Tod oder eine Verzögerung des
Todes mit nahezu allen unterschiedlichen Erregerstämmen führen. Entsprechend
kann eine Mischung einer geringen Anzahl von PspAs eine wirksame
Immunität
gegen die meisten Pneumokokken liefern.
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Die
immunprotektiven verkürzten
PspAs, die in der WO 92/14488 beschrieben sind, können in
der vorliegenden Erfindung als die vorstehend beschriebenen PspA-Fragmente
zur oralen Verabreichung verwendet werden.
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Unterschiedliche
Vektorsysteme für
in vitro und in vivo-Expression von rekombinanten Proteinen sind bekannt,
beispielsweise bakterielle Systeme wie zum Beispiel E. Coli und
Virussysteme, wie beispielsweise bakterielle Viren, Poxyviren (Vaccinen,
Avipoxviren, beispielsweise Canarypox Virus, Fowlpox Virus), Baculovirus,
Herpesvirus; Hefen und dergleichen und diese Systeme können verwendet
werden, um rekombinantes PspA unter Verwendung der kodierenden Gene
dieser herzustellen.
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Die
Immunogenität
könnte
verbessert werden, wenn das Antigen gemeinsam mit einem Zusatz verabreicht
wird, allgemein verwendet als 0,001 %ige bis 50 %ige Lösung in phosphatgepufferter
Salzlösung.
Die Adjuvanzien verbessern die Immunogenität des Antigens, sind jedoch
nicht selbst notwendigerweise immunogen. Adjuvanzien können dadurch
wirken, indem sie das Antigen näher
an die Stelle der Verabreichung bringen, um einen Depoteffekt zu
erreichen, wodurch eine langsame, konstante Freisetzung des Antigens
zu Zellen des Immunsystems zustande kommt. Adjuvanzien können ebenso
Zellen des Immunsystems an ein Antigen-Depot anlocken und derartige
Zellen zur Auslösung
der Immun-Antwort stimulieren.
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Immunostimulierende
Agenzien oder Adjuvanzien wurden seit vielen Jahren verwendet, um
die Immunantwort des Wirtes beispielsweise bei Impfungen zu verbessern.
Intrinsische Hilfsstoffe, wie beispielsweise Lipopolysaccharide,
sind normalerweise Verbindungen von abgetöteten oder abgeschwächten Bakterien,
die als Impfstoffe verwendet werden. Extrinsische Hilfsstoffe sind
Immunomodulatoren, die typischerweise nicht kovalent mit dem Antigen
verknüpft
sind und derart formuliert sind, um die Immunantwort des Wirtes
zu verbessern. Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphate (allgemein
bekannt als Alum) sind routinemäßig verwendete
Hilfsstoffe bei menschlichen und tierischen Impfstoffen. Die Effizienz
von Alum bei der Steigerung der Antikörperantwort gegenüber Diphterie-
und Tetanustoxinen ist gut bekannt, und erst kürzlich wurde ein HBsAg-Impfstoff mit Alum
unterstützt.
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Ein
weites Spektrum an extrinsischen Adjuvanzien kann eine starke Immunantwort
gegenüber
Antigenen auslösen.
Diese umfassen Saponine, die an Membranprotein Antigene komplexiert
sind (immunstimulierende Komplexe), Pluronic Polymere mit Mineralöl, getöteten Bakterien
in Mineralöl,
Freund's vollständige Hilfsstoffe,
bakterielle Produkte, wie beispielsweise Muramyldipeptid (MDP) und
Lipopolysaccharid (LPS), ebenso wie Lipid A und Liposomen. Um die
humorale Immunantwort (HIR) und die zellvermittelte Immunität (CMI)
effizient einzuleiten, werden Immunogene bevorzugt in Adjuvanzien
emulgiert.
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Zusammensetzungen
der Erfindung, besonders zu oralen Verabreichung, könnnen bequem
als wässrige
Präparationen
zur Verfügung
gestellt werden, beispielsweise als isotonische wässrige Lösungen,
Suspensionen, Emulsionen oder zähflüssige Zusammensetzungen,
die auf einen ausgewählten
pH-Wert gepuffert sein können.
Jedoch, da die Freisetzung in dem Verdauungstrakt bevorzugt ist,
kann die Zusammensetzung der Erfindung in einer festen Form von
Pillen, Tabletten, Kapseln, Caplets und dergleichen, einschließlich fester
Präparate
mit Retardzeit oder eine flüssige
Füllung,
beispielsweise Gelatine umschlossene Flüssigkeit in Retardform, wobei
die Gelatine im Magen und/oder Dünndarm
zur Freisetzung in den Darm und/oder das Verdauungssystem gelöst wird,
vorliegen.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann ebenfalls pharmazeutisch annehmbare Aromastoffe und/oder Färbemittel
enthalten, um diese attraktiver zu machen. Die viskosen Zusammensetzungen
können in
Form von Gelen, Lotionen, Salben, Cremes und dergleichen sein und
werden typischerweise eine ausreichende Menge eines Verdickungsmittels
enthalten, so dass die Viskosität
zwischen etwa 2.500 bis 6.500 cps, wenngleich bei viskoseren Zusammensetzungen
sogar bis zu 10.000 cps verwendet werden können. Viskose Zusammensetzungen
haben eine bevorzugte Viskosität
von 2.500 bis 5.000 cps, da sie im Bereich darüber schwieriger zu verabreichen
sind. Jedoch können
die Zusammensetzungen im Bereich darüber feste oder gelatineartige
Formen annehmen, die dann leicht als eine geschluckte Pille zur
oralen Aufnahme verabreicht werden können.
