DE3931731A1 - Festphasenpeptidsynthese - Google Patents

Festphasenpeptidsynthese

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DE3931731A1
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Michel Follet
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers

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Description

Die Erfindung betrifft eine Festphasenpeptidsynthese.
Die in der Beschreibung verwandten Abkürzungen stehen mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature von 1983, wie sie in Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984), dargestellt sind, in Einklang. Zusätzlich werden die folgenden verwandt:
TFA
Trifluoressigsäure
DCM Dichlormethan
DMF Dimethylformamid
NMP N-Methylpyrrolidin
DMAc Dimethylacetamid
Aminosäuren und ihre Reste liegen in der L-Konfiguration vor, sofern nicht anders angegeben, z. B. Ala = L-Alanin, DALa = D-Alanin. Der Ausdruck (Meth)acryl wird so verwandt, daß er sowohl Acryl als auch Methacryl anzeigt.
Die üblichen Methoden der Festphasenpeptidsynthese schließen die folgende Verfahrenssequenz ein:
  • 1. Entfernen der Boc-Schutzgruppe;
  • 2. Waschen;
  • 3. Neutralisieren von NH₂ in der α-Stellung;
  • 4. Waschen;
  • 5. Kuppeln und
  • 6. Waschen.
Der Schutzgruppenabspaltungs- und Neutralisationsschritt werden durch Behandeln des harzgebundenen Peptids mit TFA und Diisopropylethylaminlösungen in DCM bewirkt. Das gleiche Lösungsmittel wird auch für Zwischenwaschungen verwandt. Welches Kupplungsmittel auch verwandt wird (symmetrisches Anhydrid, Dicyclohexylcarbodiimid, Hydroxybenzotriazol usw.), die Kupplungsreaktion wird entweder in DCM oder in DMF durchgeführt.
Folglich erfordert die Festphasenpeptidsynthese große Mengen an recht teuren Lösungsmittel und Reagentien wie TFA; somit hängt der Preis eines Peptids direkt vom Preis des in der Synthese verwandten DCM, NMP, DMF, DMAc und der TFA ab.
Deshalb wäre es von besonderem Interesse, billigere Lösungsmittel und Reagentien zu finden, um die Herstellungskosten der Peptide deutlich zu vermindern.
Unser europäisches Patent 00 79 842 beschreibt Polyacrylharz, die Copolymere von drei Monomeren, wie folgt, sind:
  • (i) einem ersten Monomer, das eine Matrix für das Copolymer liefert und eines ist aus
    1-(Meth)acryloyl-pyrrolidin,
    1-(Meth)acryloyl-piperidin,
    1-(Meth)acryloyl-perhydroazepin,
    1-(Meth)acryloyl-4-methyl-piperazin,
    4-(Meth)acryloyl-morpholin,
    N,N-Dimethyl-(meth)acrylamid und
    N,N-Diethyl-(meth)acrylamid,
  • (ii) einem zweiten Monomer, das das Copolymer vernetzt und eines ist aus
    N,N′-Di(meth)acryloyl-diaminomethan und
    N,N′-Di(meth)acryloyl-1,2-diaminoethan sowie
  • (iii) einem dritten Monomer, das das Copolymer aktiviert und eine der folgenden Säuren ist
    3-(Meth)acrylamido-essigsäure,
    3-(Meth)acrylamido-propionsäure,
    4-(Meth)acrylamido-buttersäure,
    6-(Meth)acrylamido-hexansäure,
    N-(Meth)acryloyl-L-alanin,
    N-(Meth)acryloyl-L-valin,
    N-(Meth)acryloyl-L-leucin,
    N-(Meth)acryloyl-L-phenylalanin,
    N-(Meth)acryloyl-L-tyrosin,
    N-(Meth)acryloyl-L-methionin,
    N-(Meth)acryloyl-L-lysin und
    N-(Meth)acryloyl-L-prolin,
    oder ein Methylester einer dieser Säuren.
