PT1180028E - Antagonistas do receptor il-8 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANTAGONISTAS DO RECEPTOR IL-8"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a um novo grupo de compostos de guanidina, processos para a sua preparação, a sua utilização no tratamento de doenças mediadas por IL-8, GROa, GROp, GROy, NAP-2 e ENA-78 e composições farmacêuticas para utilização em tal terapia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Têm sido aplicados muitos nomes diferentes à Interleucina-8 (IL-8), tal como proteina-1 de activação/atracção de neutrófilos (NAP-1), factor quimiotáctico de neutrófilo derivado de monócito (MDNCF), factor de activação de neutrófilos (NAF) e factor quimiotáctico de linfócitos T. A interleucina-8 é um quimioatractivo para neutrófilos, basófilos e um subconjunto de células T. É produzida pela maioria das células nucleadas, incluindo macrófagos, fibroblastos, células endoteliais e epiteliais expostas a TNF, IL-la, IL-Ιβ ou LPS e pelos próprios neutrófilos quando expostos a LPS ou factores quimiotácticos, tal como FMLP. M. Baggiolini et al, J. Clin. Invest. 84, 1045 (1989); J, Schroder et al, J. Immunol. 139, 3474 (1987) e J.

Immunol. 144, 2223 (1990); Strieter, et al, Science 243, 1467 (1989) e J. Biol. Chem. 264, 10621 (1989); Cassatella et al, Immunol. 148, 3216 (1992). 1 A Groa, GROp, GROy e NAP-2 também pertencem à família de quimiocinas a. Como a IL-8, estas quimiocinas também têm sido referidas por diferentes nomes. Por exemplo, as GROa, β e γ têm sido referidas como MGSAa, β e γ, respectivamente (Actividade de Estimulação do Crescimento de Melanoma), ver Richmond et ai, J. Cell Physiology 129, 375 (1986) e Chang et al, J. Immunol 148, 451 (1992) . Todas as quimiocinas da família α que apresentem o motivo ELR directamente antes do motivo CXC ligam-se ao receptor IL-8 B. IL-8, Groa, GROp, GROy, NAP-2 e ENA-78 estimulam várias funções in vitro. Verificou-se que todas apresentam propriedades quimioatractivas para neutrófilos, enquanto a IL-8 e GROa demonstraram actividade quimiotáctica para linfócitos T e basófilos. Além disso, a IL-8 pode induzir a libertação de histamina de basófilos de indivíduos normais e atópicos. A GRO-a e IL-8 podem, além disso, induzir a libertação de enzima lisossomal e burst respiratório a partir de neutrófilos. A IL-8 também demonstrou aumentar a expressão superficial de Mac-1 (CDllb/CD18) em neutrófilos sem síntese de novo de proteína. Isto pode contribuir para a adesão aumentada dos neutrófilos às células endoteliais vasculares. Muitas doenças conhecidas são caracterizadas por acentuada infiltração de neutrólifos. Como IL-8, Groa, GRC^, GROy e NAP-2 promovem a acumulação e activação de neutrófilos, estas quimiocinas têm sido implicadas numa vasta gama de distúrbios inflamatórios crónicos e agudos, incluindo psoríase e artrite reumatóide, Baggiolini et al, FEBS Lett. 307, 97 (1992); Miller et al, Crit. Rev. Immunol. 12, 17 (1992); Oppenheim et al, Annu. Rev. Immunol. 9,617 (1991); Seitz et al., J. Clin. Invest. 87, 463 (1991); Miller et al., Am. Rev. Respir. Pis. 146, 427 (1992); Donnely et al., Lancet 341, 643 (1993). 2

Além disso, as quimiocinas ELR (aquelas contendo os aminoácidos do motivo ELR imediatamente antes do motivo CXC) têm sido também implicadas na angiostase, Strieter et al, Science 258, 1798 (1992) .

In vitro, as IL-8, Groa, GROP, GROy e NAP-2 induzem a alteração da forma dos neutrófilos, quimiotaxia, libertação de grânulos e burst respiratório por ligação e activação de receptores da família sete transmembranar ligada à proteína G, em particular, por ligação aos receptores IL-8, mais notavelmente ao receptor B, Thomas et al., J. Biol. Chem. 266, 14839 (1991); e Holmes et al., Science 253, 1278 (1991). Tem precedentes o desenvolvimento de pequenas moléculas não peptídicas antagonistas para membros desta família de receptores. Para uma revisão ver R. Freidinger em: Progress in Drug Research, Vol. 40, pp. 33-98, Birkhauser Verlag, Basel 1993. Assim, o receptor IL-8 representa um alvo promissor para o desenvolvimento de novos agentes anti-inflamatórios.

Foram caracterizados dois receptores IL-8 humanos com elevada afinidade (77% de homologia): IL-8Ra, que se liga apenas a IL-8 com elevada afinidade e IL-8Rp, que apresenta elevada afinidade para a IL-8 bem como para GRO-α, GROp, GROy e NAP-2. Ver Holmes et al., supra; Murphy et al., Science 253, 1280 (1991); Lee et al., J. Biol. Chem. 267, 16283 (1992); LaRosa et al., J. Biol. Chem. 267, 25402 (1992); e Gayle et al., J. Biol. Chem. 268, 7283 (1993).

Permanece uma necessidade para tratamento, neste campo, para compostos que sejam capazes de se ligar ao receptor IL-8a ou β. Por isso, os estados associados com um aumento na produção de IL-8 (que é responsável pela quimiotaxia de neutrófilos e 3 subconjuntos de células T para o local inflamatório) iram beneficiar com compostos que sejam inibidores da ligação ao receptor IL-8.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os compostos da invenção podem ser utilizados em associação com o tratamento veterinário de mamíferos, que não humanos, com necessidade de inibição da IL-8 ou outras quimiocinas que se liguem aos receptores IL-8RA e RB. As doenças mediadas por quimiocinas para tratamento, terapeuticamente ou profilacticamente, em animais incluem estados de doença, tais como aqueles aqui indicados na secção de Métodos de Tratamento.

Os compostos da presente invenção são: 4-[[3-(2-bromofenil)-4-oxo-l-(fenilmetil)-2-imidazolidinilideno]imino]-3-hidroxibenzonitrilo; 4-[[(7aS)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-l-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo; 4-[[5-(2-bromofenil)-3,3a,4,5-tetra-hidro-l,l-dioxido-4-oxoimidazo[1,5—b]isotiazol-6(2H)-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo; 4-[[(6R,7aS)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-6-hidroxi-l-oxo-3H-pirrolo[1,2—c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo; 4 4-[[(7aR)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-l-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo, 4-[(S)-2-(2,3-Dicloro-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2— c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, 4-[(R)-2-(2,3-Dicloro-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, 4-[2-(2,3-Dicloro-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, 4-[(S)-2-(2-Bromo-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-henzonitrilo, 4-[(R)-2- (2-Bromo-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, 4-[2-(2-Bromo-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2—c]imidazol- 3- ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, e 4- [[2-(2-bromofenil)-1,5,6,7,8,8a-hexa-hidro-l-oxoimidazo[1,5-a]piridin-3(2H)-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável,

Os sais farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos para os especialistas na técnica e incluem sais básicos de ácidos inorgânicos e orgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido acético, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido sucínico, ácido fumárico, ácido maleico, 5 ácido benzóico, ácido salicilico, ácido fenilacético e ácido mandélico. Além disso, os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção podem também ser formados com um catião farmaceuticamente aceitável, por exemplo, se um grupo substituinte compreende uma porção carboxilo. Os catiões farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos para os especialistas na técnica e incluem catiões alcalinos, alcalino terrosos, amónio e amónio quaternário.

