JPH02129200A - ペプチドの固相合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本明細書中で使用されている略号はＥｕｒ．　Ｊ。

Ｂｉｏｅｈｅｍ，　１３Ｊ　９　−　３７　（１９８４
）に掲載されるごときＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｊｏｉｎｔ
　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａ
ｌＮｏｍｅｎｅｌａｔｕｒ＊の１９８３年の提唱（Ｒｓ
ｅｏｒｒｍａｎ　ｄａｔｉｏｎ　）に従ったものである
。尚、本明細書中では以下の略号も使用されている： ＴＦＡ　　　　トリフルオル酢酸 ＤＣＭ　　　ジクロルメタン Ｄ■゛　　　ジメチルホルムアミド ＮＭＰ　　　　Ｎ−メチルピロリドン ＤＭＡｅ　　　ジメチルアセトアミド アミノ酸及びその残基は，特に規定されていない限り、
Ｌ一立体配置のもの、例えばＡＬａ　＝　Ｌ　ーアラニ
ン、ＤＡム　＝Ｄーアラニンである。。（メタ）アクリ
ル酸”という用語はアクリル酸又はメタクリル酸を表わ
すのに使用されている。

通常の固相−？グチド合成法は下記の操作工程からなる
： １　−　Ｂｏｃ基の脱保護： ２一洗浄： ３−α一位のＮＨ２の中相： ４一洗浄： ５−カップリング：及び ６−洗浄 脱保護工程と中和工程は樹脂−はデチド付加物（　ｒ＠
ｓｉｎ　−　ｐｅｐｔｉｄｅ　）　ｆ　ＤＣＭ中のＴＦ
Ａとジイソプロビルエチルアミンの溶液で処理すること
くより行われる。これと同一の溶剤は中間の洗浄工程で
も使用される。どのようなカップリング剤（対称的無水
物、ジシクロへキシルカルボジイミド、ヒドロキシベン
ゾトリアゾール等）が使用された場合でも、カップリン
グ反応はＤＣＭ中か又はＤＭＦ中で行われる。

従って、固相ペプチド合成法はＴＦＡのごとき。

どちらかと云えば高価な溶剤及び薬品ン多量に使用する
：従って、はグチドの価格は、その合成中に使用される
ＤＣＭ　、　ＮＭＰ　、ＤＭＦ　、　ＤＭＡｅ　　及び
ＴＦＡの価格により、直接、影響を受ける。

従って、はデチドの製造価格を低下させるためには、よ
り安価な溶剤と薬品を見出丁ことは特に興味のあること
であろう。

本出願人の欧州特許第０．０７９８４２号明細書には、
下記の３種の単量体の共重合体、すなわち。

（ｉ）　　共重合体のマトリックスを提供するかつ１−
（メタ）アクリロイルピロリドン −（メタ）アクリロイルビぼりジン １−（メタ）アクリロイルパーヒドロアゼピン１−（メ
タ）アクリロイル−４−メチルビはラジン４−（メタ）
アクリロイルモルホリン Ｎ、Ｎ−ジメチル−（メタ）アクリルアミド及びＮ、Ｎ
−ジエチル−（メタ）アクリルアミドの１つである第１
の単量体： （ｉｔ）　　共重合体を架橋させるかつＮ　、　Ｎ’−
ジ（メタ）アクリロイルジアミノメタン及びＮ、Ｎ’−
ジ（メタ）アクリロイル−１，２−ジアミノエタン の１つである第２の単量体：及び ０１６　　共重合体を活性化するかつ下記の酸：２−（
メタ）アクリルアミド酢酸 ３−（メタ）アクリルアミドプロピオン酸４−（メタ）
アクリルアミド酢酸 ６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸Ｎ−（メタ）ア
クリロイル−Ｌ−アラニンＮ−（メタ）アクリロイル−
Ｌ−バリンＮ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−ロイシンＮ
−（メタ）アクリロイル−Ｌ−フェニルアラニンＮ−（
メタ）アクリロイル−Ｌ−チロシンＮ−（メタ）アクリ
ロイル−Ｌ−メチオニ／Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ
−リシン及びＮ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−プロリン
又はこれらの酸の１つのメチルエステル： ０１つである第３の単量体； の共重合体であるポリアクリル酸系樹脂が記載されてい
る。

