KR102357352B1 - 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법 - Google Patents

화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102357352B1
KR102357352B1 KR1020200001573A KR20200001573A KR102357352B1 KR 102357352 B1 KR102357352 B1 KR 102357352B1 KR 1020200001573 A KR1020200001573 A KR 1020200001573A KR 20200001573 A KR20200001573 A KR 20200001573A KR 102357352 B1 KR102357352 B1 KR 102357352B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
bacteria
pcn4
group
inactivating
Prior art date
Application number
KR1020200001573A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210088302A (ko
Inventor
윤주영
싱슈 리
이은혜
Original Assignee
이화여자대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이화여자대학교 산학협력단 filed Critical 이화여자대학교 산학협력단
Priority to KR1020200001573A priority Critical patent/KR102357352B1/ko
Publication of KR20210088302A publication Critical patent/KR20210088302A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102357352B1 publication Critical patent/KR102357352B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0076—PDT with expanded (metallo)porphyrins, i.e. having more than 20 ring atoms, e.g. texaphyrins, sapphyrins, hexaphyrins, pentaphyrins, porphocyanines

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 및 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법을 개시한다.

Description

화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법{Compound, composition including the same, and method of inactivating or killing bacterial cell using the compound}
화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 및 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법에 관한 것이다.
광역학치료는 광감각제(photosensitizers)를 이용하여 특정파장의 빛을 흡수하고 에너지전달 메커니즘을 거쳐 반응성 산소종(reactive oxygen species; ROS)를 생성하고, 이렇게 생성된 반응성 산소종은 주변 박테리아 세균을 비활성시키거나 또는 사멸시켜 치료하는 방법이다.
그러나 대부분의 광감각제, 예를 들어, 포르피린은 종종 수용액에서 강하게 응집되는 큰 공액화합물로서, 응집이 담금질(quenching)을 유발하기 때문에 충분한 반응성 산소종(ROS)의 생성이 어렵다. 또한 이러한 광감제는 박테리아 세균에 대해 갖는 낮은 표적화 능력을 갖는다.
따라서 안정적인 나노구조체를 형성할 수 있는 광감각제 화합물, 타겟 박테리아 세균에 대해 선택적이며 반응성 산소종(ROS)을 발생시키는 능력을 향상시킨 상기 화합물을 포함하는 조성물, 및 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법이 요구되고 있다.
일 측면은 광감각제(photosensitizers) 화합물을 제공하는 것이다.
다른 측면은 타겟 박테리아 세균에 대해 선택적이며 반응성 산소종(reactive oxygen species; ROS)을 발생시키는 능력을 향상시킨 상기 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
또다른 측면은 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에 따라,
하기 화학식 3으로 표시되는 화합물이 제공된다:
<화학식 3>
Figure 112021105780648-pat00029

상기 화학식 3에서,
CY1, CY2, CY3, CY4는 서로 독립적으로 벤젠 고리, 나프탈렌 고리, 또는 이들 조합이고; 및
X-는 F, Cl, Br, I의 음이온이다.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
다른 측면에 따라,
전술한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및
용매, 산, 염기, 및 버퍼 용액 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 약학 조성물이 제공된다.
또다른 측면에 따라,
박테리아 세균을 전술한 조성물의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계;
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 박테리아 세균 내에 분포될 수 있는 시간을 허용하는 단계; 및
상기 박테리아 세균을 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 의하여 흡수가능한 파장의 여기 광으로 조사하는 단계;를 포함하고,
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 반응성 산소종(ROS)를 생성함으로써 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법이 제공된다.
일 측면에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 광감각제(photosensitizers) 화합물을 제공한다. 또한 상기 광감각제 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물은 안정한 자기조립 나노닷(nanodot) 구조체가 형성될 수 있다. 이러한 자기조립 나노닷 구조체는 Type I 및 Type II 광화학반응 모두에 관여하여 그람 양성균 또는/및 그람 음성균을 포함하는 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시킬 수 있다.
도 1은 일 구현예에 따른 광감각제 화합물이 관여하는 Type I 및 Type II 광화학반응을 나타내는 모식도이다.
도 2는 일 구현예에 따른 조성물(수용액)에서 자기조립 나노닷(nanodot) 구조체가 형성되는 것을 나타내는 모식도이다.
도 3은 실시예 1에 의해 얻은 조성물에 함유된 자기조립 나노닷 형태의 구조체에 대한 TEM 이미지 결과이다.
도 4(a), (b)는 합성예 2의 화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물을 10 μM 농도로 N, N-디메틸포름아미드(DMF) 및 물 용매에 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, 및 0:10의 혼합비로 각각 용해시켜 정상 상태(steady-state)에서의 흡수 스펙트럼과 방출 스펙트럼을 각각 분석한 결과이며; 도 4(c), (d)는 합성예 2의 화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물을 10 μM 농도로 N, N-디메틸포름아미드(DMF) 및 물 용매에 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, 및 0:10의 혼합비로 각각 용해시켜 680 nm 파장의 여기 광에서 정규화된 붕괴 프로파일을 나노세컨드 흡수 스펙트럼을 분석한 결과이다.
도 5(a)는 물에 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트 10 μM과 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물 및 비교예 1~4에 의해 얻은 화학식 A에서 R이 PcN4, PcO4, PcS4, 및 PcC4 함유 조성물을 각각 용해한 10 μM 샘플, 및 물에 메틸렌블루만을 용해한 샘플에 대하여 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트(2,7-dichlorofluorescin diacetate; DCF)를 프로브로 하여 형광방출 스펙트럼을 분석한 결과이며; 도 5(b)는 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물, 메틸렌블루, 및 히드로에티딘을 각각 DNA 용액에 용해한 샘플에 대하여 히드로에티딘을 프로브로 하여 형광방출 스펙트럼을 분석한 결과이며; 도 5(c)는 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 대하여 스핀-트랩(spin-trap)으로 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘을 이용하여 전자상자성 공명(Electron paramagnetic resonance; EPR) 분석한 결과이다.
도 6은 ESBL E. coli (그람 음성균, ATCC BAA-198) 및 MR S. aureus (그람 양성균, CCRAM 3696)을 사용하여 박테리아 함유 저장액 샘플(Control), PcN4-BA 함유 조성물과 박테리아 용액 혼합물 배양액 샘플(PcN4-BA), PcN4-BA 함유 조성물과 박테리아 용액 혼합물 배양액에 레이저 조사한 샘플(PcN4-BA + Light), 및 메틸렌블루와 박테리아 용액의 혼합물 배양액에 레이저 조사한 샘플(MB + Light)에 대한 플레이트 사진이다.
