DE4002351A1

DE4002351A1 - Verfahren und zusammensetzung zur reinigung vom amphotericin b

Info

Publication number: DE4002351A1
Application number: DE4002351A
Authority: DE
Inventors: Gerd W Michel; Wilbur L Bryan; Elizabeth Bryan
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1987-10-27
Filing date: 1990-01-26
Publication date: 1991-08-01
Also published as: CA2007367C; CA2007367A1; CN1029617C; CN1053794A; FR2657260A1; HU900124D0; FR2657260B1; HU205768B; JPH03240793A; GB2239653A; GB2239653B; GB9000357D0; HUT56377A; US4902789A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Zusammenset zung zur Reinigung und Kristallisation von Amphotericin B.

Amphotericin B ist ein wirksames fungizides Mittel aus der Klasse der Polyen-Macrolidantibiotika. Diese Verbindungen sind durch einen großen Lactonring charakterisiert, der eine Kette von konjugierten Doppelbindungen umfaßt.

Amphotericin B und ein Verfahren zu seiner Herstellung aus Streptomyces nodosus sind aus US-PS 29 08 611 (Dutcher et al., 13. 10. 1959) bekannt. Amphotericin B weist folgende Strukturformel auf:

Die von Dutcher et al. offenbarten Verfahren zur Extraktion und Kristallisation von Amphotericin umfassen folgende Stu fen:

a) Aufschlämmen des rohen Amphotericins in einem Alkohol mit einer Säure und anschließend Neutralisieren mit einer starken Base; oder
b) Aufschlämmen des rohen Amphotericins mit Dimethylform amid und Behandlung der Aufschlämmung mit einem wäßrigen Alkohol oder einem wäßrigen Keton.

Michel et al. offenbaren in US-PS 41 77 265 ein Verfahren zur Reinigung von Amphotericin B, das sich solubilisierender Medien mit einem Gehalt an Natriumjodid oder Natriumthiocya nat und Aceton oder Methanol bedient. Die Verwendung von einem dieser Medien bringt eine erhebliche Verbesserung der Löslichkeit vom Amphotericin B mit sich, das ansonsten in Aceton oder Methanol allein eine begrenzte Löslichkeit auf weist.

Es besteht ein Bedürfnis nach neuen Verfahren und Zusammen setzungen, die sich zur Reinigung von Amphotericin B eignen und dabei gleichmäßig hohe Ausbeuten an hochkristallinem Produkt liefern.

Erfindungsgemäß werden ein neues Verfahren und eine neue Kristallisationszusammensetzung bereitgestellt, die sich zum Reinigen von Amphotericin B eignen und in gleichmäßiger Weise höhere Ausbeuten an kristallinem Material liefern. Die neue Amphotericin B-Zusammensetzung enthält Amphotericin B in Lösung mit Methanol, Dimethylformamid, Methylenchlorid und Wasser. Das neue Verfahren umfaßt das Auflösen von rohem, teilweise gereinigtem oder verunreinigtem Amphoteri cin B in einer Lösung aus Methanol, Dimethylformamid und einer Säure; das Abtrennen des erhaltenen Extraktgemisches von etwaigen unlöslichen Bestandteilen; das Vereinigen des gereinigten Extrakts mit einem Lösungsmittelgemisch aus Me thylenchlorid und Wasser; das Kristallisieren des Amphoteri cin B; und das Gewinnen des kristallinen Produkts.

Es wurde nunmehr festgestellt, daß die Zuverlässigkeit des Verfahrens zur Herstellung von Amphotericin B und die kri stalline Natur des Produkts erheblich verbessert werden kön nen, indem man das quaternäre Lösungsmittelsystem des erfin dungsgemäßen Verfahrens verwendet. Das quaternäre Lösungs mittelsystem umfaßt Dimethylformamid und Methanol, worin Amphotericin B zunächst gelöst wird, sowie Methylenchlorid und Wasser, die nach Filtration der anfänglichen Lösung zu gesetzt werden. Die erhaltene Amphotericin B-Kristallisa tionszusammensetzung enthält das Amphotericin B und eine Säure, die mit Amphotericin B in diesen vier Lösungsmitteln ein Salz bildet. Ferner wurde festgestellt, daß nach Reini gung, Kristallisation, Filtration und Waschen das Produkt nach Trocknung auf einen Wassergehalt von mindestens 2 Gew.-% und vorzugsweise von etwa 2 bis 6 Gew.-%, ein stabileres kristallines Material darstellt.

