KR101045516B1 - 식물 세포벽을 구성하는 다양한 다당류를 분해하는 효소를 생산하는 클렙시엘라 속 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 세포벽을 구성하는 다당류를 분해하는 효소, 특히 카르복실메틸셀룰라제(carboxylmethylcellulase, CMCase)를 발현하는 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.) 미생물에 관한 것이다.

클렙시엘라 속, 세포벽, 카르복시메틸셀룰라제

Description

식물 세포벽을 구성하는 다양한 다당류를 분해하는 효소를 생산하는 클렙시엘라 속 미생물{Klebsiella sp. Producing Cell Wall Degrading Enzyme}

본 발명은 신규한 클렙시엘라 속 미생물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 세포벽의 다당류를 분해하는 효소를 발현하는 클렙시엘라 속 미생물에 관한 것이다.

셀룰로오스(cellulose)는 지구상에 가장 많이 존재하는 바이오매스(biomass)로, 포도당이 β-1,4-글리코시드 결합으로 이루어진 중합체로서, 식물 생체 건조 중량의 약 40% 이상을 차지하고 있으며, 이러한 셀룰로오스를 기본 구성당인 글루코오스 또는 에탄올로의 변환에 대해서 많은 연구들이 수행 중이다.

셀룰로오스 분해는 주로 박테리아와 곰팡이에 의해 생산되는 셀룰라제(cellulase)에 대해 많은 연구 수행되어지고 있다. 이러한 셀룰라제에 의한 셀룰로오스의 분해기작은 순차적인 메커니즘에 의한 상승작용이 관여함이 받아들여지고 있으며, Wood와 Eriksson은 엔도글루카나제(endoglucanase; EC 3.2.1.4), 엑소글루카나제(exoglucanase; EC 3.2.1.91) 및 β-글루코시다제(β-glucosidase; EC 3.2.1.21)가 동시에 존재할 때 이들의 상승작용에 의하여 결정형 셀룰로오스를 분해할 수 있다고 보고하였다.

이러한 글루코시다제 (glycosidases; EC 3.2.1.X)의 촉매 도메인은 아미노산 서열들의 유사성 정도에 따라 적어도 83개 이상의 그룹으로 분류 될 수 있다. 글루코실 하이드롤라제 패밀리 8(Glycosyl hydrolase family 8)의 경우, 6개의 내부와 6개의 외부의 α-헬릭스 형태를 가진 (α/α)₆ 배럴(barrel) 형태로 고차구조를 형성하는 것으로 알려져 있으며, 대략 20개 정도의 보존 영역이 존재하며 이들 중 아스파레이트 잔기가 촉매 반응에 있어서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

한편, 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.)은 그람 음성 세균으로 통성 혐기성균이며, 장내 세균과에 속하는 세균으로서 자연계에 널리 분포하며 사람의 대장 내에서 상재균총을 형성하며 상기도, 구강 등에도 존재한다. 최신의 Bergey's Manual of Sysmenatic Bacteriolgy에 따르면 16S rDNA와 rpoB 유전자의 계통발생학적(phylogenetic) 분석에 의해 클렙시엘라(Klebsiella) 속은 K. pneumoniae, K. oxytoca, K. terrigena 및 K. planticola로 크게 4개의 종으로 구분한다. 이들 중 K. pneumoniae 종은 다시 K. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. pneumoniae subsp. ozaenae, K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis의 3개의 아종으로 다시 분류하였다.

그런데 현재까지 클렙시엘라 속 미생물이 세포벽 다당류를 분해하는 효소를 생산할 수 있다는 것은 알려져 있지 않다.

본 발명자는 토양으로부터 세포벽 다당류를 분해하는 균주를 분리한 후 이들 균주 중에서 강력한 CMCase를 생산하는 신규한 클렙시엘라 속 균주를 분리하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 세포벽의 다당류를 분해하는 효소를 발현하는 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.) 미생물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 세포벽의 다당류 (즉, 세포벽을 구성하는 다당류)를 분해하는 효소를 생산하는 클렙시엘라 속 미생물은 토양으로부터 분리한 것이다.

구체적으로 토양으로부터 채취한 균주들을 카르복실메틸셀룰로오스(carboxylmethylcellulose, CMC), 키틴, 전분 또는 자일란(xylan)으로 이루어진 기질이 첨가된 평판배지에 접종하여 배양한 후 콩고 레드(Congo red) 또는 KI/I₂ 용액으로 염색하여 시각화한 후 균주 주변에 투명환이 나타난 균주를 선별하였다. 그 균주들 중에서 CMC 분해(즉, CMCase) 활성이 우수한 균주를 선별하였다. 이와 같이 분리된 CMCase 활성이 우수한 균주는 CMC 뿐만 아니라 키틴, 전분 및 자일란 도 모두 분해할 수 있다.

