DE60033145T2

DE60033145T2 - Il-8 rezeptorantagonist

Info

Publication number: DE60033145T2
Application number: DE60033145T
Authority: DE
Inventors: R. Michael Norristown PALOVICH; L. Katherine King of Prussia WIDDOWSON
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2020-05-27
Also published as: JP2003500447A; NO20015775D0; MXPA01012268A; EP1180028B1; SI1180028T1; CA2375683A1; PL351946A1; TR200103448T2; IL146046A0; DE60033145D1; KR20020010674A; NZ514729A; AR029637A1; PT1180028E; EP1180028A1; HUP0201300A2; DK1180028T3; CZ20014247A3; CO5170514A1; AU766082B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine neue Gruppe von Guanidin-Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung in der Behandlung von IL-8-, GROα-, GROβ-, GROγ-, NAP-2- und ENA-78-vermittelten Krankheiten und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in einer solchen Therapie.
Hintergrund der Erfindung
Viele unterschiedliche Namen wurden Interleukin-8 (IL-8) gegeben, wie zum Beispiel Neutrophilattraktans/Aktivierungsprotein-1 (NAP-1), aus Monozyten stammender chemotaktischer Neutrophilfaktor (MDNCF), Neutrophilaktivierender Faktor (NAF) und chemotaktischer T-Zell-Lymphozytenfaktor. Interleukin-8 ist ein Chemoattraktans für Neutrophile, Basophile und eine Untergruppe von T-Zellen. Es wird durch eine Mehrzahl von zellkernhaltigen Zellen erzeugt, einschließlich Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen und Epithelzellen, die TNF, IL-1α, IL-1β oder LPS ausgesetzt werden, und durch Neutrophile selbst, wenn sie LPS oder chemotaktischen Faktoren wie FMLP ausgesetzt werden. M. Baggiolini et al., J. Clin. Invest. 84, 1045 (1989); J. Schroder et al., J. Immunol. 139, 3474 (1987) und J. Immunol. 144, 2223 (1990); Strieter et al., Science 243, 1467 (1989) und J. Biol. Chem. 264, 10621 (1989); Cassatella et al., J. Immunol. 148, 3216 (1992).
GROα, GROβ, GROγ und NAP-2 gehören auch zur Chemokin-α-Familie. Wie IL-8 werden diese Chemokine mit unterschiedlichen Namen bezeichnet. Zum Beispiel werden GROα, β und γ als MGSAα, β bzw. γ bezeichnet (Melanomwachstum-stimulierende Aktivität), siehe Richmond et al., J. Cell. Physiology 129, 375 (1986) und Chang et al., J. Immunol. 148, 451 (1992). Alle Chemokine der α-Familie, die das ELR-Motiv besitzen, das direkt dem CXC-Motiv vorangeht, binden an den IL-8 B-Rezeptor.
IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 und ENA-78 stimulieren eine Anzahl von Funktionen in vitro. Es wurde gezeigt, daß sie alle Chemoattraktanseigenschaften für Neutrophile besitzen, währen IL-8 und GROα chemotaktische Aktivität für T-Lymphozyten und Basophile gezeigt haben. Zusätzlich kann IL-8 die Histaminfreisetzung aus Basophilen von sowohl normalen als auch atopischen Individuen induzieren. GROα und IL-8 können zusätzlich die lysosomale Enzymfreisetzung und den Respiratory Burst aus Neutrophilen induzieren. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß IL-8 die Oberflächenexpression von Mac-1 (CD11b/CD18) auf Neutrophilen ohne neue Proteinsynthese erhöht. Dies kann zur erhöhten Adhäsion der Neutrophile an vaskulären Endothelzellen beitragen. Viele bekannte Krankheiten sind durch eine massive Neutrophilinfiltration gekennzeichnet. Da IL-8, GROα, GROβ, GROγ und NAP-2 die Ansammlung und Aktivierung von Neutrophilen fördern, wurden diese Chemokine mit einem weiten Bereich von akuten und chronischen inflammatorischen Störungen in Verbindung gebracht, die Psoriasis und rheumatoide Arthritis einschließen, Baggiolini et al., FEBS Lett. 307, 97 (1992); Miller et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 17 (1992); Oppenheim et al., Annu. Rev. Immunol. 9, 617 (1991); Seitz et al., J. Clin. Invest. 87, 463 (1991); Miller et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146, 427 (1992); Donnely et al., Lancet 341, 643 (1993). Zusätzlich wurden die ELR-Chemokine (diejenigen, die die Aminosäuren des ELR-Motivs gerade vor dem CXC-Motiv enthalten) mit Angiostasis in Verbindung gebracht, Strieter et al., Science 258, 1798 (1992).
In vitro induzieren IL-8, GROα, GROβ, GROγ und NAP-2 die neutrophile Formveränderung, Chemotaxis, Granulafreisetzung und den Respiratory Burst durch Bindung an und Aktivierung von Rezeptoren der G-Protein-gebundenen 7-Transmembran-Familie, insbesondere durch Bindung an IL-8-Rezeptoren, ganz besonders an den B-Rezeptor, Thomas et al., J. Biol. Chem. 266, 14839 (1991); und Holmes et al., Science 253, 1278 (1991). Die Entwicklung von kleinen nicht-peptidischen Molekülen als Antagonisten für Mitglieder dieser Rezeptorfamilie hat Beispiele. Für eine Übersicht siehe R. Freidinger, "Progress in Drug Research", Bd. 40, S. 33–98, Birkhauser Verlag, Basel 1993. Daher stellt der IL-8-Rezeptor ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuer antiinflammatorischer Mittel dar.
Zwei hochaffine humane IL-8-Rezeptoren (77 % Homologie) wurden charakterisiert: IL-8Rα, das nur IL-8 mit hoher Affinität bindet, und IL-8RB, das hohe Affinität für IL-8 sowie für GROα, GROβ, GROγ und NAP-2 besitzt. Siehe Holmes et al., s.o.; Murphy et al., Science 253, 1280 (1991); Lee et al., J. Biol. Chem. 267, 16283 (1992); LaRosa et al., J. Biol. Chem. 267, 25402 (1992): und Gayle et al., J. Biol. Chem. 268, 7283 (1993).
Es bleibt auf diesem Gebiet ein Behandlungsbedarf für Verbindungen bestehen, die an den IL-8α- oder -β-Rezeptor binden können. Deshalb würden Zustände, die mit einer Zunahme der IL-8-Produktion assoziiert sind (die verantwortlich für die Chemotaxis von Neutrophilen und T-Zell-Untergruppen in den Entzündungsort ist), von Verbindungen profitieren, die Inhibitoren der IL-8-Rezeptorbindung sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Verbindungen der Erfindung können in Verbindung mit der veterinärmedizinischen Behandlung von anderen Säugern als Menschen verwendet werden, die der Inhibierung von IL-8 oder anderen Chemokinen bedürfen, die an die IL-8RA- und -RB-Rezeptoren binden. Chemokin-vermittelte Krankheiten zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung in Tieren schließen Krankheitszustände wie die hier im Abschnitt Behandlungsverfahren angegebenen ein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind:
4-[[3-(2-Bromphenyl)-4-oxo-1-(phenylmethyl)-2-imidazolidinyliden]imino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[[(7aS)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[[5-(2-Bromphenyl)-3,3a,4,5-tetrahydro-1,1-dioxido-4-oxoimidazo[1,5-b]isothiazol-6(2H)-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[[(6R,7aS)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-6-hydroxy-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[[(7aR)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[(S)-2-(2,3-Dichlorphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[(R)-2-(2,3-Dichlorphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[2-(2,3-Dichlorphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[(S)-2-(2-Bromphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[(R)-2-(2-Bromphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril;
4-[2-(2-Bromphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril; und
4-[[2-(2-Bromphenyl)-1,5,6,7,8,8a-hexahydro-1-oxoimidazo[1,5-a]pyridin-3(2H)-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril;
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Geeignete pharmazeutisch akzeptable Salze sind den Fachleuten wohlbekannt und schließen basische Salze von anorganischen und organischen Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Essigsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Phenylessigsäure und Mandelsäure ein. Zusätzlich können pharmazeutisch akzeptable Salze von Verbindungen der Erfindung auch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Kation gebildet werden, zum Beispiel wenn eine Substituentengruppe eine Carboxyeinheit umfaßt. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Kationen sind den Fachleuten wohlbekannt und schließen Alkali-, Erdalkali-, Ammonium- und quaternäre Ammoniumkationen ein.