MÉTODOS DE PREPARAÇÃO

Os compostos da invenção podem ser obtidos por aplicação de processos sintéticos, alguns dos quais são ilustrados nos Esquemas abaixo.

Uma vez estabelecido o núcleo de guanidina, podem ser preparados outros compostos destas fórmulas por aplicação de técnicas convencionais, para inter-conversão do grupo funcional, bem conhecidas na técnica. 6

Esquema 1

a) Br2, NaOAc, HOAc; b) CuCN, DMF, refluxo; c) (B0C)20, DMAP, TEA; b) K2C03, MeOH; e) TFA A anilina 6-esquema-l desejada pode ser preparada a partir da benzoxazolinona 1-esquema-l disponível comercialmente. O brometo 2-esquema-l pode ser preparado a partir da benzoxazolinona 1-esquema-l utilizando condições de bromação convencionais, tal como bromo e acetato de sódio em ácido acético. 0 brometo 2-esquema-l pode ser convertido no cianeto 3- esquema-l utilizando processos, tais como cianeto de cobre (I) em DMF em refluxo. A amida 3-esquema-l pode ser convertida no composto 4-esquema-l protegido com BOC, utilizando condições convencionais, tal como anidrido BOC e trietilamina com uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina em cloreto de metileno ou outro solvente orgânico adequado. A oxazolinona 4- esquema-l pode ser convertida na anilina 6-esquema-l desejada por hidrólise inicial para o fenol 5-esquema-l, utilizando condições convencionais, tal como carbonato de potássio em metanol, seguida por remoção do grupo de protecção BOC utilizando condições convencionais, tal como ácido trifluoroacético em cloreto de metileno ou outro solvente orgânico adequado, para proporcionar a anilina 6-esquema-l. 7

Esquema 2

NC

OH NHj

OTBS

NR d OTBS I . || Λ N

NC

NH, OH . NC b

NC NHj

a) RNCS; b) TBSC1; c) tiofosgénio; d) RNH2

A tioureia 3-esquema-2 desejada pode ser preparada como indicado no esquema 2. A anilina l-esquema-2 pode ser associada a um isotiocianato disponível comercialmente ou com um isotiocianato preparado a partir da condensação de uma amina disponível comercialmente com um tiofosgénio ou um equivalente de tiofosgénio, para proporcionar a tioureia 2-esquema-2. 0 fenol 2-esquema-2 pode ser protegido como o éter TBS

3- esquema-2, utilizando condições convencionais, tal como TBSC1 e imidazole em THF ou outro solvente orgânico adequado. Alternativamente, a amina l-esquema-2 pode ser associada no isotiocianato 5-Esquema-2, protegendo inicialmente o fenol l-Esquema-2 com um grupo de protecção, tal como o éter de TBS 4- esquema-2, utilizando condições convencionais, tal como TBSC1 e uma base amina, tal como imidazole em THF, ou outro solvente orgânico adequado. A tioureia 5-esquema-2 pode ser preparada por condensação da amina 4-esquema 2 com tiofosgénio na presença de uma base, tal como carbonato de potássio. A tioureia 3-esquema-2 8 desejada pode ser preparada a partir do isotiocianato 5-esquema-2 por condensação deste com a amina desejada num solvente orgânico adequado, tal como etanol ou DMF.

Esquema 3

a) MsCl, TEA; b) aminoéster, THF C) TBAF, THF brc

3 A lactama 3-esquema-3 desejada pode ser preparada como indicado no Esquema 3. A carbodiimida 2-Esquema-3 pode ser preparada a partir da tioureia l-esquema-3, utilizando condições convencionais, tal como uma quantidade em excesso de cloreto de metanossulfonilo e uma base amina adequada, tal como trietilamina, num solvente orgânico, de um modo preferido, cloreto de metileno, à temperatura ambiente. A lactama 3-Esquema-3 pode ser preparada a partir da carbodiimida 2-Esquema~3 por, primeiro, condensar a carbodiimida 2-Esquema-3 com o α-aminoéster desejado num solvente orgânico desejado, tal como THF, seguido pela remoção do grupo TBS utilizando condições convencionais, tal como TBAF em THF a 0 °C. 9

EXEMPLOS SINTÉTICOS A invenção será agora descrita por referência aos seguintes exemplos que são meramente ilustrativos e são devem ser considerados como uma limitação do âmbito da presente invenção. Todas as temperaturas são apresentadas em graus centígrados, todos os solventes estão disponíveis na pureza mais elevada e todas as reacções efectuadas sob condições anidras numa atmosfera de árgon excepto quando indicado em contrário.

Nos exemplos, todas as temperaturas estão em graus Centígrados (°C). Foram efectuados espectros de massa num espectrómetro de massa VG Zab utilizando bombardeamento com átomos rápidos, excepto quando indicado em contrário. Os espectros de RMN de 1H (daqui para a frente "RMN") foram registados a 250 MHz utilizando um espectrómetro Bruker AM 250 ou Am 400. As multiplicidades indicadas são; s=singuleto, d=dupleto, t=tripleto, q=quarteto, m=multipleto e o br indica um sinal largo. Sat. Indica uma solução saturada, eq indica a proporção de um equivalente molar de reagente em relação ao reagente principal.

Exemplo 1

Preparação de 4-[[3-(2-bromofenil)-4-oxo-l-(fenilmetil)-2-imidazolidinilideno]imino]-3-hidroxibenzonitrilo a) Preparação de 4-bromo-l,2-benzoxazolinona. A uma solução de benzoxazolinona (10 g, 74 mmol) em ácido acético (50 mL) a 0 °C, foi adicionado acetato de sódio (7,4 g, 10 74 mmol) e bromo (3,8 mL, 74 mmol) e a mistura reaccional foi deixada a aquecer até à ta. Após 21 h, foi recolhido o precipitado por filtração e lavado com água. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, para se obter mais material sólido que foi recolhido por filtração, seguido por lavagem com água. 0 material foi combinado para se obter 14 g (88%) de 4-bromo-l, 2-benzoxazolinona como um sólido amarelo que não necessitou de purificação posterior. RMN de 1H (400 MHz, DMSO) δ 7,6 (s, 1H), 7,3 (d, 1H) , 7,0 (d, 1H) ; EM (EI) m/e 212 (M+) . b) Preparação de 4-ciano-l,2-benzoxazolinona. A uma solução de 4-bromo-l,2-benzoxazolinona (5,0 g, 23 mmol) em DMF (11 mL) , foi adicionado cianeto de cobre (I) (3,6 g, 39 mmol) e a reacção aquecida a 165 °C. Após 6,5 h, a mistura reaccional foi arrefecida até à ta e foi adicionada água (20 mL), cianeto de sódio (3,6 g) e a reacção aquecida a 100 °C. Após 12 h, a mistura reaccional foi extraída com acetato de etilo e as camadas orgânicas combinadas foram filtradas através de uma almofada de sílica gel, eluída com acetato de etilo. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para se obter 1,9 g (51%) de 4-ciano-l,2-benzoxazolinona como um sólido castanho, que não necessitou de purificação posterior. RMN de 1H (400 MHz, DMSO) δ 7,8 (s, 1H), 7,6 (d, 1H), 7,2 (d, 1H). 11 c) Preparação de N-t-butilacetoxi-4-ciano-l,2- benzoxazolinona. A uma solução de 4-ciano-l,2-benzoxazolinona (1,9 g, 15 mmol) em THF (50 mL) a 0 °C, foi adicionada trietilamina