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Flüssige Präparate sind
normalerweise leichter herzustellen als Gele und andere viskose
Zusammensetzungen und feste Zusammensetzungen. Zusätzlich sind
flüssige
Zusammensetzungen in gewisser Weise leichter zu verabreichen, insbesondere
an Tiere, Kinder, insbesondere Kleinkinder und andere, die Probleme haben
könnten,
eine Pille, Tablette, Kapsel oder dergleichen zu schlucken oder
in Fällen
von Mehrfachdosierungen. Viskose Zusammensetzungen können andererseits
innerhalb eines geeigneten Viskositätsbereiches formuliert sein,
um längere
Kontaktdauern mit der Magenschleimhaut, ebenso mit der Auskleidung
des Magens oder Dünndarmes
zu erreichen.
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Geeignete
nicht-toxische pharmazeutisch annehmbare Träger und speziell orale Träger sind
dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie und besonders oraler oder
peroraler pharmazeutischer Formulierungen bekannt. Offensichtlich
wird die Auswahl der geeigneten Träger von der exakten Natur der
besonderen Dosierungsform abhängen,
beispielsweise der flüssigen
Dosierungsform (zum Beispiel wenn die Zusammensetzung in einer Lösung, einer
Suspension, einem Gel oder in einer anderen Flüssigkeit formuliert ist oder
einer festen Dosierungsform, oder beispielsweise wenn die Zusammensetzung
in einer Pille, Tablette, Kapsel, Caplet, Retardform oder flüssigkeitsgefüllten Form
formuliert ist).
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Lösungen,
Suspensionen und Gele enthalten normalerweise eine Hauptmenge an
Wasser (bevorzugt gereinigtes Wasser) zusätzlich zu dem Antigen. Kleinere
Mengen von anderen Inhaltsstoffen wie beispielsweise pH-entstellenden
Mitteln (beispielsweise eine Base wie z.B. NaOH), Emulgatoren oder
dispergierende Agenzien, puffernde Agenzien, Konservierungsmittel,
Netzmittel, Geliermittel (beispielsweise Methylcellulose), Färbemittel
und/oder Aromastoffe können
anwesend sein. Die Zusammensetzungen können isotonisch sein, das heisst
diese können
den gleichen osmotischen Druck wie Blut und Tränenflüssigkeit haben.
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Die
angestrebte Isotonie der Zusammensetzung dieser Erfindung kann durch
die Verwendung von Natriumchlorid oder anderer pharmazeutisch annehmbare
Agenzien wie beispielsweise Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol
oder andere anorganische oder organisch lösliche Substanzen eingestellt
werden. Natriumchlorid ist besonders bevorzugt für Puffer, die Natriumionen
enthalten.
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Die
Viskosität
der Zusammensetzungen kann auf der ausgewählten Höhe aufrechterhalten werden unter
Verwendung eines pharmazeutisch annehmbaren Verdickungsmittels.
Methylcellulose ist bevorzugt, da sie leicht erhältlich ist und mit ihr leicht
umzugehen ist. Andere geeignete Verdickungsmittel umfassen beispielsweise
Xanthan, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carbomer
und dergleichen. Die bevorzugte Konzentration des Verdickungsmittels
wird von dem ausgewählten
Agens abhängen.
Der wichtige Punkt hierbei ist, eine Menge zu verwenden, die die
ausgewählte
Viskosität
erreichen lässt.
Viskose Zusammensetzungen werden normalerweise aus Lösungen durch
Zugabe derartiger Verdickungsmittel hergestellt.
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Ein
pharmazeutisch annehmbares Konservierungsmittel kann verwendet werden,
um die Haltbarkeit der Zusammensetzung zu erhöhen. Benzylalkohol kann geeignet
sein, obwohl eine Vielzahl von Konservierungsmitteln einschließlich beispielsweise
Paraben, Thimerosal, Chlorbutanol oder Benzalkoniumchlorid ebenfalls
verwendet werden können.
Eine geeignete Konzentration des Konservierungsmittels wird von
0,02 Gew.-% bis 2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht sein, obwohl
es beträchtliche
Abweichungen in Abhängigkeit
des ausgewählten
Agens geben kann.
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Die
Fachleute werden erkennen, dass die Verbindungen der Zusammensetzung
derart ausgewählt sein
müssen,
so dass sie chemisch inert hinsichtlich mikrobieller Antigene sind.
Dies wird für
die Fachleute auf dem chemischen und pharmazeutischen Gebiet kein
Problem darstellen oder das Problem kann in einfacher Weise durch
Bezugnahme auf Standardtests oder durch einfache Experimente (ohne
Einbeziehung nicht durchgeführter
Experimente) aufgrund dieser Beschreibung vermieden werden.
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Die
immunologisch wirkungsvollen Zusammensetzungen dieser Erfindung
werden durch Mischung der Bestandteile mit nachfolgenden allgemein
akzeptierten Verfahrensschritten hergestellt. Beispielsweise können die
ausgewählten
Verbindungen einfach in einem Mischer oder in einem Standardhilfsmittel,
um konzentrierte Mischungen herzustellen, gemischt werden, die daraufhin
auf ihre endgültige
Konzentration und Viskosität
durch die Zugabe von Wasser oder Verdickungsmitteln und möglicherweise
eines Puffers, um den pH einzustellen oder einen zusätzlichen
gelösten
Stoff, um die Tonizität
kontrollieren zu können.