Herstellungsverfahren
Die Verbindungen der Erfindung können durch Einsatz von Syntheseverfahren erhalten werden, von denen einige in den nachfolgenden Schemata veranschaulicht werden.
Sobald der Guanidinkern etabliert wurde, können weitere Verbindungen dieser Formeln durch Einsatz von Standardtechniken zur gegenseitigen Umwandlung von funktionellen Gruppen, die wohlbekannt auf dem Gebiet sind, hergestellt werden. Schema 1
a) Br₂, NaOAc, HOAc; b) CuCN, DMF, Reflux; c) (BOC)₂O, DMAP, TEA; d) K₂CO₃, MeOH; e) TFA
Das gewünschte Anilin 6-Schema-1 kann aus dem handelsüblichen Benzoxazolinon 1-Schema-1 hergestellt werden. Bromid 2-Schema-1 kann aus Benz oxazolinon 1-Schema-1 unter Verwendung von Standard-Bromierungsbedingungen wie Brom und Natriumacetat in Essigsäure hergestellt werden. Das Bromid 2-Schema-1 kann zum Cyanid 3-Schema-1 unter Verwendung von Standardverfahren wie Kupfer(I)-Cyanid in refluxierendem DMF umgewandelt werden. Das Amid 3-Schema-1 kann zur BOC-schützenden Verbindung 4-Schema-1 unter Verwendung von Standardbedingungen wie BOC-Anhydrid und Triethylamin mit einer katalytischen Menge Dimethylaminopyridin in Methylenchlorid oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel umgewandelt werden. Das Oxazolinon 4-Schema-1 kann zum gewünschten Anilin 6-Schema-1 durch zunächst Hydrolyse zum Phenol 5-Schema-1 unter Verwendung von Standardbedingungen wie Kaliumcarbonat in Methanol, gefolgt von der Entfernung der BOC-Schutzgruppe unter Verwendung von Standardbedingungen wie Trifluoressigsäure in Methylenchlorid oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel umgewandelt werden, um das Anilin 6-Schema-1 zu ergeben. Schema 2
a) RNCS; B) TBSCl; c) Thiophosgen; d) RNH₂
Der gewünschte Thioharnstoff 3-Schema-2 kann wie in Schema 2 umrissen hergestellt werden. Das Anilin 1-Schema-2 kann mit einem handelsüblichen Isothiocyanat oder mit einem Isothiocyanat gekuppelt werden, das aus der Kondensation eines handelsüblichen Amins mit Thiophosgen oder einem Thiophosgenäquivalent hergestellt wurde, um den Thioharnstoff 2-Schema-2 zu ergeben. Des Phenol 2-Schema-2 kann als TBS-Ether 3-Schema-2 unter Verwendung von Standardbedingungen wie TBSCl und Imidazol in THF oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel geschützt werden. Alternativ kann das Amin 1-Schema-2 zum Isothiocyanat 5-Schema-2 durch zunächst Schützen des Phenols 1-Schema-2 mit einer geeigneten Schutzgruppe wie dem TBS-Ether 4-Schema-2 unter Verwendung von Standardbedingungen wie TBSCl und einer Aminbase wie Imidazol in THF oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel umgewandelt werden. Der Thioharnstoff 5-Schema-2 kann durch Kondensation des Amins 4-Schema-2 mit Thiophosgen in Gegenwart einer Base wie Kaliumcarbonat hergestellt werden. Der gewünschte Thioharnstoff 3-Schema-2 kann aus dem Isothiocyanat 5-Schema-2 durch Kondensation mit dem gewünschten Amin in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Ethanol oder DMF hergestellt werden. Schema 3
a) MsCl, TEA; b) Aminoester, THF c) TBAF, THF
Das gewünschte Lactam 3-Schema-3 kann wie in Schema 3 umrissen hergestellt werden. Das Carbodiimid 2-Schema-3 kann aus dem Thioharnstoff 1-Schema-3 unter Verwendung von Standardbedingungen wie mit einer überschüssigen Menge Methansulfonylchlorid und einer geeigneten Aminbase wie Triethylamin in einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt Methylenchlorid, bei Raumtemperatur hergestellt werden. Das Lactam 3-Schema-3 kann aus dem Carbodiimid 2-Schema-3 durch zunächst Kondensation des Carbodiimids 2-Schema-3 mit dem gewünschten α-Aminoester in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie THF, gefolgt von der Entfernung der TBS-Gruppe unter Verwendung von Standardbedingungen wie TBAF in THF bei 0°C hergestellt werden.
Synthesebeispiele
Die Erfindung wird jetzt durch Verweis auf die folgenden Beispiele beschrieben werden, die bloß illustrativ sind und nicht als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung aufzufassen sind. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben, alle Lösungsmittel sind von der höchsten verfügbaren Reinheit, und alle Reaktionen werden unter wasserfreien Bedingungen in einer Argonatmosphäre durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist.
In den Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius (°C). Massenspektren wurden an einem Massenspektrometer VG Zab unter Verwendung von Fast Atom Bombardment durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. ¹H-NMR-Spektren (nachfolgend "NMR") wurden bei 250 MHz unter Verwendung eines Spektrometers Bruker AM 250 oder Am 400 aufgezeichnet. Die angegebenen Multiplizitäten sind: s = Singulett, D = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, M = Multiplett, und br zeigt ein breites Signal an. Ges. zeigt eine gesättigte Lösung an, Äq. zeigt den Anteil eines molaren Äquivalents von Reagens relativ zum Hauptreaktanden an.