Diese Copolymere haben freie Carboxy- oder Methoxycarbonylgruppen, die sich von dem dritten Monomer ableiten. Unser europäisches Patent 81 408 beschreibt weiterhin Polyacrylharze, in denen diese Gruppen mit Ethylendiamin amidifiziert sind. Es beschreibt auch die Verwendung dieser weiteren Polyacrylharze bei der Festphasenpeptidsynthese, jedoch nur in Verbindung mit den gewöhnlich mit Polystyrolharzen verwandten teuren Lösungsmitteln, wie vorstehend diskutiert.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Festphasenpeptidsynthese bereit, welches Verfahren das Anheften eines ersten Aminosäurerests an ein Polyacrylharz, Kuppeln einer oder mehrerer Aminosäurereste unter Bildung des erwünschten Peptids und das Lösen des Peptids von dem Harz umfaßt und das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Kupplungsverfahren als Schritte das Waschen des Harzes in Wasser und/oder wäßriger Lösung bzw. wäßrigen Lösungen einschließt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zieht Vorteil aus den hydrophilen Eigenschaften, die die Polyacrylharze anders als die Polystyrolharze aufweisen. Die erfindungsgemäß zu verwendenden Polyacrylharze sind vorzugsweise die in unseren oben diskutierten europäischen Patenten 00 79 842 und 00 81 408 beschriebenen.
Der erste Aminosäurerest kann an der Matrix durch eine Glykolamideinheit befestigt werden (B. Calas et al., Tetrahedron, 1985, 41, 5331). Frühere Versuche mit anderen labilen Bindegruppen, wie
worin X Br, Cl oder OH ist, erwiesen sich als unbefriedigend.
Das Harz kann dann mit Wasser gewaschen werden. Die nächste Aminosäure der aufzubauenden Peptidsequenz kann nach dem folgenden Verfahren angefügt werden (anwendbar, wenn die Schutzgruppe Boc ist):
  • 1. Waschen: destilliertes Wasser - 2- bis 4mal, jeweils 2 min;
  • 2. Abspalten der Schutzgruppe: HCl (6N) in Wasser - einmal, 2 min, und noch einmal, 30 min;
  • 3. Waschen: destilliertes Wasser - 4- bis 6mal, jeweils 2 min;
  • 4. Neutralisieren: 1 Äquivalent Boratpuffer 12,5 mM, pH 8,5-9,0 - einmal, 1 bis 2 min, und noch einmal, 1 bis 2 min;
  • 5. Waschen: destilliertes Wasser - 4- bis 6mal, jeweils 1 bis 2 min;
  • 6. Waschen: DMF - zweimal, jeweils 1 bis 2 min;
  • 7. Kuppeln: symmetrisches Anhydrid (2 Äquivalente, zweimal in DMF);
  • 8. Waschen: DMF oder NMP - zweimal, jeweils 2 min; und
  • 9. Waschen: destilliertes Wasser - 4mal, jeweils 2 min.
Der Fortschritt der Kupplungsreaktion kann mit Ninhydrin oder Fluorescamin verfolgt werden.
Wenn die Schutzgruppe Fmoc ist, kann das Verlängerungsverfahren alternativ wie folgt aussehen:
  • 1. Waschen: destilliertes Wasser - 4- bis 6mal, jeweils 2 min;
  • 2. Abspalten der Schutzgruppe: Piperidin oder Diethylamin in Wasser;
  • 3. Waschen: Isopropanol, zweimal, jeweils 2 min; destilliertes Wasser - 4- bis 6mal, jeweils 2 min;
  • 4. gegebenenfalls Waschen: DMF - einmal, 2 min;
  • 5. Kuppeln: symmetrisches Anhydrid (3mal im Überschuß in DMF) und
  • 6. Waschen: DMF (zweimal, jeweils 2 min); destilliertes Wasser - 6mal, jeweils 2 min.
Nach Beendigung der Synthese wird das Peptid von der Matrix durch selektives Aufbrechen der Glykolamidbindung, das durch eine der folgenden Behandlungen erzielt wird, abgetrennt:
  • - NaOH in Isopropanol,
  • - NH₃ in Trifluorethanol oder Methanol oder Ethanol oder Isopropanol,
  • - N₂H₄ in DMF und
  • - CH₃OH in Triethylamin.
