JP5547688B2 - サーモスポロスリックス・ハザケンシスに由来する新規セルラーゼ - Google Patents

Description

本発明は、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）に由来する新規セルラーゼに関する。より詳細には、本発明は、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）ＳＫ２０−１^Ｔ株（ＪＣＭ １６１４２Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８８１Ｔ）に由来する新規セルラーゼに関する。

セルラーゼとは、セルロースを、グルコース、セロビオースおよびセロオリゴ糖に加水分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式により、エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼなどに分類される。セルラーゼのこれら酵素の相互作用により、セルロースが最終的にグルコースまで分解される。

一方、近年、セルラーゼを用いて、バイオマス資源を酵素分解、糖化することによって構成単位であるグルコース、キシロースにし、更にこれを発酵することによって得られるエタノールや乳酸などを液体燃料もしくは化学原料として利用することが検討・注目されている。

しかしながら、従来的に利用されているセルラーゼによるセルロース分解の速度は充分ではなく、特にエタノール、塩などの存在下においては、セルラーゼの活性は低下するために、効率的且つ経済的にバイオマス資源を酵素分解、糖化することが可能なセルラーゼが求められていた。

サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）は、クロロフレクサス門クテドノバクテリア綱クテドノバクテル目に属する細菌であり、好気性のグラム陽性細菌である。本発明者らにより、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）ＳＫ２０−１^Ｔ株（ＪＣＭ １６１４２Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８８１Ｔ）が単離され、セルロース、キシラン、キチンを分解する能力を有することが示されている（非特許文献１）。しかしながらこれまでに、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）に由来するセルラーゼが取得されたという報告はない。

Ｓｈｕｈｅｉ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０），６０，１７９４−１８０１

本発明は、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）に由来する新規セルラーゼを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）ＳＫ２０−１^Ｔ株（ＪＣＭ １６１４２Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８８１Ｔ）より、新規セルラーゼを見いだし、本発明を完成するに至った。

本発明は以下を包含する。
［１］ 少なくともβ−グルカン、可溶性セルロース、結晶性セルロース、リン酸膨張セルロース、およびキシランに対して酵素活性を有する、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）に由来するセルラーゼ。
［２］ サーモスポロスリックス・ハザケンシスが、サーモスポロスリックス・ハザケンシスＳＫ２０−１^Ｔ株（ＪＣＭ １６１４２Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８８１Ｔ）である、［１］のセルラーゼ。
［３］ 少なくとも１０〜８０℃の温度条件下において、酵素活性を保持する、［１］または［２］のセルラーゼ。
［４］ 少なくともｐＨ２〜１１のｐＨ条件下において、酵素活性を保持する、［１］または［２］のセルラーゼ。
［５］ 少なくとも０〜２５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒の存在下において、酵素活性を保持する、［１］または［２］のセルラーゼ。
［６］ 有機溶媒がトルエン、アセトン、クロロホルム、ブタノール、ヘキサンおよびＤＭＳＯからなる群から選択される、［５］のセルラーゼ。
［７］ 少なくとも０〜５０％（ｖ／ｖ）のエタノールの存在下において、酵素活性を保持する、［１］または［２］のセルラーゼ。
［８］ 少なくとも０〜２５％（ｖ／ｖ）の塩存在下において、酵素活性を保持する、［１］または［２］のセルラーゼ。
［９］ 以下のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含む加水分解酵素からなる群から選択される一または複数の加水分解酵素を含む、［１］〜［８］のいずれかのセルラーゼ：
（Ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＩ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＩＩ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号３に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＶ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号４に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｖ）配列番号５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号５に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；ならびに
（ＶＩ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド。

［１０］ ［１］〜［９］のいずれかのセルラーゼをコードするポリヌクレオチド。
［１１］ ［１０］のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１２］ ［１１］の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
［１３］ ［１１］の形質転換体の培養によって得られる培養物。
［１４］ ［１］〜［９］のいずれかのセルラーゼまたは［１３］の培養物を含む、洗剤組成物。
［１５］ 炭水化物含有原料を［１］〜［９］のいずれかのセルラーゼ、［１２］の形質転換体または［１３］の培養物で処理することを含む、炭水化物含有原料の糖化方法。
［１６］ 炭水化物含有原料を［１］〜［９］のいずれかのセルラーゼ、［１２］の形質転換体または［１３］の培養物で処理することを含む、食品または飼料の製造方法。
［１７］ （i）炭水化物含有原料を［１］〜［９］のいずれかのセルラーゼ、［１２］の形質転換体または［１３］の培養物で処理すること；ならびに
（ii）工程（i）で得られた処理物を発酵することを含む、エタノールの製造方法。

本発明によれば、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）、特にサーモスポロスリックス・ハザケンシスＳＫ２０−１^Ｔ株（ＪＣＭ １６１４２Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８８１Ｔ）に由来する新規セルラーゼを提供することができる。

図１はＧＨ５−１のアミノ酸配列および当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 図２はＧＨ５−２のアミノ酸配列および当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 図３はＧＨ５−３のアミノ酸配列および当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 図４−１はＧＨ９のアミノ酸配列を示す。 図４−２はＧＨ９のアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 図５はＧＨ１２−１のアミノ酸配列および当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 図６はＧＨ１２−２のアミノ酸配列および当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 図７は、各種基質に対するＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の酵素活性を示す特性図である。表中、ＮＤは未検出を示し、酵素処理後の基質溶液の黄色が濃い場合を「＋＋」、薄い場合を「＋」として相対的に評価した。なお、１分間あたりに還元糖（ＤＲＳ）を１μｍｏｌ生成させる酵素量を１ユニット（Ｕ）とする。 図８は、反応温度によるＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の酵素活性の影響を示す特性図である。各酵素について、最も高い活性値を１００％とする相対活性値（％）を示す。 図９は、ｐＨによるＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の酵素活性の影響を示す特性図である。各酵素について、最も高い活性値を１００％とする相対活性値（％）を示す。 図１０は、ＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の温度安定性を示す特性図である。各酵素について、最も高い活性値を１００％とする相対活性値（％）を示す。 図１１は、ＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の有機溶媒耐性を示す特性図である。各酵素について、最も高い活性値を１００％とする相対活性値（％）を示す。 図１２は、ＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２のエタノール耐性を示す特性図である。各酵素について、最も高い活性値を１００％とする相対活性値（％）を示す。 図１３は、ＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２のＮａＣｌ耐性を示す特性図である。各酵素について、最も高い活性値を１００％とする相対活性値（％）を示す。 図１４は、ＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の組み合わせによる酵素活性の相乗効果を示す特性図である。 図１５−１は、ＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による基質分解特性試験の結果を示す特性図である。各レーンは、それぞれ以下の基質を処理したサンプルを示す。Ｃ１：グルコース；Ｃ２：セロビオース；Ｃ３：セロトリオース；Ｃ４：セロテトラオース；Ｃ５：セロペンタオース；酸：リン酸膨張セルロース；結：結晶性セルロース；グ：βグルカン；紙：ろ紙；ｃｍｃ：ＣＭセルロース。Ｍ：マーカー。縦軸は糖の炭素数を示す。 図１５−２は、ＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による基質分解特性試験の結果を示す特性図である。各基質を各酵素で処理した際に見出される分解産物の炭素数を示す。