Beispiel 1
Herstellung von 4-[[3-(2-Bromphenyl)-4-oxo-1-(phenylmethyl)-2-imidazolidinyliden]imino]-3-hydroxybenzonitril
a) Herstellung von 4-Brom-1,2-benzoxazolinon
Zu einer Lösung aus Benzoxazolinon (10 g, 74 mmol) in Essigsäure (50 ml) bei 0°C wurden Natriumacetat (7,4 g, 74 mmol) und Brom (3,8 ml, 74 mmol) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde auf RT erwärmen gelassen. Nach 21 h wurde der Niederschlag durch Filtration aufgefangen und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um ein festeres Material zu ergeben, das durch Filtration aufgefangen wurde, gefolgt von Waschen mit Wasser. Das Material wurde vereinigt, um 14 g (88 %) 4-Brom-1,2-benzoxazolinon als gelben Feststoff zu ergeben, der keine weitere Reinigung erforderte.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 7,6 (1H), 7,3 (d, 1H), 7,0 (d, 1H);
MS(EI) m/e 212 (M⁺).
b) Herstellung von 4-Cyano-1,2-benzoxazolinon
Zu einer Lösung aus 4-Brom-1,2-benzoxazolinon (5,0 g, 23 mmol) in DMF (11 ml) wurde Kupfer(I)-cyanid (3,6 g, 39 mmol) gegeben und die Reaktion auf 165°C erwärmt. Nach 6,5 h wurde die Reaktionsmischung auf RT abgekühlt, und Wasser (20 ml) und Natriumcyanid (3,6 g) wurden hinzugegeben und die Reaktion auf 100°C erwärmt. Nach 12 h wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten organischen Schichten wurden durch ein Kissen aus Kieselgel unter Elution mit Ethylacetat filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck auf konzentriert, um 1,9 g (51 %) 4-Cyano-1,2-benzoxazolinon als braunen Feststoff zu ergeben, der keine weitere Reinigung erforderte.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 7,8 (s, 1H), 7,6 (d, 1H), 7,2 (d, 1H).
c) Herstellung von N-t-Butylacetoxy-4-cyano-1,2-benzoxazolinon
Zu einer Lösung aus 4-Cyano-1,2-benzoxazolinon (1,9 g, 15 mmol) in THF (50 ml) bei 0°C wurden Triethylamin (2,5 ml, 18 mmol), DMAP (0,37 g, 3,0 mmol) und BOC-Anhydrid (4,3 g, 20 mmol) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde auf RT erwärmen gelassen. Nach 1,5 h wurde die Mischung mit Wasser (100 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um 4,3 g (100 %) N-t-Butylacetoxy-4-cyano-1,2-benzoxazolinon als gelben Feststoff zu ergeben, der keine weitere Reinigung erfordert.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7,8 (d, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,45 (s, 1H), 1,65 (s, 9H).
d) Herstellung von N-t-Butylacetoxy-4-cyano-2-hydroxylanilin
Zu einer Lösung aus N-t-Butylacetoxy-4-cyano-1,2-benzoxazolinon (4,3 g, 16 mmol) in Methanol (50 ml) wurde Kaliumcarbonat (2,3 g, 16 mmol) gegeben. Nach 1,5 h wurde die Reaktion mit Wasser (100 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um 3,1 g (81 %) N-t-Butylacetoxy-4-cyano-2-hydroxylanilin als braunen Schaum zu ergeben, der keine weitere Reinigung erforderte.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7,7 (d, 1H), 7,15 (s, 1H), 7,1 (d, 1H), 1,5 (s, 9H).
e) Herstellung von 4-Cyano-2-hydroxylanilin
Zu einer Lösung aus N-t-Butylacetoxy-4-cyano-2-hydroxylanilin (3,1 g, 13 mmol) in Methylenchlorid (100 ml) bei 0°C wurde Trifluoressigsäure gegeben, und die Reaktionsmischung wurde auf RT erwärmen gelassen. Nach 2,5 h wurde die Reaktion mit Wasser (100 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Säulenchromatographie (50 % Ethylacetat/Hexan) gereinigt, um 1,7 g (96 %) 4-Cyano-2-hydroxylanilin als braunen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 7,0 (d, 1H), 6,85 (s, 1H), 6,65 (d, 1H);
MS(EI) m/e 134 (M⁺).
f) Herstellung von N-(4-Cyano-2-hydroxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)thioharnstoff
Zu einer Lösung aus 4-Cyano-2-hydroxylanilin (1,0 g, 7,5 mmol) in Ethanol (20 ml) wurde 2-Bromphenylisothiocyanat (1,0 ml, 7,5 mmol) gegeben. Nach 24 h wurde die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um 2,0 g (77 %) N-(4-Cyano-2-hydroxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)thioharnstoff als gelben Feststoff zu ergeben, der keine weitere Reinigung erforderte.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 10,8 (s, 1H), 10,1 (s, 1H), 9,6 (s, 1H), 8,7 (d, 1H), 7,7 (d, 1H), 7,6 (d, 1H), 7,4 (t, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,2 (s, 1H und d, 2H);
MS(EI) m/e 229 (100), 348 (75 (M⁺)), 462 (30), 695 (10).
g) Herstellung von N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)thioharnstoff
Zu einer Lösung aus N-(4-Cyano-2-hydroxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)thioharnstoff (3,5 g, 10 mmol) in THF (50 ml) bei 0°C wurden Imidazol (1,0 g, 15 mmol) und TBSC1 (1,5 g, 10 mmol) gegeben. Nach 1 h wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (100 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck auf konzentriert. Das Rohmaterial wurde aus Ethylacetat kristallisiert, um 3,9 g (84 %) N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)thioharnstoff als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 9,9 (s, 1H), 9,2 (s, 1H), 8,1 (d, 1H), 7,7 (d, 1H), 7,6 (d, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,4 (t, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,2 (t, 1H);
MS(EI) m/e 347 (100 (M⁺)), 175 (40), 461 (40).
h) Herstellung von N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)carbodümid
Zu einer Lösung aus N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)thioharnstoff (3,4 g, 7,4 mmol) in Methylenchlorid (40 ml) bei 0°C wurden Triethylamin (3,1 ml, 22 mmol), DMAP (20 mg) und Methansulfonylchlorid (1,1 ml, 15 mmol) gegeben. Nach 25 min wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (100 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um 3,3 g (100 %) N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)carbodiimid als gelben Feststoff zu ergeben, der keine weitere Reinigung erforderte.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 7,7 (d, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,4 (m, 4H), 7,15 (t, 1H).
i) Standardverfahren zur Synthese von cyclischen Tetraalkylguanidinen. Herstellung von 4-[[3-(2-Bromphenyl)-4-oxo-1-(phenylmethyl)-2-imidazolidinyliden]imino]-3-hydroxybenzonitril
Zu einer Lösung aus N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)carbodiimid (86 mg, 0,20 mmol) in THF (2 ml) wurden Diisopropylethylamin (25 μl, 0,57 mmol) und N-Benzylglycinethylester (41 mg, 0,22 mmol) gegeben. Nach 15 min wurden zur Mischung Methanol (0,1 ml) und dann TBAF (0,24 ml, 0,24 mmol) bei 0°C gegeben. Nach 30 min wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (2 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Das Rohmaterial wurde durch Umkristallisation (Methylenchlorid/Hexan) gereinigt, um 74,5 mg (80 %) 4-[[3-(2-Bromphenyl)-4-oxo-1-(phenylmethyl)-2-imidazolidinyliden]imino]-3-hydroxybenzonitril als braunes Pulver zu ergeben.
¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ: 7,45 (2H, d), 7,35 (2H, t), 7,3 (1H, d), 7,25 (1H, d), 7,15 (1H, d), 6,9 (3H, m), 6,8 (1H, d), 6,6 (1H, t), 4,6 (2H, m), 4,0 (2H, s);
MS(EI) m/e: 463 (100 (M⁺)).
j) Herstellung von 4-[[(7aS)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril
Das Standardverfahren wurde unter Verwendung von N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)carbodiimid (54 mg, 0,13 mmol), Diisopropylethylamin (32 μl, 0,29 mmol), L-Prolinbenzylesterhydrochlorid (34 mg, 0,14 mmol) und TBAF (0,16 ml, 0,16 mmol) in THF (2 ml) und Methanol (0,1 ml) befolgt, um 36 mg (67 %) 4-[[(7aS)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril als braunes Pulver zu ergeben.
¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ: 7,6 (2H, m), 7,35 (3H, m), 7,15 (1H, m), 7,0 (1H, m), 4,5 (1H, t), 3,0 (1H, m), 2,4 (1H, m), 2,2 (1H, m), 2,05 (2H, m);
MS(EI) m/e 412 (M⁺).
k) Herstellung von 4-[[5-(2-Bromphenyl)-3,3a,4,5-tetrahydro-1,1-dioxido-4-oxoimidazo[1,5-b]isothiazol-6(2H)-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril
Das Standardverfahren wurde unter Verwendung von N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)carbodiimid (60 mg, 0,14 mmol), Diisopropylethylamin (17 μl, 0,15 mmol), Aminoester (27 mg, 0,15 mmol) und TBAF (0,17 ml, 0,15 mmol) in THF (1,5 ml) und Methanol (0,1 ml) befolgt, um 46 mg (71 %) 4-[[5-(2-Bromphenyl)-3,3a,4,5-tetrahydro-1,1-dioxido-4-oxoimidazo[1,5-b]isothiazol-6(2H)-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril als braunes Pulver zu ergeben.
¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ: 8,1 (1H, d), 7,8 (1H, s), 7,75 (1H, d), 7,7 (1H, d), 7,6 (2H, m), 7,25 (1H, t), 4,35 (1H, t), 3,9 (2H, s), 3,25 (1H, t), 2,9 (1H, m), 2,7 (1H, m);
MS(EI) m/e 330 (100), 662 (20).
1) Herstellung von 4-[[(6R,7aS)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-6-hydroxy-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril
Das Standardverfahren wurde unter Verwendung von N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)carbodiimid (102 mg, 0,24 mmol), Diisopropylethylamin (60 μl, 0,26 mmol), Hydroxy-L-prolinmethylesterhydrochlorid (44 mg, 0,26 mmol) und TBAF (0,29 ml, 0,29 mmol) in THF (2,5 ml) und Methanol (0,1 ml) befolgt, um 80 mg (78 %) 4-[[(6R,7aS)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-6-hydroxy-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril als braunes Pulver zu ergeben.
MS(EI) m/e 427 (100 (M⁺)).
m) Herstellung von 4-[[(7aR)-2-(2-bromphenyl)-hexahydro-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril
Das Standardverfahren wurde unter Verwendung von N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)carbodiimid (107 mg, 0,25 mmol), Diisopropylethylamin (71 μl, 0,55 mmol), D-Prolinmethylesterhydrochlorid (46 mg, 0,28 mmol) und TBAF (0,30 ml, 0,30 mmol) in THF (2,5 ml) und Methanol (0,1 ml) befolgt, um 80 mg (78 %) 4-[[(7aR)-2-(2-bromphenyl)-hexahydro-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril als braunes Pulver zu ergeben.
MS(EI) m/e 411 (100(M⁺)).
n) Herstellung von 4-[[2-(2-Bromphenyl)-1,5,6,7,8,8a-hexahydro-1-oxoimidazo[1,5-a]pyridin-3(2H)-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril
Das Standardverfahren wurde unter Verwendung von N-(4-Cyano-2-t-butyldimethylsilanoxyphenyl)-N'-(2-bromphenyl)carbodiimid (106 mg, 0,25 mmol), Diisopropylethylamin (71 μl, 0,28 mmol), Methylpipecolinathydrochlorid (50 mg, 0,28 mmol) und TBAF (0,30 ml, 0,30 mmol) in THF (2,5 ml) und Methanol (0,1 ml) befolgt, um 80 mg (75 %) 4-[[2-(2- Bromphenyl)-1,5,6,7,8,8a-hexahydro-1-oxoimidazo[1,5-a]pyridin-3(2H)-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril als braunes Pulver zu ergeben.
MS(EI) m/e 425 (100 (M⁺)).
Behandlungsverfahren
Die Verbindungen der Erfindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon können in der Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung jedes Krankheitszustandes in einem Menschen oder anderen Säuger verwendet werden, der durch übermäßige oder unregulierte 2L-8-Cytokin-Produktion durch die Zellen eines solchen Säugers verschlimmert oder verursacht wird, wie zum Beispiel (ohne Beschränkung) Monozyten und/oder Makrophagen, oder durch andere Chemokine, die an den IL-8α- oder -β-Rezeptor binden, auch als Rezeptor Typ I oder Typ II bezeichnet. Insbesondere sind die Chemokine IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78.
Die Verbindungen der Erfindung werden in einer ausreichenden Menge verabreicht, um die Cytokinfunktion zu hemmen, insbesondere von IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78, so daß sie biologisch auf normale Spiegel der physiologischen Funktion oder in manchen Fällen auf subnormale Spiegel herabreguliert wird, um den Krankheitszustand zu lindern. Abnormale Spiegel von IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78 im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung stellen zum Beispiel dar: (i) Spiegel von freiem IL-8, die größer als oder gleich 1 pg pro ml sind; (ii) jedes zellgebundene IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78 oberhalb normaler physiologischer Spiegel; oder (iii) die Gegenwart von IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78 oberhalb von Basisspiegeln in Zellen oder Geweben, in denen IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 bzw. ENA-78 erzeugt wird.
Es kann viele Krankheitszustände geben, in denen eine übermäßige oder unregulierte 2L-8-Produktion mit der Verschlimmerung und/oder Verursachung der Krankheit in Verbindung steht. Chemokin-vermittelte Krankheiten schließen Psoriasis, atopische Dermatitis, Arthritis, Asthma, chronischobstruktive Lungenkrankheit, respiratorisches Distress-Syndrom des Erwachsenen, entzündliche Darmkrankheit, Morbus Crohn, ulzeröse Kolitis, Schlaganfall, septischen Schock, endotoxischen Schock, Gram-negative Sepsis, toxisches Schocksyndrom, kardiale und renale Reperfusionsverletzung, Glomerulonephritis, Thrombose, Transplantat-Wirt-Reaktion, Alzheimer-Krankheit, Allotransplantatabstoßungen, Malaria, Restenose, Angiogenese, Atherosklerose, Osteoporose, Gingivitis und unerwünschte hämatopoetische Stammzellfreisetzung ein.
Diese Krankheiten sind primär durch eine massive Neutrophilinfiltration, T-Zellinfiltration oder neovaskuläres Wachstum gekennzeichnet und sind mit einer erhöhten IL-8-, GROα-, GROβ-, GROγ- oder NAP-2-Produktion verbunden, die verantwortlich für die Chemotaxis von Neutrophilen in den Entzündungsort oder das gerichtete Wachstum von Endothelzellen ist. Im Gegensatz zu anderen inflammatorischen Cytokinen (IL-1, TNF und IL-6) hat IL-8, GROα, GROβ, GROγ oder NAP-2 die besondere Eigenschaft der Förderung der Neutrophilchemotaxis, Enzymfreisetzung, einschließlich (ohne Beschränkung) Elastasefreisetzung, sowie der Superoxidproduktion und -aktivierung. Die α-Chemokine, aber insbesondere GROα, GROβ, GROγ und NAP-2, die durch den IL-8-Rezeptortyp I oder II wirken, können die Neovaskularisation von Tumoren durch Förderung des gerichteten Wachstums von Endothelzellen fördern. Deshalb würde die Inhibierung von IL-8-induzierter Chemotaxis oder Aktivierung zu einer direkten Reduzierung der Neutrolphilinfiltration führen.