도 7은 MR S. aureus (그람 양성균, CCRAM 3696)을 사용하여 PcN4-BA 함유 조성물과 박테리아 용액 혼합물 배양액에 레이저 조사한 샘플(PcN4-BA) 및 비교예 1에 의해 얻은 PcN4 함유 조성물의 4급 암모늄염(PcN4-M)과 박테리아 용액 혼합물 배양액에 레이저 조사한 샘플(PcN4-M)에 대해 Miles 및 Misra 플레이트법에 의해 살아있는 세균의 수를 분석한 결과이다.
도 8은 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물의 레이저 조사하지 않은 샘플(PcNa-BA)과 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 레이저 조사한 샘플(PcNA-BA + Laser)에 대한 Cryo TEM 이미지 결과이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 및 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법에 관하여 상세히 설명하기로 한다. 이하는, 예시로서 제시되는 것으로서 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 특허청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 "포함"이라는 용어는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 추가 또는/및 개재할 수 있음을 나타내도록 사용된다.
본 명세서에서 "이들의 조합"이라는 용어는 기재된 구성요소들 하나 이상과의 혼합 또는 조합되는 것을 의미한다.
일 구현예에 따른 화합물은 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다:
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
<화학식 3>
Figure 112020001233825-pat00007
상기 화학식 3에서,
CY1, CY2, CY3, CY4는 서로 독립적으로 벤젠 고리, 나프탈렌 고리, 또는 이들 조합일 수 있고; 및
X-는 F, Cl, Br, I의 음이온일 수 있다.
예를 들어, 상기 화합물은 하기 화학식 4로 표시될 수 있다:
<화학식 4>
Figure 112020001233825-pat00008
상기 화학식 3 또는 4로 표시되는 화합물은 치환된 아연(II) 프탈로시아닌 화합물로서 광역학적 치료에 사용되는 광감각제이다. 상기 화합물은 포르피린과 비교하여 일반적으로 광치료 윈도우(phototherapeutic window)에서 더 강한 광 흡수를 나타낸다.
도 1은 일 구현예에 따른 광감각제 화합물이 관여하는 Type I 및 Type II 광화학반응을 나타내는 모식도이다.
도 1에서 보이는 바와 같은 광화학반응과 관련하여, 일 구현예에 따른 상기 광감각제 화합물은 Type I 및 Type II 광화학반응 모두에 관여하여 반응성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 발생에 있어서 높은 효율을 갖고 있다.
또한 상기 화합물은 4급 암모늄염기와 더불어 예를 들어, 보론산기를 치환기로 갖는 아연(II) 프탈로시아닌 화합물일 수 있다. 상기 화합물은 소수성(hydrophobicity)인 프탈로시아닌 코어에 친수성(hydrophilicity)인 4급 암모늄염기와 더불어 예를 들어, 보론산기가 결합된 양친성(amphiphillic) 화합물일 수 있다. 상기 프탈로시아닌 코어에 도입된 4급 암모늄염기는 음전하를 갖는 박테리아 외부막(outer membrane)에 대한 친수성 및 친화도(affinity)을 향상시킬 수 있으며, 또한 보론산기는 박테리아 표면의 글리칸과 한 쌍의 공유결합을 형성할 수 있다. 이 때문에, 상기 화합물은 타겟 박테리아 세균에 대해 선택적인 특성을 나타낼 수 있다.
다른 일 구현예에 따른 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 약학 조성물은 전술한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및 용매, 산, 염기, 및 버퍼 용액 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물은 용매, 버퍼 용액 또는 이들의 혼합물에 전술한 화합물을 첨가하고, 여기에 산, 및/또는 염기를 첨가하여 준비될 수 있다. 또한 상기 약학 조성물은 당해 기술분야에서 사용할 수 있는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물이 포함하는 용매, 산, 염기, 및 버퍼 용액의 함량은 요구되는 성능에 따라 적절히 조절될 수 있다. 또는 상기 약학 조성물은 시료(sample)와 혼합될 수 있다. 상기 시료는 미생물(microorganism), 세포(cell), 및 조직(tissue) 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 생물학적 시료일 수 있으나, 반드시 이들로 한정되지 않으며 당해 기술분야에서 생물학적 시료로 사용할 수 있는 것이라면 모두 가능하다.
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 광감각제일 수 있다. 상기 용매는 물, N,N-디메틸포름아미드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 용매, 산, 염기, 또는 버퍼 용액에서 자기조립 나노구조체가 형성될 수 있다.
상기 자기조립 나노구조체는 자기조립 나노닷(nanodot) 형태일 수 있다.
도 2는 일 구현예에 따른 조성물(수용액)에서 자기조립 나노닷(nanodot) 구조체가 형성되는 것을 나타내는 모식도이다.
도 2를 참조하면, 일 구현예에 따른 조성물은 친수성(hydrophilicity)인 4급 암모늄염기와 보론산기가 결합된 치환기로 갖고 소수성인 아연(II) 프탈로시아닌을 코어로 갖는 경우 물과 같은 친수성 용매에서 균일한 크기의 나노닷 형태로 성장하여 안정한 자기조립된 나노구조체가 형성될 수 있다.
상기 자기조립 나노구조체의 평균직경(mean size)은 1 nm 내지 200 nm일 수 있다. 상기 자기조립 나노구조체의 평균직경(mean size)은 예를 들어 5 nm 내지 190 nm일 수 있고, 예를 들어 10 nm 내지 180 nm일 수 있고, 예를 들어 20 nm 내지 170 nm일 수 있고, 예를 들어 30 nm 내지 150 nm일 수 있다.
또다른 일 구현예에 따른 방법은 박테리아 세균을 전술한 조성물의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계; 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 박테리아 세균 내에 분포될 수 있는 시간을 허용하는 단계; 및 상기 박테리아 세균을 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 의하여 흡수가능한 파장의 여기 광으로 조사하는 단계;를 포함하고, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 반응성 산소종(ROS)를 생성함으로써 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시킬 수 있다.
