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Technisches Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Metall-Phthalocyanine mit der Formel
(I), über
die im Folgenden berichtet wird und die photosensibilisierende Verbindungen
mit therapeutischem Nutzen sind, gekennzeichnet durch Absorption
und Fluoreszenz im roten Bereich des sichtbaren Spektrums. Genannte
Verbindungen sind für
die Behandlung und Diagnose verschiedener Infektionskrankheiten
und Krankheiten von Nutzen, die durch übermäßige Zellwucherungen gekennzeichnet
sind, insbesondere bei Tumoren, Psoriasis, aktinischer Keratose,
Atheromen, endoarterieller Hyperplasie und Prostata-Hyperplasie;
wobei die genannten Verbindungen auch für die Sterilisation von Blut
und Blutderivaten von Nutzen sind.
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Stand der Technik
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Von
organischen Molekülen,
welche den chromo- und fluorophoren Phthalocyanin-Makrozyklus enthalten,
ist bekannt, dass sie reaktive Sauerstoffderivate, insbesondere
Singulett-Sauerstoff oder Sauerstoffradikale, durch Wechselwirkung
mit sichtbarem Licht erzeugen.
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Verbindungen
mit einer Phthalocyaninstruktur als Grundlage werden in der Therapie
verwendet, zum Beispiel in der photodynamischen Therapie (PDT),
und/oder für
diagnostische Zwecke (E. Ben-Hur und I. Rosenthal, Int. J. Radiat.
Biol., Vol. 47, S. 145–147,
1985).
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Andere
Photosensibilisatoren, die in der photodynamischen Therapie (PDT)
und Diagnose Verwendung finden, sind Zn(II)-Phthalocyanine und deren
Konjugate, die unter dem Namen des Anmelders in der europäischen Patentanmeldung
EP 98 115 036 beschrieben
werden.
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Obwohl
die Forschung auf diesem Gebiet große Fortschritte gemacht hat
und als „Produkte
der zweiten Generation" definierte
photosensibilisierende Produkte hergestellt wurden, ist ihre therapeutische
Anwendung noch immer begrenzt, da ihre Effizienz gegenüber pathogenen
Wirkstoffen oder Tumorzellen nicht ausreichend hoch oder selektiv
ist.
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Bis
heute ist die hauptsächliche
therapeutische Anwendung von photosensibilisierenden Molekülen mit
ihrer Antikrebs-Aktivität
verbunden und basiert auf der Verwendung von photosensibilisierenden
auf Porphyrin basierenden Mitteln (Gomer, C. J., Seminars in Hematology,
Vol. 26, S. 27–34,
1989), welche, obgleich sie bei der palliativen oder kurativen Behandlung
von verschiedenen Tumoren vielversprechende Ergebnisse erzielten,
durch eine niedrige Effektivität
und Selektivität
deutlich einschränkt
werden und eine verlängerte
Persistenz in der Haut aufweisen, was das Phänomen einer allgemeinen Photosensibilität verursachen
kann (Jori, G., J. Photochem. Photobiol., B: Biol., Vol. 36, S.
87–93,
1996).
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Die
nicht-optimale Verteilung des Photosensibilisators der ersten Generation
beruht auf der schlechten Selektivität, welche mit den physiko-chemischen
Merkmalen verbunden ist.
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Es
liegt daher auf der Hand, dass die Entwicklung von für therapeutische
und diagnostische Anwendungen geeigneten Derivaten, wie den in der
vorliegenden Erfindung beschriebenen Phthalocyaninverbindungen,
von großer
Bedeutung ist.
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Die
Haupteigenschaften, welche die Phthalocyaninderivate für therapeutische
und/oder diagnostische Zwecke in vivo geeignet machen, sind die
folgenden:
- i) geringe Dunkeltoxizität, hohe
Quantenausbeute bei der Singulett-Sauerstoffherstellung und/oder eine hohe
Fluoreszenzquantenausbeute;
- ii) die Fähigkeit,
durch rotes oder Nahes Infrarotlicht aktiviert zu werden; Strahlungsarten,
die tief ins Gewebe eindringen können;
- iii) die Gegenwart von Substituenten mit geeigneten photodynamischen
und physikochemischen Merkmalen, unter denen ein Substituent eine
reaktive oder potentiell aktivierbare funktionelle Gruppe enthält, die, falls
erforderlich, eine site-spezifische Konjugation des photosensibilisierenden
Moleküls
an makromolekulare Trägersubstanzen
ermöglicht;
- iv) ausreichende Löslichkeit
in Wasser für
eine gute Bioverfügbarkeit,
schneller Metabolismus und ein Bewahren der biologischen Eigenschaften
der konjugierten makromolekularen Trägersubstanz.
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Zusätzlich zu
den oben genannten Eigenschaften, wurde kürzlich in der wissenschaftlichen
Literatur beschrieben, dass die Zahl und die Ladung der Substituenten
in vitro und in vivo die Phototoxizität der Verbindungen beeinflusst
(Brasseur et al., Photochem. Photobiol., Vol. 45, S. 581–586, 1987;
Brasseur et al., Photochem. Photobiol., Vol. 47, S. 705–711, 1988).
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Insbesondere
wurde die höchste
Phototoxizität
gefunden, wenn zwei benachbarte Sulfongruppen vorliegen, was mit
einer erhöhten
Fähigkeit,
in die Tumorzellmembran einzudringen, in Verbindung gebracht wurde
(Brasseur et al., Photochem. Photobiol., Vol. 46, S. 739–744, 1987;
Paquette et al., Vol. 47, S. 215–220, 1988; Margaron et al.,
Photochem. Photobiol., Vol. 62, S. 217–223, 1996).
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Es
wurde darüber
hinaus bewiesen, dass die Addition von hydrophoben Gruppen an sulfonierte
Phthalocyanine eine Erhöhung
der amphiphilen Eigenschaften, eine höhere zellulare Aufnahme und
eine größere Phototoxizität bewirkt
(Paquette et al., J. Chem. Phys., Vol. 88, S. 1113–1123, 1991).