Kürzliche Hinweise bringen auch die Rolle von Chemokinen mit der Behandlung von HIV-Infektionen in Verbindung, Littleman et al., Nature 381, S. 661 (1996) und Koup et al., Nature 381, S. 667 (1996).
TNF-α ist ein Cytokin mit proinflammatorischen Wirkungen, einschließlich der endothelialen Leukozytenadhäsionsmolekülexpression. Leukozyten infiltrieren in ischämische Hirnläsionen, und deshalb wären Verbindungen, die die Spiegel von TNF hemmen oder verringern, nützlich zur Behandlung von ischämischer Hirnverletzung. Siehe Liu et al., Stroke, Bd. 25, Nr. 7, S. 1481-88 (1994).
Modelle für geschlossene Kopfverletzungen und die Behandlung mit gemischten 5-LO/CO-Mittel werden in Shohami et al, erörtert, J. of Vaisc. & Clinical Physiology and Pharmacology, Bd. 3, Nr. 2, S. 99–107 (1992).
Die Verbindungen der Erfindung sollen in einer Menge verabreicht werden, die ausreichend ist, um die Bindung an die IL-8α- oder -β-Rezeptoren zu hemmen, wie es durch eine Reduzierung der Neutrophilchemotaxis und -aktivierung belegt wird. Der Befund, daß die Verbindungen der Erfindung Inhibitoren der IL-8-Bindung sind, beruht auf den Wirkungen der Verbindungen der Erfindung in den nachfolgend beschriebenen in-vitro-Rezeptorbindungstests. Die Verbindungen der Erfindung haben sich in manchen Fällen als duale Inhibitoren beider rekombinanten IL-8-Rezeptoren vom Typ I und Typ II erwiesen. Bevorzugt sind die Verbindungen Inhibitoren nur eines Typs, besonders bevorzugt des Typs II.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "IL-8-vermittelte(r) Krankheit oder Krankheitszustand" jeden und alle Krankheitszustände, in denen IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78 eine Rolle spielt, entweder durch Produktion von IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78 selbst oder dadurch, daß IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78 die Freisetzung eines anderen Monokins wie IL-1, IL6 oder TNF (ohne Beschränkung) verursacht. Ein Krankheitszustand, in dem zum Beispiel IL-1 eine Hauptkomponente ist, und dessen Produktion oder Wirkung als Reaktion auf IL-8 verschlimmert oder sezerniert wird, würde deshalb als ein durch IL-8 vermittelter Krankheitszustand betrachtet werden.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Chemokin-vermittelte r) Krankheit oder Krankheitszustand" jeden und alle Krankheitszustände, in denen ein Chemokin, das an einen IL-8α- oder -β-Rezeptor bindet, eine Rolle spielt, wie z.B. ohne Beschränkung IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2 oder ENA-78. Dies würde einen Krankheitszustand einschließen, in dem IL-8 eine Rolle spielt, entweder durch Produktion von IL-8 selbst oder dadurch, daß IL-8 die Freisetzung eines anderen Monokins wie ohne Beschränkung IL-1, IL-6 oder TNF verursacht. Ein Krankheitszustand, in dem zum Beispiel IL-1 eine Hauptkomponente ist, und dessen Produktion oder Wirkung als Reaktion auf IL-8 verschlimmert oder sezerniert wird, würde deshalb als ein durch IL-8 vermittelter Krankheitszustand betrachtet.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Cytokin" jedes sezernierte Polypeptid, das die Funktionen von Zellen beeinflußt und ein Molekül ist, das Wechselwirkungen zwischen Zellen in der Immun-, inflammatorischen oder hämatopoetischen Reaktion moduliert. Eine Cytokin schließt ohne Beschränkung Monokine und Lymphokine ein, unabhängig davon, welche Zellen sie produzieren. Zum Beispiel wird ein Monokin allgemein als durch eine mononukleäre Zelle wie einen Makrophagen und/oder Monozyten produziert und sezerniert bezeichnet. Viele andere Zellen erzeugen jedoch auch Monokine, wie natürliche Killerzellen, Fibroblasten, Basophile, Neutrophile, Endothelzellen, Hirnastrozyten, Knochenmark-Stromazellen, epiderale Keratinozyten und B-Lymphozyten. Lymphokine werden allgemein als durch Lymphozyten erzeugt bezeichnet. Beispiele für Cytokine schließen ohne Beschränkung Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und Tumornekrosefaktor-beta (TNF-β) ein.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Chemokin" jedes sezernierte Polypeptid, das die Funktionen von Zellen beeinflußt und ein Molekül ist, das Wechselwirkungen zwischen Zellen in der Immun-, inflammatorischen oder hämatopoetischen Reaktion moduliert, ähnlich dem obigen Begriff "Cytokin". Ein Chemokin wird primär durch Zelltransmembranen sezerniert und verursacht die Chemotaxis und Aktivierung von spezifischen weißen Blutkörperchen und Leukozyten, Neutrophilen, Monozyten, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, Endothelzellen und glatten Muskelzellen. Beispiele für Chemokine schließen ohne Beschränkung IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, IP-10, MIP-1α, MIP-β, PF4 und MCP 1, 2 und 3 ein.
Zur Verwendung einer Verbindung der Erfindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon in der Therapie wird sie (es) normalerweise zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß pharmazeutischer Standardpraxis formuliert werden. Diese Erfindung betrifft deshalb auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame, nicht-toxische Menge einer Verbindung der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsstoff umfaßt.
Verbindungen der Erfindung, pharmazeutisch akzeptable Salze davon und pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie beinhalten, können zweckmäßig auf jedem der Wege verabreicht werden, die herkömmlich zur Wirkstoffverabreichung verwendet werden, zum Beispiel oral, topisch, parenteral oder durch Inhalation. Die Verbindungen der Erfindung können in herkömmlichen Arzneiformen verabreicht werden, die durch Kombinieren einer Verbindung der Erfindung mit pharmazeutischen Standardträgern gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Die Verbindungen der Erfindung können auch in herkömmlichen Dosierungen in Kombination mit einer bekannten zweiten therapeutisch wirksamen Verbindung verabreicht werden. Diese Verfahren können das Vermischen, Granulieren und Verpressen oder Auflösen der Bestandteile nach Eignung für die gewünschte Zubereitung beinhalten. Man wird einsehen, daß die Form und Eigenschaft des pharmazeutisch akzeptablen Trägers oder Verdünnungsmittels durch die Menge des Wirkstoffs, der zu kombinieren ist, den Verabreichungsweg und andere wohlbekannte Variablen diktiert wird. Der (die) Träger muß (müssen) "akzeptabel" in dem Sinne sein, daß er (sie) mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und nicht nachteilig für den Empfänger ist (sind).
Der eingesetzte pharmazeutische Träger kann zum Beispiel entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Exemplarische feste Träger sind Lactose, Kaolin, Saccharose, Talkum, Gelatine, Agar, Pectin, Gummi arabicum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dgl. Exemplarische flüssige Träger sind Sirup, Erdnußöl, Olivenöl und Wasser. In ähnlicher Weise kann der Träger oder das Verdünnungsmittel ein fachbekanntes Zeitverzögerungsmaterial einschließen, wie zum Beispiel Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs.