상기 흡수가능한 파장은 500 내지 850 nm 파장일 수 있다. 상기 흡수가능한 파장은, 예를 들어, 501 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 502 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 503 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 504 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 505 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 506 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 507 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 508 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 509 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 510 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 511 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 512 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 513 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 514 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 515 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 516 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 517 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 518 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 519 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 520 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 521 내지 850 nm 파장일 수 있고, 예를 들어, 522 내지 850 nm 파장일 수 있다.
상기 방법은 예를 들어, 전술한 조성물의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치환기가 양전하를 갖는 4급 암모늄염기에 의해 그 표면이 양전하를 갖고 상기 박테리아 세포막은 음전하를 갖는다. 상기 전술한 조성물의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 자기조립 나노닷(nanodot) 구조체를 형성할 경우 보론산기가 박테리아 표면의 글리칸과 한 쌍의 공유결합을 형성할 수 있다. 이러한 상기 자기조립 나노닷(nanodot) 구조체에 레이저가 조사되면 반응성 산소종(ROS)를 생성하여 박테리아의 세포막을 파괴시키고 내부를 손상시켜 박테리아의 사멸을 유도할 수 있다.
상기 박테리아 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 박테리아 세균은 P. aeruginosa, MR S. aureus, ESBL E. coli, E. coli O157:H7, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 치환기는 치환되지 않는 모그룹(mother group)에서 하나 이상의 수소가 다른 원자나 작용기를 교환됨에 의하여 유도된다. 다르게 기재하지 않으면, 어떠한 작용기가 "치환된"것으로 여겨질 때, 그것은 상기 작용기가 탄소수 1 내지 40의 알킬기, 탄소수 2 내지 40의 알케닐기, 탄소수 2 내지 40의 알키닐기, 탄소수 3 내지 40의 시클로알킬기, 탄소수 3 내지 40의 시클로알케닐기, 탄소수 7 내지 40의 아릴기에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환됨을 의미한다. 작용기가 "선택적으로 치환된다"고 기재되는 경우에, 상기 작용기가 상술한 치환기로 치환될 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "탄소수 a 내지 b"의 a 및 b는 특정 작용기(group)의 탄소수를 의미한다. 즉, 상기 작용기는 a 부터 b까지의 탄소원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, "탄소수 1 내지 4의 알킬렌기"는 1 내지 4의 탄소를 가지는 알킬렌기, 즉, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -(CH3)2C-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH(CH3)- and -(CH3)2C-를 의미한다.
본 명세서에서, 본 명세서에서, "알킬"이라는 용어는 분지된 또는 분지되지 않은 지방족 탄화수소를 의미한다. 일 구현예에서 알킬기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 알킬기는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 헥실기, 시클로프로필기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기 등을 포함하나 반드시 이들로 한정되지 않으며, 이들 각각은 선택적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 일 구현예에서 알킬기는 1 내지 6의 탄소원자를 가질 수 있다. 예를 들어, 탄소수 1 내지 6의 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 펜틸, 3-펜틸, 헥실 등일 수 있으나 반드시 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서, "알케닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 분지형 또는 비분지형 탄화수소를 의미한다. 알케닐기의 비제한적인 예로는 비닐, 알릴, 부테닐, 이소프로페닐, 또는 이소부테닐 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "알키닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 갖는 분지형 또는 비분지형 탄화수소를 말한다. 알키닐기의 비제한적인 예로는 에티닐, 부티닐, 이소부티닐, 이소프로피닐 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "시클로알킬"이라는 용어는 1가 포화 탄화수소 모노시클릭을 의미한다. 시클로알킬기의 비제한적인 예로는 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "헤테로시클로알킬"이라는 용어는 N, O, Si, P 및 S 중에서 선택된 적어도 하나의 헤테로 원자를 고리-형성 원자로서 포함한 1가 모노시클릭을 의미한다. 헤테로시클로알킬기의 비제한적인 예로는 1,2,3,4-옥사트리아졸리디닐기(1,2,3,4-oxatriazolidinyl), 테트라히드로퓨라닐기(tetrahydrofuranyl), 테트라히드로티오페닐기 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "시클로알케닐"이라는 용어는 1가 모노시클릭으로서, 고리 내에 적어도 하나의 이중 결합을 가지거나, 방향족성(aromaticity)을 갖지 않는 것을 의미한다. 시클로알케닐기의 비제한적인 예로는 시클로펜테닐기, 시클로헥세닐기, 시클로헵테닐기 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "헤테로시클로알케닐"이라는 용어는 N, O, Si, P 및 S 중에서 선택된 적어도 하나의 헤테로 원자를 고리-형성 원자로서 포함한 1가 모노시클릭으로서, 고리 내에 적어도 하나의 이중결합을 갖는 것을 의미한다. 헤테로시클로알케닐기의 비제한적인 예로는, 4,5-디히드로-1,2,3,4-옥사트리아졸일기, 2,3-디히드로퓨라닐기, 2,3-디히드로티오페닐기 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "아릴"라는 용어는 고리 골격이 오직 탄소만을 포함하는 방향족 고리, 고리 시스템(즉, 2개의 인접하는 탄소 원자들을 공유하는 2 이상의 융합된(fused) 고리), 또는 복수의 방향족 고리가 단일결합, -O-, -S-, -C(=O)-, -S(=O)2-, -Si(Ra)(Rb)-(Ra 및 Rb는 서로 독립적으로 탄소수 1 내지 10의 알킬기), 할로겐으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 -C(=O)-NH-에 의하여 서로 연결된 고리를 의미한다. 아릴기가 고리 시스템이면, 상기 시스템에서 각각의 고리는 방향족이다. 예를 들어, 아릴기는 페닐기, 비페닐기, 나프틸기, 페날트레닐기(phenanthrenyl), 나프타세닐기(naphthacenyl) 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 아릴기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
본 명세서에서, "헤테로아릴"이라는 용어는 N, O, P 또는 S 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리원자가 탄소인 모노시클릭(monocyclic) 또는 바이시클릭(bicyclic) 유기 화합물을 의미한다. 상기 헤테로아릴기는 예를 들어 1-5개의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 5-10 고리 멤버(ring member)를 포함할 수 있다. 상기 S 또는 N은 산화되어 여러가지 산화 상태를 가질 수 있다.