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Darstellung der Erfindung
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Ungeachtet
dessen, was in der oben zitierten Literatur über die Untersuchungen an Strukturen
für Photosensibilisatoren,
die phototoxische Eigenschaften aufweisen, berichtet wurde und aus
dem hervorgeht, dass eine optimale Aufnahme dann erfolgt, wenn zwei
stark anionische Gruppen an benachbarten Ringen des Makrozyklus
anwesend sind, um so ein amphiphiles Molekül mit einer hydrophoben Matrix
zu bilden, hat der Anmelder überraschenderweise
gefunden, dass Phthalocyanine, die nur an spezifischen Positionen
an einem Ring des Makrozyklus mit kationischen Gruppen oder mit
protonierbaren Gruppen substituiert sind, besonders aktiv sind und
besonders effektiv bei der Induzierung von in vitro-Photoinaktivierung.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind daher Metall-Phthalocyanine mit
der allgemeinen Formel (I)
in welcher:
M ausgewählt wird
aus der Gruppe bestehend aus Zn, Si(OR
8)
2, Ge(OR
8)
2 und AlOR
8;
R
H oder eine Gruppe ausgewählt
aus linearen oder verzweigten Alkyl-, Alkenyl- und Alkyloxygruppen
mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, unter der Voraussetzung, dass
wenn R von H unterschiedlich ist, die Positionen 8, 11, 15, 18,
22, 25 oder 9, 10, 16, 17, 23, 24 substituiert sind; und
R
1 und R
2, gleich
oder voneinander verschieden, H oder eine Gruppe (X)
pR
3 ist, wobei X ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend
aus O, S, -NR
6 und -CH
2-;
und R
3 ist
wobei:
Y ausgewählt wird
aus der Gruppe bestehend aus substituierten, C
1-10-Alkyl-
und Phenylgruppen, oder es bildet mit der Z-Gruppe, an welche es
gebunden ist, einen gesättigten
oder ungesättigten,
gegebenenfalls substituierten, Heterocyclus, welcher bis zu zwei
Heteroatome ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus N, O und S enthält;
Z wird ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus -N, -CH
2N und -CONHCH
2CH
2N;
R
4 und R
5, gleich
oder voneinander verschieden, werden ausgewählt aus einer Gruppe bestehend
aus einer C
1-15-Alkyl- und Phenylgruppe,
oder bilden mit der Z-Gruppe, an welche sie gebunden sind, einen
gesättigten oder
ungesättigten,
gegebenenfalls substituierten, Heterocyclus, welcher bis zu zwei
Heteroatome ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus N, O und S enthalten kann;
R
6 und R
7, gleich
oder voneinander verschieden, werden ausgewählt aus einer Gruppe bestehend
aus H und einer C
1-15-Alkylgruppe;
m,
n, p, w, t und u sind unabhängig
voneinander 0 oder 1; und
v ist eine ganze Zahl zwischen 1
und 3;
unter der Voraussetzung, dass, wenn R
1 und
R
2 gleich, nicht H und in den Positionen
1,4 oder 2,3 sind, wenn hingegen nur entweder R
1 oder
R
2 kein H ist, ist die Position 1 oder 2
substituiert; oder R
1 und R
2 bilden
zusammengenommen einen gesättigten
oder ungesättigten,
gegebenenfalls substituierten, Heterocyclus, welcher bis zu zwei
Heteroatome ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus N, O und S enthält;
R
8 ausgewählt aus
H und C
1-C
15-Alkylgruppen
wird,
und ihre pharmazeutisch geeigneten Salze.
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Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind site-spezifisch mit bioorganischen
Trägersubstanzen
wie Aminosäuren,
Polypeptiden, Proteinen und Polysacchariden konjugierte Verbindungen
mit der oben genannten Formel (I).
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Genannte
Verbindungen mit der Formel (I), wie auch die entsprechenden Konjugate,
sind für
die Behandlung von mikrobiellen Infektionen (virale, bakterielle
und von Pilzen verursachte), Tumoren, vorkanzerogenen und proliferativen
Erkrankungen bei der Photodynamischen Therapie von Nutzen und sind
ebenso als diagnostische Mittel zur Identifizierung von pathologisch
betroffenen Gebieten wie auch für
die photodynamische Sterilisierung von Blut und Blutderivaten von
Nutzen.
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Merkmale
und Vorteile der erfindungsgemäßen Verbindungen
mit der Formel (I) werden in der folgenden Beschreibung im Detail
erläutert.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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1: Überlebensrate (%) vs. Bestrahlungszeit
(min) mit rotem Licht bei 100 mW/cm2 für E. coli
04, welche vorher mit 2,5 μM
Verbindung 18 für
5 Minuten inkubiert wurden.
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2: Überlebensrate (%) von Kolonie
bildenden Einheiten (CFU) von Candida albicans vs. Konzentration
(μM) der
folgenden erfindungsgemäßen Verbindungen,
im Vergleich mit vorher in der Literatur genannten, strukturell ähnlichen
Verbindungen:
- --
bezeichnet die Kurve, die unter Verwendung von Verbindung 20, hergestellt
wie in Beispiel 3 beschrieben, erhalten wurde.
- -•-
bezeichnet die Kurve, die unter Verwendung von Verbindung 19, hergestellt
wie in Beispiel 3 beschrieben, erhalten wurde.
- ...∇...
zeigt die Kurve, die unter Verwendung der Verbindung PPC erhalten
wurde, welche von Minnoch, A. et al., J. Photochem. Photobiol.,
32, 159–164
(1996) beschrieben wurde.
- --
zeigt die Kurve, die unter Verwendung der Verbindung erhalten wurde,
welche als Verbindung 42 in der europäischen Patentanmeldung 98 115
936.0 im Namen des Anmelders benannt wurde.
- ...☐... zeigt die Kurve, die unter Verwendung von Zn-Phthalocyanin,
vertrieben von Aldrich, erhalten wurde.
- ...o... zeigt die Kurve, die unter Verwendung der Verbindung
T4MPyP erhalten wurde, beschrieben von Merchat,
M. et al., J. Photochem. Photobiol. 32, 152–157 (1996).
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3 zeigt die Variation der
CFU für
verschiedene Konzentrationen von Candida albicans Zellen, inkubiert
für 60
min mit 1 μM
der Verbindung 19, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, und
mit einem Licht von 100 mW/cm2 bestrahlt.