Eine große Vielzahl pharmazeutischer Formen kann eingesetzt werden. Falls somit ein fester Träger verwendet wird, kann die Zubereitung tablettiert, in eine Hartgelatinekapsel in Pulver- oder Pelletform plaziert werden oder in Form einer Pastille oder Lutschtablette sein. Die Menge des festen Trägers wird weithin variieren, aber wird bevorzugt von ca. 25 mg bis ca. 1 g sein. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, wird die Zubereitung in Form eines Sirups, einer Emulsion, einer Weichgelatinekapsel, einer sterilen injizierbaren Flüssigkeit wie einer Ampulle oder einer nicht-wäßrigen flüssigen Suspension sein.
Verbindungen der Erfindung können topisch verabreicht werden, das heißt durch nicht-systemische Verabreichung. Dies schließt die äußere Anwendung einer Verbindung der Erfindung auf die Epidermis oder Backenhöhle und das Einträufeln einer solchen Verbindung in das Ohr, das Auge und die Nase ein, so daß die Verbindung den Blutstrom nicht signifikant betritt. Im Gegensatz bezeichnet die systemische Verabreichung die orale, intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung.
Zur topischen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen flüssige oder halbflüssige Zubereitungen ein, die zur Durchdringung durch die Haut zum Entzündungsort geeignet sind, wie Einreibemittel, Lotionen, Cremes, Salben oder Pasten und zur Verabreichung an das Auge, das Ohr oder die Nase geeignete Tropfen. Der Wirkstoff kann zur topischen Verabreichung 0,001 bis 10 % G/G, zum Beispiel 1 bis 2 Gew.% der Formulierung, umfassen. Er kann jedoch so viel wie 10 % G/G umfassen, aber wird bevorzugt weniger als 5 % G/G umfassen, besonders bevorzugt 0,1 bis 1 % G/G der Formulierung.
Erfindungsgemäße Lotionen schließen diejenigen ein, die zur Anwendung auf die Haut oder das Auge geeignet sind. Eine Augenlotion kann eine sterile wäßrige Lösung umfassen, die gegebenenfalls ein Bakterizid enthält, und kann durch Verfahren hergestellt werden, die ähnlich denjenigen zur Herstellung von Tropfen sind. Lotionen oder Einreibemittel zur Anwendung auf die Haut können auch ein Mittel zur Beschleunigung des Trocknens und zur Abkühlung der Haut, wie zum Beispiel einen Alkohol oder Aceton, und/oder ein Feuchthaltemittel wie Glycerin oder ein Öl wie Rizinusöl oder Erdnußöl einschließen.
Cremes, Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden Erfindung sind halbfeste Formulierungen des Wirkstoffs zu äußeren Anwendung. Sie können durch Vermischen des Wirkstoffs in feinverteilter oder gepulverter Form, allein oder in Lösung oder Suspension in einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Flüssigkeit, mit Hilfe geeigneter Ausrüstung mit einer fettigen oder nicht-fettigen Basis hergestellt werden. Die Basis kann Kohlenwasserstoffe wie hartes, weiches oder flüssiges Paraffin, Glycerin, Bienenwachs, eine Metallseife; einen Schleim; ein Öl natürlichen Ursprungs wie Mandelöl, Maisöl, Erdnußöl, Rizinusöl oder Olivenöl; Wollfett oder seine Derivate oder eine Fettsäure wie Stearin- oder Oleinsäure zusammen mit einem Alkohol wie Propylenglykol oder einem Makrogel umfassen. Die Formulierung kann jedes geeignete Tensid wie ein anionisches, kationisches oder nichtionisches Tensid wie einen Sorbitanester oder ein Polyoxyethylen-Derivat davon beinhalten. Suspendiermittel wie natürliche Gummen, Cellulose-Derivate oder anorganische Stoffe wie kieselerdehaltige Kieselerden und andere Bestandteile wie Lanolin können auch eingeschlossen werden.
Erfindungsgemäße Tropfen können sterile wäßrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen umfassen und können durch Auflösen des Wirkstoffs in einer geeigneten wäßrigen Lösung eines bakteriziden und/oder fungiziden Mittels und/oder jedes anderen geeigneten Konservierungsmittels und bevorzugt unter Einschluß eines Tensids hergestellt werden. Die resultierende Lösung kann dann durch Filtration geklärt und in einen geeigneten Behälter überführt werden, der dann versiegelt und durch Autoklavieren oder Halten auf 98–100°C für eine halbe Stunde sterilisiert wird. Alternativ kann die Lösung durch Filtration sterilisiert und in den Behälter durch eine aseptische Technik überführt werden. Beispiele für bakterizide und fungizide Mittel, die zum Einschluß in den Tropfen geeignet sind, sind Phenylquecksilbernitrat oder -acetat (0,002 %), Benzalkoniumchlorid (0,01 %) und Chlorhexidinacetat (0,01 %). Geeignete Lösungsmittel zur Herstellung einer öligen Lösung schließen Glycerin, verdünnten Alkohol und Propylenglykol ein.
Verbindungen der Erfindung können parenteral verabreicht werden, das heißt durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intranasale, intrarektale, intravaginale oder intraperitoneale Verabreichung. Die subkutanen und intramuskulären Formen der parenteralen Verabreichung sind allgemein bevorzugt. Geeignete Arzneiformen für eine solche Verabreichung können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden. Verbindungen der Erfindung können auch durch Inhalation verabreicht werden, das heißt durch intranasale und orale Inhalationsverabreichung. Geeignete Arzneiformen für eine solche Verabreichung, wie zum Beispiel eine Aerosolformulierung oder ein Dosierinhalator, können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden.
Für alle hier für die Verbindungen der Erfindung offenbarten Verwendungsverfahren wird das tägliche orale Dosierungsschema bevorzugt von ca. 0,01 bis ca. 80 mg/kg Gesamtkörpergewicht sein. Das tägliche parenterale Dosierungsschema ist ca. 0,001 bis ca. 80 mg/kg Gesamtkörpergewicht. Das tägliche topische Dosierungsschema wird bevorzugt 0,1 bis 150 mg sein, verabreicht 1- bis 4-, bevorzugt 2- oder 3-mal täglich. Das tägliche Inhalationsdosierungsschema wird bevorzugt von ca. 0,01 bis ca. 1 mg/kg/Tag sein. Ein Fachmann wird auch anerkennen, daß die optimale Menge und der Abstand individueller Dosierungen einer Verbindung der Erfindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon durch die Natur und das Ausmaß des behandelten Zustands, die Form, den Weg und den Ort der Verabreichung und den besonderen behandelten Patienten bestimmt werden, und daß solche Optima durch herkömmliche Techniken bestimmt werden können. Ein Fachmann wird ebenfalls einsehen, daß der optimale Behandlungsverlauf, d.h. die Anzahl der Dosen einer Verbindung der Erfindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, die pro Tag für eine definierte Anzahl von Tagen gegeben werden, durch die Fachleute unter Verwendung herkömmlicher Bestimmungstests für den Behandlungsverlauf sichergestellt werden können.
Die Erfindung wird jetzt durch Verweis auf die folgenden biologischen Beispiele beschrieben werden, die bloß illustrativ sind und nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung aufzufassen sind.
Biologische Beispiele
Die IL-8- und GROα-Chemokin-inhibitorischen Wirkungen von Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden durch den folgenden Invitro-Test bestimmt.