상기 분리 균주에 대하여 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과, Klebsiella pneumoniae와 99% 이상의 상동성을 나타내는 등 클렙시엘라 속의 여러 종들과 높은 상동성을 나타내었다(도 1a). 그래서, 16S rDNA와 함께 미생물의 유전학적 진화를 비교 분석하는데 사용되는 RNA polymerase B subunit를 코딩하는 rpoB 유전자를 이용하여 세부 동정을 실시하였다. 그 결과, Klebsiella pneumoniae (U77444, AF129445, AF129446) 및 K. granulomatis (AF218573)와 각각 99% 정도의 상동성을 나타내었으며, K. oxytoca (AF129442), K. planticola (AF129449), K. trevisanii (AF129450), K. ornithinolytica (AF129447)와는 각각 94%의 상동성을 나타내었으며, K. terrigena (AF129448)와는 93%의 상동성을 나타내었다. 그리고 예상외로 Citrobacter freundii (U77434)와도 96%의 상동성을 나타내었다(도 1b). 이러한 결과를 토대로 하여 분리 균주를 "Klebsiella sp. Sc"라고 명명하였다. 그리고, 상기 균주를 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)(대한민국 경기도 수원시 권선구 서둔동 225번지)에 2008년 9월 16 일자로 기탁하고 기탁번호 KACC 91407P를 부여받았다.

이어서, shut-gun 방법을 이용하여 상기 분리 균주의 게놈 라이브러리를 구축하고, 그로부터 CMCase 유전자를 분리하였다(도 2).

분리 균주의 CMCase 유전자는 37,666 Da의 분자량을 가지는 333개의 아미노산을 암호화하는 1,002개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. CMCase는 N-말단 영역에 23개의 아미노산으로 이루어진 신호서열을 가지고 있으며 23번째의 Ala과 24번 째의 Asp 사이가 절단되는 것으로 SignalP (http://www.csb.dtu.dk/services/signalP/) 사이트를 통해서 예측하였다. 상기 CMCase의 아미노산 서열을 분석한 결과 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8에 속하는 단백질로 밝혀졌다. 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8(gylcosyl hydrolase family 8)의 경우에는 A-[ST]-D-[AG]-D-X(2)-[IM]-A-X-[SA]-[LIVM]-[LIVMG]-X-A-X(3)-[FW]와 같은 보존 영역이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 분리 균주의 CMCase에서는 A-S-D-G-D-T-L-I-A-W-A-L-L-R-A-Q-K-Q-W와 같은 형태로 보존 영역이 존재하였다(도 3). 대략 20개의 보존 영역에는 두 개의 보존된 아스파르테이트 (aspartate, D, 110)가 존재하며, 첫 번째 아스파르테이트의 경우 친핵체(nucleophile)로서 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8의 촉매 반응에 있어서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 53번째 아미노산인 글루타메이트 (glutamate, E)는 양성자 공여자로 효소 반응에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따른 균주의 CMCase는 단독으로 또는 다른 효소와 조합하여 식품 산업에서, 예를 들면 야채 또는 과일 주스 제조와 같은 식물 세포 물질의 액상화(liquefaction)를 위하여 또는 멤브레인의 막힘을 감소시키기 위한 가공 보조물로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 균주의 CMCase는 사료 산업에도 이용될 수 있다. 일례로 세포벽을 분해하고 다양한 종류의 곡물의 점도를 감소시킴으로써 사료의 이용 효율을 높이기 위하여 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 균주의 CMCase는 세제 산업에서, 예를 들면 세제 조성물에 이용될 수 있다. 세제 조성물은 가루, 액체와 같은 통상적인 형태로 제형화될 수 있다. 세제 조성물은 하나 이상의 다른 효소와 빌더(builder), 표백제, 향수와 같은 다른 공지 성분들을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 클렙시엘라 속 균주는 키틴, 전분 및 자일란 뿐만 아니라 카르복실메틸셀룰로오스를 분해할 수 있다. 이는 본 발명의 클렙시엘라 속 균주가 카르복실메틸셀룰라제(CMCase)를 생산하기 때문이다.