"헤테로아릴"의 비제한적인 예로는, 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴기, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 이소티아졸-3-일, 이소티아졸-4-일, 이소티아졸-5-일, 옥사졸-2-일, 옥사졸-4-일, 옥사졸-5-일, 이소옥사졸-3-일, 이소옥사졸-4-일, 이소옥사졸-5-일, 1,2,4-트리아졸-3-일, 1,2,4-트리아졸-5-일, 1,2,3-트리아졸-4-일, 1,2,3-트리아졸-5-일, 테트라졸릴, 피리드-2-일, 피리드-3-일, 2-피라진-2일, 피라진-4-일, 피라진-5-일, 2- 피리미딘-2-일, 4- 피리미딘-2-일, 또는 5-피리미딘-2-일 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "알킬렌"이라는 용어는 -CnH2n- 알케인의 양단의 탄소원자에서 수소원자가 하나씩 빠진 형태를 의미한다. 일 구현예에서 알킬렌기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 알킬렌기는 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 이소프로필렌기, 부틸렌기, 이소부틸렌기, tert-부틸렌기, 펜틸렌기, 헥실렌기, 시클로프로필렌기, 시클로펜틸렌기, 시클로헥실렌기, 시클로헵틸렌기 등을 포함하나 반드시 이들로 한정되지 않으며, 이들 각각은 선택적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 일 구현예에서 알킬렌기는 1 내지 6의 탄소원자를 가질 수 있다. 예를 들어, 탄소수 1 내지 6의 알킬렌기는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 이소프로필렌, 부틸렌, 이소-부틸렌, sec-부틸렌, 펜틸렌, 3-펜틸렌, 헥실렌 등일 수 있으나 반드시 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서, "알콕시"라는 용어는 각각 산소 원자에 결합된 알킬 또는 아릴을 의미한다.
본 명세서에서, "방향족 고리기"라는 용어는 방향족성을 갖고있는 탄화 수소를 의미한다. 방향족 고리기는 전술한 아릴기 및 헤테로아릴기를 포함하는 광의의 개념으로 사용된다.
본 명세서에서, "히드록시기"는 -OH이다.
이하 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 일 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
하기 합성예 및 분석예에 사용된 N, N-디메틸포름아미드(DMF), n-펜탄올, 디메틸설폭시드(DMSO), 탄산칼륨(potassium carbonate), 1,8-디아자바이시클로-[5,4,0]운데-7-센(1,8-diazabicyclo-[5,4,0]undec-7-ene; DBU), 아세트산아연(zinc acetate), 3-니트로프탈로니트릴, 3-(디메틸아미노)페놀, 4-(브로모메틸)페닐보론산, 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트(2,7-dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA), 메틸렌블루(MB), 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘(TEMP), 크레모포 EL(CEL), 히드로에티딘(hydroethidine), ctDNA, 및 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(MTT)는 Sigma-Aldrich Korea로부터 구입하였다. 하기 화학식 A에서 R이 PcO4인 경우에는 J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10880-10886에, R이 PcS4인 경우에는 Chem. -Eur. J. 2015, 21, 3310-3317에, 및 R이 PcC4인 경우에는 ACS Nano 2019, 13, 6702-6710에 기재된 방법에 따라 각각 합성되었다.
<화학식 A>
Figure 112020001233825-pat00009
R= PcO4
Figure 112020001233825-pat00010
R= PcS4
Figure 112020001233825-pat00011
R= PcC4
Figure 112020001233825-pat00012
흡수스펙트럼을 Evolution 201 UV/VIS 분광기(ThermoFisher Scientific사)로 기록하였다. 형광방출스펙트럼(Fluorescence emission spectra)을 FS-2 분광 광도계(spectrophotometer)(Scinco사)로 얻었다. 1H NMR 스펙트럼을 Bruker AM 300 MHz로 측정하였다. 고해상도의 질량 스펙트럼(High-resolution mass spectra; HRMS)을 전자분무 이온화(FAB, EI) JMS 700 (JEOL; Daegu Center of KBSI)) 또는 Exactive Plus Orbitrap (Thermo Fisher Scientific사)로 고속원자충격을 이용하여 측정하였다. 전자상자성 공명(Electron paramagnetic resonance; EPR)을 EMX-plus(Bruker; Western Seoul Center of KBSI)로 얻었다. 나노세컨드(nanosecond) 흡수(TA) 스펙트럼을 Q-전환(swiched) Nd:YAG 레이저(Continuum, Surelite II-10)에 의해 펌핑된 광학 파라메트릭 발진기 시스템(optical parametric oscillator system, Continuum, Surelite OPO)을 이용하여 얻었고 신호들을 500 MHz 디지털 저장 오실로스코프(Lecroy, WaveRunner 6050A)로 기록하였다. TEM 이미지는 JEM2100F (JEOL) 또는 JEM1011 (JEOL) 전자현미경으로 측정하였다. Cryo-TEM 이미지를 CryoTecnai F20 G2(FEI; Korea Institute of Science and Technology, 200 kV)를 이용하여 기록하였다
합성예 1: PcN4 화합물
상기 화학식 A에서 R이 PcN4인 화합물을 다음과 같이 합성하였다.
DMSO (용매, 30 mL) 중 3-니트로프탈로니트릴 (2.61g, 15 mmol), 3-(디메틸 아미노)페놀 (2.06g, 15 mmol), 및 무수 K2CO3 (4.14g, 30mmol)의 혼합물을 질소 분위기 하에 72 시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응혼합물을 물 (150 mL)에 붓고 3 시간 동안 정치시켰다. 생성된 갈색 고체를 여과하고 물로 세척한 다음, 진공에서 건조시켰다. 연갈색 고체의 결과물인 3-[3-(디메틸아미노)페녹시]프탈로니트릴을 수득하였다 (2.56 g, 65 % 수율, 반응스킴 1).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 7.84 - 7.74 (m, 2H), 7.29 - 7.20 (m, 2H), 6.67 - 6.39 (m, 3H), 2.90 (s, 6H). HRMS (EI): m/z Calcd for C16H13N3O, [M]+ 263.1059, found 263.1059.