Auf der y-Achse ist die Überlebensrate
(%) dargestellt.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
es, den oben genannten Anforderungen dank der Metall-Phthalocyanine
mit der allgemeinen Formel (I) gerecht zu werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung sind Zn(II)-Phthalocyanine bevorzugt.
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Erfindungsgemäße Verbindungen
mit der Formel (I) tragen die gleichen Substituenten in den spezifischen
Positionen an den drei Benzolringen des Phthalocyaninkerns und diese
sind vom vierten Substituenten, der mindestens eine kationische
oder protonierbare Gruppe enthält,
verschieden.
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Unter
protonierbarer Gruppe gemäß der oben
genannten allgemeinen Formel (I) wird vorzugsweise eine Amingruppe
verstanden.
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Unter
einem gegebenenfalls substituierten gesättigten oder ungesättigten
Heterocyclus, wie in der oben genannten allgemeinen Formel definiert,
sind vorzugsweise die folgenden gemeint: Morpholin, Piperidin, Pyridin,
Pyrimidin, Piperazin, Pyrrolidin, Pyrrolin, Imidazol, Anilin und
Julolidin (2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-benzo[ij]chinolin). Erfindungsgemäß sind die
bevorzugten Produkte diejenigen, in welcher die Gruppe (X)pR3 Substituenten
enthält,
die tertiären
oder quartären
Stickstoff tragen.
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Insbesondere
wird die genannte Gruppe (X)pR3 vorzugsweise
dargestellt durch:
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-
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Die
vorliegenden Verbindungen weisen wertvolle photodynamische Eigenschaften
auf, welche sie für die
Photodynamische Therapie (PDT) gegenüber bakteriellen, von Pilzen
hervorgerufenen und viralen Infektionen, bei verschiedenen Erkrankungen
mit übermäßigen Wucherungen
wie auch für
die Photosterilisation von Blut und Blutderivaten wie Thrombozyten
und Erythrozyten wertvoll machen. In diesem besonderen Fall können die
vorliegenden Verbindungen, direkt oder vorher an eine geeignete
Matrix gebunden, gemäß bekannter Techniken
zum Blut oder zu den Blutderivaten gegeben und anschließend bestrahlt
werden. Darüber
hinaus können
sie als diagnostische Mittel für
die Identifizierung von pathologisch befallenen Gebieten verwendet werden.
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Die
vorliegenden Produkte besitzen einen höheren molaren Absorptionskoeffizienten
als die derzeit in der Therapie verwendeten Photosensibilisatoren,
was eine wichtige Anforderung für
eine effektive therapeutische Antwort darstellt.
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Diese
Produkte können
durch gewebedurchdringende Strahlung mit einer Wellenlänge von
mehr als 650 nm aktiviert werden, und sind daher für die PDT
bei sowohl dermatologischen wie auch internen Erkrankungen geeignet.
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Die
Produkte, die durch Photobleichen dieser Verbindungen gebildet werden,
sind nicht toxisch. Diese Feststellung unterstreicht ihre Nützlichkeit
als Therapeutika, denn nachdem diese Verbindungen ihre Wirkung ausgenutzt
haben, werden sie durch Licht inaktiviert und sind dann nicht mehr
potentiell toxisch in vivo.
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Die
vorliegenden Verbindungen sind bei der Singulett-Sauerstoffproduktion
aktiv und ermöglichen
die Herstellung reaktiver Sauerstoffspezies unter Bedingungen von
geringer Sauerstoffsättigung.
Eine derartige Anforderung ist insbesondere von Bedeutung, da sie
die spezifische Behandlung von anaeroben Mikroorganismen oder Tumorzellen
ermöglicht,
die bekanntermaßen
durch eine sauerstoffarme Umgebung gekennzeichnet sind.
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Insbesondere
weisen die beispielhaft aufgeführten
Produkte sehr hohe Wirksamkeit gegenüber Mikroorganismen wie Hefepilzen
und Mycoplasma, Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien auf,
und zeigen die Fähigkeit,
diese Mikroorganismen im Vergleich zu Säugetier-Wirtszellen spezifisch
zu lokalisieren.
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Die
Entdeckung der unterschiedlichen Toxizität bei Wirtszellen und Mikroorganismen
stärkt
die Bedeutung der beanspruchten Produkte (I).
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch die oben beschriebenen Verbindungen
mit der Formel (I), welche site-spezifisch mit bioorganischen Trägersubstanzen
konjugiert sind, die das Molekül
auf ein bestimmtes Ziel lenken können.
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Die
Trägersubstanz
wird üblicherweise
ausgewählt
aus Molekülen
mit wohlbekannten spezifischen Bindungsfähigkeiten, zum Beispiel Aminosäuren (vorzugsweise
basische Aminosäuren),
Polypeptide (vorzugsweise bestehend aus basischen Aminosäuren), Proteine
und Polysaccharide, welche üblicherweise
für derartige
Zwecke verwendet werden.
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Die
Bindung Phthalocyanin (I)/Trägersubstanz
kann zum Beispiel zwischen den verwandten Amino- oder Carboxylgruppen
entstehen oder kann andere spezifische funktionelle Gruppen der
Phthalocyanineinheit oder der Trägersubstanz
involvieren. Funktionelle Gruppen wie Thiol, Maleimid-Derivate, α-Bromester
und -amide, Diazoniumsalze und Azidoderivate können eingeführt werden, in dem herkömmliche
Verfahren verwendet werden, um sowohl das Phthalocyanin wie auch
die Trägersubstanz
in Abhängigkeit
von der gewählten Trägersubstanz
selbst und ihrer Stabilität
zu präfunktionalisieren.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch Kondensation in
homogener wie auch in heterogener Phase von passend substituierten
Phthalonitrilen gemäß in der
organischen Chemie bekannter Reaktionsschemata hergestellt werden.