본 발명에 따른 균주의 CMCase는 식품, 사료, 세제, 섬유, 제지 산업 등 여러 산업 분야에서 이용될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1: 유용효소 생성 균주의 분리>

식물 세포벽 분해 관련 효소의 생산 균주의 분리를 위하여 부산 인근의 토양을 채취하여 시료로 사용하였으며, 배양 배지로 LB, R2A, M9 배지를 사용하였다. 여기서, LB 배지는 폴리펩톤 10 g/l, 효모 추출물 5 g/l, NaCl 5 g/l에 탄소원으로 글루코오스 1 g/l을 첨가하였으며, R2A 배지는 효모 추출물 0.5 g/l, 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 0.5 g/l, 카스아미노산(casamino acids) 0.5 g/l, 글루코오스 0.5 g/l, 용해성 전분(soluble starch) 0.5 g/l, Na-피루베이트 0.3 g/l, K₂HPO₄ 0.3 g/l, MgSO₄ · 7H₂O 0.05 g/l이고, M9의 배지조성은 Na₂HPO₄ 6 g/l, K₂HPO₄ 3 g/l, NH₂Cl 1 g/l, NaCl 0.5 g/l와 같다.

분리 균주의 세포벽 분해 관련 효소의 생산 여부를 확인하기 위해서 평판배지확산 (agar-diffusion) 방법을 이용하여 확인하였다. 각 시험의 기질로 CMC(carboxylmethylcellulose), 교질 키틴(colloidal chitin), 로거스트콩검(locust bean gum), 용해 전분(soluble starch) 및 자일란(xylan) 등을 사용하였다. 각각의 기질은 대략 0.5%가 되게 평판배지에 첨가하였다. 상기 기질이 첨가된 평판배지에 균을 접종한 뒤 37℃에 2일 동안 배양하였다. 그 후, 콩고 레드 또는 KI/I₂ 용액으로 염색한 후 콩고 레드로 염색한 배지는 다시 NaCl로 탈색하여 균주 주변으로 투명환(clear zone)이 나타나는 균주를 골라서 다시 각각의 기질을 분해하는 능력을 판별하였다.

식물 세포벽 분해에 관여하는 여러 효소를 생산하는 100여 종의 균주를 분리하여 그 중 CMCase(carboxyl methyl cellulase) 활성이 우수한 균주를 2종 선별하 여 'Sc'라고 명명하였다. 분리 균주 Sc는 CMC 뿐만 아니라, 용해성 전분, 용해성 키토산, 자일란 등을 분해하는 것으로 관찰되었다.

<실시예 2: 균주의 염색체 DNA 분리>

선별 균주의 동정 및 게놈 라이브러리 구축을 위하여 선별 균주의 염색체 DNA를 다음과 같이 분리하였다. 염색체 DNA를 얻기 위하여 전배양(pre-culture)한 균주를 LB 배지 3 ml에 접종하여 진탕 배양기내에 37℃에서 4~6시간 동안 배양하였다. 배양된 균주를 집균하여 1×TEN 완충용액 (Tris-HCl, EDTA, NaCl)으로 세척하였다. 500㎕ SET 완충용액 (20% sucurose, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH7.6], 1 mg/ml lysozyme)으로 현탁하고, 37℃에서 10분 동안 정치한 후에 프로테아제 K (protease K, 20 mg/ml)를 소량 첨가하였다. 동시에 SDS를 최종 1%가 되도록 첨가하여 37℃에서 30분간 세포를 용균하고, 6 M NaCl을 첨가한 후 페놀로 정제하였다. 페놀로 정제한 시료는 99% 에탄올로 침전시켜 (-70℃에서, 10분 동안) 염색체 DNA를 회수하였다.

<실시예 3: 16S rDNA와 rpoB 유전자를 이용한 계통도 분석>

16S rDNA와 rpoB (RNA polymerase B subunit) 유전자는 PCR법을 통해서 획득하였다. 16S rDNA를 증폭하기 위해서 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (위치 9~27; E. Coli 16S rDNA; 서열번호: 1), 5'-A GAAAGGAGGTGATCCAGCC-3' (위치 1,542~1,525; E. Coli 16S rDNA; 서열번호: 2)를 이 용하였으며, rpoB 유전자의 증폭을 위해서 두 개의 프라이머 5'-AACCAGTTCCTCGTTGGCCTGG-3'(서열번호: 3), 5'-CCTGAACAACACGCTCGGA-3'(서열번호: 4)를 사용하였다. 두 종류의 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 수행방법은 다음과 같다. 초기 변성 단계는 95℃ 1분을 시작으로 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 수행하고 최종 72℃에 10분간 신장 단계를 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물은 pGEM T-easy vector (Promega사, USA)속에 재조합하였다. 분리 균주의 16S rDNA와 rpoB 유전자의 염기서열을 결정한 다음 GenBank 데이터베이스에서 상동성을 비교하였으며, 유사 종들과의 유전학적인 유연관계를 알아보기 위하여 ClustalX 프로그램을 이용하여 계통발생학적 트리(phylogenetic tree)를 제작하였다.

