DE60015296T2

DE60015296T2 - Indolderivate und ihre verwendung als mcp-1 rezeptor antagonisten

Info

Publication number: DE60015296T2
Application number: DE60015296T
Authority: DE
Inventors: Wellington Alan FAULL; Grant Jason KETTLE
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-02-01
Also published as: EP1150952B1; CZ20012807A3; NO20013809L; WO2000046196A1; KR20010094755A; HUP0105079A3; RU2235090C2; ZA200105311B; PL350184A1; GB9902461D0; NO20013809D0; US6737435B1; RU2001124567A; MY133209A; EE200100403A; ID30401A; BR0007984A; AR022461A1; EP1150952A1; AU2121300A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft entzündungshemmende Verbindungen, die über einen Antagonismus des CCR2-Rezeptors (auch als MCP-1-Rezeptor bekannt) wirken, was unter anderem zur Hemmung des Monozyten-Lockstoff-Proteins-1 (MCP-1) führt. Diese Verbindungen enthalten eine Indoleinheit. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung, zu ihrer Herstellung geeignete Zwischenprodukte und ihre Verwendung als Therapeutika.
MCP-1 ist ein Mitglied der Chemokinfamilie der proinflammatorischen Proteine, die Leukozytenchemotaxis und -aktivierung vermitteln. MCP-1 ist ein C-C-Chemokin, das eines der stärksten und selektivsten bekannten T-Zell- und Monozyten-Lock- und -Aktivierungsmittel ist. MCP-1 wurde bei der Pathophysiologie einer großen Zahl von Entzündungserkrankungen impliziert, einschließlich rheumatoider Arthritis, glomerulären Nephritiden, Lungenfibrose, Restenose (internationale Patentanmeldung WO 94/09128), Alveolitis (Jones et al., 1992, J. Immunol., 149, 2147) und Asthma. Andere Krankheitsfelder, von denen angenommen wird, dass MCP-1 eine Rolle bei ihrer Pathologie spielt, sind Atherosklerose (z.B. Koch et al., 1992, J. Clin. Invest., 90, 772–779), Psoriasis (Deleuran et al., 1996, J. Dermatological Science, 13, 228–236), Hypersensitivitätsreaktionen der Haut des verzögerten Typs, Reizdarm (Grimm et al., 1996, J. Leukocyte Biol., 59, 804–812), Multiple Sklerose und Hirntrauma (Berman et al, 1996, J. Immunol., 156, 3017-3023). Ein MCP-1-Inhibitor kann auch zur Behandlung von Schlaganfall, Reperfusionsverletzung, Ischämie, Myokardinfarkt und Transplantatabstoßung nützlich sein.
MCP-1 wirkt über den CCR2-Rezeptor. MCP-2 und MCP-3 können, zumindest teilweise, ebenfalls über diesen Rezeptor wirken. Wenn daher in dieser Beschreibung auf die "Hemmung oder den Antagonismus von MCP-1" oder "MCP-1-vermittelte Wirkungen" Bezug genommen wird, beinhaltet dies die Hemmung oder den Antagonismus von MCP-2- und/oder MCP-3-vermittelten Wirkungen, wenn MCP-2 und/oder MCP-3 über den CCR2-Rezeptor wirken.
Die Anmelder haben eine Klasse von Verbindungen entdeckt, die eine Indoleinheit enthalten und die eine nützliche hemmende Aktivität gegen MCP-1 besitzen. Die gleichzeitig anhängige Anmeldung UK 9716657.3 offenbart eine Klasse von Indolen mit MCP-1-Inhibitoraktivität. WO98/06703 offenbart eine Reihe von 2-Phenylbenzimidazolen mit MCP-1-Antagonistenaktivität. WO 96/37469 offenbart eine Reihe von N-Benzylindol-3-ylpropansäurederivaten als Cylooxygenase-2-Inhibitoren. WO 96/37467 offenbart eine Reihe von N-Benzylindol-3-ylbutansäurederivaten als Cyclooxygenase-2-Inhibitoren. WO 96/18393 offenbart eine Reihe von N-Benzyl-3-arylindol-2-carbonsäurederivaten als IL-8-Inhibitoren. US 5081145 offenbart eine Reihe von Indol-2-alkansäurederivaten als Prostaglandinantagonisten und Leukotriensynthese-Inhibitoren. WO 99/07678 und WO 99/07351, die beide nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurden, offenbaren eine Reihe von Indolderivaten mit MCP-1-Antagonistenaktivität. Diese Anmeldung beruht auf der überraschenden Entdeckung, dass bestimmte substituierte 5-Hydroxyindole MCP-1-Inhibitoren sind, die unerwartete und günstige Eigenschaften im Hinblick auf die Stärke und/oder die Blutspiegel und/oder die biologische Verfügbarkeit und/oder die Löslichkeit besitzen.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (I) bereit:
wobei:
R¹ ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder Methoxy ist;
R² ein Wasserstoffatom, Halogenatom, Methyl, Ethyl oder Methoxy ist;
R³ Carboxy, Tetrazolyl oder -CONHSO₂R⁴ ist, wobei R⁴ Methyl, Ethyl, Phenyl, 2,5-Dimethylisoxazolyl oder Trifluormethyl ist;
T -CH₂- oder -SO₂- ist; und
der Ring A 3-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 3,4-Dichlorphenyl, 3,4-Difluorphenyl, 3-Fluor-4-chlorphenyl, 3-Chlor-4-fluorphenyl oder 2,3-Dichlorpyrid-5-yl ist;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Prodrug davon.
In dieser Beschreibung umfasst der Begriff "Alkyl" sowohl gerade als auch verzweigtkettige Alkylreste, aber Bezugnahmen auf einzelne Alkylreste, wie "Propyl", sind nur für die geradkettige Version spezifisch. Der Begriff "Halogen" betrifft Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Besondere neue erfindungsgemäße Verbindungen umfassen zum Beispiel Verbindungen der Formel (I) oder pharmazeutisch annehmbare Salze oder Prodrugs davon, wobei, wenn nicht anders angegeben:

a) R¹ einen der in i) – iii) nachstehend definierten Werte oder eine Kombination von zwei dieser Werte annimmt;
b) R² einen der in iv) – viii) nachstehend definierten Werte oder eine Kombination von zwei dieser Werte annimmt;
c) R³ einen der in ix) – xi) nachstehend definierten Werte oder eine Kombination von zwei dieser Werte annimmt;
e) T einen der in xii) – xiii) nachstehend definierten Werte annimmt;
f) Ring A einen der in xiv) – xxi) nachstehend definierten Werte der eine Kombination von zwei oder mehreren dieser Werte annimmt; i) R¹ Wasserstoff ist; ii) R¹ Halogen ist; iii) R¹ Methoxy ist; iv) R² Wasserstoff ist; v) R² Halogen ist; vi) R² Methyl ist; vii) R² Ethyl ist; viii) R² Methoxy ist; ix) R³ Carboxy ist; x) R³ Tetrazolyl ist; xi) R³ -CONHSO₂R⁴ ist, wobei R⁴ Methyl, Ethyl, Phenyl, 2,5-Dimethylisoxazolyl oder Trifluormethyl ist; xii) T -CH₂- ist; xiii) T -SO₂- ist; xiv) Ring A 3-Chlorphenyl ist; xv) Ring A 4-Chlorphenyl ist; xvi) Ring A 3-Trifluormethylphenyl ist; xvii) Ring A 3,4-Dichlorphenyl ist; xviii) Ring A 3,4-Difluorphenyl ist; xix) Ring A 3-Fluor-4-chlorphenyl ist; xx) Ring A 3-Chlor-4-fluorphenyl ist; und xxi) Ring A 2,3-Dichlorpyrid-5-yl ist. Vorzugsweise ist R¹ Wasserstoff. Vorzugsweise ist R² Wasserstoff. Vorzugsweise ist R³ Carboxy. Vorzugsweise ist T -CH₂-.

Vorzugsweise ist Ring A 3-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 3,4-Dichlorphenyl, 3,4-Difluorphenyl, 3-Fluor-4-chlorphenyl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl.
Stärker bevorzugt ist Ring A 3,4-Dichlorphenyl, 3-Fluor-4-chlorphenyl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl.
Zum Beispiel ist Ring A 3,4-Dichlorphenyl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung ist Ring A vorzugsweise 3,4-Dichlorphenyl, 2,3-Dichlorpyrid-5-yl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl.
Unter einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird daher eine Verbindung der Formel (I), wie vorstehend dargestellt, bereitgestellt, wobei:
R¹ Wasserstoff ist;
R² Wasserstoff ist;
R³ Carboxy ist;
T -CH₂- ist; und
Ring A 3,4-Dichlorphenyl, 3-Fluor-4-chlorphenyl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl, insbesondere 3,4-Dichlorphenyl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Prodrug davon.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen umfassen eine derjenigen der Beispiele. Stärker bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind die Beispiele 1, 3 und 4, beispielsweise Beispiel 1 und 3.
Die Erfindung betrifft ferner alle tautomeren Formen der Verbindungen der Formel (I).
Es sollte ebenfalls selbstverständlich sein, dass bestimmte Verbindungen der Formel (I) in solvatisierten sowie unsolvatisierten Formen, wie beispielsweise hydratisierten Formen, existieren können. Es sollte selbstverständlich sein, dass die Erfindung alle solche solvatisierten Formen umfasst.
Verbindungen der Formel (I) sind Inhibitoren von Monozyten-Lockstoff-Protein-1. Außerdem scheinen sie die durch RANTES induzierte Chemotaxis zu hemmen. RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted, reguliert bei Aktivierung, normal in der T-Zelle exprimiert und sezerniert) ist ein weiteres Chemokin aus der gleichen Familie wie MCP- 1 mit einem ähnlichen biologischen Profil, das aber über den CCR1-Rezeptor wirkt. Infolgedessen können diese Verbindungen dazu verwendet werden, eine von diesen Substanzen vermittelte Erkrankung, insbesondere eine Entzündungserkrankung, zu behandeln.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze von Verbindungen der Formel (I) umfassen Basensalze, wie ein Salz von Alkalimetall, beispielsweise Natrium, ein Salz von Erdalkalimetall, beispielsweise Calcium oder Magnesium; ein Salz von organischem Amin, beispielsweise Triethylamin, Morpholin, N-Methylpiperidin, N-Ethylpiperidin, Procain, Dibenzylamin, N,N-Dibenzylethylamin, oder Aminosäuren, beispielsweise Lysin. Wenn die Verbindung ausreichend basisch ist, umfassen unter einem anderen Aspekt geeignete Salze Säureadditionssalze, wie Methansulfonat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Citrat, Maleat und mit Phosphor- und Schwefelsäure gebildete Salze. Je nach der Anzahl geladener Funktionen und der Wertigkeit der Kationen oder Anionen kann es mehr als ein Kation oder Anion geben. Ein bevorzugtes pharmazeutisch annehmbares Salz ist ein Natriumsalz.
Im Stand der Technik sind verschiedene Formen von Prodrugs bekannt. Beispiele für solche Prodrugderivate siehe in:

a) Design of Prodrugs, herausgegeben von H. Bundgaard, (Elsevier, 1985) und Verfahrens in Enzymology, Bd. 42, S. 309–396, K. Widder et al. (Academic Press, 1985);
b) A Textbook of Drug Design und Development, herausgegeben von Krogsgaard-Larsen und H. Bundgaard, Kapitel 5 "Design und Application of Prodrugs", von H. Bundgaard, S. 113–191 (1991);
c) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1–38 (1992);
d) H. Bundgaard et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988); und
e) N. Kakeya et al., Chem Pharm Bull, 32, 692 (1984).