Im Allgemeinen kann der pH-Wert von etwa 3 bis 7,5 betragen. Die
Zusammensetzungen können
dann in Dosierungen und mittels Techniken, die der Fachmann auf
dem Gebiet der Medizin und Veterinärmedizin in Betracht zieht,
wie beispielsweise Faktoren wie Alter, Geschlecht, Gewicht und Zustand
des besonderen Patienten oder Tieres und der Zusammensetzungsform,
die zur Verabreichung verwendet wird (beispielsweise fest gegenüber löslich),
verabreicht werden. Die Dosierungen für Menschen oder andere Säugetiere
können
ohne aufwendige Experimente durch den Fachmann bestimmt werden.
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Wenn
CT als ein Hilfsstoff zur oralen Immunisierung verwendet wird, so
werden spezifische IgA Antikörper
in Sekreten induziert. Starke Immunantworten in dem Kreislauf können ebenso
mit IgG und IgA Antikörpern
in dem Serum und IgG und IgA Antikörper-sekretierenden Zellen
in der Milz induziert werden. Die Kreislauf- (oder systemische)
Immunantwort, ausgelöst
durch orale (peroral; intragastral) Verabreichung von mikrobiellen
Antigenen, gemeinsam mit CT, sind vergleichbar mit oder sogar stärker als
jene, die durch die Verabreichung von ähnlichen Immunogenen über den
Magen-Darm-Trakt
verabreicht wurden. Demgemäß erscheint
es, dass die orale Immunisierung ein effektiver Weg zur Auslösung der
allgemeinen mukosalen Immunantwort ebenso wie der Antikörperantwort
des Kreislaufsystems ist und dass diese weniger Antigen als andere
Immunisierungswege benötigt.
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Die
meisten löslichen
oder nicht-replizierenden Antigene sind schlechte Immunogene, insbesondere über den
peroralen Weg, wahrscheinlich, weil sie über Verdauungsenzyme abgebaut
werden und wenig oder kein Tropismus für die GALT aufweisen. Eine
bemerkenswerte Ausnahme ist CT, welches ein starkes mukosales Immunogen
ist, wahrscheinlich wegen der G.sub.M1 Gangliosid-Bindeeigenschaft
dieser Binde- Untereinheit,
CTB, welches es ihm ermöglicht,
von den M-Zellen der Peyer'schen
Platten aufgenommen zu werden und zu den darunterliegenden immunokompetenten
Zellen zu gelangen. Zusätzlich
ein gutes mukosales Immunogen zu sein, ist CT ein wirkungsvoller
Hilfsstoff wenn es in Mikrogramm-Dosen verabreicht wird, verstärkt CT wesentlich
die Immnunogenität
von anderen löslichen
Antigenen, mit denen es gemeinsam verabreicht wurde.
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Gemäß einer
Ausführungsform
und gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung
eines Medikamentes zur Behandlung von Krankheiten oder Funktionsstörungen eines
Wirtes durch Zurverfügungstellen
eines therapeutischen Agens für
den Wirt nach oraler Verabreichung zur Verfügung gestellt.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
umfassen Krebszellen, die gemäß der vorliegenden
Erfindung behandelt werden können,
bösartige
Tumore. Bösartige
Tumore (einschließlich
primärer
Tumore und Metastasen), die behandelt werden können, sind jedoch nicht beschränkt auf
derartige, die in der Nebenniere, der Blase, den Knochen, der Brust,
der Gebärmutter,
den endokrinen Drüsen
(einschließlich
der Schilddrüse, der
Hypophyse und dem Pankreas), Darm, Mastdarm, Herz, hematopoietischem
Gewebe, Niere, Leber, Lunge, Muskel, Nervensystem, Gehirn, Auge,
Mundhöhle,
Rachen, Kehlkopf, Eierstöcke,
Prostata, Haut (einschließlich
Melanome), Hoden, Thymus und Uterus vorkommen. Es sollte jedoch
verstanden werden, dass der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung
nicht auf die Behandlung eines dieser besonderen Tumore beschränkt ist.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das Agens, das geeignet ist, die
Krebszellen nach der Verabreichung eines solchen Agens zu inhibieren,
verhindern oder zu zerstören,
ein negativer Selektionsmarker, beispielsweise ein Material, welches
in Kombination mit einem Chemotherapeutikum oder interagierenden
Agens das Wachstum der Krebstumorzellen inhibiert, verhindert oder diese
zerstört.
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Damit
wird aufgrund der systemischen Zurverfügungstellung des negativen
Selektionsmarkers ein interagierendes Agens dem tierischen oder
menschlichen Wirt verabreicht. Das interagierende Agens interagiert mit
dem negativen Selektionsmarker, um das Wachstum der Krebszellen
zu verhindern, inhibieren oder diese zu zerstören. Negative Selektionsmarker,
welche beispielsweise verwendet werden können, sind jedoch nicht beschränkt auf
Thymidinkinase und Cytosindeaminase.
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Das
interagierende Agens wird in einer Menge verabreicht, die ausreichend
ist, um das Wachstum der Krebszellen zu inhibieren, verhindern oder
zu zerstören.
Beispielsweise kann das interagierende Agens in einer Menge von
5 mg bis 15 mg/kg Körpergewicht,
bevorzugt etwa 10 mg/kg, in Abhängigkeit
der Gesamttoxizität
einem Patienten verabreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele,
die dargestellt sind, um die Erfindung zu illustrieren und nicht
um den Schutzbereich einzuschränken,
leichter verstanden werden.