Nach diesem Verfahren wurden das Referenzpeptid von Dorman (Leu Ala Gly Val) und LHRH- Analoga in Ausbeuten von ungefähr mehr als 50% erhalten.
Die Erfindung wird aus der Beschreibung der nachstehenden Beispiele besser verständlich.
Beispiel 1 Synthese von DTrp⁶-LHRH: Pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-DTrp- Leu-Arg-Pro-Gly
5 g eines Polyacrylharzes (0,55 mMol NH₂/g), hergestellt durch Copolymerisation von 1-Acryloylpyrrolidin, N,N′- Diacryloyl-1,2-diaminoethan und Methyl-2-acrylamidoacetat, wie in Beispiel 19 der EP 00 79 842 beschrieben, wurden wie folgt behandelt:
  • 1. Wäsche mit DCM (4mal, jeweils 2 min)
  • 2. Neutralisation mit 5%igem Diisopropylethylamin in DCM (2mal, jeweils 2 min)
  • 3. Wäsche mit DCM (4mal, jeweils 2 min)
4,29 g (0,0165 Mol) Bromessigsäureanhydrid in 50 ml DCM wurden zu dem Harz hinzugefügt. Nach 45 min Schütteln wurde die DCM-Lösung durch Filtration entfernt und der bromierte Träger wie folgt gewaschen:
  • 1. DCM (4mal, jeweils 2 min)
  • 2. DMF (4mal, jeweils 2 min)
Cäsiumsalz von BocGlyOH (4,22 g, 0,0137 Mol), hergestellt gemäß Mery et al. (Int. J. Protein Peptide Res., 1988, 31, 412), wurde in DMF (75 ml) gelöst und diese Lösung zu dem Harz hinzugefügt. Die Mischung wurde zwei Tage bei Raumtemperatur geschüttelt. Zu dieser Zeit wurde das DMF abgegossen und das Polymer gewaschen mit:
  • 1. DMF (10mal, jeweils 2 min)
  • 2. Methanol (4mal, jeweils 2 min)
  • 3. DCM (4mal, jeweils 2 min)
  • 4. Diethylether (4mal, jeweils 2 min)
Das Harz wurde im Hochvakuum in Gegenwart von KOH-Pellets 12 h getrocknet. Die Menge an gebundenem Gly betrug 0,483 mMol/g, bestimmt durch Aminosäureanalyse nach Hydrolyse in 6N HCl in evakuierten und zugeschmolzenen Ampullen bei 110°C über 24 h.
BocGly-Harz (4,47 g) wurde mit Wasser (4mal, jeweils 2 min) gewaschen und die Boc-Gruppe unter Verwendung von 6N HCl in Wasser (2mal, einmal 2 min und noch einmal 30 min) abgespalten. Die HCl wurde durch Filtration abgetrennt und das Harz mit Wasser gewaschen (6mal, jeweils 2 min). Die Neutralisation wurde unter Verwendung von Boratpuffer (12,5 mMol, pH 9) durchgeführt, wobei das Harz zweimal mit 50 ml Puffer behandelt wurde (jeweils 1 min). Nach dem Waschen mit Wasser (6mal, jeweils 2 min) und mit DMF (2mal, jeweils 2 min) wurde das symmetrische Anhydrid von BocProOH in DMF (50 ml) zu dem Harz zugefügt.
Die Lösung des symmetrischen Anhydrids wurde wie folgt hergestellt: BocProOH (3,55 g, 0,0165 Mol) wurde in 40 ml DMF gelöst, die Lösung auf 0°C abgekühlt und mit Dicyclohexylcarbodiimid (1,69 g 8,25 mMol) in 10 ml DCM versetzt. Nach 30minütigem Rühren bei 0°C und Filtrieren wurde die Lösung im Hochvakuum ohne Erhitzen verdampft und der Rückstand in DMF gelöst und zum Harz hinzugefügt. Die Mischung wurde 30 min geschüttelt, zu welcher Zeit der qualitative Ninhydrdintest von Kaiser et al. (Anal. Biochem., 1970, 34, 575) negativ war, was eine Kupplungsausbeute von mehr als 99,6% anzeigte. Das DMF wurde dann entfernt und der Träger zweimal mit DMF (jeweils 2 min) und mit Wasser (4mal, jeweils 2 min) gewaschen.