Beispiele für solche Prodrugs sind in vivo spaltbare Ester einer erfindungsgemäßen Verbindung. Ein in vivo spaltbarer Ester einer erfindungsgemäßen Verbindung, die eine Carboxygruppe enthält, ist beispielsweise ein pharmazeutisch annehmbarer Ester, der im menschlichen oder tierischen Körper unter Bildung der Ausgangssäure gespalten wird. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Ester für Carboxy umfassen C₁-₆-Alkylester, beispielsweise Methyl- oder Ethyl-; C_1-6-Alkoxymethylester, beispielsweise Methoxymethyl-; C_1-6-Alkanoyloxymethylester, beispielsweise Pivaloyloxymethyl-; Phthalidylester; C_3-8-Cycloalkoxycarbonyloxy-C₁-₆-alkylester, beispielsweise 1-Cyclohexylcarbonyloxyethyl-; 1,3-Dioxolan-2-ylmethylester, beispielsweise 5-Methyl-1,3-dioxolan-2-ylmethyl-; C_1-6-Alkoxycarbonyloxyethylester, beispielsweise 1-Methoxycarbonyloxyethyl-; Aminocarbonylmethylester und Mono- oder Di-N-(C_1-6-alkyl)-Versionen davon, beispielsweise N,N-Dimethylaminocarbonylmethylester und N-Ethylaminocarbonylmethylester; und können an jeder Carboxygruppe der erfindungsgemäßen Verbindungen gebildet werden. Ein in vivo spaltbarer Ester einer erfindungsgemäßen Verbindung, die eine Hydroxygruppe enthält, ist beispielsweise ein pharmazeutisch annehmbarer Ester, der im menschlichen oder tierischen Körper unter Bildung der Ausgangshydroxygruppe gespalten wird. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Ester für Hydroxy umfassen C_1-6-Alkanoylester, beispielsweise Acetylester; und Benzoylester, wobei die Phenylgruppe mit Aminomethyl oder N-substituiertem Mono- oder Di-C_1-6-Alkylaminomethyl substituiert sein kann, beispielsweise 4-Aminomethylbenzoylester und 4-N,N-Dimethylaminomethylbenzoylester.
Weitere Beispiele für solche Prodrugs sind in vivo spaltbare Amide einer erfindungsgemäßen Verbindung. Beispiele für solche in vivo spaltbaren Amide umfassen ein N-C_1-6-Alkylamid und ein N,N-Di-(C_1-6-alkyl)amid, wie N-Methyl-, N-Ethyl-, N-Propyl-, N,N-Dimethyl-, N-Ethyl-N-methyl- oder N,N-Diethylamid.
Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Prodrugs davon bereit, wobei das Verfahren (wobei R¹, R², R³, T und Ring A, wenn nicht anders angegeben, die für Formel (I) definierte Bedeutung haben) folgendes umfasst:

a) Umsetzen von Verbindungen der Formel (II):
wobei R^a ein Rest R³ oder eine geschützte Form des Rests R³ ist, R^b Wasserstoff oder eine geeignete Hydroxy-Schutzgruppe ist, mit einer Verbindung der Formel (III):
wobei L ein austauschbarer Rest ist; und danach nötigenfalls: i) Umwandeln einer Verbindung der Formel (I) in eine weitere Verbindung der Formel (I); ii) Entfernen jedweder Schutzgruppen; oder iii) Bilden eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder eines Prodrugs davon.