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BEISPIEL 1
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Wachstumsbeschleunigung
von Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) und Bachforellen (Salvelinus fontinalis):
Fütterung
des rekombinanten bovinen Wachstumshormons unter Verwendung eines
neuartigen Abgabesystems
-
Die
Aquakuitur-Industrie ist weltweit während der vergangenen zwei
Jahrzehnte stark gewachsen und repräsentiert zum jetzigen Zeitpunkt
das am schnellsten wachsende agrarwirtschaftliche Segment. Der Sektor ist
mit einer jährlichen
Wachstumsrate von 10,9 seit 1984 im Vergleich mit 3,1 für die Landtierhaltung
zur Fleischproduktion gewachsen. Der am schnellsten wachsende Tierzuchtsektor über die
gleiche Zeitperiode war die Hühnerfleischproduktion
mit einer APR von 5,3, gefolgt von Schweinefleisch 3,4, Hammel und
Lanzen 1,4 und Rind und Kalb mit 0,9. Der Beitrag der Aquakulturen
zur gesamten weltweiten Fischanlandung hat sich seit 1984 mehr als
verzweifacht von 11,5 Gew.-% auf 25,6 Gew.-% in 1995. Die projektierte
gesteigerte Nachfrage für
Meeresprodukte, gekoppelt an sinkende Fischereianlandungen von wilden
Beständen,
hat und wird weiterhin zu dem Wachsen der Aquakultur-Industrie beitragen.
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Die
Aquakultur-Industrie, wie andere Sektoren der Landwirtschaft, stellt
sich vielen der Produktionsherausforderungen, welche mit der traditionellen
Viehzucht assoziiert sind. 40 bis 50 % der Kosten der Lachsproduktion
wird der Fütterung
zugeschrieben. Die Rationen enthalten einen hohen Prozentsatz an
teurem Fischprotein und die Lachse benötigen eine vergleichsweise
lange Fütterungsperiode,
um ihr Marktgewicht zu erreichen. In schnell wachsenden Fischen
ist eine übermäßige Fettablagerung
gegenüber
beiden, den Herstellern und den Konsumenten, in Betracht zu ziehen.
-
Das
Ziel der tierischen Nahrungsmittelindustrie ist es, die Produktionseffizienz
zu optimieren durch Minimierung des Inputs an Futter, Arbeit und
investiertem Kapital, während
die Ausbeute von hochqualitativem Protein maximiert wird. In der
Vergangenheit wurden die wirtschaftlich bedeutenden Parameter durch
genetische Selektion oder Nahrungsmodifikation verändert. Vor
noch kürzerer
Zeit wurde eine Vielzahl von Ansätzen verfolgt
einschließlich
Manipulationen an dem endokrinen System, um das Wachstum und die
Körperzusammensetzung
der domestizierten Tiere zu beeinflussen. Die Möglichkeit von exogenen Verbindungen,
erfolgreich das Wachstumsverhalten von domestizierten Tieren zu
verändern
und die Möglichkeit
der Einsparung an Produktionskosten haben Nachforschungen bei der
Verwendung dieser Agenzien am Fisch aufkommen lassen.
-
Die
Verabreichung des Wachstumshormons (GH), erhalten von verschiedenartigen
Quellen, hat den Beweis erbracht, dass dieses Hormon eine Schlüsselrolle
bei der Stimulation des somatischen Wachstums und bei der Reduktion
der Fettablagerung im Fisch bewirkt. Beide, natives und rekombinantes
Fisch GH wurde verschiedenen Spezies an Fischen verabreicht und
diese sind gleichwirkend, wenn sie in gesunde Lachse injiziert werden.
Ebenso ist berichtet worden, dass GH abgeleitet von Säugetier-
und Geflügelquellen
effektiv bei der Veränderung
des Wachstumsverhaltens von jugendlichen Lachsen ist. Die Verabreichung
von bovinem GH (bGH) an Lachse führt
zu einem 2 bis 3-fachen
Anstieg der Wachstumsrate, einer Steigerung des Appetits und der
Fütterungseffektivität und einer
Reduktion an Fettgewebe. Exogenes GH ist ebenso wirkungsvoll in älteren (subadulten)
Fischen und bei geringeren Wassertemperaturen, wenn die Wachstumsrate
gering ist.
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Die
orale Verabreichung von GH ist eine praktische Methode und hat histochemische
und biologische Beweise für
einen Mechanismus, der intakte Proteine in den Blutkreislauf von
Knochenfischen infolge oraler Verabreichung transportiert, geliefert.
Es wurde nun gezeigt, dass oral verabreichte Meerrettich-Peroxidase
innerhalb 1 Stunde in den Blutkreislauf transportiert wird.
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Es
wird berichtet, dass der Transfer des bGH in das Kreislaufsystem
von Jährlings-Regenbogenforellen
infolge der Einführung
des Hormons in das Lumen des Verdauungstraktes geschieht. In gleicher
Weise ist gezeigt worden, dass oral verabreichtes rekombinantes
Lachs-Wachstumshormon (rsGH) signifikant die Plasma rsGH-Konzentrationen erhöht. Die
gleichen Ergebnisse zeigen, dass die wöchentliche intragastrische
Verabreichung von rsGH zu einem 50%igen Anstieg bei der Gewichtszunahme
und der Fischlänge
im Vergkleich mit den Kontrollfischen führt.