本発明は、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）に由来する新規セルラーゼに関する。特に、本発明は、サーモスポロスリックス・ハザケンシスＳＫ２０−１^Ｔ株（ＪＣＭ １６１４２Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８８１Ｔ）（以下、「ＳＫ２０−１^Ｔ株」と記載する）に由来する新規セルラーゼに関する。

ＳＫ２０−１^Ｔ株は、完熟堆肥より単離され（Ｓｈｕｈｅｉ Ｙ． ｅｔ． ａｌ．，上掲）、Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＪＣＭ）に１６１４２^Ｔとして、またＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＢＡＡ−１８８１Ｔとして登録されている。

本発明におけるセルラーゼは、少なくともβ−グルカン、可溶性セルロース、結晶性セルロース、リン酸膨張セルロース、およびキシランを基質とする。基質特異性については、下記「（１）基質特異性」にて詳述する。

本発明におけるセルラーゼは、少なくとも以下より選択される一または複数の加水分解酵素を含む。これらの加水分解酵素は、セルロースの非晶性領域をランダムに切断することができ、エンド型加水分解酵素活性を有する。

（Ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＩ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＩＩ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＶ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号４に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｖ）配列番号５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号５に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；ならびに
（ＶＩ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド。

なお、上記ポリペプチドについて記載される「１もしくは数個」とは、特には限定されないが、例えば、２０個以内、好ましくは１０個以内、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、あるいは１個又は２個である。

また、上記ポリペプチドについて記載される「同一性」とは、２つのアミノ酸配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（パーセンテージ）を意味する。同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ））を使用して求めることができる。「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を示す。

さらに、上記ポリペプチドについて記載される「セルラーゼ活性」とは、セルロースを、グルコース、セロビオースおよびセロオリゴ糖に加水分解する活性を示す。なお、本明細書において、「セルラーゼ活性」を「酵素活性」および単に「活性」という場合がある。セルラーゼ活性は、公知の手法によって測定することが可能であり、例えば、上記ポリペプチドにセルラーゼの公知の基質（例えば、濾紙、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）、サリシン、キシラン、セロビオースなど、特にこれらに限定されない）を加えて、一定時間酵素反応を行わせた後に、生じた還元糖をＳｏｍｏｇｙ−Ｎｅｌｓｏｎ法およびＤｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ）法などにより発色させ所定の波長で比色定量して測定することができる。すなわち、Ｓｏｍｏｇｙ−Ｎｅｌｓｏｎ法においては、一定時間反応させた上記反応溶液にＳｏｍｏｇｙ銅試薬（和光純薬）を加えて反応を停止する。その後およそ２０分間煮沸し、煮沸終了後急速に水道水にて冷却する。冷却後、Ｎｅｌｓｏｎ試薬を注入して還元銅沈殿を溶解し発色させ、およそ３０分静置した後蒸留水を加え、吸光度を測定する。ＤＮＳ法を用いる場合は、１％ＣＭＣ基質液に酵素液を加え、一定時間酵素反応を行わせたのち、煮沸などによって酵素反応を停止する。この反応液にジニトロサリチル酸を加えて、５分間煮沸し、冷却後吸光度を測定する。

本発明において特に好ましいセルラーゼは、以下より選択される一または複数の加水分解酵素を含む。

（Ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＶ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号４に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；ならびに
（ＶＩ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド。

本発明においてさらに好ましいセルラーゼは、以下より選択される一または複数の加水分解酵素を含む。

（Ｉａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ＩＶａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
（ＶＩａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。

なお、本明細書において、上記（Ｉ）〜（ＶＩ）に示される一または複数の加水分解酵素を「セルラーゼ」と呼ぶ場合がある。

本発明のセルラーゼは、以下の特性を有する。
（１）基質特異性
本発明のセルラーゼは、β−グルカン、可溶性セルロース（ＣＭセルロース）、リン酸膨張セルロース、結晶性セルロース、キシラン、マンナン、ラミナリン、パラニトロフェニルセロビオシド、パラニトロフェニルグルコシド、カードラン、デキストラン、ムタン、アラビノキシラン、キチン、ガラクタン、ガラクトマンナン、プルラン、キシログルカン、ろ紙を基質とするが、これらに限定されない。好ましくは、少なくともβ−グルカン、可溶性セルロース、結晶性セルロース、リン酸膨張セルロース、およびキシランに対して酵素活性を有するに対して活性を有する。

特に、上記（Ｉ）の加水分解酵素は、β−グルカン、可溶性セルロース（ＣＭセルロース）、リン酸膨張セルロース、結晶性セルロース、キシラン、パラニトロフェニルセロビオシド、パラニトロフェニルグルコシドなどの基質に対して活性を有する。

また、上記（ＩＶ）の加水分解酵素は、β−グルカン、可溶性セルロース（ＣＭセルロース）、リン酸膨張セルロース、結晶性セルロース、キシラン、パラニトロフェニルセロビオシドなどの基質に対して活性を有する。