도 1a에 나타낸 바와 같이 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과, 분리 균주 Sc의 경우 클렙시엘라(Klebsiella pneumoniae)와 99% 이상의 상동성을 나타내는 등 클렙시엘라 속의 여러 종들과 높은 상동성을 나타내었다. 그래서 RNA polymerase B subunit를 코딩하는 rpoB 유전자를 이용하여 세부동정을 실시하였다. rpoB 유전자는 16S rDNA와 함께 미생물의 유전학적 진화를 비교 분석하는데 사용되는 것으로 알려져 있다. 그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 Klebsiella pneumoniae (U77444, AF129445, AF129446) 및 K. granulomatis (AF218573)와 각각 99% 정도의 상동성을 나타내었으며, K. oxytoca (AF129442), K. planticola (AF129449), K. trevisanii (AF129450), K. ornithinolytica (AF129447)와는 각각 94%의 상동성을 나타내었으며, K. terrigena (AF129448)와는 93%의 상동성을 나타내었다. 그리고 특이하게 Citrobacter freundii (U77434)와도 96%의 상동성을 나타내었다. 이러한 실험 결과를 토대로 하여 분리 균주를 "Klebsiella sp. Sc"라고 명명하였다. 그리고, 상기 균주를 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)(대한민국 경기도 수원시 권선구 서둔동 225번지)에 2008년 9월 16 일자로 기탁하고 기탁번호 KACC 91407P를 부여받았다.

<실시예 4: 분리 균주의 Shot-gun 방법을 이용한 게놈 라이브러리의 구축>

준비된 분리 균주의 게놈 DNA를 제한효소 PstI (5′-CTGCAG-3′)을 이용하여 부분 절단한 후, 0.6% 아가로스 겔에 전기 영동하여 대략 1~5 kb 정도의 단편들을 회수하였다. 회수한 DNA 단편들은 제한효소 PstI과 CIAP(calf intestine alkaline phophatase)로 처리된 pUC118 플라스미드에 재조합되어졌다. 재조합된 플라스미드는 다시 E.coli JM109에 형질전환하였으며, 형질전환된 균주는 37℃에서 앰피실린(50 ㎍/ml)과 0.5% CMC가 함유된 LB 고체배지에 배양하였다. 2일 배양 후, 0.5% 콩고 레드로 염색하여 1M NaCl로 탈색하였을 때 CMC가 분해되어 투명환이 형성되는 균주를 생산하는 재조합 균주 (pSCMC)로 선별하였으며 염기서열을 분석하였으며, GenBank 데이터베이스에서 기존에 밝혀진 여러 유사 단백질 서열을 수집하여 MacVector 6.5의 CLUSTAL W program (Oxford Molecular Group)을 이용하여 각각의 단백질들의 상동성을 비교 분석하였다.

콜로니 주변에 오렌지색의 존을 나타내는 클론을 CMC를 분해하는 효소를 생산하는 재조합체로 선별하였다. 대략 2,000개의 앰피실린 저항성 콜로니들 중에서 오직 하나의 콜로니만이 오렌지색의 존을 나타내었다(도 2). 이 재조합체를 분석 한 결과, 분리 균주 Sc의 CMCase 유전자는 37,666 Da의 분자량을 가지는 333개의 아미노산(서열번호: 6)을 암호화하는 1,002개의 뉴클레오티드(서열번호: 5)로 구성되어 있었다. CMCase는 N-말단 영역에 23개의 아미노산으로 이루어진 신호서열을 가지고 있었으며 23번째의 Ala과 24번째의 Asp 사이가 절단되는 것으로 SignalP (http://www.csb.dtu.dk/services/signalP) 사이트를 통해서 예측하였다. 상기 CMCase의 아미노산 서열을 분석한 결과 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8에 속하는 단백질로 밝혀졌다. 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8 경우에는 A-[ST]-D-[AG]-D-X(2)-[IM]-A-X-[SA]-[LIVM]-[LIVMG]-X-A-X(3)-[FW]와 같은 보존 영역이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 분리 균주 Sc의 CMCase에서는 A-S-D-G-D-T-L-I-A-W-A-L-L-R-A-Q-K-Q-W(서열번호: 7)와 같은 형태로 보존 영역이 존재하였다(도 3). 대략 20개의 보존 영역에는 두 개의 보존된 아스파르테이트 (aspartate, D, 110)가 존재하며, 첫 번째 아스파르테이트의 경우 친핵체(nucleophile)로서 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8의 촉매 반응에 있어서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 53번째 아미노산인 글루타메이트 (glutamate, E)는 양성자 공여자로 효소 반응에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

