HU205768B

HU205768B - Process for purifying amphotericin b

Info

Publication number: HU205768B
Application number: HU90124A
Authority: HU
Inventors: Gerd W Michel; Wilbur L Bryan; Elizabeth F Bryan
Original assignee: Squibb & Sons Inc
Priority date: 1987-10-27
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1992-06-29
Also published as: CA2007367A1; DE4002351A1; CA2007367C; FR2657260A1; CN1053794A; GB2239653A; GB2239653B; GB9000357D0; US4902789A; JPH03240793A; HU900124D0; CN1029617C; HUT56377A; FR2657260B1

Description

A találmány tárgya eljárás amfotericin-B tisztításáfa és kristályosítására.

Az amfotericin-B a polién makrolid antibiotikumoknéven ismertvegyületcsoport egyik tagja, hatásos gombaellenes szer. Amolekula fő szerkezeti eleme egy óriási laktongyűrű, amely konjugált kettős kötések sorozatát foglalja magában. Az amfotericín-B-t, valamint az eljárást a vegyület Streptomyces modusos tenyészetből történő előállítására 1959. október 13-án2 908 611 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban hozták nyilvánosságra. Jelenlegi ismereteink szerint az amfotericin-B szerkezete az (I) képletnek felel meg. A fenti eljárás amfotericin-B kinyerésére és kristályosítására abban áll, hogy

a) a nyers amfotericint valamilyen savat hozzáadva feliszapolják, majd ezt követően valamilyen erős bázissal a savat semlegesítik; vagy

b) a nyers amfotericint NJST-dimetil-formamdiban feliszapolják és valamilyen vizes alkoholt vagy ketont adnakhozzá.

Michel és munkatársainak az amerikai egyesült államokbeli 4 177 265 számú szabadalmi leírásban közölt eljárása azon alapszik, hogy oldószerként acetont vagy metanolt és az oldódást elősegítő anyagokat, nátrium-jodidot vagy nátrium-tiocianátot alkalmaznak. Tény,hogy ezeknekázadalékoknakbármelyikelényegesen megjavítja az amfotericin-B oldhatóságát, amely egyébként meglehetősen korlátozott tiszta acetonban vagymetanolban.

A fenti előzmények után a kutatás célja az volt, hogy olyan új tisztítási eljárást, valamint oldószerrendszert sikerüljön találni, amely megbízhatóan jó hozammal minél tökéletesebben kristályos szerkezetű amfotericin-B-t szolgáltat. A találmány lényege, hogy az általunkfelismert, meghatározott összetételű oldószerrendszert alkalmazva, és követve az alábbiakban részletezendő eljárást, az eddigieknél jobb kitermeléssel lehet az amfotericin-Bt előállítani, illetve kristályos termékké alakítani. Az amfotericin-Β tisztítását egy olyan új oldószerrendszerrel végezzük, amelynek Összetevői; metanol, Ν,Ν-dimetil-formamid, metilén-díldorid és víz. A találmány szerinti eljárás abban áll, hogy a nyers, részlegesen tisztított vagy szennyezett amfotericin-B-t feloldjuk metanol és Ν,Ν-dimetil-formamid elegyében, amely valamilyen, az amfotericin-B-vel sót képező savat is tartalmaz, az így kapott oldatot elválasztjuk a nem oldódó alkotórészektől, az így megtisztított oldathoz metilén-dikloridot és vizet adunk, az amfotericin-B-t kikristályosítjuk, végül elkülönítjükakristályos terméket.

Legújabban azt találtuk, hogy a tiszta amfotericinB előállításának megbízhatósága, valamint a terméknek a kristályos szerkezettel összefüggő előnyös tulajdonságai nagymértékben javíthatók olyan módon, hogy egy négykomponensú oldószerelegyet alkalmazunk a tisztítási eljárás során. A négykomponensú oldószerelegy alkotórésze az Ν,Ν-dimetil-formamid és a metanol, amelyek elegyében legelőször is feloldjuk az amfotericin-B-t továbbá a metilén-diklorid és a víz, amelyek hozzáadása az előbbi oldat szűrését követően történik. Az amfotericin-B tisztítására szolgáló rendszer afentiekenkívül tartalmazmég valamilyen, a célnakmegfelelő savatis, amely ebben anégy oldószerből álló elegyben az amfotericin-B-vel sót képez. Megfigyeléseink egy további lényeges eleme, hogyha a tisztítást, kristályosítást, szűrést ésmosást követően a termék szárítását úgy végezzük, hogy annak legalább 2, de előnyösen 2 és 6 tömegszázalékközötti víztartalma marad, akkor sokkal stabilabb kristályos anyagot kapunk.