さらに、上記（ＶＩ）の加水分解酵素は、β−グルカン、可溶性セルロース（ＣＭセルロース）、リン酸膨張セルロース、結晶性セルロース、キシランなどの基質に対して活性を有する。

通常、細菌由来のエンド型セルラーゼは、結晶性セルロースやリン酸膨張セルロースに対して活性を示さない。したがって、本発明のセルラーゼが備える基質特異性はユニークな性質であるといえる。

下記実施例にて詳述するように、これらのセルラーゼのＣＭセルロースに対する活性は、今日工業利用されている一般的なセルラーゼ（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅのエンド型セルラーゼ）（Ｋａｙｏｋｏ Ｈｉｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４（８），１６９０−１６８６，２０１０）の１．５〜６倍、好ましくは２〜４倍である。

（２）反応温度範囲
本発明のセルラーゼは、５〜９０℃、好ましくは１０〜８０℃の範囲に、最適活性温度を有する。

特に、下記実施例にて詳述するとおり、上記（Ｉ）および（ＶＩ）の加水分解酵素は、５〜９０℃、好ましくは１０〜８０℃の範囲に最適活性温度を有し、上記（ＩＶ）の加水分解酵素は、４５〜６５℃、好ましくはおよそ６０℃に最適活性温度を有する。

（３）ｐＨ範囲
本発明のセルラーゼは、ｐＨ２〜１１、好ましくはｐＨ３〜１０の範囲に、最適活性ｐＨを有する。

特に、下記実施例にて詳述するとおり、上記（Ｉ）の加水分解酵素は、ｐＨ３以上、好ましくはｐＨ４〜１１の範囲に最適活性ｐＨを有する。また、上記（ＩＶ）の加水分解酵素は、ｐＨ３．５〜９の範囲、好ましくはおよそｐＨ４に最適活性ｐＨを有する。さらに、上記（ＶＩ）の加水分解酵素は、ｐＨ２〜１０．５、好ましくはｐＨ３〜９の範囲に最適活性ｐＨを有する。

（４）耐熱性
本発明のセルラーゼは、５０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃の温度範囲の熱処理に対して、安定性を有する。「安定性」とは、熱処理に対して活性を完全に消失しないことを意味し、必ずしも、熱処理に対して、処理前の活性の１００％を維持することを意味しない。

特に、下記実施例にて詳述するとおり、上記（Ｉ）の加水分解酵素は、７０℃、３０分間以内の熱処理に対してほとんど活性を失うことなく、安定である。また、上記（ＶＩ）の加水分解酵素は、７０℃、１０分間未満の熱処理に対して高い活性を保持し、安定である。

（５）有機溶媒耐性
本発明のセルラーゼは、０〜８０％（ｖ／ｖ）、好ましくは０〜５０％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは０〜２５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒の存在下にて、活性を維持しうる。ここで「有機溶媒」とは、トルエン、アセトン、クロロホルム、ブタノール、ヘキサン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタジオール、１−ヘキサノール、メタノール、２−プロパノール、トリエチレングリコール、ジメチルホルムアミド、１，４−ジオキサン（これらに限定されない）から選択される一または複数の有機溶媒を意味する。

特に、下記実施例にて詳述するとおり、上記（Ｉ）の加水分解酵素は、トルエン、クロロホルム、ヘキサンまたはＤＭＳＯの存在下にて、高い活性を維持する。また、上記（ＩＶ）の加水分解酵素は、ヘキサンの存在下にて、高い活性を維持する。さらに、上記（ＶＩ）の加水分解酵素は、トルエン、アセトン、クロロホルム、またはヘキサンの存在下にて、高い活性を維持する。

本発明のセルラーゼは、有機溶媒の存在下において高い活性を維持することができ、有機溶媒存在下でセルラーゼ処理が必要な状況（例えば、糖脂肪酸エステルの合成などのファインケミカルへの応用など）において極めて有用である。

（６）エタノール耐性
本発明のセルラーゼは、０〜７０％（ｖ／ｖ）、０〜６０％（ｖ／ｖ）、好ましくは、０〜５０％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは、０〜３０％（ｖ／ｖ）のエタノールの存在下において、活性を維持しうる。

特に、下記実施例にて詳述するとおり、上記（Ｉ）の加水分解酵素は、５０％（ｖ／ｖ）のエタノールの存在下においても、高い活性を維持する。また、上記（ＶＩ）の加水分解酵素は、およそ３０％（ｖ／ｖ）以下のエタノールの存在下において、高い活性を維持する。さらに、上記（ＩＶ）の加水分解酵素は、およそ１５％（ｖ／ｖ）以下のエタノールの存在下において、高い活性を維持する。

本発明のセルラーゼは、エタノールの存在下において高い活性を維持することができ、バイオマスの糖化処理とアルコール発酵処理を同時に行うことができ、極めて有用である。

（７）ＮａＣｌ耐性
本発明のセルラーゼは、０〜２５％（ｖ／ｖ）の塩存在下にて、活性を維持しうる。
特に、下記実施例にて詳述するとおり、上記（ＩＶ）および（ＶＩ）の加水分解酵素は、２５％（ｖ／ｖ）以下の塩存在下にて、高い活性を維持する。

本発明のセルラーゼは、塩存在下において高い活性を維持することができ、塩濃度が高い状況下でセルラーゼ処理が必要な状況（例えば、酸やアルカリ処理した木質系バイオマスを中和処理した後の糖化処理など）において極めて有用である。

（８）組み合わせによる相乗効果
上記（Ｉ）〜（ＶＩ）の加水分解酵素は、二種以上を組み合わせて用いることによって、セルラーゼ活性を相乗的に増強させることができる。「二種以上」とは、上記（Ｉ）〜（ＶＩ）の加水分解酵素から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、および６つを意味する。加水分解酵素を組み合わせて用いることによって、単独で加水分解酵素を用いた場合と比べて、およそ２〜５０倍のセルラーゼ活性を得ることができる。

（９）基質の分解様式
本発明のセルラーゼは、基質をグルコースやオリゴ糖に分解することできる。
特に、下記実施例にて詳述するとおり、上記（Ｉ）および（ＶＩ）の加水分解酵素は、セロトリオース（Ｃ３）を分解できる最少単位（分解最小単位）とする。また、上記（ＩＶ）の加水分解酵素は、セロテトラオース（Ｃ４）を分解最小単位とする。