Dieses Verfahren wurde verwandt, um die anderen Aminosäuren der DTrp⁶-LHRH-Sequenz einzuführen. Die symmetrischen Anhydride wurden unter Verwendung von BocArg(Mts)OH (7,52 g, 0,0165 Mol), BocLeuOH (4,11 g, 0,0165 Mol), BocDTrpOH (5,02 g, 0,0165 Mol), BocTyr(2,6-dichlorbenzyl)OH oder BocTyr(2,6 DCB)OH (7,26 g, 0,0165 Mol), BocSer(Bzl)OH (4,86 g, 0,0165 Mol), BocTrpOH (5,02 g, 0,0165 Mol), BocHos(dinitrophenyl)OH oder BocHis(Dnp)OH (6,94 g, 0,0165 Mol), Pyro-GluOH (2,13 g, 0,0165 Mol), hergestellt.
Nach der Einführung von Pyro-GluOH wurde das Harz mit Methanol (4mal, jeweils 2 min), Diethylether (4mal, jeweils 2 min) gewaschen und im Hochvakuum bei Raumtemperatur 48 h getrocknet.
Das Peptidharz wurde dann mit Thiophenol (10 ml) in DMF (50 ml) behandelt, um die Dinitrophenylgruppe der Histidinseitenkette zu entfernen.
Nach 45minütigem Schütteln wurde die Thiophenollösung abgegossen und das Harz mit DMF (4mal, jeweils 2 min), DCM (4mal, jeweils 2 min), und Diethylether (4mal, jeweils 2 min) gewaschen. Das Harz wurde im Hochvakuum 12 h getrocknet. Es wurde zweimal (jeweils 30 min) bei 0°C mit 50 ml der folgenden vorgekühlten Lösung behandelt: Tri­ fluormethansulfonsäure (3,6 ml), Anisol (4 ml ), Thioanisol (4 ml), Metacresol (4 ml) und Trifluoressigsäure (40 ml). Am Ende der Schutzgruppenabspaltung wurde das Harz mit DCM (zweimal, jeweils 2 min). DCM/DMF (50-50) (2mal, jeweils 2 min), 5%igem Diisopropylethylamin in DCM (2mal, jeweils 1 min), DMF (3mal, jeweils 2 min), Isopro­ pynol-Wasser (70-30) (3mal, jeweils 2 min) gewaschen. Das Peptidharz wurde dann in einer NH₃-gesättigten Trifluorethanollösung (250 ml) suspendiert.
Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 h geschüttelt, die schutzgruppenfreies DTrp⁶-LHRH enthaltende Trifluorethanollösung gesammelt und der Träger mit Wasser (4mal, jeweils 2 min), Methanol (4mal, jeweils 2 min) und Wasser (6mal, jeweils 2 min) gewaschen. Die Filtrate wurden vereinigt, das pH mit 1 N-Salzsäure auf etwa 4 gebracht; sie wurden im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert. Der Rückstand wurde auf einer Carboxymethylcellulosesäule (Wathman CM 52, 10×2 cm) mit einem linearen NaCl-Gradienten (10 mM AcONa von pH 5,0 zu 10 mM AcONa, 0,15 M NaCl, von pH 5,0) fraktioniert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt, gefriergetrocknet und durch Gelfiltration auf einer Sephadex G10-Säule (100×2,5 cm) in 10 M HCl entsalzt. Die Peptidfraktion wurde dann durch HPLc auf einer Säule (270×20 mm) von Lichrosorb RP18 (10 µm) unter Verwendung von 0,01%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser und Acetonitril als Elutionsmittel gereinigt.
Ausbeute: 51% (bezogen auf die Ausgangs-Aminogruppen des Trägers).