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Die
vorstehenden Untersuchungen unterstreichen, dass oral verabreichtes
GH von verschiedenen Quellen die Wachstumseigenschaften verschiedener
Knochenfischspezies beeinflusst, indem sie vor dem Magen- und Dünndarmverdau
geschützt
wurden, so dass diese intakt und biologisch aktiv bleiben. Dies
hat zu einer Steigerung verschiedenartiger Versuche geführt, Systeme
zu entwickeln, die bioaktive Proteine (Wachstumshormone, Antigene
etc.) vor der sauren Umgebung des Magens schützen. Die orale oder rektale
Intubation von Fischen sind wirkungsvolle Methoden, um bioaktive
Proteine durch den Magen hindurch zu verabreichen, jedoch sind diese
für kommerzielle
Anwendungen nicht brauchbar. Anstrengungen sind unternommen worden,
um bioaktive Proteine gemeinsam mit Detergenzien und Antisäuren zu
verabreichen, um die saure Umgebung im Magen zu reduzieren. Während dieser
Studien wurde ein verminderter Proteinabbau nachgewiesen, die verwendeten
Behandlungen können
genutzt werden, um die Aufnahme von weiteren wichtigen Nahrungsfaktoren
zu beeinflussen. Eine weitere Möglichkeit
ist die Verwendung von pH-sensitiven Polymeren, welche die Peptide
einkapseln und vor saurem Abbau im Magen schützen und deren Freisetzung
erst im Dünndarm
erlauben.
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In
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist deutlich nachgewiesen
worden, dass Verbindungen (Hormone, Impfstoffe, Antikörper etc.),
die oral verabreicht wurden, den Magen von einmägigen Tieren (einschließlich Menschen)
passierten, um den Abbau im Magen bis zur Absorption in dem kleinen
und/oder großen Darm
zu umgehen. Heutzutage hat sich ein Großteil der Forschung auf die
Entwicklung von Umkapselungsstrategien unter Verwendung einer Vielzahl
von Formulierungen und interessanter Formen konzentriert. Diese Formulierungen
und Formen können
in einfacher Weise die Freisetzung einer spezifischen Verbindung
in einer vorherbestimmten Art und Weise steuern oder können spezifische
physiologische Determinanten (beispielsweise pH-Wert, Temperatur
etc.) zur Auslösung
der Freisetzung des eingeschlossenen Materials nutzen.
-
Das
komplexe Polymer, welches in den anderen Arten von Freisetzungssystemen
verwendet wird, ist manchmal schwierig zu charakterisieren. Ebenso
macht die Verwendung von gewissen Polymeren, die nicht allgemein
als sicher (GRAS) betrachtet werden, die regulatorische Verwendung
dieser Systeme zu einem langen und risikoreichen Prozess. Darüber hinaus
sind viele Polymersysteme relativ teuer, was die Verwendung im großen Maßstab unpraktikabel
macht.
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Das
aktuelle Experiment unterstreicht eine neue Strategie, um die orale
Verabreichung eines bioaktiven Peptids (in diesem Fall bST) zu ermöglichen.
Durch die Fütterung
einer gewünschten
bioaktiven Verbindung gemeinsam mit einem Cocktail von antinutritiellen
Faktoren, um die Funktion der Verdauungsenzyme zeitweise zu unterdrücken, und
Produkten, die die intestinale Absorption steigern (bezogen auf
die des "Bypass-Cocktails"), haben wir gezeigt,
dass wir die enzymatischen Prozesse effektiv umgehen können und
die intestinale Aufnahme der vorstehend genannten Verbindung erhöhen können, um
einen gewünschten
biologischen Effekt zu erreichen.
-
Materialien
und Methoden
-
Bypass-Cocktail Zusammensetzung
-
Die
Zusammensetzung des Bypass-Cocktails ist in Tabelle 1 gezeigt. Unbehandelte Ölsaat und
Hülsenfrüchte wurden
von lokalen Händlern
erhalten und mechanisch enthüllt.
Fischmehl, Reiskleie, Bierhefe, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat
und EDTA hatten alle Futterqualität und wurden von lokalen Händlern bezogen.
Natriumdeoxycholat und rohres Ei-Albumin wurden von Sigma Chemical
Co. (St. Louis MO) erhalten. Die Kur wurde wie gezeigt gemischt
und unter Verwendung einer 1 mm-Masche gemahlen. Tabelle
1 Bypass-Cocktail
Zusammensetzung
-
- 1 Die variierte in den Experimenten,
vgl. den Abschnitt Materialien und Methoden
-
Fisch und Fütterung
-
Eine
Serie von Experimenten unter Verwendung von zwei Lachsarten wurde
unternommen (Experiment 1: Regenbogenforelle; Experiment 2: Bachforelle).
Diese Arten wurden ausgewählt,
da sie zwei sehr gut studierte experimentelle Modelle ebenso wie
wirtschaftlich interessante kultivierte Spezien darstellen.
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Für Experiment
1 wurden Regenbogenforellen (n = 20; Anfangsgewicht = 52 g) in zylindrische
6 bis 60 Litertanks mit einem geschlossenen Wasser-Rezirkulationssystem
2 Wochen vor dem Start der Experimente gegeben. Die Wassertemperatur
wurde bei 15°C
gehalten und die Lichtperiode wurde auf 12 hL:12hD-Zyklen eingestellt.
In Experiment 2 wurden Bachforellen (n = 400; Anfangsgewicht 38
g) in zylindrische 8 bis 800 Litertanks mit einem geschlossenen
Wasser-Rezirkulationssystem 2 Wochen vor dem Beginn der Experimente gegeben.
