CN1029617C - 纯化与结晶两性霉素b的方法 - Google Patents
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Abstract
用一种独特的含有甲醇、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和水的四溶剂系统,提供一种改进的用于纯化与结晶两性霉素B的方法。
Description
本发明涉及一种用于纯化与结晶两性霉素B的方法及组合物。
两性霉素B,一种有效的抗真菌剂,是一类已知多烯大环内酯抗菌素化合物中的一员。这些化合物的特征为有一个大的内酯环,该环含有一条共轭双键链。
两性霉素B及其由结节链霉菌Streptomyces nodosus制备的方法已被Dutcher等人在1959年10月13日批准的2,908,611号美国专利中公开。两性霉素B的结构已知为
由Dutcher等人公开的两性霉素的提取与结晶方法包括:
a.在带有一种酸的乙醇中将两性霉素的粗制品调成浆,然后用强碱中和;或
b.用二甲基甲酰胺将两性霉素粗制品调成浆,并用醇的水溶液
或酮的水溶液处理。
michel等人在4,177,265号美国专利中公开了利用一种增溶介质纯化两性霉素B的方法,该介质含有碘化钠或硫氰酸钠以及丙酮或甲醇。使用这些介质中的任何一种可以大大增进两性霉素B的溶解度,而两性霉素B在丙酮或甲醇中的溶解度是受限的。
已经发现了用于纯化两性霉素B的新的方法和组合物,获得稳定产率的,高度结晶的产品。
根据本发明,公开了一种新的适于纯化两性霉素B的可获得稳定高产率的结晶物质的方法与结晶组合物。这种新的两性霉素B组合物含有溶于甲醇、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和水的溶液中的两性霉素B。这种新的方法包括将粗制的、部分纯的或含杂质的两性霉素B溶于甲醇、二甲基甲酰胺和一种酸的溶液中,从提取混合物中分离出不溶成分,将纯的提取物与二氯甲烷和水的混合溶剂合并,使两性霉素B结晶,并回收结晶产物。
已经发现通过使用本方法的四溶剂系统,可以大大改进制备两性霉素B方法的连贯性以及产物的结晶性质。这种四溶剂系统包括最初溶解两性霉素B的二甲基甲酰胺和甲醇,以及将初始溶液过滤后所加入的二氯甲烷和水。所得到的两性霉素B结晶组合物含有溶于这四种溶剂中的两性霉素B和一种可与两性霉素B形成盐的酸。此外还发现当纯化、结晶、过滤、洗涤后,如果将产物干燥到使其保持至少2%(重量)的水、最好是约2-6%(重量)的水,可以获得更稳定的结晶物质。
下表说明了本发明方法的优点。表中所示为按照Dutcher等人在2,908,611号美国专利中描述的方法制备的两性霉素B
与按照本发明方法制备的两性霉素B的比较。对各个产品的微生物效能、产率、纯度(通过产物灼烧后的残渣测量)以及稳定性进行测量。
微生物效能 产率 纯度 稳定性
(灼烧 (活性损失
残渣) /年)5℃
先有技术方法 884mcg/mg 80% 2.5% 10-15%
(重量)
本发明方法 1000mcg/mg 97% <0.1% <5%
(重量)
虽然还不知道发生这些改善的准确机制,但是可以确信,加至两性霉素B、甲醇和二甲基甲酰胺中的二氯甲烷和水增强了结晶结构,并因此增加了所生成的两性霉素B的微生物活性、纯度以及稳定性。
在该纯化方法中用作起始物质的两性霉素B可以包括粗制的、部分纯化的或含有杂质的两性霉素B。所谓“含有杂质的两性霉素B”是指含有物理杂质,例如杂污物颗粒、纤维状物质及其它可导致两性霉素B不适于药用的颗粒成份。