Geeignete Werte für L sind beispielsweise eine Halogen- oder Sulfonyloxygruppe, beispielsweise ein Chlor-, Bromatom, eine Methansulfonyloxy- oder Toluol-4-sulfonyloxygruppe.
Spezifische Reaktionsbedingungen für die vorstehenden Umsetzungen lauten wie folgt.
Verbindungen der Formel (II) und (III) können zusammen in einem inerten Lösungsmittel und einer Base, wie N,N-Dimethylformamid/Natriumhydrid oder Dichlormethan/Natriumhydroxid oder Acetonitril/Kaliumcarbonat, oder in Gegenwart eines Phasentransferkatalysators, wie Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, umgesetzt werden. Die Umsetzung wird geeigneterweise für 1–6 Stunden, vorzugsweise 1–3 Stunden, bei einer Temperatur von 15-30°C, vorzugsweise 20–25°C durchgeführt, um eine Verbindung der Formel (I) zu erhalten.
Verbindungen der Formel (II) können kommerziell erhältlich sein oder unter Verwendung bekannter Verfahren durch Modifikation von kommerziell erhältlichen Verbindungen der Formel (II) oder durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
Verfahren i)
Umsetzen einer Verbindung der Formel (IV)
wobei R^b wie vorstehend definiert ist, mit einer Verbindung der Formel (V)
wobei R^c C_1-4-Alkyl ist.
Verbindungen der Formel (IV) und (V) werden zusammen unter Reissert-Reaktionsbedingungen, wie in einem inerten Lösungsmittel (wie Tetrahydrofuran), in Gegenwart einer Base (wie Kaliumethoxid), in einem Temperaturbereich von 15–30°C, vorzugsweise 20–25°C, für 10–20 Stunden, vorzugsweise 15–17 Stunden, umgesetzt. Die erhaltene Verbindung wird isoliert und in einem Alkohol, wie Ethanol, und einer organischen Säure (wie Essigsäure) gelöst, und ein Übergangsmetallkatalysator (wie 10% Pd/C) und Cyclohexen werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei einer Temperatur von 60–120°C, vorzugsweise bei 70-90°C, für 15–25 Stunden, vorzugsweise 16–20 Stunden, erhitzt, um eine Verbindung der Formel (II) zu erhalten, wobei R^a -CO₂C_1-4-Alkyl ist.
Verfahren (ii)
Umsetzen einer Verbindung der Formel (VI)
wobei R^b wie vorstehend definiert ist, mit einer Verbindung der Formel (VII):
wobei R^d C_1-4-Alkyl ist. Verbindungen der Formel (VI) und (VII) werden zusammen unter Fischer-Bedingungen, wie mit einer organischen Säure (wie Essigsäure), in einem Alkohol (wie Ethanol), bei einer Temperatur von 60–90°C, vorzugsweise 75–85°C, für 1–5 Stunden, vorzugsweise 1–3 Stunden, umgesetzt. Die erhaltene Verbindung wird mit einer starken Säure (wie Polyphosphorsäure) gemischt und bei 90–150°C, vorzugsweise 100–120°C, für 0,5–4 Stunden, vorzugsweise 0,5–2 Stunden, erhitzt, um eine Verbindung der Formel (II) zu erhalten, in der R² Wasserstoff ist. Wenn gewünscht, kann R² dann gegebenenfalls unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken, wie den nachstehend beschriebenen, in einen anderen Wert von R², wie in Formel (I) definiert, umgewandelt werden.
Verfahren (iii)
Cyclisierung einer Verbindung der Formel (VIII)
wobei R¹, R^a, R^b und R² wie vorstehend definiert sind.
Die Cyclisierung kann durch Erhitzen der Verbindung unter Rückfluss in einem organischen Lösungsmittel, wie Xylol, erfolgen. Verbindungen der Formel (VIII) werden geeigneterweise durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (IX)
wobei R¹, R² und R^b wie vorstehend definiert sind, mit einer Verbindung der Formel (X)
wobei R^a wie vorstehend definiert ist, hergestellt. Die Umsetzung erfolgt geeigneterweise in einem organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, insbesondere Methanol, in Gegenwart einer Base, wie einem Alkalimetallalkoxid, insbesondere Natriummethoxid. Mäßige Temperaturen von –30 bis 20°C werden geeigneterweise eingesetzt.
Verfahren (iv)
Bei noch einer weiteren Modifikation werden Verbindungen der Formel (II) durch Cyclisierung einer Verbindung der Formel (XI)
wobei R¹ und R^b wie vorstehend definiert sind, R⁷ Alkyl, wie Methyl, ist und R⁸ eine Carboxyschutzgruppe, wie Alkyl, insbesondere Methyl, ist, hergestellt.
Die Cyclisierung erfolgt geeigneterweise unter Japp-Klingemann-Bedingungen durch Erwärmen einer Lösung der Verbindung in einem organischen Lösungsmittel, wie Toluol, und einer geeigneten Säure, wie p-Toluolsulfonsäure.
Verbindungen der Formel (XI) werden geeigneterweise durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XII)
wobei R¹, R^b, R⁵ und R⁶ wie vorstehend definiert sind, mit einer Verbindung der Formel (XIII)
wobei R⁷ und R⁸ wie in Verbindung mit Formel (XI) definiert sind, hergestellt. Die Verbindung der Formel (XII) wird geeigneterweise in einer verdünnten Säure, wie 1,5 N HCl, in Gegenwart eines Nitrits, wie Natriumnitrit, bei mäßig niedrigen Temperaturen von –30 bis 0°C, vorzugsweise –5°C, gelöst.
Diese Lösung wird dann mit einer Lösung einer Verbindung der Formel (XIII) in einem organischen Lösungsmittel, wie Ethanol, in Gegenwart einer Lösung einer Base, wie eines Alkalimetallhydroxids, beispielsweise wässriger Natriumhydroxidlösung, gemischt.
Verbindungen der Formel (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (X), (XII) und (XIII) sind bekannt oder kommerziell erhältlich oder werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren durch Standardmanipulation kommerziell erhältlicher oder bekannter Materialien hergestellt.
R^c und R^d sind C_1-4-Alkyl. Vorzugsweise sind R^c und R^d Methyl oder Ethyl.
Es ist ebenfalls ersichtlich, dass es bei einigen der hier erwähnten Umsetzungen notwendig/erwünscht sein kann, jedwede empfindliche Gruppe in den Verbindungen zu schützen. Die Fälle, in denen Schutz notwendig oder erwünscht ist, und geeignete Verfahren zum Schutz sind dem Fachmann bekannt. Wenn somit Reaktanten Gruppen, wie Carboxy oder Hydroxy, enthalten, kann es wünschenswert sein, die Gruppe bei einigen der hier erwähnten Umsetzungen zu schützen.
Eine geeignete Schutzgruppe für eine Hydroxygruppe ist beispielsweise eine Acylgruppe, beispielsweise eine Alkanoylgruppe, wie Acetyl, eine Aroylgruppe, beispielsweise Benzoyl, oder eine Arylmethylgruppe, beispielsweise Benzyl. Die Bedingungen zum Entfernen der vorstehenden Schutzgruppen variieren notwendigerweise mit der Wahl der Schutzgruppe. So kann beispielsweise eine Acylgruppe, wie eine Alkanoyl- oder eine Aroylgruppe, beispielsweise durch Hydrolyse mit einer geeigneten Base, wie einem Alkalimetallhydroxid, beispielsweise Lithium- oder Natriumhydroxid, entfernt werden. Alternativ kann eine Arylmethylgruppe, wie eine Benzylgruppe, beispielsweise durch Hydrierung über einem Katalysator, wie Palladium-auf-Kohle, entfernt werden.
Eine geeignete Schutzgruppe für eine Carboxygruppe ist beispielsweise eine veresternde Gruppe, beispielsweise eine Methyl- oder eine Ethylgruppe, die beispielsweise durch Hydrolyse mit einer Base, wie Natriumhydroxid, entfernt werden kann, oder beispielsweise eine t-Butylgruppe, die beispielsweise durch Behandlung mit einer Säure, beispielsweise einer organischen Säure, wie Trifluoressigsäure, entfernt werden kann, oder beispielsweise eine Benzylgruppe, die beispielsweise durch Hydrierung über einem Katalysator, wie Palladium-auf-Kohle, entfernt werden kann.
Die Schutzgruppen können auf jedweder geeigneten Stufe bei der Synthese unter Verwendung von im chemischen Fachgebiet bekannten üblichen Techniken entfernt werden.
Einige der hier beschriebenen Zwischenprodukte können neu sein, zum Beispiel Zwischenprodukte der Formel (II), und werden als solche als weiteres Merkmal der Erfindung bereitgestellt.
Wenn ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung der Formel (I) erforderlich ist, kann es beispielsweise durch Umsetzung der Verbindung mit der geeigneten Säure (die ein physiologisch annehmbares Anion liefert) oder mit der geeigneten Base (die ein physiologisch annehmbares Kation liefert) oder durch jedes andere übliche Salzbildungsverfahren erhalten werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Verbindung der Formel (I), wie hier vorstehend definiert, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Prodrug davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Excipienten oder Träger umfasst.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können eine Form besitzen, die zur oralen Verwendung (beispielsweise als Tabletten, Pastillen, Hart- oder Weichgelatinekapseln, wässrige oder ölige Suspensionen, Emulsionen, dispergierbare Pulver oder Granulate, Sirupe oder Elixiere), zur topischen Verwendung (zum Beispiel als Cremes, Salben, Gele oder wässrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen), zur Verabreichung durch Inhalation (zum Beispiel als fein verteiltes Pulver oder ein flüssiges Aerosol), zur Verabreichung durch Einblasung (beispielsweise als fein verteiltes Pulver) oder zur parenteralen Verabreichung (zum Beispiel als sterile wässrige oder ölige Lösung zur intravenösen, subkutanen, intramuskulären oder intramuskulären Dosierung oder als Suppositorium zur rektalen Dosierung) geeignet ist.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können durch übliche Verfahren unter Verwendung üblicher pharmazeutischer Excipienten, wie im Stand der Technik bekannt, erhalten werden. So können zur oralen Verwendung bestimmte Zusammensetzungen zum Beispiel einen oder mehrere Farb-, Süß-, Geschmacks- und/oder Konservierungsstoffe enthalten.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Excipienten für eine Tablettenformulierung umfassen beispielsweise inerte Verdünnungsmittel, wie Lactose, Natriumcarbonat, Calciumphosphat oder Calciumcarbonat, Granulier- und Auflösemittel, wie Maisstärke oder Algensäure, Bindemittel, wie Stärke, Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talk, Konservierungsmittel, wie Ethyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat, und Antioxidantien, wie Ascorbinsäure. Tablettenformulierungen können, um entweder ihre Auflösung und die anschließende Absorption des Wirkstoffs im Gastrointestinaltrakt zu modifizieren oder ihre Stabilität und/oder ihr Aussehen zu verbessern, in jedem Fall unter Verwendung üblicher Überzugsmittel und im Stand der Technik bekannter Verfahren nichtüberzogen oder überzogen werden.
Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können die Form von Hartgelatinekapseln haben, in denen der Wirkstoff mit einem inerten festen Verdünnungsmittel, beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin, gemischt ist, oder als Weichgelatinekapseln verwendet werden, in denen der Wirkstoff mit Wasser oder einem Öl, wie Erdnussöl, Flüssigparaffin oder Olivenöl, gemischt ist.
Wässrige Suspensionen enthalten gewöhnlich den Wirkstoff in fein pulverisierter Form zusammen mit einem oder mehreren Suspensionsmitteln, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragant und Gummiarabicum; Dispergier- und Benetzungsmitteln, wie Lecithin oder Kondensationsprodukte eines Alkylenoxids mit Fettsäuren (beispielsweise Polyoxyethylenstearat) oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, beispielsweise Heptadecaethylenoxycetanol, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit partiellen Estern, die von Fettsäuren und einem Hexit stammen, wie Polyoxyethylensorbitolmonooleat, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, beispielsweise Heptadecaethylenoxycetanol, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit partiellen Estern, die von Fettsäuren und einem Hexit stammen, wie Polyoxyethylensorbitolmonooleat, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit partiellen Estern, die von Fettsäuren und Hexitanhydriden stammen, beispielsweise Polyethylensorbitanmonooleat. Die wässrigen Suspensionen können auch einen oder mehrere Konservierungsstoffe (wie Ethyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat, Antioxidantien (wie Ascorbinsäure), Farbstoffe, Geschmacksstoffe und/oder Süßstoffe (wie Saccharose, Saccharin oder Aspartam) enthalten.
Ölige Suspensionen können durch Suspendieren des Wirkstoffs in einem Pflanzenöl (wie Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnussöl) oder in einem Mineralöl (wie Flüssigparaffin) formuliert werden. Die öligen Suspensionen können auch ein Verdickungsmittel, wie Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol, enthalten. Süßstoffe, wie die vorstehend dargelegten, und Geschmacksstoffe können hinzugefügt werden, um eine wohlschmeckende orale Zubereitung bereitzustellen. Diese Zusammensetzungen können durch Zugabe eines Antioxidans, wie Ascorbinsäure, konserviert werden.
Dispergierbare Pulver und Granulate, die sich zur Herstellung einer wässrigen Suspension durch Zugabe von Wasser eignen, enthalten gewöhnlich den Wirkstoff zusammen mit einem Dispergier- oder Benetzungsmittel, Suspensionsmittel und einem oder mehreren Konservierungsstoffen. Geeignete Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel werden durch die bereits vorstehend genannten veranschaulicht. Zusätzliche Excipienten, wie Süß-, Geschmacks- und Farbstoffe, können ebenfalls vorhanden sein.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch die Form von Öl-in- Wasser-Emulsionen haben. Die ölige Phase kann ein Pflanzenöl, wie Olivenöl oder Erdnussöl, oder ein Mineralöl, wie beispielsweise Flüssigparaffin, oder ein Gemisch von beliebigen von diesen sein. Geeignete Emulgatoren können zum Beispiel natürlich vorkommende Gummen, wie Gummiarabicum oder Tragant, natürlich vorkommende Phosphatide, wie Sojabohne, Lecithin, ein Ester oder partielle Ester, die von Fettsäuren und Hexitanhydriden stammen, (beispielsweise Sorbitanmonooleat) und Kondensationsprodukte der partiellen Ester mit Ethylenoxid, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat, sein. Die Emulsionen können auch Süß-, Geschmacks- und Konservierungsstoffe enthalten.
Sirupe und Elixiere können mit Süßstoffen, wie Glycerin, Propylenglycol, Sorbit, Aspartam oder Saccharose, formuliert werden und können auch ein Milderungsmittel, einen Konservierungsstoff, Geschmacks- und/oder Farbstoff enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch die Form einer sterilen, injizierbaren, wässrigen oder öligen Suspension haben, die gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung von einem oder mehreren der geeigneten Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel, die vorstehend genannt wurden, formuliert werden können. Eine sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen, parenteral annehmbaren Verdünnungs- oder Lösungsmittel, zum Beispiel eine Lösung in 1,3-Butandiol, sein.
Suppositorienformulierungen können durch Mischen des Wirkstoffs mit einem geeigneten, nichtreizenden Excipienten hergestellt werden, der bei gewöhnlichen Temperaturen fest, aber bei der Rektaltemperatur flüssig ist und deshalb im Rektum schmilzt, um das Arzneimittel freizusetzen. Geeignete Excipienten umfassen zum Beispiel Kakaobutter und Polyethylenglycole.
Topische Formulierungen, wie Cremes, Salben, Gele und wässrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen, können gewöhnlich durch Formulieren eines Wirkstoffs mit einem üblichen, topisch annehmbaren Vehikel oder Verdünnungsmittel unter Verwendung eines im Stand der Technik bekannten, üblichen Verfahrens erhalten werden.
Zusammensetzungen zur Verabreichung durch Einblasen können die Form eines fein verteilten Pulvers haben, das Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von beispielsweise 30 μ oder viel weniger enthält, wobei das Pulver selbst entweder den Wirkstoff allein oder verdünnt mit einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Trägern, wie Lactose, umfasst. Das Pulver zum Einblasen wird dann geeigneterweise in einer Kapsel, die beispielsweise 1 bis 50 mg Wirkstoff enthält, zur Verwendung in einer Turboinhalatorvorrichtung gehalten, wie sie beispielsweise zum Einblasen der bekannten Substanz Natriumcromoglycat verwendet wird.
Zusammensetzungen zur Verabreichung durch Inhalation können die Form eines üblichen, unter Druck stehenden Aerosols haben, das derart angeordnet ist, dass der Wirkstoff entweder als Aerosol, das fein verteilte feste oder flüssige Tröpfchen enthält, gespendet wird. Übliche Aerosoltreibmittel, wie flüchtige fluorierte Kohlenwasserstoffe oder Kohlenwasserstoffe, können verwendet werden, und die Aerosolvorrichtung ist gewöhnlich derart angeordnet, dass eine abgemessene Menge des Wirkstoffs gespendet wird.
Für weitere Informationen zur Formulierung wird der Leser an Kapitel 25.2 in Band 5 von Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990, verwiesen.
Die Menge an Wirkstoff, die mit einem oder mehreren Excipienten kombiniert wird, um eine Einzeldosierungsform herzustellen, variiert notwendigerweise je nach dem behandelten Wirt und dem besonderen Verabreichungsweg. Zum Beispiel enthält eine Formulierung, die zur oralen Verabreichung an Menschen bestimmt ist, gewöhnlich beispielsweise von 0,5 mg bis 2 g Wirkstoff, der mit einer geeigneten und günstigen Menge an Excipienten compoundiert ist, die von etwa 5 bis etwa 98 Gewichtsprozent der Gesamtzusammensetzung variieren kann. Einzeldosierungsformen enthalten in der Regel etwa 1 mg bis etwa 500 mg eines Wirkstoffes. Für weitere Informationen zu Verabreichungswegen und Dosierungsschemata wird der Leser an Kapitel 25.3 in Band 5 von Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990, verwiesen.
Die Größe der Dosis für therapeutische oder prophylaktische Zwecke einer Verbindung der Formel I variiert natürlich gemäß der Art und Schwere der Zustände, dem Alter und Geschlecht des Tieres oder Patienten und dem Verabreichungsweg gemäß bekannten Prinzipien der Medizin. Wie vorstehend erwähnt, eignen sich Verbindungen der Formel I zur Behandlung von Erkrankungen oder medizinischen Zuständen, die allein oder teilweise auf die Wirkungen von Farnesylierung von Ratten zurückzuführen sind.
Bei Verwendung einer Verbindung der Formel I zu therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken wird sie gewöhnlich derart verabreicht, dass eine tägliche Dosis im Bereich von beispielsweise 0,5 mg bis 75 mg pro kg Körpergewicht erhalten wird, wenn erforderlich, in geteilten Dosen verabreicht. Gewöhnlich werden niedrigere Dosen verabreicht, wenn ein parenteraler Weg verwendet wird. So wird beispielsweise zur intravenösen Verabreichung gewöhnlich eine Dosis in Bereich von beispielsweise 0,5 mg bis 30 mg pro kg Körpergewicht verwendet. Ähnlich wird zur Verabreichung durch Inhalation eine Dosis im Bereich von beispielsweise 0,5 mg bis 25 mg pro kg Körpergewicht verwendet. Die orale Verabreichung ist jedoch bevorzugt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Prodrug davon, wie hier vorstehend definiert, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie bereitgestellt. Geeigneterweise stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Entzündungserkrankung durch Verabreichung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Prodrugs oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon, wie vorstehend beschrieben, bereit.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel (I) und ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Prodrug davon zur Verwendung als Medikament.
Geeigneterweise ist dies eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Prodrug davon zur Verwendung als Medikament zum Entgegenwirken einer MCP-1-vermittelten Wirkung bei einem warmblütigen Tier, wie einem Menschen.
Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Entgegenwirken einer MCP-1-vermittelten Wirkung bei einem warmblütigen Tier, wie einem Menschen, bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zum Entgegenwirken einer MCP-1-vermittelten Wirkung bei einem warmblütigen Tier, wie einem Menschen, der eine solche Behandlung benötigt, bereitgestellt, welches das Verabreichen einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Prodrugs davon, wie hier vorstehend definiert, an das Tier umfasst.
Biologische Tests

Die folgenden biologischen Testverfahren, Daten und Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung. Abkürzungen:

ATCC	American Type Culture Collection, Rockville, USA.
BCA	Bicinchroninsäure, (mit Kupfersulfat zum Testen von Protein verwendet)
BSA	Rinderserumalbumin
DMEM	Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium
EGTA	Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure
FCS	fötales Kälberserum
HEPES	(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure])
HBSS	Hanks balancierte Salzlösung
hMCP-1	humanes Monozyten-Lockstoff-Protein-1
PBS	phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR	Polymerasekettenreaktion