분리 균주 Sc의 엔도글루카나제와 기존에 밝혀진 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8에 속하는 세균 유래의 14개의 단백질들과의 상동성을 분석하였다(표 1). Cellulomonas uda (CELUD)와 95%의 identities와 97%의 positives(유사성)를 나타내었으며, Erwinia chrysanthemi (DICD3)와는 58%와 72%를 나타내었으며, Acetobacter xylinus (ACEXY)와는 37%와 56%, Salmonella typhi (SALTI)와 S. typhimurium (SALTY)와는 각각 33%와 47%, Escherichia coli (ECO57, ECOLI)와는 각각 31%와 47%, Clostridium thermocellum (CLOTH)와는 30%와 45%, Xanthomonas axomopodis (XANAC)와는 29%와 42%, Pseudomonas fluorescens (PSEFL)와는 28%와 45%, Bacillus circulans (BACCI)와는 28%와 46%, Bacillus sp. KSM-330과는 27%와 42%, Clostridium josui (CLOJO)와는 28%와 42%, C. cellulyticum (CLOCE)와는 27%와 41%를 나타내었다. 이 결과를 미루어 보아 기존에 밝혀진 많은 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8 유래의 단백질들과는 많은 차이를 보이는 것으로 분석되었다.

<실시예 5: GST-친화 크로마토그래피를 이용한 정제를 위한 재조합 플라스미드의 구축>

글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST) 융합 단백질을 구축하기 위하여 바이오니아사에서 합성한 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 사용하였다. 이 프라이머들은 GST 융합 단백질을 생산하는 발현 벡터인 pGEX-6P-1에 쉽게 클로닝하기 위해서 프라이머 내부에 제한효소 EcoRI과 XhoI의 자리를 삽입하였다. PCR 반응액 50㎕ 속에는 100 pmol의 프라이머, 200 ng의 주형 DNA, 20 mM의 각각의 dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)와 1.0 U의 Taq DNA 폴리머라제를 함유하였다. 증폭 과정은 다음 단계를 30회 반복하였다: 전변성을 95℃에서 60초간 실시한 후, 변성 95℃에서 60초, 어닐링 55℃에서 60초, 신장 72℃에서 90초를 30회 반복하였으며, 이후 마지막 신장 반응으로 72℃에서 10분간 실시하였다. 증폭된 DNA 단편은 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 처리한 후, EcoRI과 XhoI을 처리하고 5'-인산기가 제거된 pGEX-6P-1 벡터에 재조합하였다. 그 결과, GST-CMCase 융합 플라스미드인 pGESCMC를 구축 하였다.

<실시예 6: 재조합 단백질 CMCase의 정제>

GST-CMCase 융합 플라스미드를 가진 E.coli BL21 (DE3)은 지수 성장기의 초기에 0.1 mM의 IPTG를 첨가하여 과발현을 유도하였으며, 이후 37℃에서 3시간정도 더 배양하였다. 세포는 4℃, 6,000 rpm에서 15분간 원심분리를 통해서 집균하였으며, 1X PBS 버퍼 (10X PBS를 희석사용: 1.4 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ [pH 7.3])를 이용하여 세척하였으며, 1X PBS를 이용하여 재현탁하였다. 세포는 초음파로 처리하여 파쇄하였으며, 그 상등액은 4℃, 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 수집하였다. 상등액은 1X PBS로 평형화되어있는 GSTrap FF 컬럼에 통과시킨 후, 10 mM 환원된 글루타치온을 이용하서 용출하였다. 용출 속도는 분당 1 ml의 속도를 유지하였다. 용출된 분획물은 PreScission 절단 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT [pH 7.0])으로 투석하고 Amicon Ultra-4를 이용하여 농축하였다. 농축된 GST-CMCase 융합 단백질은 PreScission 프로테아제를 이용하여 5℃에서 12시간동안 반응시켜 GST 영역을 제거하였다. 이 분리된 단백질들은 다시 GSTrap FF 컬럼에 다시 통과시켜 컬럼에 결합하지 않은 단백질들을 회수하여 정제한 단백질로 사용하였다. 대량 발현된 단백질들은 SDS-PAGE를 통해서 발현의 유무를 확인한 뒤, 고체 배지위에서 활성의 유무를 확인하였다(도 4).