Aminosäurenanalyse: Glu 0,99 (1), Leu 1,0 (1), His 1,0 (1), Trp 1,89 (2), Ser 0,96 (1), Tyr 0,97 (1), Pro 0,99 (1), Gly 1,07 (1).
Für einige Aminosäuren, die unter sauren Bedingungen weniger stabil sind, können die analytischen Werte wegen ihrer Zersetzung geringer sein als die erwarteten.
Das gleiche Verfahren wurde für die folgenden Peptide verwandt:
  • - Dorman-Peptid: Leu Ala Gly ValOH
    Ausbeute = 46,6%
    Gly = 0,96, Ala = 0,94, Val = 1,05, Leu = 1,04
  • - Laminin: Tyr Ile Gly Ser ArgNH₂
    Ausbeute = 35,6%
    Ser = 0,75, Gly = 1,03, Ile = 0,99, Tyr = 1,
    Arg = 0,99
  • - CDC-28-Kinoseprotein aus dem Zellzyklus von "Pombee"- Hefe
    Ausbeute = 44,1% (rohes Peptid)
    Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH
    Asp = 1, Gly = 1,08, Ala = 1, Leu = 1,05×2, Tyr = 0,99, Arg = 0,99, Lys = 1, Pro = 1.
  • - Tyrosinphosphatase
    Ausbeute = 58,6% (rohes Peptid)
    Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH
    Asp = 0,95×3, Ser = 0,58×3, Glu = 0,67, Ile = 1,1, Leu = 1,1.
  • - Oncogen: Phe Arg Gly Thr Leu Arg
    Ausbeute = 53,4%
    Phe = 0,97, Arg = 2×1,1, Gly = 1,02, Thr = 0,99, Leu = 1.
Beispiel 2 Synthese von Leu-Ala-Gly-Val
1 g des in Beispiel 1 verwandten Polyacrylharzes wurde wie folgt behandelt:
  • 1. Wäsche mit DCM (4mal, jeweils 2 min)
  • 2. Neutralisation mit 5%igem Diisopropylethylamin in DCM (2mal, jeweils 2 min)
  • 3. Wäsche mit DCM (4mal, jeweils 2 min)
0,8585 g (3,3 mMol) Bromessigsäureanhydrid in 10 ml DCM wurde zum Harz hinzugefügt. Nach 45minütigem Schütteln wurde die DCM-Lösung durch Filtration entfernt und der bromierte Träger wie folgt gewaschen:
  • 1. DCM (4mal, jeweils 2 min)
  • 2. DMF (4mal, jeweils 2 min)
Cäsiumsalz von FmocValOH (1,29 g, 2,75 mMol), hergestellt nach Mery et al. (Int. J. Peptide Protein Res., 1988, 31, 412), wurde in DMF (15 ml) gelöst und die Lösung zu dem Harz hinzugefügt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur drei Tage geschüttelt. Zu dieser Zeit wurde das DMF abgegossen und das Polymer gewaschen mit:
  • 1. DMF (10mal, jeweils 2 min)
  • 2. Methanol (4mal, jeweils 2 min)
  • 3. DCM (4mal, jeweils 2 min)
  • 4. Diethylether (4mal, jeweils 2 min)
Das Harz wurde im Hochvakuum in Gegenwart von KOH-Pellets 12 h getrocknet. Die Menge an gebundenem Val betrug 0,492 mMol/g, bestimmt durch Aminosäureanalyse nach Hydrolyse mit 6N HCl in evakuierten und zugeschmolzenen Ampullen über 24 h.
FmocVal-Harz (1,1 g) wurde mit Wasser gewaschen (4mal, jeweils 2 min) und die Fmoc-Gruppe unter Verwendung von 10% Piperidin oder Diethylamin in Wasser abgespalten (2mal, jeweils 2 min). Das Harz wurde dann mit Isopropanol (2mal, jeweils 2 min) und mit Wasser (4mal, jeweils 2 min) gewaschen.