Von Perkin-Elmer Cetus erhältliche AMPLITAQ^TM wird als Quelle für thermostabile DNA-Polymerase verwendet.
Der Bindungspuffer besteht aus 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% fötalem Kälberserum, mit 1 M NaOH auf pH 7,2 eingestellt.
Nichtessenzielle Aminosäuren (100X Konzentrat) sind: L-Alanin, 890 mg/l; L-Asparagin, 1320 mg/l; L-Asparaginsäure, 1330 mg/l; L-Glutaminsäure, 1470 mg/l; Glycin, 750 mg/l, L-Prolin, 1150 mg/l und L-Serin, 1050 mg/l.
Hypoxanthin- und Thymidinergänzung (50X Konzentrat) ist: Hypoxanthin, 680 mg/l, und Thymidin, 194 mg/l.
Penicillin-Streptomycin ist: Penicillin G (Natriumsalz); 5000 Einheiten/ml; Streptomycinsulfat, 5000 μg/ml.
Zellen der menschlichen Monozytenzelllinie THP-1 sind von der ATCC, Zugangsnummer ATCC TIB-202, erhältlich.
Hanks balancierte Salzlösung (HBSS) wurde von Gibco erhalten; siehe Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1949, 71, 196.
Synthetisches Zellkulturmedium RPMI 1640 wurde von Gibco erhalten; es enthält anorganische Salze [Ca(NO₃)₂·4 H₂O 100 mg/l; KCl 400 mg/l; MgSO₄·7 H₂O 100 mg/l; NaCl 6000 mg/l; NaHCO₃ 2000 mg/l und Na₂HPO₄ (wasserfrei) 800 mg/l], D-Glucose 2000 mg/l, reduziertes Glutathion 1 mg/l, Aminosäuren und Vitamine.
FURA-2/AM ist 1-[2-(5-Carboxyoxazol-2-yl)-6-aminobenzofuran-5-oxy]-2-(2'-amino-5'-methylphenoxy)-ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäurepentaacetoxymethylester und wurde von Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA, bezogen.
Blutsedimentationspuffer enthält 8,5 g/l NaCl und 10 g/l Hydroxyethylcellulose.
Lysepuffer ist 0,15 M NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 1 mM EDTA.
Gesamtzellbindungspuffer ist 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% BSA, 0,01% NaN₃, mit 1 M NaOH auf pH 7,2 eingestellt.
Waschpuffer ist 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% hitzeinaktiviertes FCS, 0,5M NaCl, mit 1 M NaOH auf pH 7,2 eingestellt.
Es kann nach allgemeinen molekularbiologischen Verfahren aus einem der in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" Zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschriebenen Verfahren vorgegangen werden.
i) Klonierung und Expression des hMCP-1-Rezeptors
Die cDNA des MCP-1-Rezeptors B (CCR2B) wurde mittels PCR aus THP-1-Zell-RNA unter Verwendung geeigneter Oligonucleotidprimer auf der Basis der veröffentlichten MCP-1-Rezeptosequenzen kloniert (Charo et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2752). Die erhaltenen PCR-Produkte wurden in den Vektor PCR-II^TM (InVitrogen, San Diego, CA.) kloniert. Fehlerfreie CCR2B-cDNA wurde als Hind-III-Not-I-Fragment in den eukaryotischen Expressionsvektor pCDNA3 (InVitrogen) subkloniert, um pCDNA3/CC-CKR2A bzw. pCDNA3/CCR2B zu erzeugen.
Linearisierte pCDNA3/CCR2B-DNA wurde durch Calciumphosphatfällung in CHO-K1-Zellen transfiziert (Wigler et al., 1979, Cell, 16, 777). Transfizierte Zellen wurden durch Zugabe von Geneticinsulfat (G418, Gibco BRL) in einer Konzentration von 1 mg/ml 24 Stunden nach dem Transfizieren der Zellen selektiert. RNA-Präparation und Northern-Blotting wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Needham et al., 1995, Prot. Express. Purific., 6, 134). CHO-K1-Klon 7 (CHO-CCR2B) wurde als der höchste MCP-1-Rezeptor-B-Expressor identifiziert.
ii) Präparation von Membranfragmenten
CHO-CCR2B-Zellen wurden in DMEM gezüchtet, das mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1X nichtessenziellen Aminosäuren, 1X Hypoxanthin- und Thymidinergänzung und Penicillin-Streptomycin (in einer Konzentration von 50 μg Streptomycin/ml, Gibco BRL) angereichert war. Membranfragmente wurden unter Verwendung von Zelllyse-/Differenzialzentrifugationsverfahren präpariert, wie zuvor beschrieben (Siciliano et al., 1990, J. Biol. Chem., 265, 19658). Die Proteinkonzentration wurde durch den BCA-Proteintest (Pierce, Rockford, Illinois) gemäß den Angaben des Herstellers bestimmt.
iii) Test
¹²⁵I-MCP-1 wurde unter Verwendung der Bolton-und-Hunter-Konjugation hergestellt (Bolton et al., 1973, Biochem. J., 133, 529; Amersham International plc]. Gleichgewichtsbindungsstudien wurden unter Verwendung des Verfahrens von Ernst et al., 1994, J. Immunol., 152, 3541, durchgeführt. Kurz gesagt, wurden verschiedene Mengen ¹²⁵I-markiertes MCP-1 zu 7 μg gereinigten CHO-CCR2B-Zellmembranen in 100 μl Bindungspuffer gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Bindungsreaktionsgemische filtriert und 5 Mal unter Verwendung von eiskaltem Bindungspuffer durch einen Plattenwäscher (Brandel MLR- 96T Cell Harvester) gewaschen. Die Filtermatten (Brandel GF/B) wurden vor der Verwendung für 60 Minuten in 0,3% Polyethylenimin vorgetränkt. Nach der Filtration wurden einzelne Filter in 3,5-ml-Röhrchen (Sarstedt Nr. 55.484) aufgeteilt, und gebundenes ¹²⁵I-markiertes MCP-1 wurde bestimmt (LKB 1277 Gammamaster). Kalte Kompetitionsstudien erfolgten wie vorstehend unter Verwendung von 100 pM ¹²⁵I-markiertem MCP-1 in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von unmarkiertem MCP-1. Die unspezifische Bindung wurde bestimmt, indem ein 200-facher molarer Überschuss von unmarkiertem MCP-1 zur Reaktion gegeben wurde.
Ligandenbindungsstudien mit Membranfragmenten, die von CHO-CCR2B-Zellen präpariert wurden, zeigten, dass der CCR2B-Rezeptor in einer Konzentration von 0,2 pmol/mg Membranprotein vorlag und MCP-1 selektiv und mit hoher Affinität (IC₅₀ = 110 pM, K_d = 120 pM) band. Die Bindung an diese Membranen war vollständig reversibel und erreichte nach 45 Minuten bei Raumtemperatur ein Gleichgewicht, und es bestand eine lineare Beziehung zwischen der MCP-1-Bindung und der CHO-CCR2B-Zellmembrankonzentration, wenn MCP-1 in Konzentrationen zwischen 100 pM und 500 pM eingesetzt wurde.
Die in DMSO (5 μl) gelösten Testverbindungen wurden in Konkurrenz zu 100 pM markiertem MCP-1 über einen Konzentrationsbereich (0,01–50 μM) in Doppelproben unter Verwendung von Acht-Punkt-Dosis-Wirkungs-Kurven getestet, und die IC₅₀-Konzentrationen wurden berechnet.
Die getesteten erfindungsgemäßen Verbindungen hatten IC₅₀-Werte von 50 μM oder weniger im hier beschriebenen hMCP-1-Rezeptorbindungstest.
b) MCP-1-vermittelter Calciumflux in THP-1-Zellen
Die menschliche Monozytenzelllinie THP-1 wurden in einem synthetischen Zellkulturmedium RPMI 1640, das mit 10% fötalem Kälberserum, 6 mM Glutamin und Penicillin-Streptomycin (in einer Konzentration von 50 μg Streptomycin/ml, Gibco BRL) angereichert war, gezüchtet. Die THP-1-Zellen wurden in HBSS (ohne Ca²⁺ und Mg²⁺) + 1 mg/ml BSA gewaschen und im gleichen Puffer in einer Dichte von 3 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden dann mit 1 mM FURA-2/AM für 30 min bei 37°C beladen, zwei Mal in HBSS gewaschen und in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die THP-1-Zellsuspension (0,9 ml) wurde in eine 5-ml-Einmalküvette gegeben, die einen Magnetrührstab und 2,1 ml vorgewärmtes (37°C) HBSS mit 1 mg/ml BSA, 1 mM MgCl₂ und 2 mM CaCl₂ enthielt. Die Küvette wurde in ein Fluoreszenz-Spektralphotometer (Perkin Elmer, Norwalk, CT) gestellt und für 4 min bei 37°C unter Rühren vorinkubiert. Die Fluoreszenz wurde über 70 s aufgezeichnet, und die Zellen wurden durch Zugabe von hMCP-1 zu der Küvette nach 10 s stimuliert. [Ca²⁺]i wurde durch abwechselnde Anregung bei 340 nm und 380 nm und anschließende Messung der Intensität der Fluoreszenzemission bei 510 nm gemessen. Das Verhältnis der Intensitäten des emittierten Fluoreszenzlichts nach Anregung bei 340 nm und 380 nm, (R), wurde berechnet und angezeigt, um cytoplasmatisches [Ca²⁺] gemäß folgender Gleichung zu erhalten und zu bestimmen:
wobei als K_d für denFURA-2-Ca²⁺-Komplex bei 37°C 224 nm angenommen wurde. R_max ist das maximale Fluoreszenzverhältnis, das nach Zugabe von 10 mM Ionomycin bestimmt wird, R_min ist das minimale Verhältnis, das durch anschließende Zugabe einer Ca²⁺-freien Lösung, die 5 mM EGTA enthält, bestimmt wird, und Sf2/Sb2 ist das Verhältnis der Fluoreszenzwerte bei 380 nm Anregung, das bei R_min bzw. R_max bestimmt wird.
Eine Stimulation von THP-1-Zellen mit hMCP-1 induzierte einen schnellen, vorübergehenden Anstieg des [Ca²⁺]_i auf spezifische und dosisabhängige Weise. Dosis-Wirkungs-Kurven zeigten eine ungefähre EC₅₀ von 2 nm.
Die in DMSO (10 μl) gelösten Testverbindungen wurden hinsichtlich der Hemmung der Calciumfreisetzung getestet, indem sie zu der Zellsuspension 10 s vor der Ligandenzugabe hinzugefügt wurden und die Verringerung des vorübergehenden Anstiegs von (Ca²⁺]i gemessen wurde. Die Testverbindungen wurden auch auf das Fehlen einer Agonistenaktivität durch Zugabe an Stelle von hMCP-1 überprüft.
c) hMCP-1- und RANTES-vermittelte Chemotaxis
In-vitro-Chemotaxistests wurden unter Verwendung der menschlichen Monozytenzelllinie THP-1 durchgeführt. Die Zellwanderung durch Polycarbonatmembranen wurde gemessen, indem die Hindurchwandernden entweder direkt durch Coulter-Zählung oder indirekt unter Verwendung eines colorimetrischen Lebensfähigkeitstests, bei dem die Spaltung eines Tetrazoliumsalzes durch die mitochondriale Atmungskette gemessen wird (Scudiero D. A. et al. 1988, Cancer Res., 48, 4827–4833), gezählt wurden.
Die Lockstoffe wurden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, die die untere Vertiefung einer Chemotaxiskammer bildet, die mit einer PVP-freien, mit Polycarbonat-Klebstoff umrahmten Filtermembran mit 5 μm Porengröße (NeuroProbe Reihe MB, Cabin John, MD 20818, USA) ausgestattet war, gemäß den Angaben des Herstellers eingebracht. Der Lockstoff wurde, wie angemessen, in synthetischem Zellkulturmedium RPMI 1640 (Gibco), oder mit 2 mM Glutamin und 0,5% BSA angereichert, oder alternativ mit HBSS mit Ca²⁺ und Mg²⁺ ohne Phenolrot (Gibco) plus 0,1% BSA verdünnt. Jede Verdünnung wurde für 30 min unter Vakuum entgast und wurde (400 μl) in die unteren Vertiefungen der Kammer eingebracht, und THP-1 Zellen (5 × 10⁵ in 100 μl RPMI 1640 + 0,5% BSA) wurden in jeder Vertiefung der oberen Kammer inkubiert. Für die Hemmung der Chemotaxis wurde der Lockstoff bei einer konstanten submaximalen Konzentration gehalten, die zuvor bestimmt wurde (1 nM MCP-1), und in die untere Vertiefung zusammen mit den in DMSO (DMSO-Endkonzentration < 0,05 v/v) in verschiedenen Konzentrationen gelösten Testverbindungen hinzugefügt. Die Kammer wurde für 2 Std. bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Das Medium wurde aus den oberen Vertiefungen entfernt, die dann mit 200 μl physiologischer Kochsalzlösung gewaschen wurden, bevor die Kammer geöffnet, die Membranoberfläche trocken gewischt und die Platte mit 96 Vertiefungen bei 600 g für 5 min zentrifugiert wurde, um die Zellen zu ernten. Der Überstand (150 μl) wurde abgesaugt, und 10 μl Zellproliferationsreagenz, WST-1, {4-[3-(4-Iodphenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-phenyldisulfonat} plus ein Elektronenkopplungsreagenz (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1644 807) wurden wieder in die Vertiefungen eingebracht. Die Platte wurde bei 37°C für 3 Std. inkubiert, und die Extinktion des löslichen Formazanprodukts wurde an einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 450 nm abgelesen. Die Daten wurden in eine Kalkulationstabelle eingetragen, hinsichtlich jedweder zufälligen Wanderung in Abwesenheit von Lockstoff korrigiert, und die durchschnittlichen Extinktionswerte, die Standardabweichung vom Mittelwert und Signifikanztests wurden berechnet. hMCP-1 induzierte eine konzentrationsabhängige Zellwanderung mit einer charakteristischen zweiphasigen Antwort, maximal 0,5–1,0 nm.
Bei einer alternativen Form des vorstehenden Tests können mit einer Fluoreszenzmarkierung versehene Zellen verwendet werden, die zum Endpunktnachweis beitragen. In diesem Fall wurden die verwendeten THP-1-Zellen durch Inkubation in Gegenwart von 5 mM Calcein AM (Glycin, N,N'-[[3',6'-Bis(acetyloxy)-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthen]-2',7'-diyl]bis(methylen)]bis[N-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]]bis[(acetyloxy)methyl]ester; Molecular Probes) für 45 Minuten im Dunkeln mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in HBSS (ohne Phenolrot) mit Ca²⁺, Mg²⁺ und 0,1% BSA resuspendiert. 50 μl (2 × 10⁵ Zellen) der Zellsuspension werden auf das Filter oberhalb jeder Vertiefung aufgebracht, und die Vorrichtung wird, wie vorstehend, bei 37°C für 2 Stunden unter 5% CO₂ inkubiert. Am Ende der Inkubation werden die Zellen von der Oberseite des Filters mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung abgewaschen, das Filter wird von der Platte entnommen, und die Anzahl der entweder zur Unterseite des Filters oder in die untere Vertiefung gelockten Zellen wird durch Ablesen der Fluoreszenz bei 485 nm Anregungs-, 538 nm Emissionswellenlänge (fmax, Molecular Devices) bestimmt. Die Daten wurden in eine Kalkulationstabelle eingetragen, hinsichtlich jedweder zufälligen Wanderung in Abwesenheit von Lockstoff korrigiert, und die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte, die Standardabweichung vom Mittelwert, die prozentuale Hemmung und der IC₅₀ der Verbindungen unter Test und Signifikanztests können berechnet werden. Zusätzlich zur MCP-1-induzierten Chemotaxis wurde diese alternative Form des Tests auch zur Messung der Hemmung der RANTES- (2 nM) induzierten Chemotaxis verwendet.
d) Bindung an menschliche mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (peripheral blood mononuclear cells (PBMCS))
i) Präparation von menschlichen PBMCs
Frisches menschliches Blut (200 ml) wurde von freiwilligen Spendern erhalten, in Natriumcitrat-Antikoagulanz gesammelt, um eine Endkonzentration von 0,38% zu erhalten. Das Blut wurde mit Sedimentationspuffer gemischt und bei 37°C für 20 Minuten inkubiert. Der Überstand wurde gesammelt und bei 1700 U/min für 5 Minuten (Sorvall RT6000D) zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wurde in 20 ml RPMI/BSA (1 mg/ml) resuspendiert, und 4 × 5 ml Zellen wurden vorsichtig über 4 × 5 ml Lymphoprepä (Nycomed) in 15-ml-Zentrifugenröhrchen geschichtet. Die Röhrchen wurden bei 1700 U/min für 30 Minuten (Sorvall RT6000D) zentrifugiert, und die erhaltene Schicht von Zellen wurde entnommen und in 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt. Die Zellen wurden zwei Mal in Lysepuffer gewaschen, um jedwede verbleibenden roten Blutzellen zu entfernen, gefolgt von 2 Waschschritten in RPMI/BSA. Die Zellen wurden in 5 ml Bindungspuffer resuspendiert. Die Zellzahl wurde mit einem Coulter-Zähler gemessen, und zusätzlicher Bindungspuffer wurde hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1,25 × 10⁷ PBMCs/ml zu erhalten.
ii) Test
¹²⁵[I]MCP-1 wurde unter Verwendung der Bolton-und-Hunter-Konjugation (Bolton et al., 1973, Biochem. J., 133, 529; Amersham International plc] hergestellt. Gleichgewichtsbindungstests wurden unter Verwendung des Verfahrens von Ernst et al., 1994, J. Immunol., 152, 3541, durchgeführt. Kurz gesagt, wurden 50 μl ¹²⁵I-markiertes MCP-1 (Endkonzentration 100 pM) zu 40 μl (5 × 10⁵ Zellen) einer Zellsuspension in einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Die in Gesamtzellbindungspuffer aus einer Stammlösung von 10 mM in DMSO verdünnten Verbindungen wurden in einem Endvolumen von 5 μl zugegeben, um eine konstante DMSO-Konzentration von 5% im Test beizubehalten. Die Gesamtbindung wurde in Abwesenheit von Verbindung bestimmt. Die unspezifische Bindung wurde durch Zugabe von 5 μl kaltem MCP-1 definiert, um eine Endkonzentration im Test von 100 nM zu erhalten. Die Testverbindungen wurden mit Gesamtzellbindungspuffer auf ein Endvolumen von 100 μl gebracht, und die Platten wurden verschlossen. Nach Inkubation bei 37°C für 60 Minuten wurden die Bindungsreaktionsgemische filtriert und für 10 Sekunden unter Verwendung von eiskaltem Waschpuffer in einem Plattenwäscher (Brandel MLR-96T Cell Harvester) gewaschen. Die Filtermatten (Brandel GF/B) wurden vor der Verwendung für 60 Minuten in 0,3% Polyethylenimin plus 0,2% BSA vorgetränkt. Nach der Filtration wurden einzelne Filter in 3,5-ml-Röhrchen (Sarstedt Nr. 55.484) aufgeteilt, und gebundenes ¹²⁵I-markiertes MCP-1 wurde bestimmt (LKB 1277 Gammamaster).
Die Stärke der Testverbindungen wurde durch einen Test von Doppelproben unter Verwendung von Sechs-Punkt-Dosis-Wirkungs-Kurven bestimmt, und die IC₅₀-Konzentrationen wurden bestimmt.
Bei der wirksamen Dosis für getestete erfindungsgemäße Verbindungen wurde keine physiologisch unannehmbare Toxizität beobachtet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, bei denen die nachstehenden allgemeinen Verfahren verwendet wurden, wenn nicht anders angegeben, weiter veranschaulicht, aber nicht beschränkt.