Die Wassertemperatur wurde für
die Dauer der Experimente auf 11°C
eingestellt, die Fische wurden der natürlichen Photoperiode (schätzungsweise
14 hL:10hD) ausgesetzt. Während
beider Experimente wurde die Wasserqualität (Ammoniak, Nitrat) wöchentlich überwacht
und die Sauerstoffkonzentrationen täglich gemessen. Die Fische
wurden mit einem kommerziell erhältlichen
Futter (Corey Feed Mills Ltd. Fredericton, NB) während der Akklimatisierungsperiode
und während
der Nichtbehandlungsperioden gefüttert.
-
Experimentelle
Manipulationen
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In
Experiment 1 wurde rekombinantes Rindersomatotropin (rbST; Monsanto
Co. St Louis MO) zugegeben, um die Fische mit 20 μg/g Fisch
zu versorgen. Drei Zweifachgruppen wurden mit variierenden Stufen gefüttert, um
entweder 0 (Kontrolle), 4 oder 40 g Natriumdeoxycholat pro kg Bypass-Cocktail
zu erhalten. Im zweiten Experiment erhielten vier Duplikatbehandlungsgruppen
Futter, welches mit 0, 1, 5 oder 10 mg Deoxycholat pro kg Bypass-Cocktail
mit 20 μg
rbST/g Fisch ergänzt
war.
-
In
beiden Experimenten 1 und 2 wurden das Fischgewicht und der Futterverbrauch
auf wöchentlicher Basis
beobachtet. Die Fische wurden gewogen und daraufhin für 36 Stunden
vor der Fütterung
des Bypass-Cocktails, der bST enthält, hungern gelassen. Infolge
der Fütterung
wurde das Futter für
weitere 12 Stunden zurückbehalten.
Von diesem Punkt an wurden die Fische 2 × täglich bis nahe der Sättigung
gefüttert.
-
Ergebnisse
-
In
beiden Experimenten wurde keine behandlungsbedingte Sterblichkeit
festgestellt, was auf keine negativen gesundheitlichen Effekte des
bST oder des Bypass-Cocktails auf die Regenbogen- und Bachforellen schließen lässt. Die
Fische, die mit bST in dem Bypass-Cocktail gefüttert wurden, hatten signifikant
größere Wachstumsraten
im Vergleich zu den Kontrollen. In Experiment 1 hatten die behandelten
Fische eine durchschnittliche Steigerung der Wachstumsraten von
25%, die am schnellsten wachsenden Tanks wuchsen über 40 %
schneller als die Kontrollen (1 und 2).
In Experiment 2 zeigten die bST-behandelten Gruppen verbesserte
Wachstumsraten im Vergleich zu den Kontrollen, obwohl diejenigen
mit dem Bypass-Cocktail, der 5 g/kg Deoxycholat enthielt, die höchsten Wachstumsraten
mit einer 90%igen Steigerung der Wachstumsraten gegenüber den
Kontrollen aufwiesen (3).
-
Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel)
-
Wachstumsbeschleunigung
von Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) Intraperitoneale Injektion
von rekombinantem bovinem Wachstumshormon
-
Methode
-
Die
intraperitoneale (IP) Verabreichungsdosis pro Fisch und Woche lag
bei 20 μg
bST/g Lebendgewicht für
6 Wochen.
-
Ergebnisse
-
4 zeigt,
dass rekombinante bST injizierte IP signifikant die Zunahme des
Körpergewichts
von Regenbogenforellen induziert.
-
Beispiel 3
-
Bewertung der proteolytischen
Enzyminhibitoren vorhanden in den Nahrungsergänzungsbestandteilen
-
Extrakt Enzymprotokoll
-
Materialien
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- 1. Zentrifuge, Model Sorvall
- 2. Labormischer
- 3. Sezierbesteck (Scheren)
- 4. Zentrifugenröhrchen
- 5. Einwegküvetten
für das
Spektrometer
- 6. Mikrozentrifugenröhrchen
1,5 ml
- 7. Spektrometer
- 8. Vortexer
- 9. Mikroplattenleser von Biorad
- 10. 50 mM Tris-HCl pH = 7,5
- 11. Commassie blue Färbelösung
- 12. BSA (1 mg/ml) Standardlösung
- 13. TCA 20%
- 14. Gewebe von der Bauchspeicheldrüse und des Zwölffingerdarms
der Regenbogenforellen
- 15. 0,5% Kasein in 50 mM Tris-HCl pH = 9
- 16. 50 mM Tris-HCl+CaCl2 10 mM pH =
7,5
-
Enzymextraktion
-
- 1. Die Regenbogenforellen wurden gewogen und
geopfert.
- 2. Eine Sektion wurde vorgenommen, um den proximalen Dünndarm von
dem Fisch zu entfernen.
- 3. Nach dem Wiegen wurde das Gewebe in 50 mM Tris-HCl pH = 7,5
(1:10 w/v) homogenisiert.
- 4. Zentrifugieren bei 16.000 × g für 30 Minuten bei 4°C.
- 5. Abnahme des Überstandes,
aliquotieren (gleichmäßiges aufteilen)
und lagern bei 20°C
für spätere Verwendung.
- 6. Durchführung
Commassie Assay, um die Proteinmenge in dem Enzymextrakt zu bestimmen.
-
Commassie blue Färbeprotokoll
-
- 1. Einwiegen von 160 mg BSA in 10 ml von 50
ml Tris-HCl pH = 7,5.
- 2. Vorbereitung einer Standardkurve von BSA (0 μg/ml bis
1600 μg/ml).