これらの共重合体は第３の単量体から誘導された遊離の
カルボキシ基又はメトキシカルボニル基を有する。本出
願人の欧州特許第ｇ　＋　４０８号明細書には更に、こ
れらの基がエチレンジアミンでアミド化（ａｍｌｄｉｆ
ｙ　）されているポリアクリル酸系樹脂が記載されてい
る。上記欧州特許明細書には上記ポリアクリル酸系樹脂
な固相ペプチド合成に使用することも記載されているが
、この場合、前記したごとき通常ポリスチレン樹脂と併
用される高価な溶剤と組合せて使用されているに過ぎな
い。

本発明によれば、第１のアミノ酸残基なポリアクリル酸
系樹脂に結合させ、１種又はそれ以上の他のアミノ酸残
基馨カップリングさせて所望のはデチドχ形成させつい
でかく形成されたはデチドを前記樹脂から脱離させるこ
とからなるにプチドの固相合成法において、カップリン
グ工程（ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｐｒｏｔｏｅａｌ　）中に
、前記アクリル酸系樹脂を水及び／又は水性溶液で洗浄
する工程を包含させたことを特徴とするはプチドの固相
合成法が提供される。

本発明の方法は、ポリスチレン樹脂と異り、ポリアクリ
ル酸樹脂の有する親水性馨利用している。

本発明の方法で使用するだめのポリアクリル酸系樹脂は
前記欧州特許第００７９８４２号及び同第００８１４０
８号明細書く記載されているものであることが好ましい
。

第１のアミノ酸残基はグリコールアミド部分ン介してマ
トリックス上に固定し得る（　Ｂ、Ｃａ１ａｓ等、Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　１９８５．　Ａｔ　５３３１　
　参照）。

（Ｘ　＝　Ｂｒ、　Ｃ１又はＯＨ）　　のごとき他の不
安定な（１ａｂｉｌｅ　）　　バインダー？使用する以
前の試みは満足すべきものではなかった。

ついで樹脂を水で洗浄し得る。形成させるべきハテチド
配列の次のアミノ酸はつぎの工８に従って付加し得る（
保護基がＢｏｅの場合に適用可能）−洗浄工程： ２−説保富工程： ３−洗浄工程： ４−中和工程： 蒸留水−２〜４回、各々２分 間； 水中のＩ（Ｃ１（６Ｎ）を使用＝ １回目２分間及び２回目３０ 分間； 蒸留水−４〜６回、各々２分 間： １当分８酸塩緩衝液１２．５ ｍＭ、　ｒｙＢ　＝　８．５−９．０を使用。

１回目、１〜２分間及び２回 目１〜２分間： ５−洗浄工程：　蒸留水−４〜６回、各々１〜２分間： ６−洗浄工程：ＤＭＦ−２回、各々１〜２分間７−カツ
ブリンゲエ程：対称的無水物を使用（２当址；　ＤＭＦ
中で２回）； ８−洗浄工程：　　ＤＭＦ又は犯１Ｐ−２回、各々２分
間：及び ９−洗浄工程：　蒸留水−４回、各々２分間。

また、保護基がＦｍｏｃ　　である場合には、延長工程
（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　）はつぎ
σ〕ごときもσ〕であり得るニ ー洗浄工程：　蒸留水−４〜６回、各々２分間： ２−脱保護工程：　水中のピペリジン又はジエチルアミ
ンを使用： ３−洗浄工程：　イソグロバノール、２回、各々２分間
；蒸留水、４〜６回。

各々、２分間： 八　−洗浄工程（必要に応じて実施）：ＤＭＦ　−１回
、２分間： ５−カッゾリン灯程：対称的無水物？使用（３回、ＤＭ
Ｆ中で過剰に）：及び ６−洗浄工程：ＤＭＦ−２回、各々、２分間：蒸留水−
６回、各々、２分間。

合成が完了したとき、得られたグリコールアミド結合を
下記の処理ニ ーインゾロパノール中でのＮａ　ＯＨによる処理ニート
リフルオルエタノール、メタノール、エタノール又はイ
ソゾロパノール中でのＮＨ，による処理ニ ー　ＤＭＦ中でのＮ２Ｈ４による処理ニートリエチルア
ミン中でのＣＨ，ＯＨＫよる処理：の一つにより、選択
的破断（ｂｒｅａｋｉｎｇ　）　　を行うことにより、
ベグチド？マトリックスから分離する。