Az alábbi táblázat jól illusztrálja a találmány előnyeit. A táblázatban összehasonlítjuk a 2 908 611 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt eljárással, valamint a találmány szerinti eljárással előállított amfotericin-B mikrobiológiai hatását, a kitermelést, továbbá a két különböző eredetű termék tisztaságát - az izzítási maradék mennyiségével jellemezve - és stabilitását.

1. táblázat

Eljárás Mikro- Kitér- Tisztaság Stabilitás biológiai melés (izzítási (aktivitáshatás maradék) csökkenés /év50’C-on)

US

2908.611884pg/mg 80% 2,5tömeg% 10-15% Saját lOOOng/mg 97% <0,ltömeg% <5%

BÁr nem tudjuk annak pontos magyarázatát adni, hogy mi okozza a találmány szerinti eljárással előállított-termék tulajdonságaiban megmutatkozó javulást, mindazonáltal úgy véljük, hogy a metilén-diklorid és a víz hozzáadása az amfotericin-B metanolos és N,N-dimetil-formamidos oldatához elősegíti a kristályos szerkezet kialakulását, ami azután a termék kedvezőbb aktivitásában, tisztaságában és stabilitásában nyilvánul meg. A tisztítási eljárás alkalmas nyers, részlegesen tisztított, valamint szennyezett amfotericin-B-bőI tiszta termék előállítására. Szennyezett amfotericin-B alatt itt fizikai szennyezéseket, például idegen részecskéket, szálas anyagokat vagy más szemcsés alkotórészeket értünk, amelyek az amfotericin-B gyógyszerészeti felhasználásának akadályai lehetnek.

A találmány szerinti eljárás első lépésében a kiindulási amfotericin-B-t metanol és Ν,Ν-dimetil-formamid elegyében szuszpendáljuk - az oldószereket bármilyen sorrendben adhatjuk az anyaghoz - és hozzáadjuk a savat. Minden olyan sav megfelel, amely az amfotericin-B-vel nehézség nélkülsótképez, ilyen például a citromsav, a sósav, a kénsav és hasonlók. Ahőmérsékletnek nincs meghatározó szerepe, mindazonáltal előnyös, ha az elegy hőmérséklete 15 és 20 ’C között van, és ezen a hőmérsékleten addig keverjük, amíg az amfotericin-B feloldódik. Az oldhatatlan részektől az extraktumot a kémiai technológia széles körben ismert eljárásaival választhatjuk el, előnyösnek erre a célra szűrést tartjuk.

A megszűrt amfotericin-B-oldatot ezután metiléndikloriddal és vízzel elegyítjük. A hőmérséklet, valamint a metilén-diklorid és víz hozzáadásánaksorrend2

HU 205 768 Β je nem meghatározó jelentőségű, azonban akkor járunk el célszerűen, ha a vizet előzőleg 5-10 °C-ra lehűtjük. Ezt követően az elegy pH-ját valamilyen vizes bázissal 5 és 7 közötti értékre, előnyösen 6-ra állítjuk. A bázis lehet például trisz(2-hidroxi-etil)-amin vagy bármely más, a célnak megfelelő bázis. Mjndezen műveletek eredményeképpen a tennék amorf formában válik ki, és egy sűrű szuszpenzió keletkezik. Ez az iszapszerű keverék, amely a kivált termékből és az oldószerekből áll, megfelelőnek bizonyult arra, hogy az amfotericin-B kristályos anyaggá történő átalakulását elősegítse.

Az amorf amfotericin-B átalakítását kristályos anyaggá a fenti iszapszeríí keverék melegítésével érj üli el. Az elegyet tehát felmelegítjük 40 és 60 ’C közötti, előnyösen 45 és 55 ’C közötti hőmérsékletre. Adott esetben kis mennyiségű oltókristály hozzáadásával a kristályosodást meggyorsíthatjuk.