(2,5 mL, 18 mmol), DMAP (0,37 g, 3,0 mmol) e anidrido BOC (4,3 g, 20 mmol) e a mistura reaccional foi deixada a aquecer até à ta. Após 1,5 h, a mistura foi rapidamente arrefecida com água (100 mL) e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina saturada, secas sob sulfato de magnésio anidro e concentradas sob pressão reduzida, para se obter 4,3 g (100%) de N-t-butilacetoxi-4- ciano-1,2-benzoxazolinona como um sólido amarelo, que não necessitou de purificação posterior. RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) δ 7,8 (d, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,45 (s, 1 H), 1,65 (s, 9H). d) Preparação de N-t-butilacetoxi-4-ciano-2- hidroxilanilina. A uma solução de N-t-butilacetoxi-4-ciano-l,2-benzoxazolinona (4,3 g, 16 mmol) em metanol (50 mL) foi adicionado carbonato de potássio (2,3 g, 16 mmol). Após 1,5 h, a reacção foi rapidamente arrefecida com água (100 mL) e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina saturada, secas sob sulfato de magnésio anidro e concentradas sob pressão reduzida, para se obter 3,1 g (81%) de N-t-butilacetoxi-4-ciano-2-hidroxilanilina como um sólido castanho, que não necessitou de purificação posterior. RMN de (400 MHz, CDC13) δ 7,7 (d, 1H) , 7,15 (s, 1H), 7,1 (d, 1H), 1,5 (s, 9H). 12 e) Preparação de 4-ciano-2-hidroxilanilina. A uma solução de N-t-butilacetoxi-4-ciano-2-hidroxolanilina (3,1 g, 13 mmol) em cloreto de metileno (100 mL) a 0 °C, foi adicionado ácido trifluoroacético e a mistura reaccional foi deixada a aquecer até à ta. Após 2,5 h, a reacção foi rapidamente arrefecida com água (100 mL) e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina saturada, secas sob sulfato de magnésio anidro e concentradas sob pressão reduzida. O material em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (50% de acetato de etilo/hexanos) para se obter 1,7 g (96%) de 4-ciano-2- hidroxilanilina como um sólido castanho claro. RMN de 1H (400 MHz, DMSO) δ 7,0 (d, 1H) , 6,85 (s, 1H) , 6,65 (d, 1H) ; EM (EI) m/e 134 (M+) . f) Preparação de N-(4-ciano-2-hidroxifenil)-N'-(2-bromofenil)tioureia. A uma solução de 4-ciano-2-hidroxilanilina (1,0 g, 7,5 mmol) em etanol (20 mL) foi adicionado 2-bromofenilisotiocianato (1,0 mL, 7,5 mmol). Após 24 h, a mistura reaccional foi concentrada sobre pressão reduzida para se obter 2,0 g (77%) de N-(4-ciano-2-hidroxifenil)-Ν' - (2-bromofenil)tioureia como um sólido amarelo, que não necessitou de posterior purificação. RMN de 1H (400 MHz, DMSO) δ 10,8 (s, 1H) , 10,1 (s, 1H) , 9,6 (s, 1H), 8,7 (d, 1H) , 7,7 (d, 1H) , 7,6 (d, 1H), 7,4 (t, 1H), 7,25 (d, 1H) , 7,2 (s, 1H e d, 2H) ; EM (EI) m/e 229 (100), 348 (75 (M+)) , 462 (30), 695 (10). 13 g) Preparação de N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-Ν' -(2-bromofenil)tioureia. A uma solução de N-(4-ciano-2-hidroxifenil)-N'- (2-bromofenil) tioureia (3,5 g, 10 mmol) em THF (50 mL) a 0 °C foi adicionado imidazole (1,0 g, 15 mmol) e TBSC1 (1,5 g, 10 mmol). Após 1 h, a mistura reaccional foi rapidamente arrefecida com água (100 mL) e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina saturada, secas sob sulfato de magnésio anidro e concentradas sob pressão reduzida. O material em bruto foi cristalizado a partir de acetato de etilo, para se obter 3,9 g (84%) de N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-Ν' -(2-bromofenil)tioureia como um sólido amarelo. RMN de 1H (400 MHz, DMSO) δ 9,9 (s, 1H), 9,2 (s, 1H) , 8,1 (d, 1H), 7,7 (d, 1H) , 7,6 (d, 1H) , 7,45 (d, 1H) , 7,4 (t, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,2 (t, 1H) ; EM (EI) m/e 347 (100 (M+) ) , 175 (40), 461 (40) . h) Preparação de N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-N'-(2-bromofenil)carbodiimida. A uma solução de N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-N(2-bromofenil)tioureia (3,4 g, 7,4 mmol) em cloreto de metileno (40 mL) a 0 °C, foi adicionada trietilamina (3,1 mL, 22 mmol), DMAP (20 mg) e cloreto de metanossulfonilo (1,1 mL, 15 mmol) . Após 25 min, a mistura reaccional foi rapidamente arrefecida com água (100 mL) e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina saturada, secas sob sulfato de magnésio anidro e concentradas sob pressão reduzida para se obter 3,3 g (100%) de N-(4-ciano-2- 14 t-butildimetilsilanoxifenil)-Ν' -(2-bromofenil)carbodiimida como um sólido amarelo, que não necessitou purificação posterior. RMN de ΧΗ (400 MHz, DMSO) δ 7,7 (d, 1H) , 7,45 (d, 1H) , 7,4 (m, 4H) , 7,15 (t, 1H). i) Processo convencional para a sintese de tetralquilguanidinas cíclicas. Preparação de 4 —[[3— (2 — bromofenil)-4-oxo-l-(fenilmetil)-2-imidazolidinilideno]imino]-3-hidroxibenzonitrilo. A uma solução de N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-N(2-bromofenil) carbodiimida (86 mg, 0-20 mmol) em THF (2 mL) foi adicionado diisopropiletilan-dno (25 yL, 0,57 mmol) e éster etílico de N-benzilglicina (41 mg, 0,22 mmol). Após 15 min, foi adicionado à mistura, metanol (0,1 mL) e, depois, TBAF (0,24 mL, 0,24 mmol) a 0 °C. Após 30 min, a mistura reaccional foi rapidamente arrefecida com água (2 mL) e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina saturada, secas sob sulfato de magnésio anidro e concentradas sob pressão reduzida. O material em bruto foi purificado por recristalização (cloreto de metileno/hexanos) para se obter 74,5 mg (80%) de 4-[[3-(2-bromofenil)-4-oxo-l-(fenilmetil)-2-imidazolidinilideno]imino]-3-hidroxibenzonitrilo como um pó castanho claro. RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ 7,45 (2H, d), 7,35 (2H, t), 7,3 (1H, d), 7,25 (1H, d), 7,15 (1H, d), 6,9 (3H, m) , 6,8 (1H, d), 6,6 (1H, t) , 4,6 (2H, m) , 4,0 (2H, s) ; EM (EI) m/e 463 (100 (M+) ) . 15 j) Preparação de 4-[[ (7aS)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-1-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo.