この方法を使用することにより、ドルマンの参照ベゾチ
ド（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　）　（ｏイ
シ７・アラニン、グリシン、バリン）とＬＨＲＨ同族体
を約５０％の収宅で得ろことができる。

本発明の実施例を以下に示す。

実施例Ｉ ＤＴｒＰ’　　−ＬＨＲＨ：　ｐｙｒｏ　−Ｇｌｕ　−
Ｈｉｓ　−ＴｒＰ　−８ｅｒ　−Ｔｙｒ　−ＤＴｒＰ　
−Ｌａｕ　−Ａｒｇ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙの合成 欧州特許第００７９ｇ４２号明細書の実施例１９に記載
の方法に従って１−アクリロイルピロリドン。

Ｎ、Ｎ’−ジアクリロイル−１，２−ジアミノエタン及
びメチル　２−アクリルアミドアセテートを共重合させ
ることにより調製したポリアクリル酸樹脂５ｇ（０，５
５ミリモルＮＨ２／ｇ）を下記のごとく処理した： ｌ　　ＤＣＭで洗浄（４回：各々、２分間）二　ＤＣＭ
中の５憾ジイソグロビルエチルアミンで中和（各々、２
分間）。

ユ　ＤＣＭで洗浄（４回、各々２分間）５６簀の無水ブ
ロム酢酸４．２９．９　（０，０１６５キル）を上記樹
脂に添加した。４５分間振盪後、ＤＣＭ溶液’ｋ濾過に
より除去しついで臭素化支持体（ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ
　５ｕｐｐｏｒｔ　）　　（樹脂）を下記のごとく洗浄
した： ／ＤＣＭ（４回：各々、２分間） ユ　ＤＭＦ　（４回、各々、２分間） Ｍａｒｙ　　等の方法（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ｐ＠ｐｔｉｄｅＲｅａ、　１９ｇ８１３１．４１２
　参照）に従ってｖ！４製したＢｏｃＧｌｙＯＨのセシ
ウム塩（４，２２！ｉ、　０．０１３７モル）をＤＭＦ
（７５ｄ）中に溶解し、この溶液を樹脂に添加した。混
合物を２日間、周囲温度で振盪した。この時点でＤＭＦ
　）ｌ流出させ１重合体を下記の浴剤： ／　ＤＭＦ（１０回、各々２分間） ユ　メタノール（４回、各々２分間） ３．０ＣＭ（４回、各々２分間） り　ジエチルエーテル（４回、各々、２分間）で洗浄し
た。

樹脂’ｋ　ＫＯＨベレットの存在下、高度の真空下で２
時間乾燥させた。結合したＧ１７の量は、排気しかつ密
封したチューブ中でかつ１１０°Ｃで２４時間、６ＮＨ
Ｃ／ｙ使用して加水分解した後にアミノ酸分析により測
定して０．４８３　ミリモル／ｇであった。

ＢｏｅＧｌｙ−樹脂付加物（４，４７，９）Ｙ水で洗浄
しく４回、各々２分間）ついでＢｏｃ基を水中の６ＮＨ
Ｃ７を使用して脱離させた（２回、１回目２分間。

２回目３０分間）。Ｈｃｔｗ濾過により除去しついで樹
脂を水で洗浄した（６回、各々、２分間）。

硼酸塩緩衝液（１２，５ミリモル、−９）を使用して中
和７行った；この操作では樹脂に５０ｍ１の緩衝液で２
回処理した（各々、１分間）。水で洗浄しく６回、各々
２分間）、更にＤＭＦで洗浄した後（２回、各々、２分
間）、ＤＭＦ（５０ｍｌ）中のＢｏｃＰｒｏＯＨの対称
的無水物（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌａｎｈｙｄｒｉｄｅ
　）を樹脂に添加した。

対称物無水物の溶液は以下の方法で調製した二ＲｏｃＰ
ｒｏＯＨ（３，５５ｇ、　０．０１６５モル）ｉ４ｏＲ
１のＤＭＦに溶解し、溶液を０°Ｃに冷却しついで１０
ｄのＤＣＭ中のジシクロへキシルカルボジイミド（１，
６９ｆＪ　、　８．２５ミリモル）？添加した。０°Ｃ
で３０分間攪拌しついでｆ過した後、溶液χ加熱するこ
となしに高度の真空下で蒸発させ、残渣４　ＤＭＦ中に
溶解しついで樹脂に添加した。混合物を３０分間撮盪し
た：この時点でのＫａｉｓｅｒ　　等による定性的ニン
ヒドリン試験（Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｓｍ、　１９７
０．３４゜５７５）の結果は負であり、カップリング収
率は９９．６％以上であることを示した。ＤＭＦ　’に
除去した後、支持体Ｙ　ＤＭＦで２回（各々、２回）及
び水（４回、各々２分間）で洗浄した。