さらに、本発明のセルラーゼは、トランスグリコレーション活性を有する。特に、下記実施例にて詳述するとおり、上記（Ｉ）および（ＶＩ）の加水分解酵素は、そのトランスグリコレーション活性により、３糖や４糖と反応させた場合に、それ以上の鎖長のオリゴ糖を生産する事ができる。

本発明において、上記ポリペプチドはＳＫ２０−１^Ｔ株の培養物または培養上清より精製または粗精製された形態であっても良いし、下記で詳述する上記ポリペプチドを発現する遺伝子組換え形質転換体の培養物または培養上清より精製または粗精製された形態であっても良い。培養物または培養上清からの上記ポリペプチドの精製または粗精製は、タンパク質精製に一般的に用いられる手法、例えば、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動などの技術を適宜用いて行うことができる。あるいは、上記ポリペプチドは化学合成（ペプチド合成）されたものであっても良い。

本発明において、上記ポリペプチドは、固相に固定化されていても良い。固相としては例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物などが挙げられる（特にこれらに限定されない）。上記ポリペプチドを固相に固定することによって、連続反復使用が可能となる点において有利である。

なお、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の加水分解酵素は、アミノ酸配列の類似性および疎水性クラスター分析より同じ酵素ファミリーに属する。また、上記（Ｖ）および（ＶＩ）の加水分解酵素は、アミノ酸配列の類似性および疎水性クラスター分析より上記ファミリーとは別の酵素ファミリーに属する。同じ酵素ファミリーに属する加水分解酵素は、基質特異性、反応温度範囲、ｐＨ範囲、耐熱性、有機溶媒耐性、エタノール耐性、ＮａＣｌ耐性、組み合わせによる相乗効果、基質の分解様式などの特性において、相互に類似する特性を有し得る。したがって、上記（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の加水分解酵素の特性は、上記（Ｉ）の加水分解酵素の特性と類似または同一であり得る。また、上記（Ｖ）の加水分解酵素の特性は、上記（ＶＩ）の加水分解酵素の特性と類似または同一であり得る。

また本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ以下の（ｉ）〜（ｖｉ）塩基配列より選択される。

上記（Ｉ）のポリペプチドをコードする塩基配列：
（ｉ）配列番号７で表される塩基配列；配列番号７で表される塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；配列番号７で表される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；または配列番号７で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列。

上記（ＩＩ）のポリペプチドをコードする塩基配列：
（ｉｉ）配列番号８で表される塩基配列；配列番号８で表される塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；配列番号８で表される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；または配列番号８で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列。

上記（ＩＩＩ）のポリペプチドをコードする塩基配列：
（ｉｉｉ）配列番号９で表される塩基配列；配列番号９で表される塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；配列番号９で表される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；または配列番号９で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列。

上記（ＩＶ）のポリペプチドをコードする塩基配列：
（ｉｖ）配列番号１０で表される塩基配列；配列番号１０で表される塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；配列番号１０で表される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；または配列番号１０で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列。

上記（Ｖ）のポリペプチドをコードする塩基配列：
（ｖ）配列番号１１で表される塩基配列；配列番号１１で表される塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；配列番号１１で表される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；または配列番号１１で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列。

上記（ＶＩ）のポリペプチドをコードする塩基配列：
（ｖｉ）配列番号１２で表される塩基配列；配列番号１２で表される塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；配列番号１２で表される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドコードする塩基配列；または配列番号１２で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列。

なお、上記塩基配列について記載される「１もしくは数個」とは、特には限定されないが、例えば、５０個以内、好ましくは２０個以内、さらに好ましくは１０個以内である。

また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、２〜６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）および０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中４２〜５５℃にてハイブリダイズを行い、０．１〜０．２×ＳＳＣおよび０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中５５〜６５℃にて洗浄を行う条件をいう。

さらに、上記塩基配列について記載される「少なくとも９０％の同一性」とは、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ））を用いて計算したときに、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を示すことを意味する。

「セルラーゼ活性」とは、上に定義するとおりである。
上記塩基配列には、天然変異体も含まれる。天然変異体の具体例としては、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体、スプライス変異体、遺伝暗号の縮重に基づく変異体等が挙げられる。

また上記塩基配列は、下記で詳述する形質転換される宿主生物のコドン頻度に従って、改変されていても良い。

また本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
本発明の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによって、上記ポリヌクレオチドにコードされる加水分解酵素を発現させることが可能である。

本発明の発現ベクターは、当業者に周知である遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。すなわち、当業者に公知である一般的な遺伝子導入および発現用のベクターに、上記ポリヌクレオチドを組み込んで作製することができる。本発明の発現ベクターに用いることができるベクターとしては、プラスミド、ファージ、ウイルス等、宿主細胞において複製可能である限り特に限定されないが、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６などの大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０などの枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０などの酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩなどのファージのＤＮＡ、およびレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスが挙げられる。ベクターには、上記ポリヌクレオチドより選択される１種または複数種（例えば、２種、３種、４種またはそれ以上）を含めることができる。

また、ベクターには、上記ポリヌクレオチドの他に、宿主細胞における複製を可能とする複製起点、および形質転換体を同定する選択マーカー、さらに、好ましくは、宿主細胞由来の適切な転写または翻訳制御配列が、所望により上記ポリヌクレオチドに連結されて含まれ得る。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。用いることができるプロモーターとしては、宿主細胞内にて遺伝子発現を駆動できる限り、特に限定されず、例えばＴ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターなどのＰｏｌＩＩＩプロモーターなど、当業者に公知であるプロモーターを適宜使用することができる。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができ、例えばアンピシリン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシンなどの耐性遺伝子やウリジンやアルギニンなどの生合成遺伝子などが挙げられる。

本発明はまた、上記発現ベクターを含む形質転換体に関する。
本発明の形質転換体は上記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換することによって作製することができる。本発明の形質転換体は、上記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、上記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、上記ポリヌクレオチドを含むベクターの形で含有する形質転換体であることもできる。また、上記ポリペプチドを発現している形質転換体であることもできるし、あるいは、上記ポリペプチドを発現していない形質転換体であることもできる。