Foi seguido o processo convencional utilizando N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-Ν' -(2-bromofenil)carbodiimida (54 mg, 0,13 mmol), diisopropiletilamina (32 pL, 0,29 mmol), cloridrato de benziléster de L-prolina (34 mg, 0,14 mmol) e TBAF (0,16 mL, 0,16 mmol) em THF (2 mL) e metanol (0,1 mL) , para se obter 36 mg (67%) de 4-[[ (7aS)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-1-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3- hidroxibenzonitrilo como um pó castanho claro. . RMN de (400 MHz, MeOD) δ 7,6 (2H, m) , 7,35 (3H, m) , 7,15 d H, m) , 7,0 \—1 m) , 4,5 (1H, t) , 3,0 (1H, m), 2,4 (1H , m) , 2,2 □Γ \—1 m) , 2,05 (2H, m) ; EM (EI) m/e 412 (M+) . k) Preparação de 4-[[5-(2-bromofenil)-3,3a,4,5-tetra-hidro-1, l-dioxido-4-oxoimidazo[1,5-b]isotiazol-6(2H)-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo.

Foi seguido o processo convencional utilizando N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-Ν' -(2-bromofenil)carbodiimida (60 mg, 0,14 mmol), diisopropiletilamina (17 pL, 0,15 mmol), aminoéster (27 mg, 0,15 mmol) e TBAF (0,17 mL, 0,15 mmol) em THF (1,5 mL) e metanol (0,1 mL) para se obter 46 mg (71%) de 4-[[5-(2-bromofenil)-3,3a,4,5-tetra-hidro-l,l-dioxido-4-oxoimidazo[1,5-b]isotiazol-6(2H)-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo como um pó castanho claro. RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ 8,1 (1H, d), 7,8 (1H, s) , 7,75 (1H, d), 7,7 (1H, d), 7,6 (2H, m) , 7,25 (1H, t) , 4,35 (1H, t) , 3,9 (2H, s) , 16 3,25 (1Η, t) , 2,9 (1H, m) , 2,7 (1H, m) ; EM (EI) m/e 330 (100), 662 (20). 1) Preparação de 4-[[(6R,7aS)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-6-hidroxi-l-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo.

Foi seguido o processo convencional utilizando N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-Ν' -(2-bromofenil)carbodiimida (102 mg, 0,24 mmol), diisopropiletilamina (60 pL, 0,26 mmol), cloridrato de éster metilico de hidróxido de L-prolina (44 mg, 0,26 mmol) e TBAF (0,29 mL, 0,29 mmol) em THF (2,5 mL) e metanol (0,1 mL) para se obter 80 mg (78%) de 4-[[(6R,7aS)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-6-hidroxi-l-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo como um pó castanho claro. EM(EI) m/e 427 (100 (M+) ) . m) Preparação de 4-[[(7aR)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-1-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo.

Foi seguido o processo convencional utilizando N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-N'-(2-bromofenil)carbodiimida (107 mg, 0,25 mmol), diisopropiletilamina (71 pL, 0,55 mmol), cloridrato de éster metilico de D-prolina (46 mg, 0,28 mmol) e TBAF (0,30 mL, 0,30 mmol) em THF (2,5 mL) e metanol (0,1 mL) para se obter 80 mg (78%) de 4-[[(7aR)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-l-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo como um pó castanho claro. EM(EI) m/e 411 (100 (M+) ) . 17 n) Preparação de 4-[[2-(2-bromofenil)-1,5,6,7,8,8a-hexa-hidro-l-oxoimidazo[1,5-a]piridin-3(2H)-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo.

Foi seguido o processo convencional utilizando N-(4-ciano-2-t-butildimetilsilanoxifenil)-Ν' -(2-bromofenil)carbodiimida (106 mg, 0,25 mmol), diisopropiletilamina (71 yL, 0,28 mmol), cloridrato de pipecolinato de metilo (50 mg, 0,28 mmol) e TBAF (0,30 mL, 0,30 mmol) em THF (2,5 mL) e metanol (0,1 mL) para se obter 80 mg (75%) de 4-[[2-(2-bromofenil)-1,5,6,7,8,8a-hexa-hidro-l-oxoimidazo[1,5-a]piridin-3(2H)-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo como um pó castanho claro. EM(EI) m/e 425 (100 (M+) ) .

MÉTODO DE TRATAMENTO

Os compostos da invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável podem ser utilizados na preparação de um medicamento para o tratamento profilático ou terapêutico de qualguer estado de doença num humano, ou outro animal, que é exacerbado ou provocado pela produção excessiva ou desregulada da citocina IL-8 pelas células de tal mamífero, tais como, mas não limitadas a monócitos e/ou macrófagos, ou outras quimiocinas que se ligam ao receptor IL-8 α ou β, também referidos como o receptor do tipo I ou tipo II.

Em particular, as quimiocinas são IL-8, GROa, GROP, GROy, NAP-2 ou ENA-78. 18

Os compostos da invenção são administrados numa quantidade suficiente para inibir a função da citocinas, em particular, IL-8, GROa, GROp, GROy, NAP-2 ou ENA-78, para que sejam biologicamente reguladas de modo negativo para níveis normais da função fisiológica ou, em alguns casos, para níveis sub-normais, de modo a melhorar o estado da doença. Por exemplo, níveis anormais de IL-8, GROa, GROP, GROy, NAP-2 ou ENA-78, no contexto da presente invenção, constituem: (i) níveis de IL-8 livre superiores a ou iguais a 1 picograma por mL; (ii) qualquer célula associada a IL-8, GROa, GROP, GROy, NAP-2 ou ENA-78 acima de níveis fisiológicos normais, ou (iii) a presença de IL-8, GROa, GROp, GROy, NAP-2 ou ENA-78 acima dos níveis basais em células ou tecidos onde é produzida a IL-8, GROa, GROP, GROy, NAP-2 ou ENA-78, respectivamente.