Rezeptorbindungstests
[¹²⁵I]-IL-8 (human, rekombinant) wurde von Amersham Corp., Arlington Heights, IL, mit einer spezifischen Aktivität von 2000 Ci/mmol erhalten. GROα wurde von NEN-New England Nuclear erhalten. Alle anderen Chemikalien waren von Analysenqualität. Hohe Spiegel von rekombinanten humanen IL-8-Typ α- und β-Rezeptoren wurden individuell in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters wie zuvor beschrieben exprimiert (Holmes et al., Science 1991, 253, 1278). Die Ovarialmembranen des Chinesischen Hamsters wurden gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll homogenisiert (Haour et al., J. Biol. Chem., 249, S. 2195–2205 (1974)), außer daß der Homogenisierungspuffer verändert wurde zu 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgSO₄, 0,5 mM EDTA (Ethylen diamintetraessigsäure), 1 mM PMSF (α-Toluolsulfonylfluorid), 0,5 mg/l Leupeptin, pH 7,5. Die Membranproteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Mikrotestkits von Pierce Co. unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Alle Tests wurden in einem Mikroplattenformat mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Jede Reaktionsmischung enthielt [¹²⁵I]-IL-8 (0,25 nM) oder [¹²⁵I]-GROα und 0,5 μg/ml IL-8Rα- oder 1,0 μg/ml IL-8Rβ-Membranen in 20 mM Bis-Trispropan und 0,4 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, enthaltend 1,2 mM MgSO₄, 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCl und 0,03 % CHAPS. Zusätzlich wurde Wirkstoff oder Verbindung von Interesse hinzugegeben, der/die zuvor in DMSO gelöst worden war, um eine Endkonzentration zwischen 0,01 nM und 100 μM zu erreichen. Der Test wurde durch Zugabe von [¹²⁵I]-IL-8 eingeleitet. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Platte unter Verwendung eines Tomtec-Ernters mit 96 Vertiefungen auf einer Glasfaserfiltermatte geerntet, mit 1 % Polyethylenimin/0,5 % BSA blockiert und 3-mal mit 25 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, 1 mM MgSO₄, 0,5 mM EDTA, 0,03 % CHAPS, pH 7,4 gewaschen. Der Filter wurde dann getrocknet und auf dem Betaplate-Flüssigszintillationszähler gezählt. Der rekombinante IL-8 Rα- oder Typ I-Rezeptor wird hier auch als nicht-permissiver Rezeptor bezeichnet, und der rekombinante IL-8 Rβ- oder Typ II-Rezeptor wird als permissiver Rezeptor bezeichnet.
Alle hier im Abschnitt Synthesechemie angegebenen Verbindungen, Beispiel 1 bis 15, zeigten einen IC₅₀-Wert von ca. 45 bis ca. < 1 μg/ml in den permissiven Modellen für die IL-8-Rezeptorinhibierung. Unter den getesteten Verbindungen wurde auch festgestellt, daß die Beispiele 1 bis 12 Inhibitoren der GRO-α-Bindung auf etwa dem gleichen Niveau waren.
Chemotaxistest:
Die in-vitro-inhibitorischen Eigenschaften dieser Verbindungen werden im Neutrophil-Chemotaxistest bestimmt, wie er beschrieben wird in Current Protocols in Immunology, Bd. I, Suppl. 1, Einheit 6.12.3. Neutrophile wurden aus Humanblut isoliert, wie beschrieben in Current Protocols in Immunology, Band I, Suppl. 1, Einheit 7.23.1. Die chemischen Lockstoffe IL-8, GROα, GROβ, GROγ und NAP-2 werden in die Bodenkammer einer Kammer mit 48 Vertiefungen (Neuro Probe, Cabin John, MD) mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 100 nM plaziert. Die zwei Kammern sind durch ein 5 μm Polycarbonatfilter getrennt. Wenn Verbindungen dieser Erfindung getestet werden, werden sie mit den Zellen (0,001–1000 nM) gerade vor der Zugabe der Zellen in die obere Kammer vermischt. Die Inkubation läßt man für ca. 45 bis 90 min bei ca. 37°C in einem angefeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ fort schreiten. Am Ende des Inkubationszeitraums wird die Polycarbonatmembran entfernt und die obere Seite gewaschen und die Membran dann unter Verwendung des Diff Quick-Anfärbungsprotokolls (Baxter Products, McGaw Park, IL, USA) angefärbt. Zellen, die zum Chemokin chemotaxiert sind, werden visuell unter Verwendung eines Mikroskops gezählt. Allgemein werden vier Felder für jede Probe gezählt, und diese Zahlen werden gemittelt, um die Durchschnittsanzahl von Zellen zu ergeben, die gewandert sind. Jede Probe wird in dreifacher Ausführung getestet, und jede Verbindung wird wenigstens viermal wiederholt. Zu bestimmten Zellen (Positivkontrollzellen) wird keine Verbindung gegeben. Diese Zellen stellen die maximale chemotaktische Reaktion der Zellen dar. Für den Fall, daß eine Negativkontrolle (unstimuliert) gewünscht ist, wird kein Chemokin in die Bodenkammer gegeben. Die Differenz zwischen der Positivkontrolle und der Negativkontrolle stellt die chemotaktische Aktivität der Zellen dar.
Elastasefreisetzungstest:
Die Verbindungen dieser Erfindung werden auf ihre Fähigkeit zur Verhinderung der Elastasefreisetzung aus humanen Neutrophilen getestet. Neutrophile werden aus Humanblut isoliert wie beschrieben in Current Protocols in Immunology, Bd. I, Suppl. 1, Einheit 7.23.1. 0,88 × 10⁶ PMN-Zellen, suspendiert in Ringer-Lösung (NaCl 118, KCl 4,56, NaHCO₃ 25, KH₂PO₄ 1,03, Glucose 11,1, HEPES 5 mM, pH 7,4) werden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 50 μl plaziert. Zu dieser Platte werden die Testverbindung (0,001–1000 nM) in einem Volumen von 50 μl, Cytochalasin B in einem Volumen von 50 μl (20 μg/ml) und Ringer-Puffer in einem Volumen von 50 μl gegeben. Diese Zellen läßt man für 5 min erwärmen (37°C, 5 % CO₂, 95 % RF), bevor IL-8, GROα, GROβ, GROγ oder NAP-2 mit einer Endkonzentration von 0,01–1000 nM hinzugegeben wird. Man läßt die Reaktion für 45 min fortschreiten, bevor die Platte mit 96 Vertiefungen zentrifugiert wird (800 × g, 5 min) und 100 μl des Überstandes entfernt werden. Dieser Überstand wird zu einer zweiten Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, gefolgt von einem künstlichen Elastasesubstrat (MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC, Nova Biochem, La Jolla, CA) auf eine Endkonzentration von 6 μg/ml, gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Die Platte wird unmittelbar in ein Fluoreszenz-Plattenlesegerät für 96 Vertiefungen (Cytofluor 2350, Millipore, Bedford, MA) plaziert und Daten in 3 min-Intervallen gemäß dem Verfahren von Nakajima et al. gesammelt, J. Biol. Chem. 254, 4027 (1979). Die aus den PMNs freigesetzte Elastasemenge wird durch Messung der Rate des Abbaus von McOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC berechnet.