Die folgende Tabelle erläutert die Vorteile des erfindungs gemäßen Verfahrens. Die Tabelle liefert einen Vergleich zwi schen dem Amphotericin-B-Produkt gemäß dem Verfahren von Dutcher et al. (US-PS 29 08 611) und dem nach dem erfin dungsgemäßen Verfahren erhaltenen Produkt. Die mikrobiologi sche Wirksamkeit, die Ausbeute, die Reinheit (gemessen als Glührückstand des Produkts) und die Stabilität werden für die einzelnen Produkte gemessen.

Tabelle

Obgleich der exakte Mechanismus, gemäß dem die geltend ge machten Verbesserungen erzielt werden, nicht bekannt ist, wird angenommen, daß das Methylenchlorid und Wasser, die zu Amphotericin B, Methanol und Dimethylformamid gegeben wer den, die kristalline Struktur und damit die mikrobiologische Aktivität, Reinheit und Stabilität des erhaltenen Amphoteri cin B verstärken.

Das im Reinigungsverfahren als Ausgangsmaterial verwendete Amphotericin B kann rohes, teilweises gereinigtes oder ver unreinigtes Amphotericin B enthalten. Der Ausdruck "verun reinigtes Amphotericin B" bedeutet einen Gehalt an physika lischen Verunreinigungen, wie Schmutzteilchen, faseriges Ma terial und andere teilchenförmige Bestandteile, die dazu führen können, daß Amphotericin B für pharmazeutische Zwecke ungeeignet ist.

Die erste Stufe im Verfahren besteht in der Extraktion des als Ausgangsmaterial verwendeten Amphotericin B, indem man es in einem Gemisch aus Methanol und Dimethylformamid in be liebiger Reihenfolge suspendiert und die Säure zusetzt. Bei der Säure kann es sich um eine beliebige Säure handeln, die mit Amphotericin B bereitwillig ein Salz bildet, z. B. Citro nensäure, Salzsäure, Schwefelsäure und dgl. Die Temperatur ist nicht kritisch, jedoch wird die Extraktion vorzugsweise durchgeführt, indem man die Temperatur des auf diese Weise gebildeten Gemisches auf etwa 15 bis 20°C einstellt und bewegt, bis das Amphotericin B-Ausgangsmaterial gelöst ist.

Die Trennung des Extraktionsgemisches wird unter Anwendung an sich bekannter Verfahren durchgeführt. Vorzugsweise be dient man sich der Filtration, um den Amphotericin B-Extrakt von unlöslichen Materialien abzutrennen.

Der gereinigte Amphotericin B-Extrakt wird anschließend mit einem Lösungsmittelgemisch aus Methylenchlorid und Wasser vereinigt. Die Temperaturen und die Reihenfolge der Zugabe des Methylenchlorids und des Wassers sind nicht kritisch, jedoch wird das Wasser vorzugsweise auf etwa 5 bis 10°C ge kühlt. Der pH-Wert des Gemisches wird auf etwa 5 bis 7 und vorzugsweise auf etwa 6 eingestellt, indem man eine wäßrige Base, z. B. wäßriges Triethanolamin, oder eine andere ge eignete Base verwendet. Dieses Gemisch fällt das amorphe Produkt aus. Die erhaltene Aufschlämmung (aus amorphem Pro dukt und Lösungsmitteln) ergibt eine geeignete Umgebung zur Förderung der Umwandlung von Amphotericin B in kristallines Material.

Die Aufschlämmung von amorphem Amphotericin B wird in kri stallines Material übergeführt, indem man sie auf eine Tem peratur von etwa 40 bis etwa 60°C und vorzugsweise von etwa 45 bis etwa 55°C erwärmt. Gegebenenfalls kann die Aufschläm mung zur Beschleunigung der Kristallisation mit geringen Mengen an Anzuchtkristallen versetzt werden.

Die Gewinnung von kristallinem Amphotericin B kann unter An wendung herkömmlicher Verfahren erfolgen, z. B. durch Zentri fugation oder Filtration. Das isolierte Material kann vor dem Trocknen gegebenenfalls mit einem geeigneten Lösungsmit tel gewaschen werden. Vorzugsweise sollte das isolierte kristalline Material so getrocknet werden, daß es mindestens 2% und vorzugsweise 2 bis 6 Gew.-% Wasser enthält. Beispiele für entsprechende Lösungsmittel für die Waschstufe sind Aceton, Gemische aus Aceton und Wasser, Methanol, Gemische aus Methanol und Wasser, Wasser oder Kombinationen davon.