Existem muitos estados de doença nos quais a produção excessiva ou desregulada de IL-8 está implicada no exacerbar e/ou causa da doença. As doenças mediadas por quimiocinas incluem, psoríase, dermatite atópica, artrite, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, síndrome de dificuldade respiratória em adultos, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerosa, apoplexia, choque séptico, choque endotóxico, sepsia por gram negativas, síndrome do choque tóxico, lesão por reperfusão cardíaca e renal, glomerulonefrite, trombose, reacção enxerto vs. hospedeiro, doença de alzheimer, rejeições de aloenxerto, malária, restenose, angiogénese, aterosclerose, osteoporose, gengivite e libertação de células estaminais hematopoiéticas indesejadas.

Estas doenças são principalmente caracterizadas por infiltração acentuada de neutrófilos, infiltração de células T ou crescimento neovascular e estão associadas com a produção 19 aumentada de IL-8, GROa GROP, GROy ou NAP-2, que é responsável pela quimiotaxia dos neutrófilos para o local da inflamação ou crescimento direccional de células endoteliais. Ao contrário das outras citocinas inflamatórias (IL-1, TNF e IL-6), as IL-8, GROa, GROP, GROy ou NAP-2 apresentam a propriedade única de promover a quimiotaxia dos neutrófilos, libertação de enzimas incluindo, mas não limitadas a, libertação de elastase, bem como produção e activação de superóxido. As α-quimiocinas, mas particularmente, GROa, GROp, GROy ou NAP-2, funcionado através do receptor IL-8 do tipo I ou II, podem promover a neovascularização de tumores ao promover o crescimento direccional de células endoteliais. Por isso, a inibição da quimiotaxia ou activação induzida por IL-8 poderá conduzir a uma redução directa na infiltração de neutrófilos.

Evidências recentes também implicam a função das quimiocinas no tratamento de infecções por VIH, Littleman et al., Nature 381, pp 661 (1996) e Koup et al., Nature 381, pp 667 (1996). 0 TNF-α é uma citocina com acções pró-inflamatórias, incluindo expressão de molécula de adesão de leucócitos no endotélio. 0 infiltrado de leucócitos em lesões cerebrais isquémicas e, assim, compostos que inibem ou diminuem os níveis de TNF devem ser úteis para o tratamento de lesão cerebral isquémica. Ver Liu et al., Stroke, Vol. 25., No. 7, pp 1481-88 (1994) .

Os modelos de lesões de cabeça fechada e tratamento com agentes 5-L0/C0 mistos são discutidos em Shohami et al., J. of Vaisc & Clinicai Physiology and Pharmacology, Vol. 3, N° 2, pp. 99-107 (1992). 20

Os compostos da invenção são administrados numa quantidade suficiente para inibir a ligação aos receptores IL-8 alfa ou beta, tal como evidenciado por uma redução na quimiotaxia e activação dos neutrófilos. A descoberta que os compostos da invenção são inibidores da ligação da IL-8 é baseada nos efeitos dos compostos da invenção nos ensaios de ligação ao receptor in vitro que são aqui descritos. Demonstrou-se que os compostos da invenção são, em alguns situações, inibidores duplos dos receptores IL-8 recombinantes do tipo I e tipo II. De um modo preferido, os compostos são inibidores de apenas um receptor, de um modo mais preferido, do Tipo II.

Como aqui utilizado, o termo "estado de doença ou doença mediada por IL-8" refere-se a qualquer e todos os estados de doença nos quais as IL-8, GROa, GROp, GROy, NAP-2 ou ENA-78 desempenham uma função, quer através da produção das próprias IL-8, GROa, GROp, GROy, NAP-2 ou ENA-78, ou por as IL-8, GROa, GROp, GROy, NAP-2 ou ENA-78 provocarem a libertação de outra monocina, tal como, mas não limitada a IL-1, IL-6 ou TNF. Um estado de doença no qual, por exemplo, a IL-1 é um principal componente e cuja produção ou acção é exacerbada ou secretada em resposta a IL-8 será, por isso, considerada um estado de doença mediada pela IL-8.

Como aqui utilizado, o termo "estado de doença ou doença mediada por quimiocina" refere-se a qualquer e todos os estados de doença nos quais um a quimiocina que se liga a um receptor α ou β de IL-8 desempenha uma função, tal como, mas não limitada a IL-8, GROa, GROp, GROy, NAP-2 ou ENA-78. Esta incluirá um estado de doença, no qual a IL-8 desempenha uma função, quer através da produção da própria IL-8, ou por a IL-8 provocar a libertação de 21 outra monocina, tal como, mas não limitada a IL-1, IL-6 ou TNF. Um estado de doença no qual, por exemplo, a IL-1 é um principal componente e cuja produção ou acção é exacerbada ou secretada em resposta à IL-8 será, por isso, considerada um doença considerada mediada pela IL-8.

Como aqui utilizado, o termo "citocina" refere-se a qualquer polipéptido secretado que afecta as funções das células e é uma molécula que modula as interacções entre células na resposta imunitária, inflamatória ou hematopoiética. Um citocina inclui, mas não está limitada a, monocinas e linfocinas, independentemente das células que as produzem. Por exemplo, uma monocina é geralmente referida como sendo produzida e secretada por uma célula mononuclear, tal como um macrófago e/ou monócito. No entanto, muitas outras células também produzem monocinas, tal como células natural killer, fibroblastos, basofílos, neutrófilos, células endoteliais, astrócitos cerebrais, células estromais da medula óssea, queratinócitos epidermais e linfócitos B. As linfocinas são geralmente referidas como sendo produzidas pelas células de linfócitos. Exemplos de citocinas incluem, mas não estão limitados a, Interleucina-1 (IL-1), Interleucina-6 (IL-β), Interleucina-8 (IL-8), Factor de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) e Factor de Necrose Tumoral beta (TNF-β).

Como aqui utilizado, o termo "quimiocina" refere-se a qualquer polipéptido secretado que afecta as funções das células e é uma molécula que modula as interacções entre células na resposta imunitária, inflamatória ou hematopoiética, semelhante ao termo "citocina" acima. A quimiocina é principalmente secretada através de transmembranas celulares e provoca quimiotaxia e activação de glóbulos brancos específicos e leucócitos, neutrófilos, monócitos, macrófagos, células T, 22 células B, células endoteliais e células de músculo liso. Exemplos de quimiocinas incluem, mas não estão limitadas a, IL-8, GRO-a, GRO-β, GRO-γ, NAP-2, ENA-78, IP-10, ΜΙΡ-la, ΜΙΡ-β, PF4, e MCP 1, 2, e 3.

