DE4203320A1 - Fermentationsverfahren zur gewinnung von aminosaeuren und dafuer geeigneter bakterienstamm - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäure durch Fermentation mit Aminosäure bildenden Bakterien in einem angemessenen Nährmedium und Isolation der gebildeten Produkte.

Aminosäuren werden umfänglich angewandt, insb. als Zusatz zu Nahrungs- und Futtermitteln, in Infusions­ lösungen sowie als Ausgangsmaterial in der pharmazeu­ tischen oder chemischen Industrie. Zu diesen Aminosäu­ ren gehören unter anderem L-Lysin, L-Isoleucin, L-Gluta­ minsäure, L-Glutamin, L-Arginin, L-Phenylalanin und L-Threonin. Diese Aminosäuren werden in industriellem Maßstabe unter Einsatz von Bakterien auf fermentativem Wege erzeugt. Die dabei angewandten Mikroor­ ganismen gehören vornehmlich zu den sogenannten coryneformen Glutamat bildenden Bakterien, deren Hauptvertreter Corynebacterium glutamicum mit den Subspezies glut. ssp. lactofermentum, bzw. glut. ssp. flavum ist.

Es gibt bereits vielfältige Versuche zur Produkti­ vitätssteigerung durch Optimierung der Verfahrens­ bedingungen. In diese Versuche werden auch die Mi­ kroorganismen selbst einbezogen, bei denen durch Aufklärung des zellinternen Syntheseweges und ge­ zielte Abwandelung bzw. Amplifikation des Genmate­ rials eine erhöhte Aminosäure-Bildungsrate ange­ strebt wird.

So kennt man z. B. für L-Lysin die Einführung einer Auxotrophie für bestimmte Nährstoffe, einer Resistenz gegenüber Lysinanaloga oder einer Sensitivität gegen­ über Analoga des Zentralmetabolismus sowie die Am­ plifikation eines Gens der Aminosäurebiosynthese mittels gentechnischer Methoden.

Für die Produktion von Glutaminsäure gibt es auch bereits Ansätze, den Export der zellintern gebilde­ ten Aminosäure durch Veränderung der Zellmembran- Permeabilität zu verbessern. So hat man versucht, die Wirtschaftlichkeit der Glutamatproduktion mittels Corynebacterium glutamicum durch Biotinmangel, Deter­ gensbehandlung, Mangel an essentiellen Fettsäuren (bei fettsäureauxotrophen Stämmen), Mangel an Gly­ cerin (bei glycerinauxotrophen Stämmen) bzw. Peni­ cillinbehandlung zu verbessern. Diese Versuche waren jedoch nur bei der Glutamatproduktion erfolgreich, während die Synthese anderer Aminosäuren auf diese Weise nicht verbessert werden konnte.

Zwar wurde bereits von S. Bröer und R. Krämer, Eur. J. Biochem. 202 (1991) 137-143 sowie H. Ebbighausen et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 31 (1989) 184- 190) die Kinetik der Ausschleusung von Lysin und Isoleucin aus dem Zellinnern in Abhängigkeit unter­ schiedlicher Parameter wie pH-Wert, Membranpotential und Konzentrationsgradient untersucht, jedoch ohne ausdrücklichen Bezug zur Wirtschaftlichkeit der Aminosäureproduktion.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren vorzusehen, mit dem gezielt und überschau­ bar eine Steigerung der Aminosäureproduktion erreicht werden kann.

Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bakterienstamm einsetzt, bei dem man durch chemische oder physikalische Mutation eine erhöhte Aktivität des Sekretionssystems erzeugt hat.

Ein solcher Stamm wird insbesondere aus einer Gruppe von Mutanten durch ein Sekretions-Screening-Verfahren ausgewählt, was speziell über die Messung des zeitlichen Verlaufs der zellinternen und -externen Aminosäure­ konzentration erfolgen kann.

Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß Stämme isoliert werden können, welche die im Zell­ innern gebildete Aminosäure mit erhöhten Raten durch die Zellwand ins Kulturmedium ausscheiden, wodurch eine wesentlich verbesserte Aminosäureproduktions­ rate erzielt werden kann. Dabei kommt einer erhöh­ ten Sekretionsaktivität eine der zellinternen Bil­ dungsrate vergleichbare Bedeutung zu.

Eine solche Steigerung der Sekretionsrate kann je­ doch, wie weiter gefunden wurde, nicht durch Zell- Membranpermeabilisierung oder Einflußnahme auf Sub­ strat- bzw. Metabolitgradienten überzeugend erreicht werden, vielmehr sind spezifische Carrierproteine in der Zellmembran als für den Exportvorgang verant­ wortlich anzunehmen, deren Konzentration und/oder Aktivität bzw. Spezifität nur durch Eingriff in die Zelle auf der DNA-Ebene verändert werden kann. Dies konnte insb. für die Ausschleusung von L-Glutamat, L-Isoleucin, L-Valin und L-Lysin gezeigt werden.

Es ist daher zur Verbesserung des Sekretionsvorgan­ ges für Aminosäuren zweckmäßig, aus einer Gruppe von durch chemische oder physikalische Mutagenese erzeugten Mutanten durch ein Screening-Verfahren Stämme mit besonders hoher Sekretionsrate auszuwäh­ len.

Die Prüfung auf erfolgte vorteilhafte Mutation kann direkt in wachsenden Kulturen, oder besonders vor­ teilhaft in einem Schnelltest in dichten Zellsus­ pensionen, wie von Hoischen und Krämer (Arch. Micro­ biol. 151 (1989) 342-7) beschrieben, durchgeführt werden. Dazu werden die Bakterien über Nacht in einem Komplexmedium oder aber auch Minimalmedium angezogen, und nach dem Waschen in einem geeigneten Puffer aufgenommen.

Aus der unter definierten Bedingungen gehaltenen Kultur (wobei üblicherweise keine zellinterne Nach­ lieferung erfolgen soll) werden dann in zeitlicher Folge Proben entnommen und Aminosäure-Konzentrations­ bestimmungen unterworfen. Dazu werden Kulturmedium und Zellen durch Silikonöl-Zentrifugation unter Zu­ gabe von Perchlorsäure zur Inaktivierung voneinander getrennt und die jeweils interessierende Aminosäure nach bekannten Methoden im Medium bzw. im durch Ul­ traschallbehandlung erhaltenen Zellextrakt gesondert bestimmt.

Zur Erfassung der wahren zellinternen Aminosäurekon­ zentrationen muß das Zellvolumen des benutzten Bak­ teriums bestimmt werden, was zum Beispiel nach Rottenberg (Methods Enzymol. LV (1979) 547-65) er­ reicht werden kann, indem zur Kultur vor der Tren­ nung durch Silikonöl [14-C]-Taurin (oder ein anderer die Zellwand nicht penetrierender Marker) zugegeben wird, sowie [3-H]₂O als Marker für das gesamte durch Wasser permeable Volumen. Nach der Silikonölzentri­ fugation kann dann das gesamte durch Wasser perme­ able Volumen der Probe sowie der inpermeable Volu­ menanteil derselben ermittelt werden. Durch Subtrak­ tion dieser beiden Werte ergibt sich das cytoplas­ matische Volumen der eingesetzten Bakterien. Mit dem so bestimmten cytoplasmatischen Volumen und der aus dem Zellsediment ermittelten Menge Aminosäure läßt sich deren wahre zellinterne Konzentration be­ rechnen.

Die zellinterne Konzentration sowie die Konzentra­ tion im Kulturüberstand der einzelnen Probenahme­ zeitpunkte werden dann in Abhängigkeit von den Pro­ benahmezeit aufgetragen und aus dem Kurvenverlauf die kinetischen Parameter K_M (Affinität des Export­ systems) und v_max (Maximalgeschwindigkeit des Ex­ portsystems) ermittelt.

Nach der geschilderten Methode lassen sich selbst­ verständlich auch die Abhängigkeit der Sekretions­ rate von Einflußgrößen wie pH-Wert und Membranpo­ tential ermitteln und so optimierte Stämme auffin­ den. Auf diese Weise können insb. Stämme aufgefun­ den werden, deren Aminosäure-Exportrate bis in saure Bereiche hinein relativ hoch bleibt.

Das erfindungsgemäß anzuwendende Screening-Verfahren liefert den zellinternen Konzentrationsverlauf in Abhängigkeit von der Zeit, wobei die Konzentration im Zeitpunkt "Null" ein Maß für die zellinterne Bil­ dungskapazität ist. Angestrebt werden Stämme mit möglichst steil abfallender Konzentrationskurve (im Vergleich zum Ausgangsstamm).

Der Verlauf der zellexternen Konzentration liefert auf alle Fälle eine erste Information über die wirt­ schaftliche Nützlichkeit eines Stammes, und sie ist wichtig als Korrekturmittel zur Erkennung von zell­ interner Nachbildung oder Verstoffwechselung, welch letztere die aus dem zellinternen Konzentrations­ verlauf resultierende Aussage verfälschen würden.

Ein spezieller Nutzen des wie vorstehend beschrie­ benen Screening-Verfahrens besteht darin, daß es auf diese Weise möglich ist, bei bereits vorhande­ nen Stämmen durch Messung des zellinternen und -ex­ ternen Aminosäurekonzentrationsverlaufs Stämme mit hervorragender Biosynthese zu ermitteln, bei denen durch Verbesserung der Sekretion der zellintern an­ gestauten Aminosäure eine weitere Optimierung der Wirtschaftlichkeit erreicht werden kann.

Die vorteilhafte Veränderung der Sekretionsaktivi­ tät wird vorzugsweise in Stämme, die zum Genus Corynebacterium glutamicum mit den Subspezies glut. ssp. lactofermentum und glut. ssp. flavum gehören, eingeführt. Als Beispiele für besonders geeignete Bakterien, die als coryneforme L-Glutamat bildende Bakterien bekannt sind, können genannt werden:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium glutamicum ATCC31833
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium lilium ATCC15990
Corynebacterium herculis ATCC13868
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240.

Die Produktion der Aminosäure mit solcherart herge­ stellten Mutanten erfolgt nach konventionellen fer­ mentativen Methoden, wie sie für andere Aminosäure produzierende Mutanten bereits bekannt sind. Das bedeutet, daß die im Aminosäureexport veränderten Mutanten in einem Medium, das Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Ionen, und ggfs. Aminosäuren, Vitamine usw. kultiviert werden. Bei­ spiele geeigneter Kohlenstoffquellen sind Glukose, Saccharose, Stärkehydrolysate und Molassen. Als Stickstoffquelle können Ammoniakgas, Ammoniakwasser, Ammoniumsalze oder andere Stickstoffe enthaltende Verbindungen benutzt werden. Die im Kulturmedium akkumulierte Aminosäure kann dann mit Standardme­ thoden isoliert werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann z. B. L-Lysin in beträchtlich verbessertem Maße produ­ ziert werden, wie nachfolgend an Hand von Beispie­ len gezeigt wird.

Beispiel 1 (1. Mutation)

Corynebacterium glutamicum DSM 5714 wurde mit N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine mu­ tagenisiert, und nach Verdünnen, auf BHI-Agar (Difco 0418-01-5) aufgebracht. Die Platten wurden bei 30°C 2 Tage inkubiert, und anschließend durch Stempeln auf vier verschiedene Minimalmedien übertragen. Medium 1 bestand pro Liter aus 5 g Ammoniumsulfat, 1 g Harnstoff, 1 g Kaliumdiphosphat, 3 g Dikalium­ phosphat, 0,25 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 10 mg Kalziumchlorid, 10 mg Eisensulfat-Heptahydrat, 10 mg Mangansulfat-Monohydrat, 0,1 mg Zinksulfat- Heptahydrat, 0,02 mg Kupfersulfat, 2 µg Nickelchlo­ rid-Hexyhydrat, 0,2 mg Biotin und 40 g Glukose-Mono­ hydrat enthielt. Medium 2 war identisch mit Medium 1, enthielt aber zusätzlich 300 mg/Liter L-Leucin. Medium 3 war identisch mit Medium 1, enthielt aber zusätzlich 300 mg/Liter L-Isoleucin. Medium 4 war identisch mit Medium 1, enthielt aber zusätzlich 300 mg/Liter L-Methionin. Die Platten wurden wieder inkubiert, und nach drei Tagen aminosäureauxotrophe Stämme zur weiteren Charakterisierung abgeimpft.

(2. Charakterisierung der Sekretionsaktivität)

Zur Bestimmung der Sekretionsaktivität wurden die erhal­ tenen Klone dann einzeln getestet. Dazu wurde mit dem jeweiligen Klon BHI Komplexmedium beimpft, das über Nacht bei 30°C als Flüssigkultur inkubiert wurde. Anschließend wurden die Zellen durch 5 minü­ tige Zentrifugation bei 4°C und 4000 UpM in der Kühl­ zentrifuge (J2-21M/E, Beckmann, München) geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem Tris-Puffer (50 mM TrisHCl, pH 7.5) der jeweils 10 mM NaCl und KCl war gewaschen, und zum Schluß in einem solchen Volumen resuspendiert, daß eine dichte Zellsuspen­ sion von etwa 40 mg Trockengewicht pro ml Puffer vorlag. Die Sekretion des zellinternen Lysins wurde initiiert, indem diese Zellsuspension zwölffach in auf 25°C vorgewärmten Tris-Puffer (50 mM TrisHCl, pH 7,5, 10 mM NaCl) verdünnt wurde. Sofort nach der Probenahme, sowie in Abständen von drei Minuten, über einen Gesamtzeitraum von 30 Minuten wurden Proben zur Silikonölzentrifugation entnommen. Dazu wurden 100 µl Aliquots entnommen. Diese wurden in ein 400 µl Mikrozentrifugenröhrchen (Beckmann Instru­ ments GmbH, München) gegeben, das bereits 30 µl 20%ige Perchlorsäure mit 65 µl darübergeschichtetem Silikonöl der Dichte 1,04 g/cm³ enthielt. Die Probe wurde danach sofort 1 Minute in der Microfuge E (Beckmann Instruments GmbH, München) bei 13750 UpM zentrifugiert. Anschließend wurden die Überstände zur Bestimmung des Lysins im Kulturfiltrat entnom­ men die bei -20°C bis zur Analyse aufbewahrt wurden.

Zur Bestimmung des zellinternen L-Lysins im Sediment wurden die Röhrchen in der Ölphase durchschnitten, umgedreht, und in 750 µl Zentrifugengefäße gesetzt. Durch 3 minütige Zentrifugation in der Biofuge A (Heraues Christ) GmbH, Osterode) wurde der Inhalt in das 750 µl Zentrifugengefäß quantitativ über­ führt. Nach Entfernen der leeren Spitze wurde das Gefäß zum vollständigen Aufschluß in das Brabson- Sonifier Ultraschallbad gestellt und dort 10 Minuten beschallt. Nach Zugabe von 25 µl 5 M KOH, 1 M Trie­ thanolamin HC1 zur Neutralisierung des Homogenats werden ausgefallenes KC10₄, Zelltrümer und Silikon­ öl durch 10 minütige Zentrifugation bei 4°C und 13000 UpM (Kühlzentrifuge 202MK, Sigma GmbH, Oste­ rode) abgetrennt. Die wäßrigen Phasen wurden ver­ einigt und ebenfalls bei -20°C bis zur Analyse auf­ bewahrt.

Zur Bestimmung des Zellvolumens wurden vor der Sili­ konölzentrifugation 500 µl Zellsuspension mit 20 µl Taurin (10 mM), 5 µl 14-C-Taurin (1 µCi) und 5 µl 3-H-H₂O (0,5 µCi) zugegeben und 2 Minuten unter gelegentlichem Schütteln bei 25°C inkubiert. Ali­ quots dieses Ansatzes wurden wie zuvor beschrieben durch Silikonölzentrifugation aufgetrennt, 20 µl des Überstands entnommen, mit 200 µl Wasser versetzt und die radioaktiven Zerfälle im Szintillationszäh­ ler (Rackbeta 1214, LKB Instruments GmbH, Gräfel­ fing) gemessen. Die Silikonölröhrchen wurde in der Ölschicht durchschnitten, das Sediment aufgearbei­ tet und aufgeschlossen wie oben beschrieben, und 650 µl des wäßrigen Überstands der Sedimentaufarbei­ tung mit 4 ml Szintillator gemischt und die radio­ aktiven Zerfälle bestimmt. Daraus wurde ein Wasser­ raum von 4,9 µl/mg Trockengewicht und ein Taurin­ raum von 3,0 µl/mg Trockengewicht bestimmt. Dies ergab ein cytolasmatisches Volumen von 1,9 µl/mg Trockengewicht der verwendeten Mutante.

L-Lysin wurde fluorometrisch als o-Phthaldehydderi­ vat nach automatischer Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldehydfertigreagenz (Pierce Europe B.V. Oud- Beÿerland, The Netherlands) und Trennung durch Chromatographie an Lichrospher, RP-18, 5 µm (Merck, Darmstadt) in einem Hochdruckflüssigkeitschromato­ graphen (HP 1090 M, Hewlett-Packard, Waldbronn) be­ stimmt. Für Trennung des L-Lysins von anderen Amino­ säuren wurde ein Standardprotokoll benutzt.

Aus dem Zellvolumen und den Lysinbestimmungen wurden die wahren zellinternen Lysininnenkonzentrationen bestimmt. Diese Innenkonzentrationen wurden gegenüber den verschiedenen Zeiten der Probenahme aufgetragen, ebenso die im externen akkumulierte Menge. Daraus wurde für den bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen hinterlegten Stamm DSM 6870 eine L-Lysinexportrate von 10 nmol/min und mg TG bestimmt, wogegen für den Ausgangsstamm eine Exportrate von maximal 7,5 nmol/min und mg TG bestimmt wurde (Ta­ belle 1).

(3. Produktion von L-Lysin durch den so erhaltenen neuen Stamm)

Der erhaltene Stamm wurde in einem Medium fermen­ tiert, das pro Liter 40 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Ka­ liumphosphat, 0,5 g Dikaliumphosphat, 0,30 g L-Leu­ cin, 0,25 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 10 mg Zink­ sulfat-Heptahydrat, 0,02 mg Kupfersulfat, 2 µg Nickelchlorid-Hexahydrat, 0,2 mg Biotin und 100 g Glukose-Monohydrat enthielt. Zusätzlich enthielt das Medium 20 g Kalk. Nach dem Beimpfen wurden die Kulturen bei 30°C auf dem Rotationsschüttler inku­ biert, und nach 72 Stunden Proben zu L-Lysinbestim­ mung entnommen. Die Konzentration des so gebildeten L-Lysins ist in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1: Ausscheidung von L-Lysin bei dem durch das beschriebene Verfahren erhaltenen Stamm DSM 6870.

Mit dem Corynebacterium glutamicum Stamm DSM 6870 wer­ den unter ähnlichen Bedingungen besonders hohe Lysin­ ausbeuten im Vergleich zur Verwendung bekannter Stäm­ me erzielt.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von Aminosäure durch Fermentation von Aminosäure bildenden Bakterien in einem angemessenen Nährmedium und Isolation der gebildeten Produkte, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bakterienstamm einsetzt, bei dem man durch chemische oder physikalische Mutation eine erhöhte Aktivität des Sekretionssystems erzeugt hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm aus einer Gruppe von Mu­ tanten durch ein Sekretions-Screening-Verfahren ausgewählt worden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß die Auswahl über die Messung des zeitlichen Verlaufs der zellinternen und -externen Aminosäure­ konzentration erfolgt ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm mit zusätzlich geringer pH- Abhängigkeit der Sekretionsaktivität verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß man zur Bildung von Lysin einen Stamm mit einer Sekretionsrate von < 10 µ Mol/min g Trocken­ gewicht bei pH < 7,5 verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß man einen zu den coryneformen Bakterien gehörenden Stamm verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man für die Herstellung eines Lysin erzeugenden, sekretorisch verbesserten Stammes den Corynebacterium glutamicum Stamm mit der Hinterlegungs-Nr. DSM 5714 verwendet.

8. Corynebacterium glutamicum Stamm als Lysin­ produzent zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Hinterlegungs-Nr. DSM 6870.