上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。

宿主細胞として用いることができるものとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＳＦ９、ＳＦ２１、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３など周知の細胞が挙げられる。

上記発現ベクターが導入された形質転換体は、上記加水分解酵素を発現し得る。形質転換体の培養物を上記加水分解酵素として直接利用しても良いし、発現された加水分解酵素を、形質転換体の培養物より、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、遠心分離、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を１つまたは複数組み合わせて用いて精製または粗精製して、利用することもできる。

「培養物」には、培養上清、細胞破砕物、形質転換体ならびにそれらの凍結乾燥物およびそれらを固相（上に定義されるもの）に固定したものが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はまた、上記ポリペプチドまたは上記形質転換体の培養物を洗剤成分として含む洗剤組成物に関する。当該洗剤組成物は固体または液体のどちらであっても良く、好ましくは液体である。

本発明の洗剤組成物には、上記ポリペプチドまたは上記形質転換体の培養物を約０．００１〜約１０重量％の範囲で含めることができる。当該洗剤組成物には上記ポリペプチドまたは上記形質転換体の培養物に加えて、界面活性剤を含めることができる。当該洗剤組成物中、界面活性剤は約１〜約５５重量％の範囲で含めることができる。界面活性剤はアニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性または双性イオン性あるいはそれらの混合物を利用することができる。本発明において利用可能な界面活性剤としては、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α−スルホ脂肪酸エステル塩、天然脂肪酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、脂肪酸メチルエステルエトキシレート、スクロースまたはグルコースの脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の洗剤組成物はさらに、当該分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、発泡促進剤等を含めることもできる。

本発明はまた、上記ポリペプチド、上記形質転換体の培養物、または上記形質転換体の培養物を用いた、炭水化物含有原料の糖化方法に関する。

「炭水化物含有原料」とは、単糖、オリゴ糖、または多糖などの任意の炭水化物、またはそれを含む生物由来材料である。炭水化物含有原料としては、特に限定されないが、植物や藻類が生産するセルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスが挙げられ、例えば、古紙、製材残材、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、バガス、大豆粕、大豆おから、コーヒー粕、米ぬか、麦藁、コーンストーバー、コーンコブなどが挙げられる（これらに限定されない）。

炭水化物含有原料の糖化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、粗粉砕もしくは細断処理した、または酸もしくはアルカリ処理した炭水化物含有原料を、水性媒体中に懸濁し上記ポリペプチド、上記形質転換体、または上記形質転換体の培養物を加え、撹拌または振とうしながら加温することによって行うことができる。この方法において、反応液のｐＨおよび温度は、上記ポリペプチドが失活しない範囲内で適宜選択することができる。また、当該反応は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。上記方法により得られた炭水化物含有原料の糖化物には、グルコース、フルクトース、スクロースなどの糖類を含む。

上記方法により得られた炭水化物含有原料の糖化物は、食品または飼料の原料として用いることができる。

本発明はさらに、上記方法により得られた炭水化物含有原料の糖化物を発酵させることを含む、エタノールの製造方法に関する。糖化物の発酵は、公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、上記方法により得られた炭水化物含有原料の糖化物を含めた培地中にて、アルコール発酵が可能な公知の微生物（例えば、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ，Ｚｙｍｏｍｏｎａｓなど））を培養することによって行うことができる。培地のｐＨおよび温度、培養時間は用いる微生物に応じて適宜選択することができる。培養終了後、培地を回収してエタノールを分離する。培地よりエタノールを分離する方法は、蒸留、浸透気化膜等の公知の方法が用いられるが、蒸留による方法が好ましい。次いで、分離したエタノールをさらに精製（エタノール精製法としては、公知の方法、例えば蒸留等を用いることができる）することによって、エタノールを得ることができる。上記のとおり、本発明のポリペプチドは、エタノールの存在下において高い活性を維持することができるために、本発明のエタノールの製造方法において、上記炭水化物含有原料を糖化する工程と、糖化物を発酵する工程は同時に行うことができる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１：新規セルラーゼのクローニング
＜染色体ＤＮＡの調製とゲノムの解読＞
サーモスポロスリックス・ハザケンシスＳＫ２０−１株（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）（ＪＣＭ １６１４２^Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８１１^Ｔ）をトリプトン・イーストエキス・ブロス（ＩＳＰ１）培地（ＤＩＦＣＯ社製）で５０℃にて３日間振とう培養し、集菌したものに、ＴＥ緩衝液にて３回洗浄し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液５ｍｌに懸濁させ、アクロモペプチダーゼ（シグマ社製）２．５ｍｇ、ニワトリ卵白リゾチーム（シグマ社製）２．５ｍｇを添加し、３７℃で３時間放置した。その後、プロティナーゼＫ（シグマ社製）１０Ｕと１０％ＳＤＳ溶液２５０μｌ添加して３７℃で１日間放置した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１）（ニッポンジーン社製）を等量添加し、攪拌後、遠心分離し、水層を回収した。この操作を中間層が無くなるまで繰り返し、得られた水層にＲＮａｓｅ処理を行いエタノール沈殿させて、染色体ＤＮＡを４０μｇ回収した。

ＧＳ ＦＬＸ ４５４ ｔｉｔａｎｉｕｍ（ロシュ社製）を用いて１／４プレート、４ｋｂライブラリーのペアエンド法にてゲノム配列を解読した。ゲノム解読は株式会社マクロジェンに依頼した。その結果、総リードが２２７，７７４，５６５ｂｐで１００ｂｐ以上のコンティグが１３１個、スキャフォルドが１１個、冗長度が３２であり、ゲノムの９９％以上が解読できた。