De modo a utilizar um composto da invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em terapia, será, normalmente, formulado numa composição farmacêutica de acordo com a prática farmacêutica convencional. Deste modo, esta invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz, não tóxica, de um composto da invenção e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Os compostos da invenção, seus sais farmaceuticamente aceitáveis e composições farmacêuticas incorporando estes podem ser administrados, de um modo conveniente, por qualquer uma das vias convencionalmente utilizadas para a administração de fármacos, por exemplo, oralmente, topicamente, parentericamente ou por inalação. Os compostos da invenção podem ser administrados em forma de dosagem convencionais preparadas por combinação de um composto da invenção com veículos farmacêuticos convencionais, de acordo com processos convencionais. Os compostos da invenção podem também ser administrados em dosagens convencionais em combinação com um segundo composto terapeuticamente activo, conhecido. Estes processos podem envolver mistura, granulação e compressão ou dissolução dos ingredientes, como apropriado, para a preparação desejada. Será evidente que a forma e carácter do carácter ou diluente farmaceuticamente aceitável são estipulados pela quantidade de ingrediente activo com a qual é combinado, a via de administração e outras variáveis bem conhecidas. 0(s) veículo(s) devem ser "aceitável(is)" no sentido de ser(em) compatível(is) 23 com outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o seu receptor. 0 veículo farmacêutico empregue pode ser, por exemplo, quer um sólido ou líquido. Exemplos de veículos sólidos são lactose, terra alba, sacarose, talco, gelatina, agar, pectina, acácia, estearato de magnésio, ácido esteárico e semelhantes. Exemplos de veículos líquidos são xarope, óleo de amendoim, azeite, água. De um modo semelhante, o veículo ou diluente pode incluir material retardador bem conhecido na técnica, tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo isolado ou com uma cera.

Pode ser empregue uma vasta variedade de formas farmacêuticas. Assim, se for utilizado um veículo sólido, a preparação pode ser transformada em comprimidos, colocada numa cápsula de gelatina dura em pó ou forma de sedimento ou na forma de um trocisco ou pastilha. A quantidade de veículo sólido irá variar amplamente mas, de um modo preferido, irá de cerca de 25 mg a cerca de 1 g. Quando é utilizado um veículo líquido, a preparação estará na forma de um xarope, emulsão, cápsula de gelatina mole, líquido injectável estéril, tal como uma ampola ou suspensão líquida não aquosa.

Os compostos da invenção podem ser administrados topicamente, isto é, por administração não sistémica. Isto inclui a aplicação de um composto da invenção externamente à epiderme ou na cavidade bocal e a instilação de um tal composto no ouvido, olho e nariz, de modo que o composto não entre, significativamente, na corrente sanguínea. Em contraste, a administração sistémica refere-se à administração oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. 24

As formulações adequadas para administração tópica incluem preparações liquidas ou semi-liquidas adequadas para penetração através da pele até ao local da inflamação, tais como linimentos, loções, cremes, unguentos ou pastas e gotas adequadas para administração nos olhos, ouvidos ou nariz. 0 ingrediente activo pode compreender, para administração tópica, de 0,001% a 10% p/p, por exemplo, de 1% a 2% em peso da Formulação. No entanto, pode compreender tanto como 10% p/p mas, de um modo preferido, irá compreender menos de 5% p/p, de um modo mais preferido, de 0,1% a 1% p/p da Formulação.

As loções, de acordo com a presente invenção, incluem as adequadas para aplicação na pela ou olhos. Uma loção para os olhos pode compreender uma solução aquosa estéril contendo, opcionalmente, um bactericida e pode ser preparada através de métodos semelhantes aos para a preparação de gotas. As loções e linimentos para aplicação na pele podem também incluir um agente para acelerar a secagem e arrefecer a pele, tal como um álcool ou acetona e/ou um humidificante, tal como glicerol ou um óleo, tal como óleo de rícino ou óleo de amendoim.

Os cremes, unguentos ou pastas de acordo com a presente invenção são formulações semi-sólidas do ingrediente activo para aplicação externa. Podem ser preparadas por mistura do ingrediente activo na forma finamente dividida ou em pó, isolado ou em solução ou suspensão num fluido aquoso ou não aquoso, com o auxílio de maquinaria adequada, com uma base gordurosa ou não gordurosa. A base pode compreender hidrocabonetos, tais como parafina dura, mole ou líquida, glicerol, cera de abelha, um sabão metálico; uma mucilagem; um óleo de origem natural, tal como óleo de amêndoa, milho, amendoim, rícino ou azeite; 25 lanolina ou seus derivados ou um ácido gordo, tal como ácido esteárico ou oleico juntamente com um álcool, tal como propilenoglicol ou um macrogel. A formulação pode incorporar qualquer agente de superfície activa adequado, tal como um tensioactivo, aniónico, catiónico ou não iónico, tal como um éster de sorbitano ou um seu derivado de polioxietileno. Também podem ser incluidos agentes de suspensão, tais como gomas naturais, derivados de celulose ou materiais inorgânicos, tais como sílicas siliciadas e outros ingredientes, tais como lanolina.

As gotas de acordo com a presente invenção podem compreender soluções ou suspensões aquosas ou oleosas estéreis e podem ser preparadas por dissolução do ingrediente activo numa solução aquosa adequada de um agente bactericida e/ou fungicida e/ou qualquer outro conservante adequado e, de um modo preferido, incluindo um agente de superfície activa. A solução resultante pode, depois, ser clarificada por filtração, transferida para um recipiente adequado que é, depois, selado e esterilizado por autoclavagem ou mantido a 98-100 °C meia hora. Alternativamente, a solução pode ser esterilizada por filtração e transferida para o recipiente através de uma técnica asséptica. Exemplos de agentes bactericidas e fungicidas adequados para inclusão nas gotas são nitrato ou acetato de fenilmercúrio (0,002%), cloreto de benzalcónio (0,01%) e acetato de clor-hexidina (0,01%). Os solventes adequados para a preparação de uma solução oleosa incluem glicerol, álcool diluído e propilenoglicol.

Os compostos da invenção podem ser administrados parentericamente, isto é, por administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intranasal, intrarectal, intravaginal 26 ou intraperitoneal. São geralmente preferidas as formas subcutânea e intramusculares de administração parentérica. As formas de dosagem apropriadas para tal administração podem ser preparadas através de técnicas convencionais. Os compostos da presente invenção também podem ser administrados por inalação, isto é, por administração por inalação oral e intransal. As formas de dosagem apropriadas para tal administração, tal como uma formulação de aerossóis ou um inalador de dose calibrada, podem ser preparadas através de técnicas convencionais.

Para todos os métodos de utilização aqui revelados para aos compostos da invenção, o regime de dosagem oral diária será, de um modo preferido, de cerca de 0,01 a cerca de 80 mg/kg de peso corporal total. O regime de dosagem parentérico diário de cerca de 0,001 a cerca de 80 mg/kg de peso corporal total. O regime de dosagem tópico total será, de um modo preferido, de 0,1 mg a 150 mg, administrado uma a quatro, de um modo preferido, duas a três vezes por dia. O regime de dosagem por inalação diário será, de um modo preferido, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 1 mg/kg por dia. Será evidente para um especialista na técnica que a quantidade óptima e intervalo entre doses individuais de um composto da invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, será determinado pela natureza e extensão do estado a ser tratada, a forma, via e local de administração e o doente em particular a ser tratado e que tal conjunto de condições óptimas pode ser determinado através de técnicas convencionais. Será também evidente para um especialista na técnica que o período óptimo do tratamento, i. e., o número de doses de um composto da invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável administradas por dia durante um número definido de dias, pode ser verificado pelo especialista na técnica, utilizando o período convencional dos testes de determinação de tratamento. 27 A invenção será agora descrita por referência aos seguintes exemplos biológicos que são meramente ilustrativos e não devem ser considerados como uma limitação do âmbito da presente invenção.