<반응스킴 1>
Figure 112020001233825-pat00013
다음으로, n- 펜탄올 (40 mL)에서 3-[3-(디메틸아미노)페녹시]프탈로니트릴 (1 g, 3.8 mmol)을 질소 분위기 하에서 90 ℃, 30 분동안 교반한 다음, 아세트산아연 (0.7 g, 3.8 mmol) 및 1,8- 디아자비시클로-[5.4.0]운덱-7-엔 (DBU) (2 mL, 13.4 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 140 ℃에서 48 시간 동안 교반하였다 (환류). 상기 교반한 혼합물을 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 물 (200 mL)에 붓고 3 시간 동안 정치시켰다. 생성된 녹색 고체를 여과하고 물 및 메탄올로 세척한 후 진공건조시켰다. 이어서, 조 생성물을 먼저 용리제로서 CH2Cl2 및 에틸 아세테이트를 사용하는 실리카겔컬럼 크로마토그래피로 정제하여 녹색 혼합물을 수득하였다. 상기 혼합물을 감압 하에서 농축하고 용리액으로서 DMF를 사용하여 Bio-Beads S-X3 컬럼에서 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 정제하였다. 상기 조 생성물을 CHCl3과 헥산의 혼합물로부터 재결정화하여 추가로 정제하여 녹색 고체인 상기 화학식 A에서 R이 PcN4인 화합물을 수득하였다(1.275 g, 30% 수율, 반응스킴 2).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.31 - 8.72 (m, 4H), 8.27 - 8.09 (m, 4H), 7.98 - 7.75 (m, 4H), 7.43 - 7.03 (m, 8H), 6.60 - 6.50 (m, 8H), 3.03 - 2.80 (m, 24H). HRMS (FAB): m/z Calcd for C64H52N12O4Zn, [M+H]+ 1117.3599, found 1117.3600.
<반응스킴 2>
Figure 112020001233825-pat00014
합성예 2: PcN4 -BA 화합물
화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물을 다음과 같이 합성하였다.
THF (용매, 무수, 50 mL) 중 PcN4 (200 mg, 0.179 mmol) 및 4-(브로모메틸)페닐보론산 (306 mg, 1.432 mmol)을 질소 분위기 하에서 온도 (70-80℃)에서 48 시간 동안(환류) 교반하였다. 상기 반응 후, 둥근 바닥 플라스크에서 침전이 발생하고, (PcN4, PcN4-BA 함유) 녹색 용매를 유리 피펫으로 제거하고 냉각시켰다. 이후, THF (100-150 mL)를 상기 생성된 혼합물(침전물)에 붓고, 이어서 THF(막 여과, 2 회)로 여과하였다. 이어서, 여과된 (PcN4 및 PcN4-BA를 함유) 녹색 고형물을 MeOH (4-5 mL, 초음파 처리)에 용해시키고, CHCl3를 첨가하였다(200-300 mL). 상기 혼합물을 몇 시간 동안 방치하고, 녹색 고체를 재결정화시켰다. 상기 녹색 고체를 여과하고 CHCl3로 세척한 다음 진공에서 건조시켰다(110mg, 31 % 수율, 반응스킴 3).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.37 - 8.64 (m, 4H), 8.35 - 8.31 (m, 4H), 8.13 - 8.02 (m, 4H), 8.00 - 7.83 (m, 8H), 7.73 - 7.54 (m, 16H), 7.38 - 7.30 (m, 4H), 7.12 - 7.07 (m, 4H) 5.13 - 4.93 (m, 8H), 3.74 - 3.57 (m, 24H). HRMS (ESI): m/z Calcd for C92H84B4N12O12Zn[M-4Br]4 + 414.4002, found 414.4007.
<반응스킴 3>
Figure 112020001233825-pat00015
실시예 1: PcN4 -BA 함유 조성물
합성예 2에 의해 합성한 화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물을 N, N-디메틸포름아미드(DMF)에서 1 mM 농도로 저장액을 준비하였다. 이후, 상기 저장액의 100 μL을 실온에서 물 10 mL에 적하시켰고 300 rpm에서 2시간 동안 교반하여 도 3에서 보이는 바와 같은 PcN4-BA 함유 자기조립 나노닷(nanodot) 형태의 구조체 조성물을 얻었다.
비교예 1: PcN4 함유 조성물
합성예 1에 의해 합성한 상기 화학식 A에서 R이 PcN4인 화합물을 N, N-디메틸포름아미드(DMF)에서 1 mM 농도로 저장액을 준비하였다. 이후, 상기 저장액의 100 μL을 실온에서 물 10 mL에 적하시켰고 300 rpm에서 2시간 동안 교반한 PcN4 함유 조성물을 얻었다.
비교예 2: PcO4 함유 조성물
합성예 1에 의해 합성한 상기 화학식 A에서 R이 PcN4인 화합물 대신 R이 PcO4인 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 PcO4 함유 조성물을 얻었다.
비교예 3: PcS4 함유 조성물
합성예 1에 의해 합성한 상기 화학식 A에서 R이 PcN4인 화합물 대신 R이 PcS4인 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 PcS4 함유 조성물을 얻었다.
비교예 4: PcC4 함유 조성물
합성예 1에 의해 합성한 상기 화학식 A에서 R이 PcN4인 화합물 대신 R이 PcC4인 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 PcC4 함유 조성물을 얻었다.
분석예 1: 몰폴로지 분석 - TEM 이미지 분석
실시예 1에 의해 얻은 조성물에 함유된 자기조립 나노닷 형태의 구조체에 대하여 TEM 이미지 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 실시예 1에 의해 얻은 자기조립 나노닷 형태의 구조체는 약 40-100 nm 크기를 갖는 균일한 구 형상임을 확인할 수 있다.
분석예 2: DMF: H 2 O의 혼합비에 따른 전자 구조 변화 관찰 - 흡수 및 형광방출 스펙트럼 등
(1) 흡수 및 방출 스펙트럼
합성예 2의 화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물을 10 μM 농도로 N, N-디메틸포름아미드(DMF) 및 물 용매에 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, 및 0:10의 혼합비로 각각 용해시켜 정상 상태(steady-state)에서의 흡수 및 방출 스펙트럼 분석실험을 수행하였다. 그 결과를 도 4(a), (b)에 나타내었다.
도 4(a)를 참조하면, 흡수 스펙트럼에서 DMF 용매에만 용해시킨 상기 합성예 2의 화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물은 예리하고 강렬한 흡수 특징을 나타내나, H2O 분율이 증가함에 따라 흡광 계수가 뚜렷하게 감소하고 800 nm 파장을 초과하는 넓은 대역의 흡수 특징을 나타내었다. 도 4(b)를 참조하면, 형광방출 스펙트럼에서도 상기 흡수 스펙트럼 특성과 함께 H2O 분율이 증가함에 따라 형광 방출이 약해짐을 나타내었다.