Zum Beispiel können
Amino-substituierte Zn(II)-Phthalocyanine mit der Formel (I) gemäß der hier
beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
- a)
Flüssige
Phase durch gemischte Kondensationsmethode unter Verwendung zweier
unterschiedlicher 1,2-Dicyanbenzole mit geeigneten Substituenten,
definiert durch die folgenden Formel (II) und Formel (III) wobei R, R1 und
R2 wie oben definiert sind. In der Verbindung
mit der Formel (II), sind die Positionen 3,6 oder 4,5 substituiert,
wenn R1 und R2 gleich
sind; ist jedoch ein Substituent R1 oder
R2 H, so befindet sich der andere in der
Position 3 oder 4.
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In
der Verbindung mit der Formel (III) sind die Positionen 3,6 oder
4,5 substituiert, wenn R von H verschieden ist.
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Die
Phthalonitrile mit der Formel (II) und (III) werden in verschiedenen
Verhältnissen
gemischt (1 : 1 bis 1 : 6) unter Verwendung von reinem 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) oder mit
einem Lösungsmittel
(Dichlormethan, Methanol, N,N-Dimethylformamid)
in Gegenwart von wasserfreiem Zink(II)-acetat bei verschiedenen
Temperaturen und Reaktionszeiten, um eine Mischung aus Verbindungen
zu ergeben. Die Mischung wird zunächst durch ausgiebiges mehrmaliges
Waschen mit Wasser und organischen Lösungsmitteln (z. B. Fällen mit
DMF/Wasser, Extraktionen mit Wasser/organisches Lösungsmittel)
und anschließend
durch Chromatographie (z. B. unter Verwendung von Silicagel, deaktiviertem
basischem oder neutralem Aluminiumoxid, Sephadex) gefolgt von weiteren
Waschvorgängen
der getrennten Produkte mit organischen Lösungsmitteln (Et2O,
AcOEt, CH2Cl2, CHCl3, Aceton, Methanol) gereinigt.
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b) Feste Phase
-
Einige
der Phthalocyanine mit der Formel (I) mit geeigneten Substituenten
können
auch durch eine Festphasen-Synthese hergestellt werden, damit zeitaufwendige,
schwierige Reinigungsverfahren vermieden werden, die durch die statistische
Synthese vorhersehbar sind. Das Herstellungsverfahren, ausgehend
von einem Dinitril, welches an eine feste Phase gebunden ist und
mit einem unterschiedlich substituierten Dinitril, welches vorher
in ein Diaminoisoindolylderivat umgewandelt wurde, wurde bereits
beschrieben (Tetrahedron Letters Vol. 23, (30), S. 3023–3026 (1982);
J. Org. Chem. Vol. 56, S. 82–90
(1991)); das beschriebene Verfahren ist jedoch eine Verfeinerung
des oben genannten und führt
spezifisch zu Amino-substituierten Metall-Phthalocyaninen, was bisher
nicht berichtet wurde.
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Kationische
Metall-Phthalocyanine mit der Formel (I) können hergestellt werden, in
dem die entsprechenden neutralen Verbindungen, die wie oben beschrieben
erhalten wurden, mit einem Überschuß an reinem Alkyliodid,
oder in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels (z. B. N-Methyl-2-pyrrolidinon,
DMF, Methanol, Chloroform), bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur
und Rückflußtemperatur
für eine
Reaktionsdauer zwischen 1 Stunde und 10 Tagen zur Reaktion gebracht
werden. Die Rohprodukte können
im Allgemeinen durch mehrmaliges Waschen mit verschiedenen organischen
Lösungsmitteln
wie Et2O, CH2Cl2 und CHCl3, Ethylacetat
oder Aceton gereinigt werden.
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Jede
hergestellte Verbindung kann mittels verschiedener spektroskopischer
Techniken wie 1H-NMR oder 13C-NMR,
MS identifiziert und durch Spektrometrie im UV-Vis-Bereich charakterisiert
werden.
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Im
Folgenden wird die Herstellung spezifischer Verbindungen mit der
Formel (I) zur besseren Erläuterung
der Erfindung berichtet.
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BEISPIEL 1
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Synthese der Verbindung
mit der Formel (I) in welcher M Zn, R = R2 =
H und R1 = 1,3-Bis-(dimethylamino)-2-propyloxy-
an der Position 2 ist (Verbindung 1)
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0,273
g 4-[1,3-Bis-(dimethylamino)-2-propyloxy]-1,2-benzodicarbonitril
(1 mmol) und 0,384 g 1,2-Benzodicarbonitril (3 mmol) werden in einer
kleinen Menge Methanol gelöst
und es werden Zn(OAc)2 (0,176 g, 0,96 mmol)
und DBU (0,66 ml, 0,42 mmol) zugegeben. Die Mischung wird auf 150°C unter einer
Inertgasatmosphäre
3 Stunden 30 Minuten erhitzt. Die blaue Mischung wird in DMF gelöst und mit
basischem Wasser einige Male gefällt,
anschließend
mittels Flash-Chromatographie über
Silicagel gereinigt und mit Et2O/DMF (4
: 1), EtOAc/DMF (4 : 1), EtOAc/DMF (1 : 1), EtOAc/DMF (1 : 2) und
DMF eluiert. Das interessierende Produkt wird mittels Waschen mit
Et2O und Aceton weiter gereinigt. Blauviolettes
Pulver.
UV-Vis (DMF) λmax (ε,
M–1cm–1)
344, 606, 672 (2,7635 × 10). 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,42–9,30 (m,
6H), 9,23 (d, 1H), 8,95 (s, 1H), 8,30–8,20 (m, 6H), 7,90–7,80 (m,
1H), 5,25–5,18
(m, 1H), 2,90 (d, 4H), 2,49 (s, 12H). ESI-MS, m/z
-
Verbindung
2: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = Pyridin-4-yl-oxy
an der Position 2 ist; blau-violettes Pulver; UV-Vis (DMF) λmax,
nm (ε, M–1cm–1)
350, 606, 674 (8,9670 × 10). 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,40–8,95 (m,
7H), 8,62 (d, J = 7,50 Hz, 2H), 8,35–8,10 (m, 8H), 6,59 (d, J =
7,43 Hz, 2H), ESI-MS, m/z 670 [M + H]+.