＜新規セルラーゼの検出とクローニング＞
得られたゲノム配列をＭｉＧＡＰ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｇａｐ．ｏｒｇ／）にて自動注釈を行った。ＯＲＦの検索はＧｌｉｍｍｅｒを使用し、参照したデータベースはＴｒＥＭＢＬ（２０１０．７．１３）とＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ （２０１０．７．２１）を選択し、Ｉｄｅｎｔｉｔｙは３０％以上、Ｃｏｖｅｒａｇｅは５０％以上に注釈を付加させた。また糖質加水分解酵素ファイリー（ＧＨ）の検索はＣＡＺＹ （Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ−Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）にて行った。結果、６つのセルラーゼ（ＧＨ５−１，５−２，５−３，９，１２−１，１２−２）遺伝子の翻訳領域情報を得た。各セルラーゼ遺伝子の塩基配列および当該塩基配列のコードされるアミノ酸配列を図１〜６に示す。ＧＨ５−１，９および１２−２遺伝子の翻訳領域情報を基に以下のプライマーを設計した。

上記のプライマーのペアーを用いて、染色体ＤＮＡを鋳型にそれぞれ以下の組成とプログラムでＰＣＲを行った。

ＰＣＲ反応カクテル
染色体ＤＮＡ：０．５μｌ
０．２ｍＭフォワードプライマー： １μｌ
０．２ｍＭリバースプライマー： １μｌ
１０×Ｔａｑ緩衝液（タカラ社製）：５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ （タカラ社製）：４μｌ
Ｔａｑ （タカラ社製）１μｌ
イオン交換水 ３５．７μｌ

ＰＣＲ条件
９５℃で２分間加熱後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分間のサイクルを３０回繰り返した。反応終了後、一度７２℃で１０分間加温後に、４℃に温度を下げた。

得られた各ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれのバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて切り出したＤＮＡを、定法により精製した。各精製ＤＮＡをｐＢＡＤ ＴＯＰＯ ＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０）に形質転換した。獲得した形質転換体それぞれ１株は０．５％ＣＭセルロースを含むＬＢプレートにて画線培養して、３７℃で１８時間培養した。その後、０．２％コンゴーレッド溶液を寒天表面に薄く展開し、１５分静置し、コンゴーレッド溶液を捨て、１ＭＮａＣｌ溶液を同様に展開して、２０分間静置後、コロニーの周りに形成されるクリアゾーンによって、セルラーゼの発現を確認した。同様の作業をセルラーゼ遺伝子を組み込んでいないベクターを形質転換させた大腸菌についても行い、クリアゾーンを形成しない事を確認した。

セルラーゼの発現が確認された各形質転換体を１ｍｌＬＢ培地（１００ｍｇ／ｌアンピシリン含む）に接種して、３７℃にて１８時間前振とう培養を行った後、その培養液１ｍｌを１００ｍｌＬＢ培地（１００ｍｇ／ｌアンピシリン含む）に添加し、濁度（ＯＤ６６０）が０．５になるまで振とう培養し、そこに２０％Ｌ−アラビノース溶液を０．１ｍｌ添加し、再び４時間発現誘導培養した。培養後、集菌して、０．７％生理食塩水で３回洗浄した。この洗浄菌体を用いてＮｉ−ＮＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いて、そのマニュアルに従って発現させたそれぞれのセルラーゼを精製した。即ち洗浄菌体を８ｍｌのＮａｔｉｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液に懸濁させ、８ｍｇのニワトリ卵白リゾチーム（シグマ社製）を添加し、３０分氷上で放置した。その後、超音波１０秒し、１０秒氷冷させる破砕処理を６回繰り返した。その後、１５分、３０００Ｇで遠心分離して上澄みを回収した。１．５ｍのＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅを付属のカラムに添加して、５分間自然沈降させて上澄みを取り除き、６ｍｌの蒸留水で１回、６ｍｌのＮａｔｉｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液で２回担体を洗浄した。その担体に８ｍｌの細胞破砕液を添加して、６０分間ゆっくりと振とうさせ、目的タンパク質を吸着させた。その後自然沈降によって上澄みを取り除き、８ｍｌのＮａｔｉｖｅ Ｗａｓｈ緩衝液にて４回洗浄した。そして、Ｎａｔｉｖｅ Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝液を８ｍｌ添加して最初の３ｍｌを回収し、各精製セルラーゼ溶液を得た。

実施例２：新規セルラーゼの特性解析
＜基質特異性＞
ＣＭセルロース、微結晶性セルロース（ｗａｋｏ社製）小麦β−グルカン（シグマ社製）、マンナン（シグマ社製）、ラミナリン（シグマ社製）、リン酸膨張セルロースをそれぞれ終濃度１％（ｗ／ｖ）になるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、５０℃で６０分間静置反応（結晶性セルロースは５０℃で１８時間振とうさせて反応させた。）した後、酵素活性を測定した。酵素活性の測定は以下の手法で行った。反応液にＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）溶液１ｍＬを加えて沸騰湯浴中で５分間熱処理した。熱処理後氷水中で冷却し、脱イオン水４ｍＬを加え攪拌後、Ｕ１５００スペクトロフォトメーター（日立社製）を用いて、５３５ｎｍでの吸光度を測定した。なお、酵素１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する量とした。

使用したリン酸膨張セルロースは以下のようにして調整した。ＴＯＹＯろ紙社製セルロースパウダー（１００−２００ｍｅｓｈ）５ｇを８５％リン酸（関東化学）１００ｍｌに懸濁し、室温で１２時間膨潤させた後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５ｍｉｎ）により上清を得た。この上清を５００ｍｌの蒸留水に加え非結晶性セルロース繊維を沈殿させ、遠心分離で集めた後０．０５％の炭酸ナトリウム５００ｍｌに懸濁・中和し、遠心分離によって再び沈殿を集めた。この沈殿を５００ｍｌの蒸留水でさらに３回懸濁・洗浄し、最後に沈殿を１００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に懸濁した。

各種基質に対する酵素活性を図７に示す。
ＧＨ５−１，ＧＨ９およびＧＨ１２−２はいずれも、β−グルカン、ＣＭセルロース、微結晶性セルロース、キシランに対して活性を示した。また、ＧＨ５−１は、パラニトロフェニルセロビオシドおよびパラニトロフェニルグルコシドに対しても活性を示し、ＧＨ９もパラニトロフェニルセロビオシドに対しても活性を示した。