- 3. Hinzufügen
von jeweils 4 μl
BSA und Enzymextrakt und Verdünnen
(1:1) des Enzymextraktes in einer 96-Lochplatte.
- 4. Hinzufügen
von 200 μl
Commassie blue.
- 5. Auslesen bei 655 nm mit einem Mikroplattenleser von Biorad.
-
Enzymatisches Protokoll:
-
Die
Experimente werden jeweils doppelt durchgeführt.
-
BLINDWERT:
-
- 1. zu 500 μl
von 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl2 pH = 7,5
Lösung
- 2. Hinzugeben von 500 μl
von TCA 20% (destilliertes Wasser) Lösung
- 3. Hinzugeben von 20 wl des Enzymextraktes
- 4. Hinzugeben von 500 μl
von Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
- 5. Inkubieren für
15 Minuten bei 4°C
(auf Eis). Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei 280
nm.
-
TEST:
-
- 1. Zu 500 μl
einer 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl2 pH = 7,5
Lösung.
- 2. Hinzufügen
von 20 μl
Enzymextrakt
- 3. Hinzufügen
von 500 μl
Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
- 4. Inkubieren für
0, 5, 10, 15 und 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- 5. Stoppen der Reaktion durch Hinzufügen von 500 μl TCA 20%.
Inkubieren für
15 Minuten bei 4°C
(auf Eis). Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei
280 nm.
-
Extraktion des Inhibitors
-
- 1. Durch Zermahlen mit der Industriemühle wird
das kommerziell erhaltene Futter in feines Pulver überführt.
- 2. Einwiegen von 250 mg des Pulvers und eingeben in 10 ml 50
mM Tris-HCl ph = 7,5 Lösung
(die Endkonzentration sollte bei 25 mg/ml liegen).
- 3. Homogenisierung der Lösung
der Handgewebemühle.
- 4. Zentrifugieren bei 2000 × g
für 10
Minuten bei Raumtemperatur*.
- 5. Aufnahme des Überstandes.
Dieser wird das Inhibitorextrakt für das enzymatische Protokoll
sein.
-
Enzymatisches Protokoll:
-
Die
Experimente werden immer 2-fach durchgeführt
-
BLANK:
-
- 1. zu 500 μl
50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl2 pH = 7,5 Lösung
- 2. Hinzugeben von 500 μl
von TCA 20% (destilliertes Wasser) Lösung
- 3. Hinzugeben der verschiedenen Volumina des Inhibitorextraktes
oder 50 mM Tris-HCl
pH = 7,5 Lösung
- 4. Hinzugeben von 10 μl
des Enzymextraktes.
- 5. Hinzugeben von 500 μl
Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
- 5. Inkubieren für
15 Minuten bei 4°C
(auf Eis). Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei 280
nm.
-
KONTROLLE:
-
- 1. zu 500 μl
einer 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl2 pH = 7,5
Lösung
- 2. Hinzugeben verschiedener Volumina von 50 mM Tris-HCl pH =
7,5 Lösung
- 3. Hinzugeben von 10 μl1
Enzymextrakt.
- 4. Inkubieren für
60 Minuten bei Raumtemperatur.
- 5. Hinzugeben von 500 μl
Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
- 6. Inkubieren für
30 Minuten bei Raumtemperatur.
- 7. Stoppen der Reaktion durch Hinzugabe von 500 μl TCA 20%.
Inkubieren für
15 Minuten bei 4°C
(auf Eis). Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei
280 nm.
-
TEST:
-
- 1. Zu 500 μl
einer 50 mM Tris-HCl+10 mM CaCl2 pH = 7,5
Lösung.
- 2. Hinzugeben der verschiedenen Volumina des Inhibitorextraktes.
- 3. Hinzugeben von 10 μl
Enzymextrakt.
- 4. Inkubieren für
60 Minuten bei Raumtemperatur.
- 5. Hinzufügen
von 500 μl
Kasein 0,5% (50 mM Tris-HCl pH = 9) Lösung
- 6. Inkubieren für
30 Minuten bei Raumtemperatur
- 7. Stoppen der Reaktion durch Hinzufügen von 500 μl TCA 20%.
Inkubieren für
15 Minuten bei 4°C
(auf Eis).
- 8. Zentrifugieren bei 12000 × g für 5 Minuten und Auslesen bei
280 nm.
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Resultate
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Die 5–12 zeigen
die Effekte der einzelnen Protease-Inhibitorkomponenten des OraljectTM Cocktails auf die proteolytische Inhibition
in vitro, ebenso wiedie Gesamtinhibition des OraljectTM Cocktails.
Die Daten sind als Grad der proteolytischen Enzyminhibition gegen
den ansteigenden Spiegel des Inhibitoreinschlusses dargestellt.
Die Daten zeigen, dass die einzelnen Bestandteile (lyophylisiertes
Ovalbumin, rote Kidneybohnen, Sojabohnen, Saubohnen, EDTA, Weizenkleie,
sprühgetrocknetes
Ovalbumin, jeweils 5–12) des
OraljectTM Cocktails die verschiedenen Inhibitionsgrade
der in vitro proteolytischen Enzymaktivität beeinflussen. Darüber hinaus
ist der Gesamtcocktail bei der Einleitung der gesamten proteolytischen Enzyminhibition
wirkungsvoll. Schließlich
wurde unter Verwendung der in 5 bis 12 generierten
Kurven der Punkt der maximalen Inhibition, ebenso wie die Konzentration
des Inhibitors, welche 50% der maximalen Inhibition liefert, extrapoliert.