Symmetrisches Anhydrid von FmocGlyOH in DMF (15 ml) wurde dem Träger zugesetzt. Die Lösung des symmetrischen Anhydrids wurde wie folgt hergestellt:
FmocGlyOH (0,981 g, 3,3 mMol) wurde in DCM (15 ml) gelöst, die Lösung auf 0°C abgekühlt und mit Dicyclohexylcarbodiimid (0,339 g, 1,65 mMol) in DCM (10 ml) versetzt. Die trübe Mischung wurde 20 min bei 0°C gerührt, der Di­ cyclohexylharnstoffniederschlag durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum bei Raumtemperatur konzentriert. Der ölige Rückstand wurde in DMF (15 ml) gelöst und die Lösung zu dem Harz zugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 45 min geschüttelt, zu welcher Zeit der qualitative Ninhydrintest von Kaiser et al. (Anal. Biochem., 1970, 34, 575) negativ war. Das DMF wurde durch Filtration entfernt und der Träger mit DMF (2mal, jeweils 2 min) und dann mit Wasser (6mal, jeweils 2 min) gewaschen.
Dieses Verfahren wurde zur Einführung der folgenden Aminosäuren verwandt: Leu und Ala. Die symmetrischen Anhydride wurden ausgehend von 1,16 g (3,3 mMol) FmocLeuOH und 1,02 g (3,3 mMol) FmocAlaOH hergestellt. Nach Beendigung der Synthese wurde das Peptid-Harzaddukt mit Isopropanol (4mal, jeweils 2 min), Wasser (4mal, jeweils 2 min) und Isopropanol-Wasser (70-30) (4mal, jeweils 2 min) gewaschen.
Peptidharz wurde dann in Isopropanol-Wasser (70-30) suspendiert und mit 1,1 ml 1N NaOH versetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 5 h geschüttelt, die das Leu- Ala-Gly-Val enthaltende Isopropanol-Wasser-Lösung gesammelt und der Träger mit Wasser (4mal, jeweils 2 min), Methanol (4mal, jeweils 2 min) und Wasser (4mal, jeweils 2 min) gewaschen. Die Hydrate wurden vereinigt, das pH mit 1N HCl auf 4 gebracht und die Lösung im Vakuum bei Raumtemperatur konzentriert. Der Rückstand wurde durch HPLC auf einer Säule (250×20 mm) von Lichrosorb RP 18 (10 µm) unter Verwendung von 0,1% TFA in Wasser und Acetonitril als Elutionsmittel gereinigt.
Ausbeute: 54% (bezogen auf die Ausgangsaminogruppen des Trägers).
Aminosäurenanalyse: Leu 1,02 (1), Ala 0,99 (1), Gly 1,1 (1), Val 1,0 (1).
Das gleiche Verfahren wurde zur Synthese der folgenden Peptide verwandt:
  • - Dorman-Peptid: Leu Ala Gly ValOH
    Ausbeute = 46,6%
    Gly = 0,93, Ala = 0,91, Val = 1,01, Leu = 1.
  • - Laminin: Tyr Ile Gly Ser ArgNH₂
    Ausbeute = 46,3%
    Ser = 0,79, Gly = 1,01, Ile = 0,96, Tyr = 0,89,
    Arg = 0,93.
  • - CDC-28-Kinaseprotein aus dem cellularen Zyklus von "Pombee"-Hefe
    Ausbeute = 48,6% (rohes Peptid)
    Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH
    Asp = 0,97, Gly = 1,02, Ala = 0,98, Leu = 1,02×2, Typ = 0,98, Arg = 0,96, Lys = 1, Pro = 0,97.
  • - Tyrosinphosphatase
    Ausbeute = 61,6% (rohes Peptid)
    Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH
    Asp = 0,99×3, Ser = 0,63×3, Glu = 0,73, Ile = 1,03, Leu = 1.
  • - Oncogen: Phe Arg Gly Thr Leu Arg
    Ausbeute = 49,2%
    Phe = 1, Arg = 2×1,04, Gly = 1, Thr = 0,96, Leu = 0,98.