EXEMPLOS BIOLÓGICOS

Os efeitos inibidores das quimiocinas IL-8 e Gro-α dos compostos da presente invenção foram determinados pelos seguintes ensaios in vitro:

Ensaios de Ligação ao Receptor: A [125I] IL-8 (recombinante humana) foi obtida de Amersham Corp., Arlington Heights, IL, com 200 Ci/mmol de actividade especifica. A Gro-α foi obtida de NEN- New England Nuclear. Todos os outros produtos químicos foram de grau analítico. Foram expressos, individualmente, níveis elevados de receptores IL-8 recombinantes humanos do tipo α e β em células de ovário de hamster Chinês, como descrito anteriormente (Holmes, et al., Science, 1991, 253, 1278) . As membranas de ovário de hamster Chinês foram homogeneizadas de acordo com um protocolo anteriormente descrito (Haour, et al., J Biol Chem., 249 pp 2195-2205 (1974)). Excepto que o tampão de homogeneização foi alterado para Tris-HCL 10 mM, MgS04 1 mM, EDTA (ácido etileno- diaminotetracético) 0,5 mM, PMSF (flureto de α-toluenossulfonilo) 1 mM, Leupeptina 0,5 mg/L, pH 7,5. Foi determinada a concentração da proteína na membrana utilizando o kit de micro-ensaio Pierce Co., utilizando a albumina de soro 28 bovino como um padrão. Todos os ensaios foram efectuados num formato de microplaca de 96 poços. Cada mistura reaccional continha 125I IL-8 (0,25 nM) ou 125I Gro-α e 0,5 yg/mL de membranas com IL-8Ra ou 1,0 yg/mL de membranas com IL-8Rp em tampões Bis-Trispropano 20 mM e Tris HC1 0,4 mM, pH 8,0, contendo MgS04 1,2 mM, EDTA 0,1 mM, NaCl 25 mM e CHAPS a 0,03%. Além disso, foi adicionado o fármaco ou composto de interesse, que tinha sido pré-dissolvido em DMSO de modo a alcançar uma concentração final entre 0,01 nM e 100 yM. O ensaio foi iniciado pela adição de 125I-IL-8. Após 1 hora à temperatura ambiente, a placa foi recolhida, utilizando um colector de 96 poços Tomtec, para um filtermat de fibra de vidro bloqueado com polietilenimina a 1%/BSA a 0,5% e lavado 3 vezes com NaCl 25 nM, TrisHCl 10 mM, MgS04 1 mM, EDTA 0,5 mM, CHAPS a 0,03%, pH 7,4. O filtro foi depois seco e contado no contador de cintilação liquida Betaplate. O receptor IL-8 Ra recombinante ou Tipo I é também aqui referido como o receptor não permissivo e o receptor IL-8 Rp recombinante ou Tipo II é referido como o receptor permissivo.

Todos os compostos aqui indicados na Secção de Química Sintética, Exemplo 1 a 15, demonstraram um IC50 de cerca de 45 a cerca de <1 yg/mL nos modelos permissivos para a inibição do receptor IL-8. Dos compostos testados, verificou-se também que os Exemplos 1-12 eram inibidores da ligação da Gro-a, aproximadamente, ao mesmo nível. 29

Ensaio da Quimiotaxia:

As propriedades inibidoras in vitro destes compostos são determinadas no ensaio de quimiotaxia de neutrófilos, como descrito em Current Protocols in Immunology, vol I, Supl 1, Unidade 6.12.3. Os neutrófilos foram isolados a partir de sangue humano como descrito em Current Protocols in Immunology Vol I, Suppl 1 Unidade 7.23.1. Os quimioatractivos IL-8, GRO-a, GRO-β, GRO-γ e NAP-2 são colocados na câmara inferior de uma câmara de 48 poços múltiplos (Neuro Probe, Cabin John, MD) numa concentração entre 0,1 e 100 nM. As duas câmaras são separadas por um filtro de policarbonato com 5 ym. Quando são testados os compostos desta invenção, estes são misturados com as células (0,001 - 1000 nM) imediatamente antes da adição das células à câmara superior. É permitida a incubação entre cerca de 45 e 90 min a cerca de 37 °C numa incubadora humidificada com CO2 a 5%. No final do periodo de incubação, é removida a membrana de policarbonato e o lado superior lavado, a membrana é, depois, corada utilizando o protocolo de coloração Diff Quick (Baxter Products, McGaw Park, IL, EUA). As células que foram atraidas quimicamente pela quimiocina são contadas visualmente utilizando um microscópio. Geralmente, são contados quatro campos para cada amostra, estes números são transformados em média para proporcionar o número médio de células que migraram. Cada amostra é testada em triplicado e cada composto repetido, pelo menos, quatro vezes. Para certas células (células do controlo positivo), não é adicionado composto, estas células representam a resposta quimiotáctica máxima das células. No caso onde é desejado um controlo negativo (não estimulado), não é adicionada quimiocina à câmara inferior. A diferença entre o controlo positivo e o controlo negativo representa a actividade quimiotáctica das células. 30

Ensaio de Libertação de Elastase:

Os compostos desta invenção são testados para a sua capacidade em impedir a libertação de Elastase de neutrófilos humanos. Os neutrófilos são isolados a partir de sangue humano, como descrito em Current Protocols in Immunology Vol I, Supl I Unidade 7.23.1. As 0,88 x 106 células PMN suspensas em Solução de Ringer (NaCl 118, KC1 4,56, NaHC03 25, KH2P04 1,03, Glucose 11,1. HEPES 5 mM, pH 7,4) são colocadas em cada um dos poços de uma placa de 96 poços, num volume de 50 pL. A esta placa é adicionada o composto de teste (0, 001 - 1000 nM) num volume de 50 pL, Citocalasina B num volume de 50 pL (20 pg/mL) e tampão de Ringer num volume de 50 pL. Estas células são deixadas a aguecer (37 °C, C02 a 5%, 95% de HR) durante 5 min antes de ser adicionada IL-8, GROa, GROp, GROy ou NAP-2 para uma concentração final de 0,01 - 1000 nM. A reacção é deixada prosseguir durante 45 min, antes da placa de 96 poços ser centrifugada (800 x g 5 min) e removidos 100 pL do sobrenadante. Este sobrenadante é adicionado a uma segunda placa de 96 poços, seguido por um substrato artificial da elastase (MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC, Nova Biochem, La Jolla, CA), para uma concentração final de 6 pg/mL, dissolvido em solução salina tamponada com fosfato. Logo depois, a placa é colocada num leitor de fluorescência de placas de 96 poços (Cytofluor 2350, Millipore, Bedfoxd, MA) e os dados recolhidos em intervalos de 3 min, de acordo com o método de Nakajima et al., J. Biol Chem 254 4027 (1979). A quantidade de Elastase libertada das PMN é calculada pela determinação da taxa de degradação de MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC. 31