이로부터, 합성예 2의 화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물은 극성 조건 하에 응집에 의해 상당한 전자 구조 변화를 겪었음을 확인할 수 있다.
(2) 나노세컨드 (nanosecond) 흡수(TA) 스펙트럼
합성예 2의 화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물을 10 μM 농도로 N, N-디메틸포름아미드(DMF) 및 물 용매에 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, 및 0:10의 혼합비로 각각 용해시켜 680 nm 파장의 여기 광에서 정규화된 붕괴 프로파일을 나노세컨드 흡수 스펙트럼 분석을 통해 실험하였다. 그 결과를 도 4(c), (d)에 나타내었다.
도 4(c), (d)를 참조하면, 나노세컨드 흡수 스펙트럼에서 상기 합성예 2의 화학식 4로 표시되는 PcN4-BA 화합물에 대해 H2O 분율이 증가함에 따라 나노세컨드 흡수 스펙트럼 신호의 붕괴가 빨라졌다. 이로부터, 삼중항 상태의 수명이 감소되며 응집체에서 강한 분자간 상호 작용에 의해 최저 삼중항 여기상태 및 단일항 기저상태 사이의 에너지 갭의 감소 및 항간 교차 (ISC)의 향상이 비방사성 붕괴 과정을 자극한다는 것을 알 수 있다.
분석예 3: ROS 및 O 2 ·- (superoxide anion) 검출 - 형광방출 스펙트럼
(1) ROS 검출 분석 1
실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 대한 ROS 검출을 모니터하기 위해 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트(2,7-dichlorofluorescin diacetate; DCF)를 프로브로 이용하여 형광방출 스펙트럼 분석실험을 수행하였다. 그 결과를 도 5(a)에 나타내었다.
상기 형광방출 스펙트럼 분석실험을 위하여 물에 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트 10 μM과 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물 및 비교예 1~4에 의해 얻은 화학식 A에서 R이 PcN4, PcO4, PcS4, 및 PcC4 함유 조성물을 각각 용해한 샘플 10 μM, 및 물에 메틸렌블루만을 용해한 샘플을 이용하였다.
상기 샘플들에 대하여 500 W 할로겐 램프 및 냉각용 물탱크로 구성된 광원에 의해 3분 동안 조사하였다. 상기 광원에 의한 조사 후에 상기 샘플들에 대하여 504 nm에서 여기되고 510-900 nm에서 측정된 형광 스펙트럼을 FS-2 분광 광도계를 이용하여 기록하였다.
도 5(a)를 참조하면, 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물을 비교예 1~4에 의해 얻은 화학식 A에서 R이 PcN4, PcO4, PcS4, PcC4 함유 조성물 및 메틸렌블루와 비교할 때, 522 nm 형광강도에서 우수한 ROS 검출을 보였다. 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물은 메틸렌블루와 비교할 때, 약 13배 높은 우수한 ROS 검출을 보였다.
(2) O 2 ·- (superoxide anion) 검출 분석 2
실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 대한 O2 ·-(superoxide anion) 검출을 모니터하기 위해 히드로에티딘을 프로브로 이용하여 형광방출 스펙트럼 분석실험을 수행하였다. 그 결과를 도 5(b)에 나타내었다.
상기 형광방출 스펙트럼 분석실험을 위하여 다음과 같이 준비한 샘플을 이용하였다.
ctDNA로부터 유래한 5 mg DNA 나트륨염을 물에 12시간 용해하여 250 ㎍/mL DNA 용액을 준비하였다. 이후, 상기 준비된 DNA 용액에 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물 10 μM, 메틸렌블루 10 μM, 및 히드로에티딘 50 μM을 용해한 샘플을 준비하였다. 히드로에티딘만을 함유하는 DNA 용액을 대조군 샘플(control)로 이용하였다.
상기 샘플들에 대하여 500 W 할로겐 램프 및 냉각용 물탱크로 구성된 광원에 의해 3분 동안 조사하였다. 상기 광원에 의한 조사 후에 상기 샘플들에 대하여 510 nm에서 여기되고 520-900 nm에서 측정된 형광 스펙트럼을 FS-2 분광 광도계를 이용하여 기록하였다.
도 5(b)를 참조하면, 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물은 대조군 샘플과 비교할 때, 570 nm 형광강도에서 우수한 O2 ·-(superoxide anion) 검출을 보였다.
분석예 4: 1 O 2 ( singlet oxygen) 검출 - EPR 분석
실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 대한 1O2 (singlet oxygen) 검출을 모니터하기 위해 스핀-트랩(spin-trap)으로 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘을 이용하여 전자상자성 공명(Electron paramagnetic resonance; EPR) 분석실험을 수행하였다. 그 결과를 도 5(c)에 나타내었다.
상기 EPR 분석실험을 위하여 300 mM의 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 수용액 20 uL에 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물 또는 메틸렌블루를 각각 0.2 mM 농도로 혼합한 100 uL 샘플을 준비하였다. 2,2,6,6- 테트라메틸피페리딘만을 함유하는 수용액을 대조군 샘플(control)로 이용하였다. 상기 샘플들을 EPR 분광기의 캐비티(cavity)에 넣고 0-10분 동안 655 nm, 0.4 W/cm2 로 직접 레이저를 조사하였다.
도 5(c)를 참조하면, 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 대하여 1O2 (singlet oxygen)를 검출하였다.
분석예 5: 광역학적 항박테리아 효능 1 - 플레이트 사진 등
실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 대한 광역학적 항박테리아 효능을 측정하기 위하여 플레이트 사진 및 살아있는 세균의 수(CFUs/mL)를 분석하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 각각 나타내었다.
상기 플레이트 사진 분석을 위하여 ESBL E. coli (그람 음성균, ATCC BAA-198) 및 MR S. aureus (그람 양성균, CCRAM 3696)을 사용하였다.