A kristályos amofotericin-B elkülönítése a szokásos eljárásokkal, például centrifugálással vagy szűréssel történhet. Az elkülönített kristályos anyagot ezt követően, ha úgy kívánjuk, mielőtt megszárítanánk, alkalmas oldószerrel kimoshatjuk, Előnyös, ha a kristályos termék szárítása során úgy járunk el, hogy az amfotericin-B víztartalma legalább 2, de optimálisan 2 és 6 tömegszázalék maradjon. A kimosáshoz alkalmas oldószerek közül példaképpen említhetjük az acetont, az aceton és víz elegyét, a metanolt, víz és metanol elegyét, vagy mindezek kombinációit.

A fentiekben ismertetett eljárás valamennyi lépése esetében megválaszthat juk a kivitelezés körülményeit úgy is, hogy a tisztított terméket sterilen kapjuk.

A találmány szerinti eljárás a következő példával kívánjuk bemutatni, anélkül azonban, hogy a közölt részleteket bármilyen tekintetben korlátozó érvényűnek tekintenénk. /

1. példa

Számított mennyiségű, 10 kg tiszta hatóanyagot tartalmazó amfotericin-B-t 565 1 metanolban szuszpendálunk és 225 1 Ν,Ν-dimetil-formamidot adunk hozzá. Ezt követi 18,5 kg citromsav-víz (1/1) vagy ezzel egyenértékű vízmentes citromsav beadagolása, majd az elegyet 15 és 20 ’C közötti hőmérsékleten addig keverjük, amíg a bemért szilárd anyag gyakorlatilag feloldódik. Az oldatot ekkor élesre szűrjük.

A következő lépésben a szűriethez 140 1 metiléndikloridot, majd 2251,5-10 °C-ra hűtött vizet adunk. Az elegy pH-ját 40 térfogatszázalékos vizes trisz(2hidroxi-etil)-amin-oldattal 6-ra állítjuk, kicsapva ezzel az oldatból az amfotericin-B-t, majd a keletkezett sűrű iszapszerű szuszpenziót 44-46 “C-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 30 percig. Mikroszkóp alatt megvizsgáljuk az anyagot, és ha úgy találjuk, hogy a termék kikristályosodott, akkor lehűtjük a keveréket 10 ’C-ra és 2-3 óra hosszat pihentetjük. A kristályos terméket ezután szűrjük és mossuk 851 hideg, 40 térfogatszázalékos vizes metanollal. A nedves kristálytömeget 140 1 acetonban feliszapoljuk, ismét szűrjük, és a szűrőn maradt anyagot 28 1 acetonnal átmossuk, majd megszárítjuk, ügyelve arra, hogy a termék nedvességtartalma 2 és 6% között legyen. Az ilyen módon kapott amfotericin-B tiszta hatóanyagra számított tömege hozzávetőelegesen 9,7 kg.

Claims

SZABADALMIIGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) képletű amfotericin-B tisztítására és kristályosítására, azzaljellemezve, hogy

i) az amfotericin B-t metanol és N,N-dimetil-formamid elegyében az amfotericin-B-velsót képező sav hozzáadásával oldatba visszük;

ii) az amfotericin-B oldatát elválasztjuk a nem oldódó részecskékből;

iii) az amfotericin-B oldatát metilén-dikloriddal és vízzel elegyítjük;

iv) az így kapott elegy pH-ját bázissal 5 és 7 közötti értékre állítjuk;

v) a kristályosodás elősegítése végett a kapott szuszpenziót 40-60’C-ra melegítjük; és vi) a kristályos amfotericin-B-t a szuszpenzióból kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kristályos amfotericin-B kinyerését úgy végezzük, hogy az v) lépésben keletkezett kristályos anyagot elválasztjuk az oldószerből, és az elkülönített kristályokat mossuk és 2,0-6,0 t% nedvességtartalom értékre szárítjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépést 15 és 20 ’C közötti hőmérsékleten hajtjukvégre.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépés során az amfotericin-B metanollal és Ν,Ν-dimetil-formamiddal készült szuszpenziójához citromsavat adunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ii) lépésben az amfotericin-B oldatát a nem oldódó részecskéktől szűréssel választjuk el.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az iii) lépés során először a metilén-diklorídot adjuk a szűriethez, majd ezt követően az előzőleg 5 és 10 ’C közötti hőmérsékletre hűtött vizet.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a iv) lépés foganatosítása során az elegy pH-ját 6 értékre állítjuk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-beállítás után keletkező amorf amfotericinB Icristályos amfotericin-B-vá alakítását 45 és 55 ’C közötti hőmérsékleten végezzük.