Ensaio de Lesão Cerebral Traumática em TNF-a 0 presente ensaio proporciona o exame da expressão do ARNm do factor de necrose tumoral em regiões especificas do cérebro que ocorrem após lesão cerebral traumática (TBI) por percussão fluida lateral induzida experimentalmente em ratos. Os ratos Sprague-Dawley adultos (n=42) foram anestesiados com pentobarbital de sódio (60 mg/kg, i.p.) e sujeitos a lesão cerebral por percussão fluida lateral de gravidade moderada (2,4 atm) centrada sobre o córtex temporoparietal esquerdo (n=18) ou tratamento "simulado" (anestesia cirurgia sem lesão, n=18) . Os animais são sacrificados por decapitação a 1, 6 e 24 h, após lesão, os cérebros removidos e são preparadas amostras de tecido do córtex parietal (lesionado) esquerdo (LC), área correspondente no córtex contralateral direito (RC), córtex adjacente ao córtex parietal lesionado (LA), área adjacente correspondente no córtex direito (RA), hipocampo esquerdo (LH) e hipocampo direito (RH). Foi isolado o ARN total e foi efectuada a hibridação por transferência de Northern e quantificado em relação a um ARN controlo positivo de TNF-α (macrófago = 100%) . É observado um aumento acentuado da expressão do ARNm do TNF-a no LH (104+17% do controlo positivo, p < 0,05 comparado como o simulado), LC (105+21%, p< 0,05) e LA (69+8%, p < 0,01) no

hemisfério traumatizado 1 h após a lesão. É também observada uma expressão aumentada na expressão do ARNm do TNF-α no LH (46+8%, p < 0,05), LC (30+3%, p < 0,01) e LA (32+3%, p < 0,01) às 6 h, que desaparece sem supuração 24 h após a lesão. No hemisfério contralateral, a expressão de ARNm é aumentada no RH (46+2%, p < 0,01), RC (4 + 3%) e RA (22+8%) à 1 h e no RH (28+11%), RC (7+5%) e RA (26+6%, p < 0,05) à 6 h, mas não às 24 h após a lesão. Nos ratos simulados ou naive (cirurgia sem lesão), não são observadas alterações consistentes na expressão do ARNm do 32 TNF-α em qualquer uma das 6 áreas do cérebro nos dois hemisférios em qualquer momento. Estes resultados indicam que após lesão cerebral por percussão fluida parasagital, a expressão temporal de ARNm de TNF-α é alterada em regiões especificas do cérebro, incluindo aquelas do hemisfério não traumatizado. Uma vez que o TNF-α é capaz de induzir o factor de crescimento do nervo (NGF) e estimular a libertação de outras citocinas de astrócitos activados, esta alteração pós-traumática na expressão do gene do TNF-α desempenha uma função importante na resposta aguda e regenerativa ao trauma no SNC.

Modelo de lesão no SNC para ARNm de IL-β

Este ensaio caracteriza a expressão regional do ARNm da interleucina-lB (IL-1B) em regiões especificas do cérebro após lesão cerebral traumática (TBI) por percussão fluida lateral experimental em ratos. Os ratos Sprague-Dawley adultos (n=42) foram anestesiados com pentobarbital de sódio (60 mg/kg, i.p.) e sujeitos a lesão cerebral por percussão fluida lateral de gravidade moderada (2,4 atm) centrada sobre o córtex temporoparietal esquerdo (n=18) ou tratamento "simulado" (anestesia e cirurgia sem lesão). Os animais são sacrificados 1, 6 e 24 h após a lesão, os cérebros removidos e são preparadas amostras de tecido do córtex parietal (lesionado) esquerdo (LC), área correspondente no córtex contralateral direito (RC), córtex adjacente ao córtex parietal lesionado (LA), área adjacente correspondente no córtex direito (RA) , hipocampo esquerdo (LH) e hipocampo direito (RH). É isolado o ARN total e foi efectuada uma hibridação por transferência de Northern e a quantidade de ARNm de IL-Ιβ no tecido cerebral é apresentada como radioactividade relativa em percentagem de ARN de macrófago 33 positivo para IL-1B, que foi carregado no mesmo gel. Após 1 h da lesão cerebral, é observado um aumento acentuado e significativo na expressão de ARNm de IL-1B no LC (20,0+0,7% de controlo positivo, n=6, p < 0,05 comparado com o animal simulado), LH (24,5+0,9%, p < 0,05) e LA (21,5+3,1%, p < 0,05) no hemisfério lesionado, que permaneceu elevada até 6 h após a lesão no LC (4,0±0,4%, n=6, p < 0,05) e LH (5,0+1,3%, p < 0,05). Nos animais não estimulados ou simulados, não é observada expressão de ARNm de IL-1B em qualquer uma das respectivas áreas cerebrais. Estes resultados indicam que após TBI, a expressão temporal de ARNm de IL-1B é regionalmente estimulada em regiões especificas do cérebro. Estas alterações regionais nas citocinas, tais como a IL-1B, desempenham uma função no pós-traumático.

Lisboa, 29 de Março de 2007 34

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto seleccionado do grupo consistindo de: 4-[[3-(2-bromofenil)-4-oxo-l-(fenilmetil)-2-imidazolidinilideno]imino]-3-hidroxibenzonitrilo; 4-[[(7aS)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-l-oxo-3H-pirrolo[1,2—c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo; 4-[[5-(2-bromofenil)-3,3a,4,5-tetra-hidro-l,l-dioxido-4-oxoimidazo[1,5—b]isotiazol-6(2H)-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo; 4-[[(6R,7aS)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-6-hidroxi-l-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo; 4-[[(7aR)-2-(2-bromofenil)-hexa-hidro-l-oxo-3H-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo, 4-[(S) -2-(2,3-Dicloro-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2 c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, 4-[(R) -2-(2,3-Dicloro-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2 c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, 4-[2-(2,3-Dicloro-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, 1 4-[(S)-2-(2-Bromo-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-henzonitrilo, 4-[(R)-2-(2-Bromo-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, 4-[2-(2-Bromo-fenil)-1-oxo-hexa-hidro-pirrolo[1,2-c]imidazol-3-ilidenoamino]-3-hidroxi-benzonitrilo, e 4-[[2-(2-bromofenil)-1,5,6,7,8,8a-hexa-hidro-l-oxoimidazo[1,5-a]piridin-3(2H)-ilideno]amino]-3-hidroxibenzonitrilo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável,
2. 2. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um composto, de acordo com a Reivindicação 1, e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
3. 3. Utilização de um composto de acordo com a Reivindicação 1, na preparação de um medicamento para o tratamento de um estado de doença mediado por citocina seleccionado de psoriase, dermatite atópica, artrite, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, sindrome de dificuldade respiratória em adultos, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerosa, acidente vascular cerebral, choque séptico, choque endotóxico, sepsia por gram negativas, sindrome do choque tóxico, lesão por reperfusão cardiaca e renal, glomerulonefrite, trombose, reacção enxerto vs. hospedeiro, doença de alzheimer, rejeições de aloenxerto, malária, restenose, angiogénese, aterosclerose, 2 osteoporose, gengivite e libertação de células estaminais hematopoiéticas indesejadas. Lisboa, 29 de Março de 2007 3