<실시예 7: 효소 활성 측정>

CMCase의 효소 활성은 CMC로부터 생산되어지는 환원당의 양에 의해서 측정하였다. 반응액의 조성은 0.5% CMC 50㎕, 1X PBS 100㎕와 CMCase (1㎍)을 첨가하였으며 최종 반응액을 250㎕로 맞추었다. 반응액은 50℃에서 30분 동안 반응시켰으며 정지 반응을 위해서 100℃에서 10분간 끓인 다음, 원심분리를 시행하고 DNS 시약을 첨가하여 환원당량을 측정하였다. 효소 활성(U)은 분당 1μmol의 환원당을 생산하는데 필요한 효소의 량으로 정의하였다.

정제 단백질을 이용하여 최적 온도와 pH를 측정하였으며, 이는 각각 55℃와 7.2였다. 그리고 CMC, 아비셀(avicel)과 자일란을 이용하여 정제된 CMCase의 기질 특이성을 측정하였다(표 2). 아비셀은 β-1,4-글루칸의 형태로 이루어져 있으며, 글리코실 하이드롤라제 패밀리 8의 경우 셀룰로오스를 분해할 뿐만 아니라, 자일란을 분해하는 특징을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. Klebsiella sp. Sc에서 분리한 CMCase의 기질 분해 특성을 분석한 결과에서도 CMC를 기질로 이용하였을 때 가장 높은 활성을 나타내었으며, 이를 기준으로 avicel은 대략 84%, 자일란은 대략 80%의 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

도 1a는 16S rDNA를 기반으로 본 발명에 따른 균주의 계통도를 나타낸 것이다.

도 1b는 rpoB를 기반으로 본 발명에 따른 균주의 계통도를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 균주로부터 게놈 라이브러리를 구축하는 전략을 간략하게 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 균주 유래 CMCase와 다른 균주의 글리코실 하이드롤제 패밀리 8의 아미노산 서열을 배열한 것이다.

도 4는 GST 융합 시스템을 이용하여 정제된 본 발명의 균주 유래 CMCase를 나타낸 것이다(레인 1: 마커 단백질, 2: 용해 분획물, 3:GST-CMCase 융합 단백질. 4: PreScission Protease에 의해 소화된 정제 단백질).