-
Verbindung
3: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 3-(Dimethylamino)-phenoxy
an der Position 2 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 346, 605, 671, 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,48–9,05
(m, 7H), 8,72–8,65
(m, 1H), 8,32–8,12
(m, 6H), 7,90–7,80
(m, 1H), 7,52–7,38
(m, 1H), 6,88–6,75
(m, 3H), 3,08 (s, 6H). ESI-MS, m/z 712,3 [M+H]+.
-
Verbindung
4: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 1-Methylpiperidin-4-yl-oxy
an der Position 2 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 343, 606, 673, 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,45–9,30
(m, 5H), 9,17 (d, J = 8,51 Hz, 1H), 8,794 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,33–8,18 (m,
7H), 7,775 (dd, J = 8,21 Hz, J = 2,1 Hz, 1H), 5,20–4,98 (m,
1H), 2,95–2,80
(m, 2H), 2,60–2,40
(m, 2H), 2,40–2,12
(m, 2H; s, 3H), 2,15–1,94
(m, 2H). ESI-MS, m/z 690,2 [M+H]+.
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Verbindung
5: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = H, und R1
= R2 = Pyridin-4-yl-oxy an den Positionen 2,3 ist; blau-violettes
Pulver. UV-Vis (DMF) λmax, nm 347, 666, 684, 1H-NMR
(DMSO-d6) δ ppm 9,43–9,39 (m, 6H), 8,30–8,22 (m,
8H), 8,12 (d, J = 7,6 Hz, 4H), 6,39 (d, J = 7,6 Hz, 4H).
-
Verbindung
6: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 1,3-Bis-(dimethylamino)-2-propyloxy
an der Position 1 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax nm
336, 611, 677. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,50–9,42 (m,
6H), 9,07 (bd, J = 7,33 Hz, 1H), 8,40–8,12 (m, 7H), 7,91 (bd, 7,95,
1H), 5,50–5,38
(m, 1H), 3,25–3,17
(m, 4H), 2,47 (s, 12H).
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Verbindung
7: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = H, und R1 = R2 = 3-(Piperidin-1-yl)-propyloxy
an den Positionen 1,4 ist; blau-grünes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 335, 622, 690. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,45–9,35
(m, 6H), 8,27–8,18
(m, 6H), 7,72 (s, 2H), 4,76–4,71
(m, 4H), 3,10–3,03 (m,
4H), 2,57–2,51
(m, 12 H), 1,63–1,36
(m, 12H). FAB-MS, m/z 861 [M+H]+.
-
Verbindung
8: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = H, und R1 = R2 = 3-(Dimethylamino)-phenoxy
an den Positionen 2,3 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax 344,
606, 672. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,39–9,28 (m,
6H), 8,95 (s, 2H), 8,20–8,15
(m, 6H), 7,45–7,35
(m, 4H), 6,72–6,73
(m, 4H), 3,03 (s, 12H).
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Verbindung
9: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = Pyridin-2-yl-oxy
an der Position 2 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 343, 606, 672. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,38–9,11 (m
7H), 8,50–8,40
(m, 1H), 8,32–8,07
(m, 9H), 7,88–7,75
(m, 1H), 6,85–6,68
(m, 1H).
-
Verbindung
10: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = Pyridin-3-yl-oxy an
der Position 2 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 343, 606, 672. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,40–8,85 (m,
8H), 8,72–8,62
(m, 1H), 8,34–8,10
(m, 7H), 8,09–7,95
(m, 1H), 7,94–7,68
(m, 2H).
-
Verbindung
11: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 3-(Dimethylamino)-phenoxy
an der Position 1 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 333, 607, 674. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,48–9,28
(m, 6H), 9,23 (d, J = 7,46 Hz, 1H), 9,99 (d, J = 7,26 Hz, 1H), 8,38–8,11 (m,
7H), 7,81 (d, J = 7,65 Hz, 1H), 7,14 (dd, J1 = J2 = 8,40 Hz, 1H),
7,10–7,00
(m, 1H), 6,53 (bd, J = 8,40 Hz, 1H).
-
Verbindung
12: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = H, und R1 = R2 = 2-(Diethylamino)-ethylthio
an den Positionen 2,3 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax 347,
612, 680. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,28–9,17 (m,
6H), 8,85 (s, 2H ), 8,26–8,15
(m, 6H), 3,59–3,52
(bt, 4H), 3,07–3,00
(bt, 4H), 2,79 (q, J = 7 Hz, 8H), 1,20 (t, J = 7 Hz, 12H).
-
Verbindung
13: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = H, und R1 = R2 = Pyridin-3-yl-oxy an
den Positionen 2,3 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax 346,
605, 671. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,10–9,32 (m,
6H), 8,77 (bs, 2H), 8,55 (d, J1 = 4,6 Hz,
2H), 8,25–8,18
(m, 8H), 7,87 (bd, J2 = 8,3, 2H), 7,61 (dd, J1 = 4,6 Hz, J2 =
8,3, 2H).
-
Verbindung
14: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 2-(Dimethylamino)-ethyloxy
an der Position 1 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax 334,
611, 677. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,36
(m, 8H), 8,95 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 8,23 (m, 7H), 8,12 (dd, J1 = 7,7 Hz, J2 =
7,5 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,83 (bt, 2H), 2,62 (s, 6H).
-
Verbindung
15: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 2-(Piperidin-1-yl)-ethyloxy
an der Position 1 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax 337,
611, 677. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,30–9,27 (m,
8H), 8,83 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,22–8,19 (m, 7H), 8,04 (dd, J1 = J2 = 7,6 Hz,
1H), 7,66 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,82 (bt, 2H), 2,88 (bt, 2H), 2,52
(m, 4H), 1,64–1,47
(m, 6H).
-
Verbindung
16: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 2-(Piperidin-1-yl)-ethyloxy
an der Position 2; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax 347,
607, 671. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,30–9,23 (m,
8H), 8,99 (D, J = 8,4, 1H ), 8,61 (bs, 1H), 8,25–8,17 (m, 7H), 7,63 (d, J =
8,4 Hz, 1H), 4,61 (bt, 2H), 3,03 (bt, 2H) 2,70 (m, 4H), 1,68–1,53 (m,
6H).