박테리아의 각 균주를 줄무늬로 12 시간 동안 플레이트에서 성장시켜 단일 집락(colony)을 수득하였다. 각각의 박테리아 균주의 한천 플레이트로부터 분리된 집락을 광학밀도(OD600)가 1에 도달할 때까지 37℃에서 4 mL의 배지 배양 (Luria-Bertani, LB Broth)에서 수 시간 동안 성장시켰다. 이후, 각각의 배양액을 5000 rpm에서 원심분리하였다. 상기 배양액으로부터 상등액을 제거하고 침전물을 PBS로 2회 세척한 다음, 1 mL PBS를 첨가하여 박테리아 함유 저장액에 대하여 사진을 찍었다 (도 8의 왼쪽에서 첫번째 플레이트, Control).
실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물 및 메틸렌블루에 대하여 50 nM 농도를 사용하여 E. coli 경우 8.0 x 107 CFU/mL 및 S. aureus 경우 1.0 x 108 CFU/mL의 농도로 세균 용액을 처리하였다 (원액으로부터 10배 희석됨). 이어서, PcN4-BA 함유 조성물 또는 메틸렌블루와 박테리아 용액의 혼합물을 37℃에서 회전시키면서 2 시간 동안 배양하여 사진을 찍었다 (도 8의 왼쪽에서 두번째 플레이트, PcN4-BA 함유 조성물과 박테리아 용액 혼합물의 배양된 플레이트, PcN4-BA).
배양 후, 200 μL의 PcN4-BA 함유 조성물 또는 메틸렌블루와 박테리아 용액의 혼합물에 대하여 10분 동안 655 nm 레이저 (0.4 W/cm2)를 조사하였다. 조사된 혼합물 200 ㎕를 PBS (phosphate buffer saline)로 10배 희석하고, 혼합물을 표면에 퍼지는 한천 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하여 사진을 찍었다 (도 8의 왼쪽에서 세번째 및 네번째 플레이트, PcN4-BA + Light 및 MB + Light).
도 6을 참조하면, 레이저 조사된 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물이 레이저 조사되기 전과 비교하여 ESBL E. coli (ATCC BAA-198) 및 MR S. aureus (CCRAM 3696) 세균의 갯수가 훨씬 적게 보였다. 이와 비교하여, 동일한 조건 하에 레이저 조사된 메틸렌 블루는 레이저 조사하기 전과 비교할 때 ESBL E. coli (ATCC BAA-198) 및 MR S. aureus (CCRAM 3696) 세균의 갯수에 차이가 없어 보였다.
또한 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물과 비교예 1에 의해 얻은
PcN4 함유 조성물의 4급 암모늄염(PcN4-M)에 대하여 MR S. aureus (그람 양성균, CCRAM 3696)과 각각 혼합 후 배양하고 레이저 조사할 때 살아있는 세균의 수를 Miles 및 Misra 플레이트법에 의해 결정하여 분석하였다. 이 때, 비교예 1에 의해 얻은 PcN4 함유 조성물의 4급 암모늄염(PcN4-M)은 플레이트 사진 분석을 위한 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물 샘플과 동일한 방법으로 샘플을 수득하였다.
도 7을 참조하면, 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물과 비교예 1에 의해 얻은 PcN4 함유 조성물의 4급 암모늄염(PcN4-M)의 농도가 증가함에 따라, 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물의 살아있는 세균의 수가 비교예 1에 의해 얻은 PcN4 함유 조성물의 4급 암모늄염(PcN4-M)과 비교하여 현저하게 감소됨을 확인할 수 있다.
분석예 6: 광역학적 항박테리아 효능 2 - Cryo TEM 이미지 분석
실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 대한 광역학적 항박테리아 효능을 측정하기 위하여 Cryo TEM 이미지 분석을 하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
Cryo TEM 이미지 분석을 위하여 ESBL E. coli (그람 음성균, ATCC BAA-198)을 줄무늬로 12 시간 동안 플레이트에서 성장시켜 단일 집락(colony)을 수득하였다. 각 박테리아 균주의 한천 플레이트로부터 단리된 집락을 OD600이 1에 도달할 때까지 37℃, 4 mL LB 브로쓰에서 수 시간 동안 성장시킨 후, 배양물을 5000 rpm에서 3분 동안 3회 원심분리하였다. 배양 상청액을 제거하고 침전물을 PBS로 3회 세척하였다. 각각의 박테리아 용액을 37℃에서 2 시간 동안 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물(500 nM)과 배양하였다. 조사된 샘플에 대하여, 1000 μL의 혼합물에 10분 동안 레이저 (655 nm, 0.4 W/cm2)를 조사하였다. 이어서 혼합물을 원심분리하고 상청액을 버렸다.
후고정(postfixation)을 위해, 2% 파라포름알데히드를 침전된 세포에 첨가하고, 이를 4 ℃에서 밤새 고정시켰다. 이어서, 박테리아 셀을 2 % 수성 OsO4 (0.1 M PBS, pH 7.4)에 현탁시키고 0.1 M PBS에서 5분 동안 3 회 세척하고, 상이한 농도의 에탄올 (50 %, 70 %, 95 %)에서 각각 2 회 그리고 15 분 동안 프로필렌 옥사이드에서 2회 탈수시켰다. 상기 샘플들을 밤새 프로필렌옥사이드/Epon 수지에 넣고 침투를 위해 1-2 시간 동안 새로운 100 % Epon 수지에 보관하였다. 상기 샘플들을 BEEM 캡슐에 60℃에서 12시간 이상 동안 매립시키고 중합시켰다. 그런 다음, 두꺼운 부분(1 미크론)을 스캔하여 샘플 영역을 찾은 다음 Leica Ultracut (Leica사)에서 초박형 부분(~ 70nm)을 얻어 구리 그리드(grid) 위에 놓았다. 상기 구리 그리드에 샘플들을 5 분 동안 우라닐 아세테이트(uranyl aceate)로 그리고 2 분 동안 납 시트레이트(lead citrate)로 전기염색하였다. 상기 샘플들에 대하여 cryo-TEM (FEI; CryoTecnai F20, 200 kV) 이미지로 관찰하였다.
도 8을 참조하면, 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물의 레이저 조사하지 않은 샘플(PcNa-BA)과 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 레이저 조사한 샘플(PcNA-BA+ Laser) 모두 박테리아 세균 표면에 부착됨(검은색 화살표가 PcN4-BA 입자를 나타냄)을 확인할 수 있다. 이 중에서, 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물에 레이저 조사한 샘플(PcNA-BA + Laser)은 박테리아 세포막을 심하게 깨뜨렸음을 확인할 수 있다.