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Klebsiella sp. Producing Cell Wall Degrading Enzyme <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agaaaggagg tgatccagcc 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaccagttcc tcgttggcct gg 22 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cctgaacaac acgctcgga 19 <210> 5 <211> 1795 <212> DNA <213> Klebsiella sp. <220> <221> CDS <222> (72)..(1070) <220> <221> sig_peptide <222> (72)..(140) <400> 5 ctgcagcgtg agcgggtgtt ctccgtctct gacgttcagt ttctctacta ccatccataa 60 agagtgaatt t atg ccc ctg cgt gct tta gtg gcg gtg ata gtg 104 Met Pro Leu Arg Ala Leu Val Ala Val Ile Val 1 5 10 aca acg gta gtg atg ctg gtg ccc agg gcg tgg gcg gat acg gcc tgg 152 Thr Thr Val Val Met Leu Val Pro Arg Ala Trp Ala Asp Thr Ala Trp 15 20 25 gag cgc tat aag gcc cgt ttt atg atg ccg gat ggt cgt atc att gat 200 Glu Arg Tyr Lys Ala Arg Phe Met Met Pro Asp Gly Arg Ile Ile Asp 30 35 40 acc gcc aat ggc aat gtg tcg cat acg gaa ggt cag ggc ttc gcc atg 248 Thr Ala Asn Gly Asn Val Ser His Thr Glu Gly Gln Gly Phe Ala Met 45 50 55 ctc ctg gcg gtg gcg aat aac gat cgt ccg gcg ttc gac aag ctg tgg 296 Leu Leu Ala Val Ala Asn Asn Asp Arg Pro Ala Phe Asp Lys Leu Trp 60 65 70 75 cag tgg acg gac aac acc ctg cgc aac aag tct aac ggg ctg ttt tac 344 Gln Trp Thr Asp Asn Thr Leu Arg Asn Lys Ser Asn Gly Leu Phe Tyr 80 85 90 tgg cgc tat aac ccg gtg gcg ccg gac cct atc gcc gat aaa aac aac 392 Trp Arg Tyr Asn Pro Val Ala Pro Asp Pro Ile Ala Asp Lys Asn Asn 95 100 105 gcc tcc gat ggc gat acc ctg atc gcc tgg gcg ctg ctg cgc gcg caa 440 Ala Ser Asp Gly Asp Thr Leu Ile Ala Trp Ala Leu Leu Arg Ala Gln 110 115 120 aaa cag tgg cag gat aag cgc tat gcg att gcc tct gac gcc atc acc 488 Lys Gln Trp Gln Asp Lys Arg Tyr Ala Ile Ala Ser Asp Ala Ile Thr 125 130 135 gcc gcc ctg ctg aag tct acg gtg gtg act ttc gcc ggt cgc cag gtg 536 Ala Ala Leu Leu Lys Ser Thr Val Val Thr Phe Ala Gly Arg Gln Val 140 145 150 155 atg ctc ccg ggc gtg aaa ggg ttc aac ctc aat gat cac ctg aac ctt 584 Met Leu Pro Gly Val Lys Gly Phe Asn Leu Asn Asp His Leu Asn Leu 160 165 170 aac cct tcc tat ttc atc ttc ccg gcc tgg cgc gcc ttc gcg gag cgg 632 Asn Pro Ser Tyr Phe Ile Phe Pro Ala Trp Arg Ala Phe Ala Glu Arg 175 180 185 acg cat ctc acc gcc tgg cgg aca ttg cag agc gac gga cag gcg ctg 680 Thr His Leu Thr Ala Trp Arg Thr Leu Gln Ser Asp Gly Gln Ala Leu 190 195 200 ctg ggg cag atg ggc tgg ggg aaa tct cat cta ccc agc gac tgg gtg 728 Leu Gly Gln Met Gly Trp Gly Lys Ser His Leu Pro Ser Asp Trp Val 205 210 215 gcg ctg cgg gcg gat ggc aag atg ctg cca gcc aaa gag tgg ccg ccg 776 Ala Leu Arg Ala Asp Gly Lys Met Leu Pro Ala Lys Glu Trp Pro Pro 220 225 230 235 cgg atg agt ttc gat gcg atc cgt atc ccg ctg tat ctc tcg tgg gcc 824 Arg Met Ser Phe Asp Ala Ile Arg Ile Pro Leu Tyr Leu Ser Trp Ala 240 245 250 gat ccg cac agc gcc ttg ctc gcg ccc tgg aag gcc tgg atg cag agt 872 Asp Pro His Ser Ala Leu Leu Ala Pro Trp Lys Ala Trp Met Gln Ser 255 260 265 tac ccg cgc ctg caa acc ccg gcg tgg atc aac gtc agc acc aac gag 920 Tyr Pro Arg Leu Gln Thr Pro Ala Trp Ile Asn Val Ser Thr Asn Glu 270 275 280 gtg gcc ccc tgg tat atg gcc ggc ggc ctg ctg gcg gtg cgc gat ctg 968 Val Ala Pro Trp Tyr Met Ala Gly Gly Leu Leu Ala Val Arg Asp Leu 285 290 295 acg ctg ggt gaa ccg cag gag gcg ccg