-
BEISPIEL 2
-
Synthese der Verbindung
mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 =
H, und R1 = N-(2-Aminoethyl)-benzamidoyl-4-oxytrifluoracetat
ist (Verbindung 17)
-
a) Funktionalisierung
des auf Polystyrol basierenden Harzes mit Phthalodinitril
-
159
mg (0,078 mg) Diaminoethantrityl-Harz (0,49 mmol/g) werden in 12,5
ml DMF aufgequollen. Zu dieser Suspension werden 282 mg (0,78 mmol)
Succinimidester der 4-(3'4'-Dicyano)-phenoxybenzoesäure gegeben
und das Produkt wird 18 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren stehen
gelassen. Die flüssige Phase
wird vom Harz mittels Vakuumfiltration abgetrennt und das Harz wird
einige Male mit kleinen Mengen DMF, CH2Cl2 und MeOH gewaschen.
-
b) Festphasen-Kondensationsreaktion
-
100
mg (0,78 mmol) 1,2-Dicyanbenzol werden in 2 ml DMF gelöst, das
erhaltene funktionalisierte Harz (0,078 mmol) wird zu dieser Lösung gegeben
und die Mischung für
eine Stunde auf 50°C
erwärmt.
Anschließend
werden 79 mg (0,43 mmol) Zink(II)-acetat und 0,322 ml (2,15 mmol) DBU
zugegeben und die Suspension wird 4 Stunden auf 160°C unter Rühren in
einer Stickstoffatmosphäre
erhitzt. Nach dem Abkühlen
auf Raumtemperatur werden die beiden Phasen mittels Vakuumfiltration
getrennt und die feste Phase wird mit MeOH und DMF gewaschen.
-
c) Trennung des Zn-Phthalocyanins
vom Harz
-
Das
grün-blaue
Harz wird in einer Lösung
von Trifluoressigsäure
(TFA) (375 ml, 5%) und Triisopropylsilan (TIS) (375 ml, 5%) in CH2Cl2 (7,5 ml) suspendiert
und in dieser Lösung
1,5 Stunden gehalten. Die beiden Phasen werden dann mittels Vakuumfiltration
getrennt und der Harz abwechselnd mit CH2Cl2 und kleinen Mengen an DMF und MeOH gewaschen,
bis die Lösung
farblos ist. Das Filtrat wird eingeengt und der blaugrüne Rückstand
mittels Säulenchromatographie
und Waschen mit Lösungsmitteln
gereinigt, um 8 mg des gewünschten
Produktes 2-[N-(2-Aminoethyl)-benzamidoyl-4-oxy]-zink(II)-phthalocyanintrifluoracetat
(Verbindung 17) zu ergeben; grün-blauer
Feststoff.
UV-Vis (DMF) λmax, nm; 1H-NMR (DMSO-d6), δ ppm
9,6–9,3
(m, 7H), 9,0–8,75
(s, 1H), 8,75–8,6
(m, 1H, verschwindet mit D2O), 8,35–8,2 (m,
6H), 8,2–7,9
(m, 6H, verändert
sich mit D2O), 7,6–7,4 (m, 2H), 3,7–3,5 (m, 2H),
3,2–3,0
(m, 2H); ESI-MS, m/z: 755 [M+H]+.
-
BEISPIEL 3
-
Synthese der Verbindung
mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 =
H, und R1 = 1,3-Bis-(trimethylammonium)-2-propyloxydiiodid
an der Position 2 ist (Verbindung 18)
-
10
Gramm Verbindung 1 (0,014 mmol), hergestellt wie im Beispiel 1 oben
beschrieben, werden in 2,5 ml N-Methyl-2-pyrrolidinon gelöst und mit
einem Überschuß an Methyliodid
behandelt, wobei die Mischung 15 h bei Raumtemperatur stehen gelassen
wird. Das Produkt wird mit Et2O aus der
Mischung gefällt,
mittels Filtration gewonnen und durch mehrmaliges Waschen des Niederschlags
mit organischen Lösungsmitteln
gereinigt, um das gewünschte
Produkt 2-[1,3-Bis-(trimethylammonium)-2-propyloxy]-zink(II)-phthalocyanindiiodid zu
erhalten; blaues Pulver.
UV-Vis (DMF) λmax (ε, M–1cm–1)
343, 607, 672 (1,9275 × 105). 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,55–9,40
(m, 7H), 9,23 (s, 1H), 8,42–8,35
(m, 6H), 8,25–8,15
(m, 1H), 6,30–6,10
(m, 1H), 4,45–4,10
(m, 4H), 3,55 (s, 18H), ESI-MS, m/z 375,3 [M – 2I]2+.
-
Unter
Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens werden ebenfalls erhalten:
-
Verbindung
19: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 3-(Trimethylammonium)-phenoxyiodid
an der Position 2 ist; UV-Vis (DMF) λmax,
nm (ε, M–1cm–1)
345, 606, 671 (1,7073 × 105). 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,55–9,42
(m, 5H), 9,42–9,35
(m, 1H), 9,05–8,97
(m, 1H), 8,38–8,20
(m, 8H), 8,05–7,80
(m, 3H), 7,68–7,60
(m, 1H), 3,77 (s, 9H). ESI-MS, m/z 726,4 [M – I]+.
-
Verbindung
20: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1= 1,1-Dimethylpiperidinium-4-yl-oxyiodid
an der Position 2 ist. UV-Vis (DMF) λmax,
nm (ε, M–1cm–1)
341, 606, 671 (1,8197 × 105). 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,52–9,39
(m, 5H), 9,35 (d, 1H), 9,00 (d, 1H), 8,40–8,25 (m, 7H), 7,95 (dd, 1H).