i) N,N-Dimethylformamid (DMF) wurde über 4-Å-Molekularsieben getrocknet. Wasserfreies Tetrahydrofuran (THF) wurde aus Aldrich-SURESEAL^TM-Flaschen erhalten. Andere kommerziell erhältliche Reagenzien und Lösungsmittel wurden ohne weitere Reinigung verwendet, wenn nicht anders angegeben. Organische Lösungsmittelextrakte wurden über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet.
ii) ¹H-, ¹³C- und ¹⁹F-NMR wurden an Bruker-WM200-, -WM250-, -WM300- oder -WM400-Instrumenten unter Verwendung von DMSO-d₆ mit Me₄Si oder CCl₃F als internem Standard, wie angemessen, aufgezeichnet, wenn nicht anders angegeben. Die chemischen Verschiebungen sind in d (ppm) genannt, und Maxima-Vielfache sind wie folgt angegeben: s, Singulett; d, Dublett; dd, Dublett von Dubletts; t, Triplett; dt, Dublett von Tripletts; q, Quartett; m, Multiplett; br, breit.
iii) Die Massenspektren wurden an VG-12-12-Quadrupol-, VG-70-250-5E-, VG-ZAB-2-SE- oder einem VG-modifizierten AEI/Kratos-MS9-Spektrometer aufgezeichnet.
iv) Zur DC-Analyse wurden vorbeschichtete Merck-DC-Platten (Silicagel 60 F254, d = 0,25 mm) verwendet.
v) Die Flashchromatographie wurde auf Silica (Merck Kieselgel: Art. 9385) durchgeführt.