이는 표면에 양전하를 갖는 실시예 1에 의해 얻은 PcN4-BA 함유 조성물이 음전하를 갖는 박테리아 세포막에 부착함에 기인한 것으로 여겨진다.

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물:
    <화학식 3>
    Figure 112021105780648-pat00019

    상기 화학식 3에서,
    CY1, CY2, CY3, CY4는 서로 독립적으로 벤젠 고리, 나프탈렌 고리, 또는 이들 조합이고; 및
    X-는 F, Cl, Br, I의 음이온이다.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 화합물이 하기 화학식 4로 표시되는 화합물:
    <화학식 4>
    Figure 112021105780648-pat00020
  5. 제3항 또는 제4항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및
    용매, 산, 염기, 및 버퍼 용액 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 광감각제인 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 용매는 물, N, N-디메틸포름아미드, 또는 이들의 조합을 포함하는 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 약학 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 용매, 산, 염기, 또는 버퍼 용액에서 자기조립 나노구조체가 형성되는 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 자기조립 나노구조체는 자기조립 나노닷(nanodot) 형태인 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 자기조립 나노구조체의 평균직경(mean size)이 1 nm 내지 200 nm인 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 약학 조성물.
  11. 박테리아 세균을 제5항에 따른 조성물의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계;
    상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 박테리아 세균 내에 분포될 수 있는 시간을 허용하는 단계; 및
    상기 박테리아 세균을 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 의하여 흡수가능한 파장의 여기 광으로 조사하는 단계;를 포함하고,
    상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 반응성 산소종(ROS)를 생성함으로써 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 흡수가능한 파장은 500 내지 850 nm 파장인 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 630 nm 내지 690 nm의 파장의 광에서 최대 활성을 나타내는, 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 박테리아 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균을 포함하는 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 박테리아 세균은 P. aeruginosa, MR S. aureus, ESBL E. coli, E. coli O157:H7, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.




KR1020200001573A 2020-01-06 2020-01-06 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법 KR102357352B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200001573A KR102357352B1 (ko) 2020-01-06 2020-01-06 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200001573A KR102357352B1 (ko) 2020-01-06 2020-01-06 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210088302A KR20210088302A (ko) 2021-07-14
KR102357352B1 true KR102357352B1 (ko) 2022-01-28

Family

ID=76862927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200001573A KR102357352B1 (ko) 2020-01-06 2020-01-06 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102357352B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1164135A1 (en) 2000-06-15 2001-12-19 L. MOLTENI &amp; C. DEI FRATELLI ALITTI SOCIETA' DI ESERCIZIO SOCIETA' PER AZIONI Substituted metal-phthalocyanines, their preparation and the use thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1395907B1 (it) * 2009-07-30 2012-11-02 Molteni E C Dei Flii Alitti Societa Di Esercizio Spa L Derivato ftalocianinico costituito da una miscela di quattro isomeri

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1164135A1 (en) 2000-06-15 2001-12-19 L. MOLTENI &amp; C. DEI FRATELLI ALITTI SOCIETA' DI ESERCIZIO SOCIETA' PER AZIONI Substituted metal-phthalocyanines, their preparation and the use thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anal. Chem., Vol. 91, No. 6, pp. 3929-3935
Angew Chem Int Ed., Vol. 56, No. 35, pp. 10362-10366
J Biophotonics., Vol. 6, No. 9, pp. 733-742
J. Mater. Chem., Vol. 20, No. 32, pp. 6726-6733
Journal of Organometallic Chemistry, Vol. 866, pp. 105-111

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210088302A (ko) 2021-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220048923A1 (en) Luminogens for biological applications
Liang et al. Recent progress in the development of upconversion nanomaterials in bioimaging and disease treatment
Xu et al. Tuning the singlet-triplet energy gap: a unique approach to efficient photosensitizers with aggregation-induced emission (AIE) characteristics
Zhuang et al. Efficient photosensitizers with aggregation-induced emission characteristics for lysosome-and Gram-positive bacteria-targeted photodynamic therapy
EP1558616B2 (en) Meso-substituted porphyrins
US20210221799A1 (en) Aggregation-induced emission luminogens for photodynamic therapy
RU2682674C2 (ru) Координационные комплексы на основе металлов в качестве фотодинамических соединений и их применение
US9345769B2 (en) Metal-based thiophene photodynamic compounds and their use
CN108948060B (zh) 三苯胺基树枝配体取代硅酞菁及其制备方法和应用
CN114040962B (zh) 用于细胞器成像的发射红色荧光的化合物
US20200022955A1 (en) SPECIFICALLY meso-SUBSTITUTED PORPHYRINS AND CHLORINS FOR PHOTODYNAMIC THERAPY
Mantareva et al. Lutetium (III) acetate phthalocyanines for photodynamic therapy applications: Synthesis and photophysicochemical properties
CN114213419A (zh) 一种兼具荧光成像和i型光动力/光热杀伤癌细胞活性的荧光探针及其制备方法和应用
Ding et al. Molecular engineering to achieve AIE-active photosensitizers with NIR emission and rapid ROS generation efficiency
KR102345008B1 (ko) 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용하여 종양 세포를 비활성화 또는 사멸시키는 광역학 치료방법
Kong et al. Tunable two-photon absorption near-infrared materials containing different electron-donors and a π-bridge center with applications in bioimaging in live cells
KR102357352B1 (ko) 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 방법
Li et al. Synthesis of tetraphenylethene-based D–A conjugated molecules with near-infrared AIE features, and their application in photodynamic therapy
WO2021227206A1 (zh) 一种含二乙胺的吖嗪联肼类化合物及其制备方法与应用
WO2008119950A1 (en) Porphyrin compounds
Chen et al. Anti-stokes luminescent organic nanoparticles for frequency upconversion biomedical imaging
KR102218482B1 (ko) 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 이용하여 박테리아 세균을 비활성화 또는 사멸시키는 광역학 치료방법
CN110642865B (zh) 一种高电荷阳离子卟啉在制备pdt纳米光敏剂中的应用
CN113454067A (zh) 用于单线态氧生成与癌症消融的荧光探针
KR102572743B1 (ko) 화합물, 이를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 광감각제 및 종양 진단 또는 치료용 조성물, 및 상기 종양 진단 또는 치료용 조성물을 이용한 광역학 치료방법

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant