DE4137944C2

DE4137944C2 -

Info

Publication number: DE4137944C2
Application number: DE4137944A
Authority: DE
Inventors: Kuang-Pin Hsinchu Taiwan Cn Hsiung; Feng-Tsun Taipei Hsien Taiwan Cn Lee; Chung-Long Hsinchu Taiwan Cn Hsieh
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 1990-11-19
Filing date: 1991-11-18
Publication date: 1993-04-29
Also published as: DE4137944A1; US5122461A; JPH04311394A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Brenzkatechinverbindungen.

Die Brenzkatechinverbindung L-DOPA ist nützlich zur Behandlung der Parkinson-Krankheit. Andere Brenzkatechinverbindungen sind nützlich auf dem Gebiet der Photographie, bei Färbeverfahren und als chemische Reagenzien und Pharmazeutika.

Es ist bekannt, daß Monophenolverbindungen in Brenzkatechinverbindungen umgewandelt werden können über eine Reaktion, die durch Monophenolmonooxygenase (EC 1.14.18.1) (auch bekannt als Tyrosinase) katalysiert wird. Verschiedene Verfahren zur Herstellung dieser Brenzkatechinverbindungen verwenden Tyrosinasen, die aus Pflanzen, Tieren (W. C. Evans, Biochem. J. 31, 2155 (1937)) und einer Vielzahl von Mikroorganismen (US-Patent Nr. 3 6 71 397) extrahiert werden. Diese Verfahren führen jedoch zu geringen Ausbeuten an Brenzkatechinverbindungen. Die Hauptgründe für diese niedrige Ausbeute können erklärt werden, wenn man den folgenden Reaktionsweg betrachtet:

wobei

E=Monophenolmonooxygenase
MP=Monophenolverbindung
PC=Brenzkatechinverbindung
OAQ=Orthoanthrachinon
C_rd=Reduktionsmittel, reduzierte Form
C_ox=Reduktionsmittel, oxidierte Form

In der ersten Reaktion werden Monophenolverbindungen un ter Bildung von Brenzkatechinprodukten mit der katalytischen Wirkung von Monophenolmonooxygenase oxidiert. Jedoch werden die gebildeten Brenzkatechinprodukte weiter oxidiert unter der Ein wirkung von Sauerstoff und derselben Monooxygenase zu einem Orthoanthrachinon, das eine Reihe nachfolgender Reaktionen durchläuft, wobei schließlich Melanin gebildet wird. Die Gesamt ergebnisse sind niedrige Ausbeuten an Brenzkatechinprodukten und komplexe Mischungen unerwünschter Produkte. Sorgfältige Tren nungsverfahren sind notwendig, um die gewünschten Produkte zu reinigen.

Übliche Methoden, um die Oxidation von Brenzkatechin produkten weiter zu minimieren, schließen ein:

1. Die Verwendung von Vitamin C oder Sulfit als Reduktionsmittel, um Orthoanthrachinon wieder in die Brenzkatechinverbindung zu reduzieren (W. C. Evans, Biochem. J., 31: 2162-2170 (1937)).
2. Anfügen einer Schutzgruppe an geeigneter Stellung der Ausgangsmonophenolverbindung, um die Oxidationsrate des Brenzkatechinproduktes durch sterische Hinderung zu vermindern. Zum Beispiel werden, wenn Tyrosin als Ausgangsmonophenolverbindung verwendet wird, Formyl- oder Acetylgruppen verwendet, um die Tyrosinaminogruppe zu schützen (F. E. Semersky, US-PS 3 8 12 009 (1974)).

Obwohl diese Verfahren hilfreich sind für die Herstellung von Brenzkatechinverbindungen, sind sie komplex und kostenaufwendig. Effizientere Verfahren zur Herstellung von Brenzkatechinverbindungen sind erforderlich.

Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Verfahren.

Somit liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Brenzkatechinverbindungen, bei dem man Monophenolverbindungen mit Sauerstoff in Gegenwart von Monophenolmonooxygenase und Metallionen unter geeigneten Bedingungen umsetzt. Die Brenzkatechinprodukte werden stabilisiert durch Bildung von Komplexen zwischen den Brenzkatechinprodukten und den Metallionen. Durch das Verfahren gemäß der Erfindung wird die Ausbeute an Brenzkatechinprodukten erhöht und das Herstellungsverfahren vereinfacht. Das Verfahren vermindert somit die Kosten zur Herstellung von Brenzkatechinverbindungen.

Der Reaktionsmechanismus, der bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung vorliegt, wird in der folgenden Gleichung dargestellt:

Die Reaktionen A und C werden katalysiert durch Mono phenolmonooxygenase. Es wurde gefunden, daß das Brenzkatechin produkt der Reaktion A Spontan mit Metallionen, die in der Reak tionslösung vorhanden sind (zum Beispiel Fe²⁺ oder Fe³⁺), Kom plexe bildet (Reaktion B). Ohne an die Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Ausbeute an Brenzkatechinprodukten durch einen oder beide der folgenden Mechanismen erhöht. (1) Die Reaktion B konkurriert mit Reaktion C um die Brenzkatechinverbindung und hemmt dadurch Reaktion C, die zu unerwünschten Produkten führt. (2) Reaktion B verbessert auch die Effizienz von Reaktion A, indem das Produkt (PC) entfernt wird und das Gleichgewicht der Reaktion A zur Vor wärtsreaktion hin verschoben wird.

Bevorzugte Monophenolverbindungen, die bei der vorlie genden Erfindung verwendet werden, sind Phenol, N-Formyl-L-tyro sin, N-Acetyl-L-tyrosin, L-Tyrosinmethylester, L-Tyrosinethyl ester, N-Acetyl-L-tyrosinethylester und N-Methyl-L-p-tyrosin.

Andere Monophenolverbindungen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können mit Hilfe der folgenden Formeln beschrieben werden:

worin R Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine cyclische oder acyclische (C₁-C₆)Alkyl-, (C₂-C₆)Alkenyl- oder (C₂-C₆)Alkinylgruppe, beispielsweise eine Methyl-, Ethyl-, Cyclohexyl-, 3-Pentenyl- oder 2-Butinylgruppe, ein heterocyclisches Ringsystem, das 3 bis 10 Kohlenstoffatome und mindestens ein Glied aus der Gruppe, bestehend aus N-, O- oder S-Atomen enthält, beispielsweise ein Pyridin-, Pyrrolidin-, Piperidin-, Azol-, Oxazol-, Thiazol-, Furan- oder Chinolinrest; ferner Halogen, eine (C₁-C₆)Alkoxy-, Carboxygruppe und deren Salze oder eine (C₁- C₆)Alkoxycarbonyl-, Carbamoyl-, Mono- und Di-(C₁-C₆)alkylcarbamoyl-, Sulfamoyl-, Mono- und Di-(C₁-C₆)alkylamino-, (C₁- C₆)Acyl-, Ureido-, (C₁-C₆)Alkoxycarbonyl-, (C₁-C₆)Alkoxyimino-, (C₁-C₆)Alkylthio-, Arylthio-, (C₁-C₆)Alkylsulfinyl-, Arylsulfinyl-, (C₁-C₆)Alkylsulfonyl- oder Arylsulfonylgruppe sein kann; R′ kann eine Hydroxyl-, (C₁-C₆)Alkoxy-, (C₁-C₆)Alkylgruppe oder ein heterocyclisches Ringsystem, das 3 bis 10 Kohlenstoffatome und mindestens ein Glied aus der Gruppe, bestehend aus N-, O- oder S-Atomen, enthält, sein; R′′ kann Wasserstoff und ein cyclischer oder acyclischer (C₁-C₆)Alkylrest sein; und R′′′ kann Wasserstoff, ein cyclischer oder acyclischer (C₁-C₆)Alkyl-, (C₁- C₆)Acyl-, (C₁-C₆)Alkylsulfinyl-, Arylsulfinyl-, (C₁-C₆)Alkylsulfonyl- oder Arylsulfonylrest oder eine Aminoschutzgruppe sein, beispielsweise ein t-Butyl-, 1-Methyl-cyclohexyl-, Benzyl- oder Ethylaceto-acetylrest.

Das Enzym Monophenolmonooxygenase kann aus einer Vielzahl von Quellen einschließlich Pilzen, Kartoffeln, Kleie, Mehlwurm, Froschepidermis und Mikroorganismen hergestellt werden. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung muß das Enzym nicht intensiv gereinigt sein. Das Enzym kann hergestellt werden, indem die Enzymquelle in Ammoniumsulfat (20% Sättigung) homogenisiert wird, um das Enzym zu extrahieren. Der Enzymextrakt wird dann teilweise gereinigt, indem Ammoniumsulfat bis zu 70% Sättigung zugegeben wird, um die Monooxygenase auszufällen.

Intensivere Enzymreinigungen sind bekannt (G. K. Podila, Biochem. Biophys. Res. Commun. 141 : 697 (1986)). Hochgereinigte Enzympräparate können sich bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung als nützlich erweisen.

Im allgemeinen werden zwischen etwa 1U und etwa 10U Enzym (1 Einheit wandelt 1 µMol pro Stunde unter optimalen Bedingungen um) pro mg Monophenolausgangsmaterial zugegeben.

Das Monooxygenaseenzym erfordert die Gegenwart eines Reduktionsmittels, um die aktive, reduzierte Form des Enzyms zu erhalten. Vitamin C ist eines aus einer Anzahl von Reduktionsmitteln, die der Reaktionsmischung der vorliegenden Erfindung zugegeben werden können, um die aktive Form des Monooxygenaseenzyms aufrechtzuerhalten. Andere solche Reduktionsmittel schließen Derivate von Vitamin C, Sulfit und Thiosulfatsalze ein. Zusätzlich können diese Reduktionsmittel Orthoanthrachinone zurück in die entsprechenden Brenzkatechinverbindungen reduzieren und weiter die Ausbeute an Brenzkatechinverbindungen verbessern.

Die Metallionen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen Eisenionen, Fe⁺² oder Fe⁺³, und andere Metallionen, die mit Brenzkatechinverbindungen Komplexe bilden können. Solche Metallionen, die verwendet werden können, schließen Mn⁺², Ni⁺², Co⁺², Al⁺³ und Zn⁺² ein.

Die Menge an Metallion, die der Reaktionsmischung zugegeben wird, liegt im Bereich von 0,1 bis 2 Mol pro Mol erzeugter Brenzkatechinverbindung. Vorzugsweise beträgt die Menge an zugegebenem Metall 0,33 bis 1 Mol pro Mol erzeugter Brenzkatechinverbindung.

Es wurde gefunden, daß sich die Komplexe zwischen Brenzkatechinverbindungen und den Metallionen bilden, wenn der pH im Bereich von 4 bis 11, vorzugsweise 6 bis 10 ist. Somit wird die Reaktion der vorliegenden Erfindung in einer wäßrigen Pufferlösung durchgeführt, die geeignet ist, um einen solchen pH aufrechtzuerhalten. Geeignete Pufferlösungen schließen wäßrige Lösungen von Phosphat, Borat, Carbonat, Triethanolamin- HCl und 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol-HCl ein. Die Pufferkonzentration liegt allgemein zwischen 0,01 M und 0,2 M. Die Reaktionstemperatur liegt im Bereich von 0°C bis 60°C, vorzugsweise 4°C bis 50°C und am meisten bevorzugt zwischen 10°C und 45°C.

Der für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung erforderliche Sauerstoff wird geeigneterweise durch atmosphärischen Sauerstoff geliefert, obwohl Sauerstoffgas aus anderen Quellen verwendet werden kann. Der Sauerstoff kann in die Reaktionsmischung einfach durch heftiges Rühren oder Einperlen in die Reaktionsmischung gemischt werden.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann diskontinuierlich in einer Reihe von Reaktionsgefäßen oder in kontinuierlicher Weise durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das Enzym Monooxygenase kovalent an einen festen Träger wie Agarose oder Sepharose® (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) gebunden werden oder auf Membranen oder vernetzten Matrizen wie Polyacrylamid mit einer Anzahl bekannter Techniken (zum Beispiel Wykes, Nature, 230 : 187 (1970) und P. F. Leadlay, The Chemical Society Monograph for Teachers No. 32, 67 (1978)) immobilisiert werden. Die Monophenolverbindung kann dann über den das Enzym enthaltenden festen Träger in Gegenwart von Puffer, Metallionen, Reduktionsmitteln und Sauerstoff bei einer geeigneten Temperatur geleitet werden. Zusätzlich kann das Verfahren auch in einem mit Wasser mischbaren (einphasig) oder nicht-mischbaren (zweiphasig) organischen Colösungsmittelsystem durchgeführt werden (H. A. Findeis et al., Ann. Rep. in Med. Chem. 19, 263 (1984)). Die Reaktionszeiten bei einem diskontinuierlichen Verfahren liegen im allgemeinen zwischen etwa 1 Stunde und etwa 10 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 3 Stunden und etwa 5 Stunden. Geeignete Verweilzeiten für ein kontinuierliches Verfahren können aus den Daten für das diskontinuierliche Verfahren abgeschätzt und durch übliche Routineversuche optimiert werden.

Das Brenzkatechinprodukt wird von den Metallionen durch eine Vielzahl von Verfahren einschließlich der Zugabe von Schwefelwasserstoff abgetrennt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Ein Monooxygenaseenzym wurde hergestellt, indem 50 g frische Pilze, 200 ml Wasser und 20 g Ammoniumsulfat in einem Waring- Mischer homogenisiert wurden. Das Homogenisat wurde bei 4°C mit 10 000 × g 30 Minuten zentrifugiert, um Zellbruchstücke wie Fasern zu entfernen. Zu dem Überstand wurden 100 g Ammoniumsulfat zugegeben und der Überstand wurde bei 4°C 12 Stunden gerührt, um das Enzym Monophenolmonooxygenase auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation (wie oben) gewonnen, was etwa 5 g eines Monophenolmonooxygenase enthaltenden Präparats lieferte.

Eine Reaktionsmischung wurde gebildet, indem 0,5 g des Monooxygenaseenzympräparats in 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, gelöst wurden und 0,045 g L-Tyrosin, 0,1 g Vitamin C und 0,022 g Eisen-(III)-chlorid zugegeben wurden. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden in ein Wasserbad mit 35°C gestellt (das mit 120 Upm geschüttelt wurde). Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen einen signifikanten Anstieg in der Ausbeute des Produkts, L-DOPA, bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, verglichen mit dem Verfahren ohne Zugabe von Eisenionen. Wenn ein Reduktionsmittel zu diesem System zugegeben wird, wird das OAQ schnell zu PC reduziert. Da die Biokonversionsreaktion gestoppt wurde, bevor das Reduktionsmittel aufgebraucht war, waren die meisten Verbindungen, die in Lösung blieben, MP und PC.

Tabelle 1

Beispiele 2 bis 8

Bei den Beispielen 2 bis 8 wurde das Verfahren von Beispiel 1 wiederholt mit der Ausnahme, daß L-Tyrosin durch die entsprechenden in Tabelle 2 aufgelisteten Monophenolverbindungen ersetzt wurde. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß die Ausbeuten an den entsprechenden Brenzkatechinprodukten (Ausbeute = 100% × Mol Brenzkatechin/Mol Monophenol in der Ausgangsmischung) etwa 3% bis 110% höher sind als bei der Kontrolle.

Tabelle 2

Beispiel 9

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde durchge führt mit der Ausnahme, daß die Monophenolmonooxygenase aus Kar toffel extrahiert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 ge zeigt, wobei die die Ausbeute steigernde Wirkung des Eisenions wiederum signifikant ist.

Tabelle 3

Beispiel 10

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde durchge führt mit der Ausnahme, daß Boratpuffer (0,05 M, pH 8,0) statt Phosphatpuffer verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Beispiel 11

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde durchge führt mit der Ausnahme, daß Carbonatpuffer (0,05 M, pH 7,0) statt Phosphatpuffer verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Beispiel 12

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde durchge führt mit der Ausnahme, daß statt des Phosphatpuffers Trietha nolamin-HCl-Puffer (0,05 M, pH 7,0) verwendet wurde. Die Ergeb nisse sind in Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 6

Beispiel 13

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde durchge führt mit der Ausnahme, daß statt Phosphatpuffer Tris(hydroxy methyl)aminomethan(TRIS)-Puffer (0,05 M, pH 7,0) verwendet wur de. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Weitere Untersuchungen unter Verwendung von Puffern wie Essigsäure-, Zitronensäure-, Weinsäure- und Phthalatpuffer zeig ten, daß, solange der pH im Bereich von 4 bis 11 liegt, ein Kom plex zwischen dem Eisenion und den Brenzkatechinprodukten gebil det wird und die Brenzkatechinprodukte stabilisiert.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Brenzkatechinverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Monophenolverbindungen mit Sauerstoff in einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH zwischen 4 und etwa 11 in Gegenwart von Monophenolmonooxygenase, einem Reduktionsmittel, das die aktive reduzierte Form der Monophenolmonooxygenase erhält, und einem Metallion, das einen Komplex mit Brenzkatechinverbindungen bilden kann, umsetzt, wobei das Metallion in einer Konzentration zwischen 0,1 und 2 Mol pro Mol Brenzkatechinverbindung vorhanden ist.
b) zwischen dem Metallion und der Brenzkatechinverbindung einen Komplex bildet und
c) die Brenzkatechinverbindung von dem Komplex abtrennt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Monophenolverbindung Phenol, L-Tyrosin, N-Formyl-L- tyrosin, N-Acetyl-L-tyrosin, L-Tyrosinmethylester, L- Tyrosinethylester, N-Acetyl-L-tyrosinethylester oder N- Methyl-L-p-tyrosin eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallion Fe⁺², Fe⁺³, Mn⁺², Ni⁺², Co⁺², Al⁺³ oder Zn⁺² eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallion Fe⁺² oder Fe⁺³ eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Reduktionsmittel ein Sulfitsalz, ein Thiosulfatsalz, Vitamin C oder ein Derivat von Vitamin C eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung mit einem Acetat-, Citrat-, Succinat-, Phthalat-, Phosphat-, Borat-, Carbonat-, Triethanolamin- HCl- oder Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer gepuffert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß im pH-Bereich von 6 bis 10 umgesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Reaktionstemperatur im Bereich von 0 bis 60°C umgesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Reaktionstemperatur im Bereich von 4 bis 50°C umgesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Reaktionstemperatur im Bereich von 10 bis 45°C umgesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Metallionenkonzentration zwischen 0,33 und 1 Mol pro Mol Brenzkatechinverbindung umgesetzt wird.