BEISPIEL 1
N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
Natriumhydroxid (2 M, 3 ml) wurde zu einer gerührten Lösung von Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carboxylat (0,1 g) in THF (3 ml) und Methanol (1,5 ml) gegeben. Die Umsetzung wurde bei Umgebungstemperatur für 4 Stunden gerührt. Die Umsetzung wurde im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde in Wasser (5 ml) gelöst. Die Lösung wurde durch Zugabe von wässriger Salzsäure (2 M, 4 ml) angesäuert, wodurch das Produkt als weißer Feststoff ausgefällt wurde. Das Produkt wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung (82 mg, 89%) zu erhalten. NMR: δ 5,77 (s, 2H), 6,81 (dd, 1H), 6,89 (dd, 1H), 6,95 (d, 1H), 7,13 (s, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,34 (d, 1H), 7,52 (d, 1H), 9,01 (s, 1H), 12,85 (s, 1H); m/z 334 (M-H⁺).
Das im vorstehenden Beispiel beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der entsprechenden Ausgangs-Ethylindol-2-carboxylate wiederholt. So wurden die nachstehend beschriebenen Verbindungen erhalten.
BEISPIEL 2
N-[(2,3-Dichlorpyrid-5-yl)methyl]-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
36%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 5,80 (s, 2H), 6,84 (dd, 1H), 6,96 (d, 1H), 7,14 (s, 1H), 7,23 (d, 1H), 7,73 (d, 1H), 8,06 (d, 1H); m/z 339 (M-H⁺) 337, 335.
BEISPIEL 3
N-(3-Chlor-4-fluorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
68%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 5,75 (s, 2H), 6,82 (dd, 1H), 6,95 (m, 2H), 7,12 (s, 1H), 7,2–7,4 (m, 3H); m/z 320 (M-H⁺), 318.
BEISPIEL 4
N-(4-Chlor-3-fluorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
94%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 5,78 (s, 2H), 6,78 (dd, 1H), 6,80 (dd, 1H), 6,96 (d, 1H), 7,03 (dd, 1H), 7,12 (s, 1H), 7,31 (d, 1H), 7,43 (t, 1H); m/z 318 (M-H⁺).
BEISPIEL 5
N-(3-Chlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
75%ige Ausbeute. m/z 300 (M-H⁺).
BEISPIEL 6
N-(3-Trifluormethylbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
81%ige Ausbeute. m/z 334 (M-H⁺).
BEISPIEL 7
N-(4-Chlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
82%ige Ausbeute. m/z 300 (M-H⁺).
BEISPIEL 8
3-Brom-N-(3,4-dichlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
95%ige Ausbeute. m/z 414 (M-H⁺).
BEISPIEL 9
4-Brom-N-(3,4-dichlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
96%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 5,78 (s, 2H), 6,86 (dd, 1H), 7,01 (d, 1H), 7,04 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,52 (d, 1H), 9,78 (s, 1H), 13,10 (bs, 1H); m/z 414 (M-H⁺).
BEISPIEL 10
N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-hydroxy-3-methylindol-2-carbonsäure
73%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 2,44 (s, 3H), 5,69 (s, 2H) , 6, 83 (m, 2H), 6,92 (d, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,30 (d, 1H), 7,50 (d, 1H), 9,00 (s, 1H), 12,90 (bs, 1H); m/z 350 (M-H⁺).
BEISPIEL 11
N-(3,4-Dichlorbenzyl)-4-fluor-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
68%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 5,80 (s, 2H), 6,88 (m, 1H), 7,00 (t, 1H), 7,20 (m, 2H), 7,32 (m, 1H), 7,50 (m, 1H), 9,25 (s, 1H), 13,10 (s, 1H); M/z(M-H⁺) 351,9
BEISPIEL 12
N-(3,4-Dichlorbenzyl)3-methoxy-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
73%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 4,3 (s, 3H), 5,7 (s, 2H), 6,9 (m, 2H), 7,1–7,4 (m, 4H) ; m/z 364, 366 (M-H⁺)
BEISPIEL 13
N-(3,4-Dichlorbenzyl)-3-chlor-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
97%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 5,75 (s, 2H), 6,9 (m, 3H), 7,3 (s, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,5 (d, 1H), 9,35 (s, 1H); m/z 368 (M-H⁺).
BEISPIEL 14
N-(3,4-Dichlorbenzyl)-4-chlor-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
83%ige Ausbeute. NMR(CD₃SOCD₃) δ 5,79 (s, 2H), 6,88 (dd, 1H), 7,01 (d, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,3 (d, 1H), 7,38 (d, 1H), 7,51 (d, 1H), 9,67 (bs, 1H); m/z 368,2 (M-H⁺)
Herstellung von Ausgangsmaterialen
Die Ausgangsmaterialien für die vorstehenden Beispiele sind entweder kommerziell erhältlich oder werden leicht durch Standardverfahren aus bekannten Materialien hergestellt. Beispielsweise sind die folgenden Verfahren (Verfahren A-J) Veranschaulichungen, aber keine Beschränkungen für die Herstellung der in den vorstehenden Umsetzungen verwendeten Ausgangsmaterialien.
Verfahren A
3-Chlor-4-fluorbenzylbromid
Eine Lösung von 3-Chlor-4-fluorbenzaldehyd (3 g) in THF (40 ml) wurde über 2 Minuten zu einer gerührten Suspension von Natriumborhydrid (1,07 g) in Methanol (40 ml) bei 0°C hinzugefügt. Man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen, und dann wurde es mit Wasser gequencht. Die erhaltene Suspension wurde zwischen Wasser und Diethylether verteilt, und die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (90 ml) gelöst, und Triphenylphosphin (4,62 g) und Tetrabrommethan (6,64 g) wurden bei 0°C zugegeben. Man ließ das Gemisch sich über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen, dann wurde es im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das gewünschte Produkt zu erhalten (3,57 g, 85%). NMR: δ 4,7 (s, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,7 (m, 1H).
Auf ähnliche Weise, aber ausgehend von 3-Fluor-4-chlorbenzaldehyd wurde hergestellt:
3-Fluor-4-chlorbenzylbromid
74%ige Ausbeute. NMR: δ 4,5 (s, 2H), 7,1 (t, 1H), 7,25 (m, 1H), 7,45 (dd, 1H).
Verfahren B
2,3-Dichlor-5-(hydroxymethyl)pyridin
Boran-Tetrahydrofuran-Komplex (1 M Lösung in Tetrahydrofuran, 52 ml) wurde zu einer gerührten Lösung of 5,6-Dichlornicotinsäure (2 g) in Tetrahydrofuran (60 ml) über 20 Minuten bei 0°C hinzugefügt. Man ließ das Reaktionsgemisch sich über 90 Minuten auf Raumtemperatur erwärmen, und dann wurden es auf 0°C abgekühlt und mit Wasser (100 ml) gequencht. Die Lösung wurde mit festem Natriumchlorid gesättigt und mit Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan-50% Ethylacetat verrieben, und das feste Nebenprodukt wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan/Ethylacetat (1:1 v/v) als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als weißen Feststoff (820 mg, 45%) zu erhalten. NMR: δ 4,55 (d, 2H), 5,5 (t, 1H), 8,0 (m, 1H), 8,3 (m, 1H); m/z 178,1 (M+H⁺).
Verfahren C
2,3-Dichlor-5-(brommethyl)pyridin
2,3-Dichlor-5-(hydroxymethyl)pyridin (275 mg) wurde in Dichlormethan (10 ml) gelöst und in Gegenwart von Triphenylphosphin (444 mg) und Tetrabrommethan (641 mg) über Nacht gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan: 2,5% Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als weißen Feststoff zu erhalten (270 mg, 73%). NMR: δ 4,75 (s, 2H), 8,25 (m, 1H), 8,5 (m, 1H); m/z 242 (M+H⁺).
Verfahren D
Ethyl-5-acetoxy-N-(3,4-dichlorbenzyl)indol-2-carboxylat
i) Ethyl-5-hydroxyindol-2-carboxylat
Bortribromid (64,58 g) wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von Ethyl-5-methoxyindol-2-carboxylat (20 g) in Dichlormethan (1000 ml) bei –78°C unter einer Argonatmosphäre gegeben. Man ließ die Umsetzung sich auf Raumtemperatur erwärmen, und sie wurde für weitere 2 Stunden gerührt. Die Umsetzung wurde unter Rühren in eine Lösung von Eis/gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser, wässriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 0–60% Diethylether:Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als weißen Festsoff zu erhalten (9,02 g, 48%). NMR: δ 1,31 (t, 3H), 4,29 (q, 2H), 6,79 (dd, 1H), 6,90 (dd, 1H), 7,22 (d, 1H), 8,84 (s, 1H), 11,52 (brs, 1H); m/z 206 (M+H⁺).
ii) Ethyl-5-acetoxyindol-2-carboxylat
Eine gerührte Lösung von Ethyl-5-hydroxyindol-2-carboxylat (7,79 g) und 4-Dimethylaminopyridin (20 mg) in Essigsäureanhydrid (80 ml) wurde bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Die Umsetzung wurde im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzsäure (2 M), gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser, wässriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt, um das Produkt als gelben Feststoff zu erhalten (9,39 g, 100%). NMR: δ 1,20 (t, 3H), 2,10 (s, 3H), 4,19 (q, 2H), 6,86 (dd, 1H), 6,97 (d, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,29 (d, 1H); m/z 248 (M+H⁺).
iii) Ethyl-5-acetoxy-N-(3,4-dichlorbenzyl)indol-2-carboxylat
3,4-Dichlorbenzylbromid (5,96 g) wurde zu einer gerührten Lösung von Ethyl-5-acetoxyindol-2-carboxylat (5,4 g) und Kaliumcarbonat (6,94 g) in Acetonitril (500 ml) unter einer Argonatmosphäre gegeben. Die Umsetzung wurde bei 80°C für 16 Stunden erhitzt, dann im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser, gesättigtem wässrigem Natriumchlorid gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Isohexan verrieben, um das Produkt als einen cremefarbenen Feststoff zu erhalten (5,55 g, 63%). NMR: δ 1,27 (t, 3H), 2,27 (s, 3H), 4,28 (q, 2H), 5,82 (s, 2H), 6,90 (d, 1H), 7,09 (dd, 1H), 7,33–7,40 (m, 2H), 7,46 (d, 1H) 7,52 (d, 1H), 7,60 (d, 1H).
Die in Verfahren D i) – iii) beschriebenen Verfahren wurden unter Verwendung des entsprechenden Benzylhalogenids oder unter Verwendung der Alkylindol-2-carboxylate, wie durch Verfahren F und G hergestellt, mit dem entsprechenden Benzylhalogenid wiederholt. So wurden die nachstehend beschriebenen Verbindungen erhalten.
Verfahren D1
Ethyl-5-acetoxy-N-[(2,3-dichlorpyrid-5-yl)methyl]indol-2-carboxylat
90%ige Ausbeute. NMR: δ 1,27 (t, 3H), 2,26 (s, 3H), 4,28 (q, 2H), 5,85 (s, 2H), 7,12 (dd, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,47 (d, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 8,10 (d, 1H); m/z 409 (M+H⁺), 407.
Verfahren D2
Ethyl-5-acetoxy-N-(3-chlor-4-fluorbenzyl)indol-2-carboxylat
57%ige Ausbeute. NMR (CDCl₃): δ 1,37 (t, 3H), 2,33 (s, 3H), 4,35 (q, 2H), 5,74 (s, 2H), 6,90 (m, 1H), 7,00 (d, 1H), 7,05 (dd, 1H), 7,13 (dd, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,22 (d, 1H).
Ethyl-5-acetoxy-N-(4-chlor-3-fluorbenzyl)indol-2-carboxylat
73%ige Ausbeute. m/z 390 (MH⁺).
Ethyl-5-acetoxy-N-(3-chlorbenzyl)indol-2-carboxylat
93%ige Ausbeute. m/z 372 (MH⁺).
Ethyl-5-acetoxy-N-(3-trifluormethylbenzyl)indol-2-carboxylat
91%ige Ausbeute. m/z 406 (MH⁺).
Ethyl-5-acetoxy-N-(4-chlorbenzyl)indol-2-carboxylat
70%ige Ausbeute. m/z 372 (MH⁺).
Ethyl-5-acetoxy-3-brom-N-(3,4-dichlorbenzyl)indol-2-carboxylat
86%ige Ausbeute. m/z 486 (MH⁺).
Ethyl-5-acetoxy-4-brom-N-(3,4-dichlorbenzyl)indol-2-carboxylat
62%ige Ausbeute. NMR δ 1,40 (t, 3H), 2,39 (s, 3H), 4,38 (q, 2H), 5,77 (s, 2H), 6,82 (dd, 1H), 7,08 (d, 1H), 7,18 (s, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,42 (s, 1H); m/z 486 (MH⁺).
Ethyl-5-acetoxy-N-(3,4-dichlorbenzyl)-3-methylindol-2-carboxylat
79%ige Ausbeute. NMR δ 1,40 (t, 3H), 2,36 (s, 3H), 2,40 (s, 3H), 4,35 (q, 2H), 5,76 (s, 2H), 6,83 (dd, 1H), 7,00 (d, 1H), 7,10 (d, 1H), 7,19 (s, 1H), 7,30 (d, 1H), 7,40 (s, 1H); m/z 421 (M+H⁺).
Ethyl-5-acetoxy-N-(3,4-dichlorbenzyl)-3-chlorindol-2-carboxylat
83%ige Ausbeute. NMR δ 1,25 (t, 3H), 2,25 (s, 3H), 4,3 (q, 2H), 5,8 (s, 2H), 6,9 (d, 1H), 7,2 (m, 1H), 7,4 (m, 2H), 7,5 (d, 1H), 7,7 (d, 1H); m/z 441,8 (M+H⁺).
Verfahren E
Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carboxylat
Natriumethoxid (1,86 g) wurde zu einer gerührten Lösung von Ethyl-5-acetoxy-N-(3,4-dichlorbenzyl)indol-2-carboxylat (5,55 g) in Ethanol (50 ml) unter einer Argonatmosphäre gegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, dann im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde mit wässriger Salzsäure (2 M) angesäuert und mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser, gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Hexan/Diethylether verrieben, um das Produkt als weißen Feststoff zu erhalten (3,17 g, 92%). NMR: δ 1,26 (t, 3H), 4,25 (q, 2H), 5,75 (s, 2H), 6,81–6,91 (m, 2H), 6,98 (d, 1H), 7, 19 (s, 1H), 7,29 (d, 1H), 7,38 (d, 1H) 7,50 (d, 1H), 9,06 (s, 1H); m/z 364 (M+H⁺).
Verfahren F
Ethyl-5-acetoxy-3-bromindol-2-carboxylat
N-Bromsuccinimide (0,14 g) wurde zu einer gerührten Lösung von Ethyl-5-acetoxyindol-2-carboxylat (0,2 g) in DMF (3,0 ml) hinzugefügt. Die Umsetzung wurde für 4 Stunden gerührt, dann in Wasser gegossen. Der erhaltene Niederschlag wurde filtriert und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten (0,23 g, 87%). NMR δ 1,38 (t, 3H), 2,23 (s, 3H), 4,38 (q, 2H), 7,10 (dd, 1H), 7,23 (d, 1H), 7,50 (d, 1H), 12,28 (bs, 1H); m/z 326 (M⁺).
Verfahren F1
Ethyl-5-acetoxy-3-chlorindol-2-carboxylat
Eine Lösung von Ethyl-5-acetoxyindol-2-carboxylat (500 mg) in Dichlormethan (10 ml) wurde bei Raumtemperatur in Gegenwart von N-Chlorsuccinimid (297 mg) und Kaliumcarbonat (279 mg) über Nacht gerührt. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit kaltem Dichlormethan, gefolgt von Wasser gewaschen und unter Vakuum über Nacht getrocknet, um das gewünschte Produkt als weißes Pulver zu erhalten (425 mg, 75%). NMR: δ 1,35 (t, 3H), 2,25 (s, 3H), 4,4 (q, 2H), 7,1 (d, 1H), 7,3 (s, 1H), 7,5 (d, 1H), 12,2 (s, 1H); m/z 281,9 (M+H⁺).
Verfahren G
Ethyl-5-acetoxy-3-methylindol-2-carboxylat
(i) Ethyl-5-methoxy-3-methylindol-2-carboxylat
Konzentrierte Schwefelsäure (1 ml) wurde zu einer Lösung von 4-Methoxyphenylhydrazinhydrochlorid (11,2 g) und 2-Oxobuttersäure (8,72 g) in Ethanol (250 ml) gegeben, und die Lösung wurde bei Rückfluss für 16 Stunden erhitzt. Die Umsetzung wurde abgekühlt, im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde mit Ethanol verrieben, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu erhalten (8,8 g, 59%). NMR δ 1,36 (t, 3H), 3,76 (s, 3H), 4,30 (q, 2H), 6,88 (dd, 1H), 7,03 (d, 1H), 7,28 (d, 1H), 11,28 (bs, 1H); m/z 232 (M-H⁺).
(ii) Ethyl-5-acetoxy-3-methylindol-2-carboxylat
Bortribromid (25 g) wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von Ethyl-5-methoxy-3-methylindol-2-carboxylat (2,0 g) in wasserfreiem Dichlormethan (250 ml) bei –78°C unter einer Argonatmosphäre gegeben. Man ließ die Umsetzung sich auf Raumtemperatur erwärmen, und sie wurde für weitere 2 Stunden gerührt. Die Umsetzung wurde unter Rühren in Eis/gesättigte wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser, wässriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. DMAP (20 mg) und Essigsäureanhydrid (0,5 ml) wurden hinzugefügt, und die Lösung wurde bei Rückfluss für 5 Minuten erhitzt. Die Umsetzung wurde abgekühlt, im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um die Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten (0,4 g, 18%). NMR δ 1,37 (t, 3H), 2,25 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 4,34 (q, 2H), 7,00 (dd, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,40 (d, 1H), 11,52 (bs, 1H); m/z 260 (M-H⁺).
Auf ähnliche Weise, aber ausgehend von Ethyl-4-brom-5-methoxyindol-2-carboxylat, wurde hergestellt:
Ethyl-5-acetoxy-4-bromindol-2-carboxylat NMR δ 1,42 (t, 3H), 2,39 (s, 3H), 4,42 (q, 2H), 7,02 (d, 1H), 7,23 (s, 1H), 7,35 (d, 1H), 9,22 (bs, 1H): m/z 324, 326 (M-H⁺).
Verfahren H
Methyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-4-fluor-5-hydroxyindol-2-carboxylat
(i) 2-Fluor-3-benzyloxybenzaldehyd
2-Fluor-3-hydroxybenzaldehyd (16,49 g) wurde in Dimethylformamid (200 ml) gelöst und unter einer Argonatmosphäre gerührt. Natriumhydrid (60% in Mineralöl, 5,18 g) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt. Benzylbromid (16,8 ml) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt, und der erhaltene Rückstand wurde zwischen Diethylether (200 ml) und Wasser (200 ml) verteilt. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser (400 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flashsäulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten of 0–10% Ethylacetat/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als gelben Feststoff (18,41 g) zu erhalten. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 5,20 (s, 2H), 7,2–7,6 (m, 8H), 10,21 (s, 1H)
(ii) Methyl-2-azido-3-(2-fluor-3-benzyloxyphenyl)-propenoat
Ein Gemisch von Methylazidoacetat (36,64 g) und 2-Fluor-3-benzyloxybenzaldehyd (18,32 g) in Methanol (250 ml) wurde tropfenweise unter Rühren über 1 Stunde zu einem Gemisch von Natriummethoxid (17,20 g) in Methanol (100 ml) bei –25°C unter einem Argonstrom gegeben. Man ließ das Gemisch für 20 Minuten rühren, sich auf 5°C erwärmen, und es wurde über Nacht gerührt.