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Beispiel 4
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Enzym assay für die Quantifizierung
von Meerrettichperoxidase im Blut der Regenbogenforelle
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Material
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- 1. 96 Lochplatten (ImmulonTMII
von VWR)
- 2. Mikroplattenleser von Biorad
- 3. Mikrozentrifugenröhrchen
1,5 ml
- 4. Zentrifugenröhrchen
für 15
ml oder 50 ml
- 5. TMB Tabletten
- 6. Meerrettichperoxidase Typ 1 (Sigma)
- 7. Anti-Meerrettichperoxidase von Schaf IgG (ICN)
- 8. 0,1M Carbonat-Bicarbonat pH = 9,6 Puffer
- 9. 0,1M Phosphat-Citrat pH = 5 Puffer
- 10. PBS 1X+BSA 1% + 0,5% Tween 20 Puffer
- 11. PBS 1X pH = 7,4 Puffer
- 12. Hydrogenperoxid 30%
- 13. Saranhüllen
- 14. Inkubator mit 37°C
- 15. destilliertes Wasser
- 16. Regenbogenforellen (Plasma)
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Methode
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Beschichtung der Platte
mit Antigen
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- 1. Vorlegen der 200 μl der anti-HRP aus IgG 1:1000
Verdünnungslösung (in
0,1M Carbonat-Bicarbonat pH = 9,6 Puffer) in jede Kavität einer
96 Lochplatte.
- 2. Einhüllen
der beschichteten Platte in SaranTMVerpackung
zum Versiegeln und Inkubation über
Nacht bei 4°C
für 2 Stunden
bei 37°C.
- 3. Dreimaliges Waschen der Platte mit PBS 1X pH = 7,4. Jedesmal
ausschlagen der PBS-Lösung über einem
Waschbecken und 3-maliges Waschen mit destilliertem Wasser.
- 4. Die Platten werden trockengeschlagen und bei 4°C bis zur
Verwendung gelagert.
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Blockieren der Bindekapazität der Platte
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- 1. Füllen
jeder Kavität
mit 200 μl
PBS 1X mit BSA 1% + 0,5% Tween 20 Puffer.
- 2. Inkubieren für
30 Minuten bei Raumtemperatur.
- 3. Hinzufügen
von 100 μl
der Probe enthaltend die HRP 1:10 Verdünnung in einige Kavitäten.
- 4. Hinzufügen
von 100 μl
des Standardkurvenplasmas in den weiteren Kavitäten.
- 5. Einpacken der Platte in der Saranverpackung und Inkubation
für 1 Stunde
bei 37°C.
- 6. Dreimaliges Waschen mit PBS 1X + BSA 1% + 0,5% Tween 20 Puffer.
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Standardkurvenverfahren
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- 1. Verdünnung
des Plasmas der Regenbogenforelle 1:10 mit PBS 1x pH = 7,4
- 2. Hinzufügen
der HRP, um eine Endkonzentration von 0,5 bis 8 ng/ml zu erreichen.
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Enzym assay
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- 1. Hinzufügen
von 200 μl
TMB (in 50 mM Citrat-Phosphat pH = 5 Puffer + 30% von Hydrogenperoxid)
in jeder Kavität.
- 2. Warten für
30 Minuten und Hinzufügen
von 50 μl
einer einmolaren schwefeligen Säure,
um die Farbbildung zu fixieren.
- 3. Auslesen bei 415 nm mit dem Mikroplattenleser von Biorad.
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Erlebnisse
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Ein
ELISA für
die Meerrettichperoxidase (HRP) wurde entwickelt, der es ermöglicht,
als Tracer für
die Plasma-Aufnahmestudien infolge der oralen Verabreichung verwendet
zu werden. Dieses Verfahren hat ein extrem sensitives Verfahren
zur Verfügung
gestellt, um die HRP-Aufnahme bei geringen Nachweisgrenzen von schätzungsweise
2,5 ng HRP/ml Plasma und einen linearen Bereich bis zu 8 ng/ml (13)
zu beobachten.
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Unter
Verwendung dieses Verfahrens zur Überwachung der HRP-Aufnahme
wurde eine Fischmehl-basierte Kontrollmatrix und der OraljectTMCocktail enthaltend HRP (2,5 ng/g) den
Regenbogenforellen gefüttert
und infolge der Verabreichung zu ausgewählten Zeitpunkten Blutproben
entnommen. Wie in 14 dargestellt, war die Plasmaaufnahme
von oral verabreichter HRP in der OraljectTM-Formulierung
signifikant höher
als die der Fische mit dem Kontrollfutter. Darüber hinaus wurden die Blutkreislaufkonzentrationen
von HRP nach einer Zeitdauer von 6 Stunden nach Verabreichung untersucht.
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Während die
Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen dieser beschrieben
wurde, ist zu verstehen, dass diese in Form weiterer Modifikation
durchgeführt
werden kann, und dass diese Verabreichung alle Variationen, Verwendungen
oder Anpassungen der Erfindung, die im Allgemeinen den Prinzipien der
Erfindung folgen, und derartige Richtungen der vorliegenden Erfindung,
die hierdurch zur bekannten oder anwendbaren Praxis im Stand der
Technik werden, zu dem die Erfindung beiträgt und die hieraus abgeleiteten wesentlichen
Eigenschaften einfließt,
wie es wie folgt aus dem Schutzbereich der nachfolgenden Ansprüche hervorgeht,
umfasst.