一般的な細菌由来エンド型のセルラーゼは結晶性セルロースやそれを酸により膨張させたリン酸膨張セルロースに対してはほとんど活性を示さないのに対して、ＧＨ５−１，ＧＨ９およびＧＨ１２−２はいずれも、両基質に対して活性を示した（ＴＣＬの結果も参照）。

また、今日、一般的に工業利用されているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅのエンド型セルラーゼのＣＭセルロースに対する活性が約５０Ｕ／ｍｇであることが知られている。ＧＨ５−１，ＧＨ９およびＧＨ１２−２では、その２〜４倍の活性が確認された。

＜最適反応温度＞
基質１％（ｗ／ｖ）ＣＭセルロースおよび適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加えて、反応温度を１０−９０℃（１０℃間隔）で反応させた後、上記＜基質特異性＞に記載した通り酵素活性を測定した。それぞれの最高活性を示した温度での値を１００％とした相対活性で示した。（それぞれの１００％活性はＧＨ５−１：２１０Ｕ／ｍｇ；ＧＨ９：８８Ｕ／ｍｇ；ＧＨ１２−２：１９３Ｕ／ｍｇ）。

結果を図８に示す。
ＧＨ５−１は１０〜８０℃にて５０％以上の活性を示し、活性温度範囲が非常に広いことが示された。ＧＨ１２−２もＧＨ５−１と同様に、非常に広い活性温度範囲を示した。一方、ＧＨ９は６０℃付近に至適温度を有することが明らかとなった。

＜最適反応ｐＨ＞
基質１％（ｗ／ｖ）ＣＭセルロースおよび適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを、各０．１Ｍの緩衝液（グリシン-塩酸緩衝液ｐＨ２．０、ｐＨ３、クエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４、ｐＨ５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ１０、及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１）に加えて、５０℃、６０分間の反応させた後、上記＜基質特異性＞に記載した通り酵素活性を測定した。それぞれの最大活性時を示したｐＨの値を１００％とした相対活性で示した（それぞれの１００％活性はＧＨ５−１：２１２Ｕ／ｍｇ；ＧＨ９：１１０Ｕ／ｍｇ；ＧＨ１２−２：１７７Ｕ／ｍｇ）。

結果を図９に示す。
ＧＨ５−１およびＧＨ１２−２はｐＨ２〜１１にて活性が観察され、非常に広い活性ｐＨ範囲を有することが明らかとなった。一方、ＧＨ９はｐＨ４に至適ｐＨを有することが明らかとなった。

＜温度安定性＞
適当な濃度に希釈した各酵素液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃の各温度下で、１０−３０分間熱処理した後、残存活性を１％（ｗ／ｖ）ＣＭセルロースを用いて測定した。熱に対して未処理の活性を１００％とした残存活性で示した。（それぞれの１００％活性はＧＨ５−１：２５２Ｕ／ｍｇ；ＧＨ９：１０３Ｕ／ｍｇ；ＧＨ１２−２：２２２Ｕ／ｍｇ）。

結果を図１０に示す。
ＧＨ５−１は７０℃、３０分間の熱処理によっても、ほとんど失活せず、優れた耐熱性を有することが明らかとなった。一方、ＧＨ９は７０℃、１０分間の熱処理によって失活し、耐熱性をほとんど有さないことが明らかとなった。ＧＨ１２−２もＧＨ５−１と同様に、非常に広い活性温度範囲を示した。一方、ＧＨ９は６０℃付近に至適温度を有することが明らかとなった。

＜各種有機溶媒耐性＞
０．１％（ｗ／ｖ）ＣＭセルロースを含む２５％（ｖ／ｖ）トルエン（関東化学社製）、アセトン（関東化学社製）、クロロホルム（関東化学社製）、ブタノール（関東化学社製）、ＴＥ飽和フェノール（ニッポンジーン社製）、ヘキサン（関東化学社製）、ＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ社製）をそれぞれ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を基質溶液とし、適当な濃度に希釈した各酵素液と５０℃にて６０分間反応させ、上記＜基質特異性＞に記載した通り酵素活性を測定した。有機溶媒を含まない基質溶液を用いた測定値を１００％とした相対活性で示した。（それぞれの１００％活性はＧＨ５−１：２１８Ｕ／ｍｇ；ＧＨ９：８０Ｕ／ｍｇ；ＧＨ１２−２：２０１Ｕ／ｍｇ）。

結果を図１１に示す。
ＧＨ５−１およびＧＨ１２−２は、多くの有機溶媒中で活性を維持していた。一方、ＧＨ９はヘキサンを除き、高い活性は見られなかった。

＜エタノール耐性＞
０．１％（ｗ／ｖ）ＣＭセルロースと１，３，５，１０，２０，３０，５０％（ｖ／ｖ）エタノール（関東化学社製）をそれぞれ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を基質溶液とし、適当な濃度に希釈した各酵素液と５０℃にて６０分間反応させ、上記＜基質特異性＞に記載した通り酵素活性を測定した。エタノールを含まない基質溶液を用いた測定値を１００％とした相対活性で示した。（それぞれの１００％活性はＧＨ５−１：２０２Ｕ／ｍｇ；ＧＨ９：７５Ｕ／ｍｇ；ＧＨ１２−２：１８０Ｕ／ｍｇ）。

結果を図１２に示す。
ＧＨ５−１およびＧＨ１２−２は、エタノール高濃度存在下でも活性を維持した。

＜ＮａＣｌ耐性＞
０．１％（ｗ／ｖ）ＣＭセルロースと１，２，３，４，５Ｍ ＮａＣｌをそれぞれ含む０．１Ｍリン酸緩衝液を基質溶液（ｐＨ７．０）とし、適当な濃度に希釈した各酵素液と５０℃にて６０分間反応させ、上記＜基質特異性＞に記載した通り酵素活性を測定した。ＮａＣｌを含まない基質溶液を用いた測定値を１００％とした相対活性で示した。（それぞれの１００％活性はＧＨ５−１：１９８Ｕ／ｍｇ；ＧＨ９：８３Ｕ／ｍｇ；ＧＨ１２−２：１８０Ｕ／ｍｇ）。