2. ESI-MS, m/z 704,3 [M – I]+.
-
Verbindung
21: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = H und R1 = R2 = 3-(1-Methylpiperidinium-1-yl)-propyloxyiodid
an den Positionen 1,4 ist; blau-grünes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 337, 619, 687. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,48–9,39
(m, 6H), 8,31–8,27
(m, 6H), 7,89 (s, 2H), 5,10–4,90
(m, 4H), 4,13–4,03
(m, 4H), 3,55–3,45
(m, 8H), 3,23 (s, 6H), 2,90–2,65
(m, 4H), 1,90–1,72
(m, 8H), 1,68–1,32
(m, 4H), ESI-MS, m/z 1015,4 [M – I]+, 444,6 [M – 2I]+.
-
Verbindung
22: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = H und R1 = R2 = 3-(Trimethylammonium)-phenoxyiodid
an den Positionen 2,3 ist; blaues Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 342, 606, 672. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,52–9,38
(m, 6H), 9,30 (s, 2H), 8,45–8,30
(m, 6H), 8,12 (bs, 2H), 7,92–7,80
(m, 4H), 7,63–7,58
(bd, 2H), 3,73 (18H).
-
Verbindung
23: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 1,3-Bis-(trimethylammonium)-2-propyloxydiiodid
an der Position 1 ist; grünes
Pulver. UV-Vis (DMF) λmax, nm 334, 609, 676. 1H-NMR
(DMSO-d6) δ ppm 9,60–9,38 (m, 6H), 9,36–9,30 (m,
1H), 8,52–8,20
(m, 7H), 7,95–7,85
(m, 1H), 6,40–6,30
(m, 1H), 4,68–4,38
(m, 4H), 3,44 (s, 18H). ESI-MS, m/z 1005 [M + H]+.
-
Verbindung
24: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 3-(Trimethylammonium)-phenoxyiodid
an der Position 1 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 333, 607, 674. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,50–9,30
(m, 6H), 8,78–8,70
(m, 1H), 8,52 (bs, 1H), 8,4–8,06
(m, 7H), 8,02–7,92 (m,
1H), 7,72–7,65
(m, 1H), 7,60–7,50
(m, 1H), 7,26–7,34
(m, 1H), 3,80 (s, 9H). ESI-MS, m/z 726.3 [M – I]+.
-
Verbindung
25: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = H und R1 = R2 = 2-Ddiethylmethylammonium)-ethylthioiodid
an den Positionen 2,3 ist; blau-violettes Pulver. UV-Vis (DMF) λmax,
nm 347, 611, 681. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm
9,49–9,45
(m, 8H), 8,36–8,31
(m, 6H), 4,11–4,05
(m, 4H), 3,85–3,69
(m, 4H), 3,55–3,65
(bq, 8H), 3,25 (s, 6H), 1,42 (t, J = 7 Hz, 12H).
-
Verbindung
26: Verbindung mit der Formel (I), in welcher M Zn, R = R2 = H und R1 = 1-Methylpyridinium-4-yl-oxy
an der Position 2 ist; blau-violettes Pulver; UV-Vis (DMF) λmax,
nm (ε, M–1cm–1)
350, 606, 674. 1H-NMR (DMSO-d6) δ ppm 9,85–9,68 (bd,
2H), 9,42 (bs, 1H), 9,41–9,00
(m, 7H), 8,52–8,41
(bd, 1H), 8,40–8,02 (m,
8H). ESI-MS, m/z
684,2 [M – I]+.
-
BEISPIEL 4
-
Herstellung eines Konjugats
aus Verbindung 17 und Rinderserumalbumin (BSA)
-
Rinderserumalbumin
(BSA) wurde als eine Lösung
mit einer Konzentration von 5 mg/ml in PBS (pH 8,5) hergestellt.
Verbindung 17, die wie in dem oben beschriebenen Beispiel 2 erhalten
wurde, wurde als eine DMSO-Lösung
(5 mg/ml) hergestellt.
-
In
einem Experiment wurden 12,5 Äquivalente
Verbindung 17 mit 200 μl
BSA-Lösung
gemischt; die blaue Suspension wird bei 4°C unter leichtem Rühren gehalten
und dann werden 12,5 Äquivalente
Disuccinimidylsuberat (DSS, Pierce) langsam zugegeben und die Temperatur
wird innerhalb von 90 Minuten auf Raumtemperatur gebracht. Nach
dem Zentrifugieren wird das BSA/Verbindung 17-Konjugationsprodukt
mittels Gelfiltration (Sephadex G25) gereinigt und mit PBS (pH 7,2)
eluiert, wobei Fraktionen mit einem Volumen von etwa 1 ml gesammelt
werden.
-
Das
Konjugationsprodukt, das aufgrund seiner grün-blauen Farbe sichtbar ist,
wird aus der zweiten bis vierten Fraktion erhalten. Das Markierungsverhältnis wurde
spektrometrisch bestimmt durch Messung der Proteinkonzentration
und der Molzahl der Verbindung 17 pro Mol BSA.
-
Unter
den angewandten experimentellen Bedingungen liegt das erhaltene
Markierungsverhältnis
zwischen 4 und 5 und kann durch Variierung der Anfangsreagenzverhältnisse
je nach den Anforderungen eingestellt werden.
-
Analog
können
Konjugate von anderen erfindungsgemäßen Verbindungen mit der Formel
(I) hergestellt werden.
-
Pharmazeutische Formulierungen
-
Therapeutische
Zusammensetzungen, die erfindungsgemäße Verbindungen enthalten,
umfassen auch Lösungen
für die
Verabreichung über
die Route der parenteralen Injektion, Präparate für topische Anwendung usw.
-
Die
erfindungsgemäßen topischen
Formulierungen sind zum Beispiel Lotionen, Cremes, Salben oder Gele.
Besonders bevorzugt sind DMSO- oder wäßrige Azone-Lösungen bis
zu 50%.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
mit der Formel (I) mit lipophilen Eigenschaften können in
Liposome oder Mikrokapseln eingebaut werden und in dieser Form für beide
oben genannten Applikationsmethoden verwendet werden.
-
Die
Dosierung reicht normalerweise von 0,1 bis 20 mg Verbindung mit
der Formel (I) pro Kilogramm Körpergewicht,
vorzugsweise 0,2–5
mg/kg Körpergewicht.
-
Biozide Aktivität
-
Die
in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen zur Anwendung
gemäß der PDT
weisen viele Vorteile auf, wie eine sehr niedrige Toxizität in Abwesenheit
von Licht.