TNF-α im traumatischen Hirnverletzungstest
Der vorliegende Test sieht die Untersuchung der Expression von Tumornekrosefaktor-mRNA in spezifischen Hirnregionen vor, die der experimentell induzierten lateralen traumatischen Fluid-Perkussions-Hirnverletzung (TBI) in Ratten folgt. Ausgewachsene Sprague-Dawley-Ratten (n = 42) wurden mit Natriumpentobarbital (60 mg/kg, i.p.) anästhesiert und einer lateralen Fluid-Perkussions-Hirnverletzung moderater Schwere (2,4 atm), zentriert über dem linken temporaparietalen Cortex (n = 18), oder einer "Schein"-Behandlung (Anästhesie und Operation ohne Verletzung, n = 18) unterworfen. Die Tiere werden durch Köpfen zum Zeitpunkt 1, 6 und 24 h nach der Verletzung getötet, die Gehirne entfernt und Gewebeproben des linken (verletzten) parietalen Cortex (LC), des entsprechenden Gebietes im kontralateralen rechten Cortex (RC), des zum verletzten parietalen Cortex benachbarten Cortex (LA), des entsprechenden benachbarten Gebietes im rechten Cortes (RA), des linken Hippocampus (LH) und des rechten Hippocampus (RH) präpariert. Gesamt-RNA wurde isoliert, und eine Northern-Blot-Hybridisierung wird durchgeführt und relativ zu einer TNF-α-Positiv-kontroll-RNA (Makrophage = 100 %) quantifiziert. Eine deutliche Zunahme der TNF-α-mRNA-Expression wird beobachtet in LH (104 ± 17 % der Positivkontrolle, p < 0,05, verglichen mit der Scheinbehandlung), LC (105 ± 21 %, p < 0,05) und LA (69 ± 8 %, p < 0,01) in der traumatisierten Hemisphäre 1 h nach der Verletzung. Eine erhöhte TNF-α-mRNA-Expression wird auch beobachtet in LH (46 ± 8 %, p < 0,05), LC (30 ± 3 %, p < 0,01) und LA (32 ± 3 %, p < 0,01) zum Zeitpunkt 6 h, die sich 24 h nach der Verletzung auflöst. In der kontralateralen Hemisphäre ist die Expression von TNF-α-mRNA erhöht in RH (46 ± 2 %, p < 0,01), RC (4 ± 3 %) und RA (22 ± 8 %) zum Zeitpunkt 1 h und in RH (28 ± 11 %), RC (7 ± 5 %) und RA (26 ± 6 %, p < 0,05) zum Zeitpunkt 6 h, aber nicht zum Zeitpunkt 24 h nach der Verletzung. In scheinbehandelten (Operation ohne Verletzung) oder unbehandelten Tieren werden keine konsistenten Veränderungen der Expression von TNF-α-mRNA in irgendeinem der 6 Hirnbereiche in jeder Hemisphäre zu jeder Zeit beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, daß nach einer parasagittalen Fluid-Perkussions-Hirnverletzung die zeitliche Expression von TNF-α-mRNA in spezifischen Hirnregionen verändert ist, einschließlich derjenigen der nicht-traumatisierten Hemisphäre. Da TNF-α Nervenwachstumsfaktor (NGF) induzieren und die Freisetzung anderer Cytokine aus aktivierten Astrozyten stimulieren kann, spielt diese posttraumatische Veränderung der Genexpression von TNF-α eine wichtige Rolle sowohl in der akuten als auch in der regenerativen Reaktion auf ZNS-Trauma.
ZNS-Verletzungsmodell für IL-β-mRNA
Dieser Test kennzeichnet die regionale Expression von Interleukin-1β-(IL-1β)-mRNA in spezifischen Hirnregionen nach experimenteller lateraler traumatischer Fluid-Perkussions-Hirnverletzung (TBI) in Ratten. Ausgewachsene Sprague-Dawley-Ratten (n = 42) werden mit Natriumpentobarbital (60 mg/kg, i.p.) anästhesiert und einer lateralen Fluid-Perkussions-Hirnverletzung moderater Schwere (2,4 atm), zentriert über dem linken temporaparietalen Cortex (n = 18), oder einer "Schein"-Behandlung (Anästhesie und Operation ohne Verletzung) unterworfen. Die Tiere werden zum Zeitpunkt 1, 6 und 24 h nach der Verletzung getötet, die Gehirne entfernt und Gewebeproben des linken (verletzten) parietalen Cortex (LC), des entsprechenden Gebietes im kontralateralen rechten Cortex (RC), des zum verletzten parietalen Cortex benachbarten Cortex (LA), des entsprechenden benachbarten Gebietes im rechten Cortex (RA), des linken Hippocampus (LH) und des rechten Hippocampus (RH) präpariert. Gesamt-RNA wird isoliert, und eine Northern-Blot-Hybridisierung wurde durchgeführt, und die Menge an Hirngewebe-IL-1β-mRNA wird als Prozentwert der relativen Radioaktivität von IL-1β-positiver Makrophagen-RNA dargestellt, die auf das gleiche Gel geladen wurde. Zum Zeitpunkt 1 h nach der Hirnverletzung wird eine deutliche und signifikante Zunahme der Expression von IL-1β-mRNA beobachtet in LC (20,0 ± 0,7 % der Positivkontrolle, n = 6, p < 0,05, verglichen mit scheinbehandeltem Tier), LH (24,5 ± 0,9 %, p < 0,05) und LA (21,5 ± 3,1 %, p < 0,05) in der verletzten Hemisphäre, die bis zu 6 h nach der Verletzung erhöht blieb im LC (4,0 ± 0,4 %, n = 6, p < 0,05) und LH (5,0 ± 1,3 %, p < 0,05). In scheinbehandelten oder unbehandelten Tieren wird keine Expression von IL-1β-mRNA in irgendeinem der jeweiligen Hirngebiete beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, daß nach TBI die zeitliche Expression von IL-1β-mRNA regional in spezifischen Hirnregionen stimuliert wird. Diese regionalen Veränderungen der Cytokine, wie zum Beispiel IL-1β, spielen eine Rolle in der posttraumatischen Reaktion.

Claims

Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: 4-[[3-(2-Bromphenyl)-4-oxo-1-(phenylmethyl)-2-imidazolidinyliden]imino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[[(7aS)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[[5-(2-Bromphenyl)-3,3a,4,5-tetrahydro-1,1-dioxido-4-oxoimidazo[1,5-b]isothiazol-6(2H)-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[[(6R,7aS)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-6-hydroxy-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[[(7aR)-2-(2-Bromphenyl)-hexahydro-1-oxo-3H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[(S)-2-(2,3-Dichlorphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[(R)-2-(2,3-Dichlorphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[2-(2,3-Dichlorphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[(S)-2-(2-Bromphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[(R)-2-(2-Bromphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril; 4-[2-(2-Bromphenyl)-1-oxo-hexahydro-pyrrolo[1,2-c]imidazol-3-ylidenamino]-3-hydroxybenzonitril; und 4-[[2-(2-Bromphenyl)-1,5,6,7,8,8a-hexahydro-1-oxoimidazo[1,5-a]pyridin-3(2H)-yliden]amino]-3-hydroxybenzonitril; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsstoff umfaßt.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Chemokin-vermittelten Krankheits zustands, der ausgewählt ist aus Psoriasis, atopischer Dermatitis, Arthritis, Asthma, chronisch-obstruktiver Lungenkrankheit, respiratorischem Distreß-Syndrom des Erwachsenen, entzündlicher Darmerkrankung, Morbus Crohn, ulzeröser Kolitis, Schlaganfall, septischem Schock, endotoxischem Schock, Gram-negativer Sepsis, toxischem Schocksyndrom, kardialer und renaler Reperfusionsverletzung, Glomerulonephritis, Thrombose, Transplantat-Wirt-Reaktion, Alzheimer-Krankheit, Allotransplantatabstossungen, Malaria, Restenose, Angiogenese, Atherosklerose, Osteoporose, Gingivitis und unerwünschter hämatopoetischer Stammzellfreisetzung.