この操作工程’；ｌ　ＤＴｒｐ　　−ＬＨＲＨ配列の他
のアミノ酸χ導入するのに使用した。対称的無水物はつ
ぎのものを使用して調製した：　ＢｏｅＡｒｇ（Ｍｔｓ
）ＯＨ（７，５２ｕ、０．０１６５　　モル　）、　　
　ＢｏｃＬｅｕＯＨ（４，１ｌＡ７＋０．０１６５モル
）　、　　ＢｏｅＤＴｒｐＯＨ（５，０２，９，０，０
１６５モル）　、　　ＢｏｃＴｙｒ　（２，６’；ジク
ロルンジル）　ＯＨ又よ　ＢｏｅＴｙｒ　　（２，６Ｄ
ＣＢ　　）　　ＯＨ（７，２６ｐ　　、　　０．０１６
５モル）　、　　ＢｏｅＳｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＨ（４，８
６Ｍ、　０．０１６５モル）。

ＢｏｃＴｒｐＯＨ（５，０２Ｍ、　０．０１６５モル）
　、　　ＢｏｃＨｌｓ（ジクロルフェニル’）　ＯＨハ
ＢｏｃＨ１ｓ　（Ｄｎｐ）ＯＨ（６，９４，９，０，０
１６５モル）　、　　ｐｙｒｏ−ＧｌｕＯＨ（２，１３
ｇ、　０．０１６５モル）。

ｐｙｒｏ　−ＧｌｕＯＨの導入後、樹脂をメタノール（
４回、各々、２分間）及びジエチルエーテル（４回、各
々、２分間）で洗浄しついで高い真空下。

周囲温度で４８時間乾燥した。

ついで×プチドー樹脂付加物乞ＤＭＦ　（５０ｍｌ　）
中のチオフェノール（ｌＱｍＪ）で処理して、ヒスチジ
ン側頌上のジニトロフェニル基ヲ除去した。

４５分間振盪後、チオフェノール溶液を流出させついで
樹脂４　ＤＭＦ　（４回、各々、２分間）。

ＤＣＭ　（４回、各々２分間）ついでジエチルエーテル
（４回、２分間）で洗浄した。樹脂乞高度の真空下で１
２時間乾燥した。ついで樹脂を０°Ｃで５０ｒｎｌのつ
ぎの溶液の各々で２回（各々３０分間）処理したニトリ
フルオルメタンスルホン酸（３，６ｄ）、アニソール（
４屑ｌ）、チオアニソール（４ｄ）、メタクレゾール（
４ゴ）及びトリフルオル酢酸（４０ｍｌ）。脱保護の終
了後、樹脂Ｙ　ＤＣＭ　（２回、各々、２分間）　、　
ＤＣＭ／　ＤＭＦ　（５０／　５０　）（２回、各々、
２分間）、ＤＣＭ中の５％ジイソプロピルエチルアミン
（２回、各々、１分間）。

ＤＭＦ　（３回、各り、２分間〕、イン７＃ロバノール
／水（７０／３０　）　（３回、各々２分間）で洗浄し
た。ついでペプチド−樹脂付加物ｗ　ＮＨ３を飽和さ−
せたトリフルオルエ、タノール溶液（２５０１１１７）
に懸濁させた。