Der erhaltene Niederschlag wurde filtriert, dann nacheinander mit kalten Methanol, einer verdünnten Lösung von Essigsäure in Wasser und Wasser gewaschen. Der erhaltene Feststoff was unter Vakuum getrocknet, um das Produkt als blassbraunen Feststoff (16,70 g) zu erhalten, der dann ohne Reinigung verwendet wurde.
(iii) Methyl-4-fluor-5-benzyloxyindol-2-carboxylat
Eine Lösung von Methyl-2-azido-3-(2-fluor-3-benzyloxyphenyl)propenoat (16,7 g) in Xylol (600 ml) wurde tropfenweise unter Rühren über 1 Stunde zu Xylol (2,4 l) unter Rückfluss gegeben und dann für weitere 20 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und durch Flashsäulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten of 0–100% Ethylacetat/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als gelben Feststoff (12,93 g) zu erhalten.
¹H-NMR DMSO-d₆) δ 3,85 (s, 3H), 5,15 (s, 2H), 7,05–7,45 (m, 8H), 12,06 (s, 1H); M/z(+) 300,4 (MH⁺)
(iv) Methyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-4-fluor-5-benzyloxyindol-2-carboxylat
Natriumhydrid (60% in Mineralöl, 589 mg) wurde zu einer Lösung von Methyl-4-fluor-5-benzyloxyindol-2-carboxylat (4 g) in Dimethylformamid (100 ml) gegeben, und das Gemisch wurde unter einer Argonatmosphäre für 30 Minuten gerührt. 3,4-Dichlorbenzylchlorid (2,22 ml) wurde hinzugefügt und das Gemisch über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand zwischen Diethylether (100 ml) und Wasser (100 ml) verteilt. Die organischen Extrakte wurden mit Wasser (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), im Vakuum eingeengt und durch Flashsäulenchromatographie; unter Verwendung von Isohexan, gefolgt von 5% Ethylacetat/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als gelben kristallinen Feststoff (4,61 g) zu erhalten. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 3,80 (s, 3H), 5,15 (s, 2H), 5,80 (s, 2H), 6,85 (m, 1H), 7,25–7,52 (m, 10H); M/z(+) 458,2 (MH⁺)
(v) Methyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-4-fluor-5-hydroxyindol-2-carboxylat
Ein Gemisch von Methyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-4-fluor-5-benzyloxyindol-2-carboxylat (8,22 g) und 5% Pd/C (200 mg) in Ethylacetat (250 ml) wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre über Nacht gerührt, durch Celite filtriert, im Vakuum eingeengt und durch Flashsäulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 0–50% Ethylacetat/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als braunen Feststoff (6,18 g) zu erhalten. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ3,80 (s, 3H), 5,75 (s, 2H), 6,85 (m, 1H), 7,00 (t, 1H), 7,22 (m, 2H), 7,30 (m, 1H), 7,50 (m,1H), 9,33 (s, 1H); M/z(–) 366,2 (MH^–)
Verfahren I
Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-3-methoxy-5-hydroxyindol-2-carboxylat
(i) Ethyl-5-benzyloxydiazoindol-2-carboxylat
Natriumnitrit (6 g) wurde portionsweise zu einer Lösung von Ethyl-5-benzyloxyindol-2-carboxylat in Ethylacetat (40 ml) und Essigsäure (20 ml) gegeben. Das Gemisch was für 18 Stunden gerührt und dann zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt. Die organischen Extrakte wurden mit Wasser, gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und das erhaltene Gummi wurde mit Diethylether verrieben, um das Produkt als orangefarbenes Pulver (1,8 g) zu erhalten. NMR: δ1,45 (t, 3H), 4,5 (q, 2H), 5,1 (s, 2H), 7,05 (m, 2H), 7,3 (m, 5H), 7,9 (d, 1H); m/z 322 (M+H⁺)
(ii) Ethyl-3-methoxy-5-benzyloxyindol-2-carboxylat
Rhodiumoctanoat (300 mg) wurde zu einer gerührten Lösung von Ethyl-5-benzyloxydiazoindol-2-carboxylat (2,0 g) in Toluol (100 ml) und Methanol (10 ml) hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter einer inerten Atmosphäre für 2,5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 30–50% Diethylether/Isohexan gereinigt, um einen orangefarbenen Feststoff (1,41 g) zu erhalten. NMR: δ 1,4 (t, 3H), 4,05 (s, 3H), 4,4 (q, 2H), 5,1 (s, 2H), 7,1 (dd, 1H), 7,2–7,5 (m, 8H); m/z 326 (MH⁺)
(iii) Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-3-methoxy-5-benzyloxyindol-2-carboxylat
3,4-Dichlorbenzylchlorid (0,72 ml) wurde zu einer gerührten Lösung von Ethyl-3-methoxy-5-benzyloxyindol-2-carboxylat (1,40 g), Kaliumcarbonat (0,90 g) und Kaliumiodid (0,1 g) in DMF (50 ml) unter einer inerten Atmosphäre gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 6 Stunden auf 50°C erhitzt, dann zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser, dann 3 Mal mit gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 10–30% Ethylacetat/Isohexan gereinigt, um ein gelbes Öl (0,9 g) zu erhalten. NMR: δ 1,4 (t, 3H), 4,0 (s, 3H), 4,4 (q, 2H), 5,1 (s, 2H), 5,6 (s, 2H), 6,9 (dd, 1H), 7,0–7,5 (m, 9H); m/z 484 (MH⁺)
(iv) Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-3-methoxy-5-hydroxyindol-2-carboxylat
5% Pd/C (100 mg) wurde zu einer gerührten Lösung von Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)3-methoxy-5-benzyloxyindol-2-carboxylat (0,9 g) in Ethylacetat (50 ml) gegeben, und das Gemisch wurde für 12 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft, um ein braunes Öl zu erhalten (0,61 g), das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. NMR: δ 1,4 (t, 3H), 4,0 (s, 3H), 4,4 (q, 2H), 5,6 (s, 2H), 6,8 (dd, 1H), 6,9 (dd, 1H), 7,1 (m, 3H), 7,3 (d,1H); m/z 394 (MH⁺)
Verfahren J
Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-4-chlor-5-methoxyindol-2-carboxylat
(i) Ethyl-2-azido-3-(2-chlor-3-methoxyphenyl)propenoat
Eine Lösung von Ethylazidoacetat (9,9 g) und 2-Chlor-3-methoxybenzaldehyd (3 g) in Ethanol (20 ml) wurde tropfenweise zu einer Lösung von Natriumethoxid (4,7 g) in Ethanol (10 ml) bei 0°C gegeben. Man ließ die Umsetzung sich über 18 Stunden auf Umgebungstemperatur erwärmen, dann wurde sie zwischen 2 N HCl (50 ml) und Dichlormethan (250 ml) verteilt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), unter Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan-12% Ethylacetat/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als blassgelben kristallinen Feststoff (2,2 g, 44%) zu erhalten.
Dieser wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt.
(ii) Ethyl-4-chlor-5-methoxyindol-2-carboxylat
Eine Lösung von Ethyl-2-azido-3-(2-chlor-3-methoxyphenyl)propenoat (2,22 g) in Xylol (100 ml) wurde für 30 Minuten bei Rückfluss erhitzt, im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan-50% Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als blassgelben Feststoff zu erhalten (1,34 g, 67%). NMR δ (CDCl₃) 1,31 (t, 3H), 3,84 (s, 3H), 4,32 (q, 2H), 7,0 (d, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,39 (d, 1H), 12,2 (bs, 1H).
(iii) Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-4-chlor-5-methoxyindol-2-carboxylat
Natriumhydrid (60 mg) wurde zu einer Lösung von Ethyl-4-chlor-5-methoxyindol-2-carboxylat (250 mg), 3,4-Dichlorbenzylchlorid (0,21 ml) und Tetrabutylammoniumiodid (3 mg) in DMF bei Umgebungstemperatur unter einer inerten Atmosphäre gegeben. Die Umsetzung wurde bei Umgebungstemperatur für 18 Stunden gerührt, dann zwischen Ethylacetat (30 ml) und Wasser (30 ml) verteilt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), unter Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan-15% Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als weißen Feststoff zu erhalten (196 mg, 48%) NMR: δ (CDCl₃) 1,39 (t, 3H), 3,93 (s, 3H), 4,32 (q, 2H), 5,73 (s, 2H), 6,84 (dd, 1H), 7,06–7,16 (m, 3H), 7,31 (d, 1H), 7,42 (s, 1H)
(iv) Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-4-chlor-5-hydroxyindol-2-carboxylat
Trimethylsilyliodid (0,6 ml) wurde zu einer Lösung von Ethyl-N-(3,4-dichlorbenzyl)-4-chlor-5-methoxyindol-2-carboxylat (190 mg) in Chloroform (20 ml) gegeben. Das Gemisch wurde für 18 Stunden auf 50°C erhitzt, dann in Methanol (50 ml) gegossen und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand was durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan-20% Ethylacetat/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt als einen gelben Feststoff zu erhalten (100 mg, 71%). NMR: δ (CDCl₃) 1,39 (t, 3H), 4,35 (q, 2H), 5,72 (s, 2H), 6,84 (dd, 1H), 7,05–7,13 (m, 3H) 7,3 (d, 1H) 7,35 (s, 1H); m/z 396,2/398,2 (M-H⁺)
BEISPIEL 15
N-(3,4-Dichlorbenzyl)-2-trifluormethylsulfonamido-5-hydroxyindol
Natriummethoxid (21 mg) wurde zu einer gerührten Lösung von N-(3,4-Dichlorbenzyl)-2-trifluormethylsulfonamido-5-acetoxyindol (90 mg) in Methanol (10 ml) gegeben. Die Umsetzung wurde bei Umgebungstemperatur für 1,5 Stunden gerührt, dann eingeengt und durch Zugabe von wässriger Salzsäure (2 M, 5 ml) angesäuert, mit Dichlormethan extrahiert und im Vakuum eingeengt, um ein braunes Öl zu erhalten. (50 mg).
NMR: δ 5,8 (s, 2H), 6,7 (dd, 1H), 6,9 (m, 1H), 7,0 (dd, 1H), 7,2 (dd, 1H), 7,3 (m, 1H), 7,5 (d, 1H); m/z 465, 467 (M-H⁺).
Das Ausgangsmaterial für das Vorstehende wurde hergestellt durch:
(i) N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-acetoxyindol-2-carbonsäure
Dimethylaminopyridin (100 mg) und Essigsäureanhydrid (1,12 ml) wurden zu einer Lösung von N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure in Ethylacetat (50 ml) gegeben und bei Umgebungstemperatur für 1 Stunde gerührt. Ethanol (10 ml) wurde hinzugefügt, und die Umsetzung wurde für 30 min gerührt. Das Lösungsmittel wurde teilweise verdampft und Isohexan hinzugefügt, um einen Niederschlag zu erhalten, der abfiltriert und getrocknet wurde, um das Produkt als weißen Feststoff (1,12 g) zu erhalten.
NMR: δ 2,25 (s, 3H), 5,85 (s, 2H), 6,9 (dd, 1H), 7,3-7,6 (m, 5H); m/z 376, 378 (M-H⁺)
(ii) N-(3,4-Dichlorbenzyl)-2-trifluormethylsulfonamido-5-acetoxyindol
Zu einer gerührten Lösung von N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-acetoxyindol-2-carbonsäure in DMF (5 ml) unter einer inerten Atmosphäre wurden HATU (0,27 g), DIPEA (0,12 ml) und Trifluormethylsulfonamid (97 mg) gegeben. Die Umsetzung wurde bei Umgebungstemperatur für 18 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde in gesättigte Natriumbicarbonatlösung gegossen, und der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, um das Produkt zu erhalten (90 mg). NMR: δ 2,25 (s, 3H, 5,9 (s, 2H), 6,9 (dd, 1H), 7,0 (dd, 1H), 7,1 (s, 1H), 7,35 (m, 1H); m/z 506, 508 (M-H⁺)
BEISPIEL 16
N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-tetrazol
Ammoniumchlorid (54 mg) und Natriumazid (65 mg) wurden zu einer gerührten Lösung von N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-acetoxyindol-2-nitril in DMF (5 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 10 Stunden auf 100°C erhitzt. Eine weitere Menge Ammoniumchlorid (35 mg) und Natriumazid (42 mg) wurde zugegeben und die Umsetzung für 18 Stunden auf 100°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von wässriger Salzsäure (2 M, 10 ml) angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet, im Vakuum eingeengt und durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 20% Ethylacetat in Isohexan, wobei auf 5% Methanol in Ethylacetat erhöht wurde, gereinigt, um das Produkt als braunes Öl (40 mg) zu erhalten, das sich beim Stehenlassen verfestigte.
NMR: δ 5,9 (s, 2H), 6,75 (dd, 1H), 6,9 (dd, 1H), 7,1 (s, 1H), 7,1–7,3 (m, 2H), 7,5 (d, 1H), 9,0 (s, 1H); m/z 360/362 (MH⁺).
Das Ausgangsmaterial wurde hergestellt durch: Methansulfonylchlorid (0,5 ml) wurde zu einer gekühlten (0°C) Lösung von N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-acetoxyindol-2-carbonsäure (1,12 g) in Pyridin (30 ml) gegeben und bei 0°C für 1,5 Stunden gerührt. Gasförmiger Ammoniak wurde für 15 min durch das Reaktionsgemisch geperlt, dann wurde überschüssiger Ammoniak im Vakuum entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C abgekühlt, und Methylsulfonylchlorid (2,5 ml) wurde zur gerührten Lösung gegeben, und man ließ sie über 18 Stunden Umgebungstemperatur erreichen. Methansulfonylchlorid (2 ml) wurde hinzugefügt, und man ließ das Reaktionsgemisch für 60 Stunden stehen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, man löste erneut in Dichlormethan und wusch 3 Mal mit einem 1:1-Gemisch von wässriger Salzsäure (1 M) und gesättigter Ammoniumchloridlösung. Die organischen Extakte wurden getrocknet, im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 10–25% Ethylacetat/Isohexan gereinigt, um das gewünschte Produkt zu erhalten (300 mg). NMR: δ 2,25 (s, 3H), 5,6 (s, 2H), 7,0 (dd, 1H), 7,45–7,65 (m, 4H), 7,7 (d, 1H).
BEISPIEL 17
N-(3,4-Dichlorphenylsulfonyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure
Eine Lösung von wasserfreiem Lithiumiodid (870 mg) und Methyl-N-(3,4-dichlorphenylsulfonyl)-5-hydroxyindol-2-carboxylat (260 mg) in Pyridin (15 ml) wurde für 4 Stunden bei Rückfluss gerührt. Die Umsetzung wurde abgekühlt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser (20 ml) gelöst und mit Essigsäure angesäuert. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden getrocknet, im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan-50% Ethylacetat mit 1% Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt, um das gewünschte Produkt als Glas zu erhalten (72 mg, 29%). NMR: δ 6,9 (m, 2H), 7,25 (s, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,9 (m, 2H), 8,15 (s, 1H), 9,5 (s, 1H); m/z 385,8 (M-H^–).
Das Ausgangsmaterial wurde hergestellt durch
(i) Methyl-N-(3,4-dichlorphenylsulfonyl)-5-benzyloxyindol-2-carboxylat
Natriumhydrid (60%ige Dispersion, 444 mg) wurde zu einer gerührten Lösung von Methyl-5-benzyloxyindol-2-carboxylat (2,08 g) in DMF (50 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Nach 1 Stunde wurde 3,4-Dichlorbenzolsulfonylchlorid (2,72 g) hinzugefügt. Das Rühren wurde für 2 Stunden fortgesetzt, wonach das Reaktionsgemisch zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt wurde. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet und im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Isohexan-20% Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, um das gewünschte Produkt als weißen Feststoff zu erhalten (2,02 g, 56%). NMR: δ3,85 (s, 3H), 5,1 (s, 2H), 7,2 (m, 1H), 7,4 (m, 7H), 7,9 (s, 2H), 8,0 (d, 1H), 8,2 (s, 1H); m/z 489,8 (MH⁺).
(ii) Methyl-N-(3,4-dichlorphenylsulfonyl)-5-hydroxyindol-2-carboxylat
Eine Suspension von 5% Palladium auf Kohle in Ethylacetat (450 ml) und Methyl-N-(3,4-dichlorphenylsulfonyl)-5-benzyloxyindol-2-carboxylat (2,01 g) wurde bei 60°C unter Wasserstoff bei Atmosphärendruck für 48 Stunden gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 20% Ethylacetat/Isohexan als Elutionsmittel gereinigt, um das gewünschte Produkt als Gummi zu erhalten (270 mg, 16%). NMR: δ 3,85 (s, 3H), 7,0 (m, 2H), 7,35 (s, 1H), 7,9 (m, 3H), 8,1 (s, 1H), 9,6 (s, 1H); m/z 401,9 (MH⁺).
BEISPIEL 18
N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-acetoxyindol-2-carbonsäure
Zu einer Lösung von N-(3,4-Dichlorbenzyl)-5-hydroxyindol-2-carbonsäure (10 g) in warmem Ethylacetat (250 ml) wurden 4-Dimethylaminopyridin (100 mg) und Essigsäureanhydrid (5,0 ml) gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde für 2 Stunden gerührt. Die organischen Substanzen wurden mit 1 N HCl gewaschen und getrocknet. Hexan wurde hinzugefügt, um die Kristallisation des Produkts auszulösen. Der Feststoff wurde filtriert und mit Hexan gewaschen, um das gewünschte Produkt zu erhalten (5 g, 44%). ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 2,25 (s, 3H), 5,85 (s, 2H), 6,9 (dd, 1H), 7,05 (dd, 1H), 7,3–7,6 (m, 5H); m/z 378, 380 (MH⁺).
BEISPIEL 19
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Dieses Beispiel veranschaulicht repräsentative erfindungsgemäße pharmazeutische Dosierungsformen, wie hier definiert, soll sie aber nicht beschränken, (wobei der Wirkstoff als "Verbindung X" bezeichnet wird) zur therapeutischen oder prophylaktischen Verwendung bei Menschen:
Beispiel A
Hinweis
In den vorstehenden Formulierungen kann Verbindung x eine Verbindung, wie hier in den Beispielen 1 bis 3 veranschaulicht, umfassen.
Die vorstehenden Formulierungen können durch übliche Verfahren, die im pharmazeutischen Fachgebiet bekant sind, erhalten werden. Die Tabletten (a)–(c) durch übliche Maßnamen magensaftresistent überzogen werden, beispielsweise um einen Überzug aus Celluloseacetatphthalat bereitzustellen. Die Aerosolformulierungen (h)–(k) können in Verbindung mit Standard-Messdosis-Aerosolspendern verwendet werden, und die Suspensionsmittel Sorbitantrioleat und Sojalecithin können durch alternative Suspensionsmittel, wie Sorbitanmonooleat, Sorbitansesquioleat, Polysorbat 80, Polyglycerinoleat oder Ölsäure, ersetzt werden.