本方法中,第一步是通过将两性霉素B按任何次序悬浮于甲醇和二甲基甲酰胺的混合物中,并向其中加入酸,以提取两性霉素B起始物质。这种酸可以是任何容易与两性霉素B形成盐的酸,如柠檬酸、盐酸、硫酸等。温度不是关键的,但是最好是调节这样形成的混合物的温度到大约15-20℃下进行萃取,并搅拌直至两性霉素B的起始物质溶解。
应用本技术领域众所周知的方法分离该提取混合物。最好是使用过滤的方法将不溶物与两性霉素B提取物分离。
然后将纯化的两性霉素B提取物与二氯甲烷和水的混合溶剂合并。温度与加入二氯甲烷和水的顺序不是关键的,当然最好是将水冷却至约5-10℃。用一种碱的水溶液,例如三乙醇胺水溶液或任何其它合适的碱将混合物的pH值调至大约5-7,最好是约为6。该混合物沉淀出非晶形产物,并且所获得的这种浆料(非晶形产物和溶剂的)提供了一个合适的环境,促使两性霉素B转化成为结晶物质。
通过在约40℃-60℃、最好是在约45℃至约55℃加热,这种非晶形两性霉素B的浆料转变成为结晶物质。不是必要的,也可以向此浆料中加入少量晶种以加速结晶。
应用常规方法,例如离心或过滤,回收结晶的两性霉素B。可以用适当的溶剂洗涤所分离出的物质,如果需要可预先将其干燥。最好将分离出的物质干燥,使其保持至少2%(重量),最好是2-6%(重量)的水。用于洗涤步骤的典型溶剂为丙酮、丙酮与水的混合物、甲醇、甲醇与水的混合物、水或其混合物。
实施上面所述方法的操作条件可以选择在例如产生无菌产物的方式中。
通过下面的实施例将进一步描述本发明,但不意味被其中细节所限制。
例1
向约565升甲醇中加入约10BK(基本千克,即纯的活性物质的千克)两性霉素B和225升二甲基甲酰胺。加入约18.5KG水合柠檬酸(或等当量的无水酸)。将混合物保持在15-20℃,直至进
料基本溶解。然后将此浓溶液过滤澄清。
接着,向该溶液中加入约140升的二氯甲烷。加入约225升冷却至5-10℃的水。然后将PH值调至约为6,使两性霉素B沉淀。使用40%V/V的三乙醇胺水溶液调节PH值。然后将所得到的浆料加热至44-46℃约30分钟。当进行显微观察测定,该产物已结晶时,将混合物在2-3小时内冷却至约10℃。然后过滤分离出纯化的产物,并用约85升冷却的40%V/V甲醇水溶液洗涤。将湿的滤饼在约140升丙酮中调成浆。过滤后,用约28升丙酮洗涤滤饼,然后干燥至2%-6%的含水量。回收的两性霉素B约为9.7BK。
Claims (8)
1、一种纯化与结晶两性霉素B的方法,其中包括:
a.在甲醇、二甲基甲酰胺及可与所述两性霉素B形成盐的酸中形成两性霉素B的溶液;
b.将不溶物与两性霉素B提取物分离;
c.将所述两性霉素B提取物与含有二氯甲烷和水的溶剂混合物合并;
d.用一种碱将所形成的合并液的pH值调节到约5-7;
e.将所述的浆料加热至40-60℃以加快结晶物质形成;以及
f.回收结晶的两性霉素B。
2、按照权利要求1的方法,其中回收结晶物质按下述步骤进行:
ⅰ.从剩余的溶液中分离在步骤(e)中形成的结晶物质;
ⅱ.洗涤并干燥分离出的晶体,其中将晶体干燥至保持2-6%(重量)的水。
3、按照权利要求1的方法,其中步骤(a)在15-20℃进行。
4、按照权利要求1的方法,其中在步骤(a)中将所述两性霉素B、甲醇和二甲基甲酰胺混合在一起,然后加入所述的酸。
5、按照权利要求1的方法,其中所述的分离是通过过滤完成的。
6、按照权利要求1的方法,其中在步骤(c)中将所述的二氯甲烷加至所述的提取物中,然后在5-10℃的温度下将水加至所述二氯甲烷和所述提取物中。
7、按照权利要求1的方法,其中将步骤(d)中的合并液的pH值调节至6。
8、按照权利要求1的方法,其中将所述的步骤(e)的浆料加热至45℃-55℃,使其转化成为结晶两性霉素B。
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