Die Arbeitsbedingungen zur Durchführung des vorstehend be schriebenen Verfahrens können so gewählt werden, daß man ein steriles Produkt erhält.

Nachstehend wird die Erfindung anhand eines Beispiels näher beschrieben.

Beispiel 1

Etwa 565 Liter Methanol werden mit etwa 10 BK (kg Grundmate rial, d.h. die Anzahl der kg an reinem, aktiven Material) an Amphotericin B und 225 Liter Dimethylformamid versetzt. Etwa 18,5 kg Citronensäure-monohydrat (oder eine äquivalente Menge an wasserfreier Säure) werden zugesetzt. Das auf 15 bis 20°C gehaltene Gemisch wird bewegt, bis das eingetragene Material im wesentlichen gelöst ist. Die konzentrierte Lö sung wird sodann durch Filtration gereinigt. Sodann wird das Filtrat mit etwa 140 Liter Methylenchlorid versetzt. Etwa 225 Liter Wasser, das auf etwa 5 bis 10°C gekühlt ist, wer den zugegeben. Hierauf wird der pH-Wert auf etwa 6 einge stellt, um das Amphotericin B auszufällen. Wäßriges Trietha nolamin (40% Vol./Vol.) wird zur Einstellung des pH-Werts verwendet. Die erhaltene Aufschlämmung wird sodann innerhalb von etwa 30 Minuten auf etwa 44 bis 46°C erwärmt. Nachdem das Produkt kristallisiert ist, wie durch mikroskopische Prüfung festgestellt wird, wird es innerhalb von 2 bis 3 Stunden auf etwa 10°C gekühlt. Anschließend wird das gerei nigte Produkt durch Filtration isoliert und mit etwa 85 Li ter kaltem, wäßrigem (40% Vol./Vol.) Methanol gewaschen. Der feuchte Filterkuchen wird sodann in etwa 140 Liter Ace ton aufgeschlämmt. Nach der Filtration wird der Kuchen mit etwa 28 Liter Aceton gewaschen und sodann auf einen Feuch tigkeitsgehalt zwischen 2 und 6% getrocknet. Etwa 9,7 BK Amphotericin B werden gewonnen.

Claims

1. Amphotericin B-Zusammensetzung mit einem Gehalt an Ampho tericin B und einer Säure, die zur Bildung eines Salzes mit Amphotericin B in der Lage ist, in einer Lösung, die Methanol, Dimethylformamid, Methylenchlorid und Wasser umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Mittel zum Einstellen des pH-Werts der Zusammensetzung auf etwa 5 bis 7 enthalten ist.

3. Verfahren zur Reinigung und Kristallisation von Amphote ricin B, dadurch gekennzeichnet, daß man

a. eine Lösung von Amphotericin B in Methanol, Dimethyl formamid und einer Säure, die zur Bildung eines Salzes mit Amphotericin B in der Lage ist, herstellt;
b. den Amphotericin B-Extrakt von unlöslichen Bestandtei len abtrennt,;
c. den Amphotericin B-Extrakt mit einem Lösungsmittelge misch mit einem Gehalt an Methylenchlorid und Wasser vereinigt;
d. den pH-Wert der auf diese Weise gebildeten Kombination auf etwa 5 bis 7 einstellt;
e. die Aufschlämmung zur Beschleunigung der Bildung von kristallinem Material erwärmt; und
f. das kristalline Amphotericin B gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung des kristallinen Materials durchgeführt wird durch

i. Abtrennen des kristallinen, in Stufe (e) gebildeten Materials vom restlichen Lösungsmittel; und
ii. Waschen und Trocknen der abgetrennten Kristalle, wo bei die Kristalle so getrocknet werden, daß sie etwa 2 bis 6 Gew.-% Wasser enthalten.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (a) bei einer Temperatur von etwa 15 bis 20°C durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) das Amphotericin B, das Methanol und das Dime thylformamid vermischt werden und sodann die Citronen säure zugesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung durch Filtration durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (c) das Methylenchlorid zum Extrakt gegeben wird und anschließend das Wasser bei einer Temperatur von 5 bis 10°C zum Methylenchlorid und dem Extrakt gegeben wird.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) der pH-Wert der Kombination auf etwa 6 einge stellt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das amorphe Amphotericin B auf etwa 40 bis 60°C erwärmt wird, um es in kristallines Amphotericin B überzuführen.