cag att gac gac aag gat gat 1016 Thr Leu Gly Glu Pro Gln Glu Ala Pro Gln Ile Asp Asp Lys Asp Asp 300 305 310 315 tat tac tct gcc agc ctc aag ctg ttg gtc tgg ctg gcg aaa cag gat 1064 Tyr Tyr Ser Ala Ser Leu Lys Leu Leu Val Trp Leu Ala Lys Gln Asp 320 325 330 cag cgc taaatacggt gattgatttg ccgccttccc cgcccgtatg cctgcgggct 1120 Gln Arg gagaaggtgg aatgggaacg tctcacgatg taaggccgcc aacataggcg gccttgtcgc 1180 ttattgcgga taaggcaccc agctaccgcc attcagctgg acataaggct tgccctgata 1240 ctggatgacg atggcgttgg cgttctcgga taccgccgcg ctctgcggca ggttggcgac 1300 atactgctgc cagttgacgc tgtcctcgct gaacattttg ccgtcgaggg cgcgcaccac 1360 cagctccgac accgccagat aactgctggg ctgatcgatg ataatcggcg ccccttcatg 1420 cggcgccttc atgccgaaga atttcaccgc cgtcgggacg ttagtgatcg acgggctcgg 1480 gatatcgcgc aggccagaga cctgcatctt atcgcccttc agcgcgccgc cgtgttccgg 1540 caccaccacc accatcactt tccgccccga tttctccagc tcggtgaaga agttatccag 1600 gtcatcaaac agcttctgcg cccgcacttt gtagtctgcg gttttgcttt gtcccgggaa 1660 gtggttgccg tcatgcagcg gcagggtgtt atagaaggtg gcgttccgcg gattgctgct 1720 ggcctcttcg gtcttcagcc agcggttgag gaccgccaga tcctcataca ccggggagcc 1780 gtcaaacgcc tgcag 1795 <210> 6 <211> 333 <212> PRT <213> Klebsiella sp. <400> 6 Met Pro Leu Arg Ala Leu Val Ala Val Ile Val Thr Thr Val Val Met 1 5 10 15 Leu Val Pro Arg Ala Trp Ala Asp Thr Ala Trp Glu Arg Tyr Lys Ala 20 25 30 Arg Phe Met Met Pro Asp Gly Arg Ile Ile Asp Thr Ala Asn Gly Asn 35 40 45 Val Ser His Thr Glu Gly Gln Gly Phe Ala Met Leu Leu Ala Val Ala 50 55 60 Asn Asn Asp Arg Pro Ala Phe Asp Lys Leu Trp Gln Trp Thr Asp Asn 65 70 75 80 Thr Leu Arg Asn Lys Ser Asn Gly Leu Phe Tyr Trp Arg Tyr Asn Pro 85 90 95 Val Ala Pro Asp Pro Ile Ala Asp Lys Asn Asn Ala Ser Asp Gly Asp 100 105 110 Thr Leu Ile Ala Trp Ala Leu Leu Arg Ala Gln Lys Gln Trp Gln Asp 115 120 125 Lys Arg Tyr Ala Ile Ala Ser Asp Ala Ile Thr Ala Ala Leu Leu Lys 130 135 140 Ser Thr Val Val Thr Phe Ala Gly Arg Gln Val Met Leu Pro Gly Val 145 150 155 160 Lys Gly Phe Asn Leu Asn Asp His Leu Asn Leu Asn Pro Ser Tyr Phe 165 170 175 Ile Phe Pro Ala Trp Arg Ala Phe Ala Glu Arg Thr His Leu Thr Ala 180 185 190 Trp Arg Thr Leu Gln Ser Asp Gly Gln Ala Leu Leu Gly Gln Met Gly 195 200 205 Trp Gly Lys Ser His Leu Pro Ser Asp Trp Val Ala Leu Arg Ala Asp 210 215 220 Gly Lys Met Leu Pro Ala Lys Glu Trp Pro Pro Arg Met Ser Phe Asp 225 230 235 240 Ala Ile Arg Ile Pro Leu Tyr Leu Ser Trp Ala Asp Pro His Ser Ala 245 250 255 Leu Leu Ala Pro Trp Lys Ala Trp Met Gln Ser Tyr Pro Arg Leu Gln 260 265 270 Thr Pro Ala Trp Ile Asn Val Ser Thr Asn Glu Val Ala Pro Trp Tyr 275 280 285 Met Ala Gly Gly Leu Leu Ala Val Arg Asp Leu Thr Leu Gly Glu Pro 290 295 300 Gln Glu Ala Pro Gln Ile Asp Asp Lys Asp Asp Tyr Tyr Ser Ala Ser 305 310 315 320 Leu Lys Leu Leu Val Trp Leu Ala Lys Gln Asp Gln Arg 325 330 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> conserved region of CMCase <400> 7 Ala Ser Asp Gly Asp Thr Leu Ile Ala Trp Ala Leu Leu Arg Ala Gln 1 5 10 15 Lys Gln Trp

Claims (3)

1. 식물 세포벽의 다당류를 분해하는 효소를 발현하고 기탁번호가 KACC 91407P인 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.) 미생물.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 효소는 카르복실메틸셀룰라제이고, 서열번호: 6에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 클렙시엘라 속 미생물.
3. 삭제

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