結果を図１３に示す。
ＧＨ９およびＧＨ１２−２は、５Ｍ ＮａＣｌ（約２５％（ｗ／ｖ））の存在下にて５０％以上の相対活性を示し、非常に耐塩性の強いセルラーゼであることが明らかとなった。

＜組み合わせによる相乗効果＞
ワットマンＮｏ．１ろ紙を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した基質溶液を用意し、そこに各精製セルラーゼのタンパク質濃度を１０７μｇ／ｍｌになるように調整したものを単一酵素試験においてはそれぞれ０．０３ｍｌ、２種混合試験（ＧＨ５−１＋ＧＨ９；ＧＨ５−１＋ＧＨ１２−２；ＧＨ９＋ＧＨ１２−２の組み合わせ）においては各酵素を０．０１５ｍｌ（合計０．０３ｍｌ）、３種混合試験（ＧＨ５−１＋ＧＨ９＋ＧＨ１２−２）においては各酵素を０．０１ｍｌ（合計０．０３ｍｌ）を添加して、５０℃にて６０分間反応させ、上記＜基質特異性＞に記載した通り酵素活性を測定した。なお、混合酵素の理論値は、それぞれの単一酵素の実測値の和を組み合わせた酵素の数で除した値である。また、混合酵素の相乗効果の値は、混合酵素の実測値を理論値で除した値である。

結果を図１４に示す。
ＧＨ５−１、ＧＨ９およびＧＨ１２−２の各酵素は、２種および３種と組み合わせて用いることによって、酵素活性が相乗的に向上することが明らかとなった。

＜ＴＬＣによる分解特性試験＞
ＣＭセルロース、微結晶性セルロース（ｗａｋｏ社製）、ろ紙（ワットマンＮｏ．１）小麦β−グルカン、リン酸膨張セルロース、セロビオース（焼津水産工業社製）、セロトリオース（焼津水産工業社製）、セロテトラオース（焼津水産工業社製）、セロペンタオース（焼津水産工業社製）をそれぞれ終濃度１％（ｗ／ｖ）になるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、５０℃で６０分間静置反応（結晶性セルロース及びろ紙は５０℃で１８時間振とうさせて反応させた。）した後、その上澄み２０μｌを薄層プレート；ＴＬＣ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（メルク社製）にスポットして展開溶液クロロホルム：酢酸：水（６：７：１）に浸して分解産物を解析した。

結果を図１５−１および図１５−２に示す。
ＧＨ５−１およびＧＨ１２−２はともにセロトリオース（Ｃ３）が分解最少単位であった。結晶性、酸膨張セルロース、ろ紙及びグルカンの分解産物はともにセロビオースがメインで検出された。ＧＨ５−１のみグルコースが検出されなかった。
一方、ＧＨ９はセロテトラオースが分解最少単位であり、酸膨張セルロース、ろ紙及びグルカンの分解産物はともにセロテトラオースがメインで検出された。

また、ＧＨ５−１およびＧＨ１２−２はともにトランスグリコレーション活性も示した。３糖や４糖と反応させた場合に、トランスグリコレーション活性によって、それ以上の鎖長のオリゴ糖を生産する事ができた。

本発明により、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）ＳＫ２０−１^Ｔ株（ＪＣＭ １６１４２Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８８１Ｔ）に由来する新規セルラーゼを提供することができる。当該セルラーゼは、各種有機溶媒耐性、エタノール耐性、ＮａＣｌ耐性などユニークな特性を備え、糖脂肪酸エステルの合成などのファインケミカルへの応用やバイオマスの糖化・アルコール発酵処理などの分野において貢献することが期待される。

Claims (16)

1. 少なくともβ−グルカン、ＣＭセルロース、結晶性セルロース、リン酸膨張セルロース、およびキシランに対して酵素活性を有する、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）に由来するセルラーゼであって、以下のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含む加水分解酵素からなる群から選択される一または複数の加水分解酵素を含む、前記セルラーゼ：
   （Ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
   （ＩＩ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号４に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；ならびに
   （ＩＩＩ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セルラーゼ活性を有するポリペプチド。
2. サーモスポロスリックス・ハザケンシスが、サーモスポロスリックス・ハザケンシスＳＫ２０−１^Ｔ株（ＪＣＭ １６１４２Ｔ＝ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８８１Ｔ）である、請求項１に記載のセルラーゼ。
3. 少なくとも１０〜８０℃の温度条件下において、酵素活性を保持する、請求項１または２に記載のセルラーゼ。
4. 少なくともｐＨ２〜１１のｐＨ条件下において、酵素活性を保持する、請求項１または２に記載のセルラーゼ。
5. 少なくとも０〜２５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒の存在下において、酵素活性を保持する、請求項１または２に記載のセルラーゼ。
6. 有機溶媒がトルエン、アセトン、クロロホルム、ブタノール、ヘキサンおよびＤＭＳＯからなる群から選択される、請求項５に記載のセルラーゼ。
7. 少なくとも０〜５０％（ｖ／ｖ）のエタノールの存在下において、酵素活性を保持する、請求項１または２に記載のセルラーゼ。
8. 少なくとも０〜２５％（ｖ／ｖ）の塩存在下において、酵素活性を保持する、請求項１または２に記載のセルラーゼ。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のセルラーゼをコードするポリヌクレオチド。
10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
11. 請求項１０に記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
12. 請求項１１記載の形質転換体の培養によって得られる培養物。
13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のセルラーゼまたは請求項１２に記載の培養物を含む、洗剤組成物。
14. 炭水化物含有原料を請求項１〜８のいずれか１項に記載のセルラーゼ、請求項１１に記載の形質転換体または請求項１２に記載の培養物で処理することを含む、炭水化物含有原料の糖化方法。
15. 炭水化物含有原料を請求項１〜８のいずれか１項に記載のセルラーゼ、請求項１１に記載の形質転換体または請求項１２に記載の培養物で処理することを含む、食品または飼料の製造方法。
16. （i）炭水化物含有原料を請求項１〜８のいずれか１項に記載のセルラーゼ、請求項１１に記載の形質転換体または請求項１２に記載の培養物で処理すること；ならびに
    （ii）工程（i）で得られた処理物を発酵することを含む、エタノールの製造方法。

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