Claims (6)

1. Verfahren zur Festphasenpeptidsynthese, welches Verfahren das Anheften eines ersten Aminosäurerestes an ein Polyacrylharz, das Kuppeln eines oder mehrerer weiterer Aminosäurereste unter Bildung des erwünschten Peptids und das Lösen des Peptids von dem Harz umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsprotokoll als Schritte das Waschen des Harzes in Wasser und/oder wäßriger (wäßrigen) Lösung(en) einschließt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyacrylharz ein Copolymer aus drei Monomeren ist, wie folgt:
  • (i) einem ersten Monomer, das eine Matrix für das Copolymer liefert und eines ist aus
    1-(Meth)acryloyl-pyrrolidin,
    1-(Meth)acryloyl-piperidin,
    1-(Meth)acryloyl-perhydroazepin,
    1-(Meth)acryloyl-4-methyl-piperazin,
    4-(Meth)acryloyl-morpholin,
    N,N-Dimethyl-(meth)acrylamid und
    N,N-Diethyl-(meth)acrylamid,
  • (ii) einem zweiten Monomer, das das Copolymer vernetzt und eines ist aus
    N,N′-Di(meth)acryloyl-diaminomethan und
    N,N′-Di(meth)acryloyl-1,2-diaminoethan sowie
  • (iii) einem dritten Monomer, das das Copolymer aktiviert und eine der folgenden Säuren ist
    3-(Meth)acrylamido-essigsäure,
    3-(Meth)acrylamido-propionsäure,
    4-(Meth)acrylamido-buttersäure,
    6-(Meth)acrylamido-hexansäure,
    N-(Meth)acryloyl-L-alanin,
    N-(Meth)acryloyl-L-valin,
    N-(Meth)acryloyl-L-leucin,
    N-(Meth)acryloyl-L-phenylalanin,
    N-(Meth)acryloyl-L-tyrosin,
    N-(Meth)acryloyl-L-methionin,
    N-(Meth)acryloyl-L-lysin und
    N-(Meth)acryloyl-L-prolin,
    oder ein Methylester einer dieser Säuren.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyacrylharz ein Copolymer nach Anspruch 2 ist, das mit Ethylendiamin amidifiziert worden ist.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der Aminosäurenkupplung verwandte N-Schutzgruppe Boc ist und das Kupplungsverfahren wie folgt ist:
  • 1. Waschen: destilliertes Wasser - 2- bis 4mal, jeweils 2 min;
  • 2. Schutzgruppenabspaltung: HCl (6N) in Wasser - einmal, 2 min und noch einmal, 30 min;
  • 3. Waschen: destilliertes Wasser - 4- bis 6mal, jeweils 2 min;
  • 4. Neutralisieren: 1 Äquivalent Boratpuffer, 12,5 mM von pH 8,5-9,0 - einmal, 1 bis 2 min, und noch einmal, 1 bis 2 min;
  • 5. Waschen: destilliertes Wasser - 4- bis 6mal, jeweils 2 bis 2 min;
  • 6. Waschen: DMF - zweimal, jeweils 1 bis 2 min;
  • 7. Kuppeln: symmetrisches Anhydrid (2 Äquivalente, zweimal in DMF);
  • 8. Waschen: DMF oder NMP - zweimal, jeweils 2 min; und
  • 9. Waschen: destilliertes Wasser, viermal, jeweils 2 min.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der Aminosäurenkupplung verwandte N-Schutzgruppe Fmoc ist und das Kupplungsverfahren wie folgt ist:
  • 1. Waschen: destilliertes Wasser - 4- bis 6mal, jeweils 2 min;
  • 2. Abspalten der Schutzgruppe: Piperidin oder Diethylamin in Wasser;
  • 3. Waschen: Isopropanol, zweimal, jeweils 2 min; destilliertes Wasser - 4- bis 6mal, jeweils 2 min;
  • 4. gegebenenfalls Waschen: DMF - einmal, 2 min;
  • 5. Kuppeln: symmetrisches Anhydrid (3mal in Überschuß in DMF) und
  • 6. Waschen: DMF (zweimal, jeweils 2 min); destilliertes Wasser - 6mal, jeweils 2 min.
6. Verfahren, im wesentlichen wie mit Bezug auf die Beispiele beschrieben.
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