混合物乞周囲温度で１５時間振盪し、脱保護されたＤＴ
ｒｐ　　　ＬＨＲＨ’ａ’含有するトリフルオルエタノ
ール溶液乞捕集しついで支持体を水（４回、２分間）、
メタノール（４回、各々、２分間）及び水（６回、各々
、２分間）で洗浄した。ｒ液を捕集し、ｐＨをＩＮ塩酸
でｐＨ４約４にした；ついでｒ液を加熱することなしに
真空下で濃縮した。残渣７ＮａＣ／　　の直線状勾配（
ｌ　ＯｍＭ　Ａｃ０Ｎａ　ｐｔ（５，０〜１０　ｍＭ　
ＡｅＯＮｍ、　０．１５　Ｍ　ＮａＣ／、　ｐ）ｌ　ｓ
、ｏ　）Ｙ：有するカルボキシメチルセルロースのカラ
ム（ＷａｔｈｍａｎＣＭ　５２．ＩＱ　ｘ　２α）　上
で分別した。適当な７ラクシヨンχ捕集し、凍結乾燥し
ついでｌＯＭＨｃｊ中の５ｅｐｈａｄｓｘ　Ｇ　ＩＱの
カラム（１００ｘ　２．５　ｃ！ＩＬ）上でのｒルｒ過
により脱塩した。ついでにプチドフラクションｆ　ＩＪ
ｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ　ＩＪ５　（１０Ｉｎｎ　）　
　のカラム（２７０ｘ　２０ｍｍ　）上での）ＩＰＬＣ
にかけ、かつ水中の０．０１１トＩＪフルオル酢酸（Ｔ
ＦＡ）及びアセトニトリルを溶離剤として、使用して精
製した。

収率：５１１（支持体の当初のアミノ基に基づく収率）
。

アミノ酸分析：　Ｇｌｕ　Ｏ，９９Ｔｌｌ、　　Ｌｅｕ
　１．０　ｉｌｌ。

Ｈｌｇ　１．０（１１，ＴｒＰ　１．８９（２）、　　
Ｓｅｒ　Ｏ，９６Ｈｌ、　　Ｔｙｒｏ、９７（ＩＩ、　
　Ｐｒ００．９９（ＩＩ、　　Ｇｌｙ　１．０２（１１
゜酸性条件下で不安定な幾つかのアミノ酸については１
分析値は該アミノ酸の分解のため、予期した値より低い
ものであり得る。

上記と同一の方法を使用して下記のペプチドを調製した
ニ ードルマフ（Ｄｏｒｍａｎ）ペプチド　：　　Ｌｅｕ　
Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＶａｌＯＨ収率＝４６．６％ ＧｌＦ　：　０．９６．　Ａｌｍ　＝　０．９４．　Ｍ
ａｌ　＝　１．０５．　Ｌａｕ　〜１．０４ 一ラミニン（Ｌａｍｌｎｉｎｅ）：　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　
Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＮＨ２収兆＝　３５．６チ Ｓａｒ　＝　０．７５．　Ｇｌｙ　＝　１．０３．　Ｉ
Ｉｓ　＝　０．９９．　Ｔｙｒ　＝、Ａｒｇ　＝　　０
．（？９゜ −”ボンピー”（“Ｐｏｍｂｅｅ”）酵母の細胞周期か
らのＣＤＣ２８キナーゼ蛋白 収率＝６４．１　％（粗はプチド） Ｔｙｒ　Ｌｙ８Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒ
ｇ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｙＯＨＡｇｐ＝　Ｉ、　Ｇ１ｙ＝　１
．０８．　Ａ１ａ＝＝　Ｉ、　Ｌ＠ｕ＝　１．０５Ｘ　
２．　Ｔｙｒ＝＝０．９９．　Ａｒｇ＝０．９９．　Ｌ
ｙｓ＝　ｌ、　　ｐｒ。

＝ｌ。

一チロシン　ホスファターゼ 収率：　５Ｂ、６４　（粗ベグチド） Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　
Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＳｅｒ　　ｌ１ｅＯＨ Ａｓｐ　＝　０．９５　Ｘ　３．　　Ｓｓｒ　＝　０．
５＆　Ｘ　３．　Ｇｌｕ　＝　０．６７゜ＩＩｓ　＝　
１．１　　、　Ｌｅｕ　＝　１．１゜−オンコｒン（Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ　：　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ
　Ｌｓｕ　Ａｒｇ収率二５３．４％ Ｐｈｅ　：＝　０．９７．Ａｒｇ　＝　２　Ｘ　　１．
１．Ｇｌｙ　＝　　１．０２゜Ｔｈｒ　＝　０．９９．
Ｌａｕ　＝　　１゜実施例２ Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｔの合成。