-
Jedes
Molekül
kann wiederholt angeregt werden mit der nachfolgenden Produktion
von Singulett-Sauerstoff oder anderen reaktiven Spezies mittels
eines kontinuierlichen Prozesses.
-
Aufgrund
ihrer kurzen Lebensdauer treffen sie die Zielzelle ohne die Möglichkeit
in benachbarte Zellen zu diffundieren: Singulett-Sauerstoff wird
nur an der pathologischen Stelle produziert und der Teil, der nicht
mit dem biologischen Ziel reagiert, erleidet einen raschen Zerfall.
-
Diese
Eigenschaften werden weiterhin durch die spezifische Lokalisierung
des Photosensibilisators verbessert, durch die Art des Photosensibilisators
selbst oder garantiert durch eine geeignete Trägersubstanz. Die Photodynamische
Therapie, welche die vorliegenden Verbindungen verwendet, ist daher
selektiv und führt zu
keiner keine systemischen oder dermalen Phototoxizität.
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Die
Produktion von Singulett-Sauerstoff geschieht nur gleichzeitig mit
Bestrahlung und endet sofort, wenn die Bestrahlung unterbrochen
wird.
-
Lichtquellen,
welche für
die Ausführung
der PDT geeignet sind, sind in der Fachwelt wohlbekannt und umfassen
geeignet gefiltertes, nicht kohärentes
Weißlicht
oder Laserlicht mit der erforderlichen spezifischen Wellenlänge vorzugsweise
zwischen 650 und 750 nm.
-
Die
Gesamtmenge der angewandten Bestrahlung variiert je nach der Behandlung
und Lage der zu behandelnden Gewebe.
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Die
Strahlungsmenge reicht üblicherweise
von 50 bis 1000 J/cm2, und vorzugsweise
von 100 bis 350 J/cm2.
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Fungizide und antibakterielle
(Gram-positiv und Gram-negativ) Aktivität
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Die
synthetisierten Verbindungen wurden auf ihre fungizide und antibakterielle
(Grampositiv und Gram-negativ) Aktivität hin untersucht. Für die Experimente
wurden die folgenden Mikroorganismen untersucht: Candida albicans
(ATCC10231; Hefe), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P, MRSA, Gram-positiv), Escherichia
coli (04, Gram-negativ). Alle Mikroorganismen wurden in den Experimenten
in einer stationären Wachstumsphase
verwendet. Ein Beispiel des experimentellen Protokolls, welches
zur Ermittlung der Photoinaktivierung der Mikroorganismen verwendet
wurde, wird im Folgenden beschrieben.
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Zellen
in einer stationären
Wachstumsphase wurden mit skalaren Aliquots des zu prüfenden Photosensibilisators
in einem Bereich von 30–0,01 μM, gegebenenfalls
als photosensibilisierendes Konjugat, behandelt. Die Zellen wurden
im Dunklen bei 37°C
1 Stunde inkubiert, gegebenenfalls am Ende mit PBS gewaschen und
dann mit rotem Licht (700 ± 30
nm, 10–100
mW/cm2, 1–30 Minuten) bestrahlt. Um
den Anteil der Zellpopulation nach der Photoinaktivierung für jede Photosensibilisator-Konzentration
zu bestimmen, wurden serienmäßig verdünnte Proben
aus der Bestrahlung auf Sabouraud-Dextrose-Agar (C. albicans), auf
Tryptic-Soja-Agar (S. aureus) oder auf andere geeignete Kulturmedien
ausplattiert und die Daten wurden mit den Dunkelkontrollen verglichen.
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Beispiele
für mikrobielle
Photoinaktivierung unter Verwendung einiger Verbindungen der vorliegenden Erfindung
werden in den Abbildungen gegeben.
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1 zeigt die Variation der Überlebensrate
als Funktion der Bestrahlungszeit (verabreichte Lichtdosis) für E. coli
04, vorher für
5 Minuten mit 2,5 μM
Verbindung 18, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde,
inkubiert und anschließend
mit rotem Licht bei 100 mW/cm2 bestrahlt.
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2 gibt die Abnahme der Kolonien
bildenden Einheiten (CFU) von Candida albicans nach der Behandlung
mit verschiedenen Konzentrationen von einigen in dieser Erfindung
beschriebenen Verbindungen wieder, im Vergleich zu strukturell ähnlichen
Verbindungen, die früher
in der Literatur erwähnt
wurden.
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In 3 wird die Variation der
CFU als Funktion der verabreichten Lichtdosis für verschiedene Candida-albicans-Zellen
aufgeführt,
welche 60 Minuten mit 1 μM
der Verbindung 19 inkubiert und anschließend mit 100 mW/cm2 rotem
Licht bestrahlt wurden.
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Schließlich beschreiben
wir in der folgenden Tabelle 1 das Überleben von 3T3-Zellen als
ein Modell für
Säugetierzellen
wie auch von einigen Mikroorganismen nach einer photodynamischen
Behandlung mit der Verbindung 18, hergestellt wie in Beispiel 3
beschrieben, in PBS + 5% DMSO, als ein Beispiel, um die Selektivität und Effektivität der beschriebenen
Verbindungen zu demonstrieren. Die Bestrahlung wurde mit rotem Licht
(650–750
nm), 50 mW/cm2 ausgeführt.
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-
Beweise
für die
Selektivität
werden auch durch Experimente zu den hämolytischen Eigenschaften der oben
beschriebenen Verbindungen unterstützt. In der folgenden Tabelle
2 wird gezeigt, dass einige Verbindungen für Erythrozyten auch nicht toxisch
sind: tatsächlich
wird nach Behandlung und Bestrahlung unter Verwendung von Konzentrationen
an photosensibilisierendem Mittel deutlich über denen, die für eine vollständige Inaktivierung
von Mikroorganismen notwendig sind, keine Hämolyse gefunden. Diese Tatsachen
stärken
die Nützlichkeit
der beschriebenen Verbindungen und ermöglichen auch ihre Verwendung
für die
Sterilisation von Blut und Blutderivaten.
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