Claims

Verbindung der Formel (I):
wobei: R¹ ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder Methoxy ist; R² ein Wasserstoffatom, Halogenatom, Methyl, Ethyl oder Methoxy ist; R³ Carboxy, Tetrazolyl oder -CONHSO₂R⁴ ist, wobei R⁴ Methyl, Ethyl, Phenyl, 2,5-Dimethylisoxazolyl oder Trifluormethyl ist; T -CH₂- oder -SO₂- ist; und der Ring A 3-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 3,4-Dichlorphenyl, 3,4-Difluorphenyl, 3-Fluor-4-chlorphenyl, 3-Chlor-4-fluorphenyl oder 2,3-Dichlorpyrid-5-yl ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder in vivo spaltbare Ester oder in vivo spaltbare Amide davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Ring A 3-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 3,4-Dichlorphenyl, 3,4-Difluorphenyl, 3-Fluor-4-chlorphenyl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei der Ring A 3,4-Dichlorphenyl, 3-Fluor-4-chlorphenyl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Ring A 3,4-Dichlorphenyl, 2,3-Dichlorpyrid-5-yl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl ist.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei T -CH₂- ist.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei R³ Carboxy ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei in der Verbindung der Formel (I): R¹ ein Wasserstoffatom ist; R² ein Wasserstoffatom ist; R³ Carboxy ist; T -CH₂- ist; und der Ring A 3,4-Dichlorphenyl oder 3-Chlor-4-fluorphenyl ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Prodrug davon.
Verfahren zum Herstellen einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst, a) Umsetzen von Verbindungen der Formel (II):
wobei R^a ein Rest R³ nach Anspruch 1 oder eine geschützte Form des Rests R³ ist, R^b Wasserstoff oder eine Hydroxy-Schutzgruppe ist, und R¹ und R² die in Anspruch 1 definierte Bedeutung haben, mit einer Verbindung der Formel (III):
wobei T und der Ring A die in Anspruch 1 definierte Bedeutung haben, und L ein austauschbarer Rest ist; und danach nötigenfalls: i) Umwandeln einer Verbindung der Formel (I) in eine weitere Verbindung der Formel (I); ii) Entfernen jedweder Schutzgruppen; oder iii) Bilden eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder eines Prodrugs davon.
Arzneimittel, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Behandlung einer Erkrankung, die durch einen chemischen Monozyten-Lockstoff Protein-1 oder RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted, reguliert bei Aktivierung, normal in der T-Zelle exprimiert und sezerniert) vermittelt wird, wie einer Entzündungserkrankung.