実施例１で使用したポリアクリル酸樹脂２下記のごとく
処理した： ／　　ＤＣＭで洗浄（４回、各々、２分間）。

ユ　ＤＣＭ中の５％ジイソプロピルエチルアミンで中和
（２′回、各々、２分間）。

ユ　ＤＣＭで洗浄（４回、各々２分間）。

１０ＴｒＬｌのＤＣＭ中の無水ブロムＩ！ｒ￥酸（ＯＪ
Ｓｇ　ｇ。

３．３ミＩＪモル）を上記樹脂に添加した。４５分間振
盪後、　ＤＣＭ溶液？ｒ過により除去しついで臭素化支
持体を下記のごとく洗浄した： ／ＤＣＭ（４回、各々、２分間） ユ　ＤＭＦ　（４回、各々、２分間） Ｍａｒｙ　等の方法（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ
　ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ、　１９８ｇ、　３１．４１２
　）　　に従って調製したＦｍｏｃＶａｌＯＨのセシウ
ム塩（＋、２９．Ｉ／　、２．７５ミリモル）’ｋＤＭ
Ｆ　（１５ｍ　）に溶解しついでこの溶液を樹脂に添加
した。懸濁液乞周囲温度で３日間振盪した。この時点で
ＤＭＦ　’Ｊａ’流出させついで樹脂を下記の溶剤で洗
浄した： ／ＤＭＦ（１０回、各々、２分間）。

ユ　メタノール（４回、各々、２分間）。

、７．ＤＣＭ（４回、各々、２分間）。

ク　ジエチルエーテル（４回、各々、２分間〜樹脂をＫ
ＯＨバレットの存在下、高度の真空下１１２時間乾燥さ
せた。結合したＶａｌの量は、排気し、かつ密封したチ
ューブ中で６　Ｎ　ＨＣ／中で２４時間加水分解した後
にアミノ酸分析により測定して０．４９２ミリモル／ｇ
であった。

Ｆｍｏｃ　Ｖａｌ−樹脂付加物（１，１！７）’ａ’水
で洗浄しく４回、各々、２分間）ついでＦｒｎｏｅ　　
基を水中の１０係ピペリジン又はジエチルアミンを使用
して脱ｈ１させた。ついで樹脂ンイソプロパノール（２
回、各々、２分間）及び水（４回、各々、２分間）で洗
浄した。

ＤＭＦ　（１５ｍ／　）中のＦｍｏｃＧｌｙＯＨの対称
的無水物を支持体に添加した。対称的無水物の溶液は下
記の方法で調製した： ＦｍｏｃＧｌｙ　ＯＨ（０，９８１ｇ、　３．３ミリモ
ル）　Ｖ　ＤＣＭ（１５ｍｌ）ｉｃ溶解し、溶液χ０°
Ｃに冷却しついでＤＣＭ　（Ｉ　Ｏｍｌ　）中のジシク
ロへキシルカルボジイミド（０，３３９、！；’　、　
１．６５　　ミリモル）を添加した。

濁った混合物ｖ　ｏ’ｃで２０分間攪拌し、ジシクロヘ
キシル尿素の沈ｍをｒ過により除去しついでｒ液？真空
下、室温で濃縮した。油状残渣’４　ＤＭＦ（１５ｍ）
中に溶解しついで得られた溶液を樹脂に添加した。混合
物を室温で４５分間振盪した：この時点でＫａｉｓｅｒ
　　等の定量的ニンヒドリン試験（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　１９７０．３４．５７５参照）の結果は負で
あった。ＤＭＦをｒ過により除去し、ついで支持体Ｆ！
＝　ＤＭＦ　（２回、各々、２分間）及び水（６回各々
、２分間）で洗浄した。

この操作工程？使用してつぎのアミノ酸：　ｄｅｕ及び
Ａｌａ　Ｙ導入した。対称的無水物は１．１６．９（３
，３ミリモル）のＦｍｏｃＬ＠ｕＯＩ（と１．０２　、
！９　（３，３ミリモル）のＦｍｏｃＡｌａＯＨとから
調製した。反応の完了後、ペプチド−樹脂付加物乞イソ
ゾロパノール（４回、各々、２分間）、水（４回、各々
、２分間）及びイソゾロパノール／水（７０／３０）（
４回、各々、２分間）で洗浄した。

ついでペプチド−樹脂付加物をイソゾロパノール／水（
７０／３０）中に懸濁させ、１．Ｉｉｔ／のｌＮＮａＯ
ＨＹ添加した。混合物を周囲温度で５時間振盪し、　Ｌ
ａｕ　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　’ｌ含有するイ
ソプロバノール／水混合溶液を捕集しついで支持体を水
（４回、各々、２分間）、メタノール（４回。

各々、２分間）及び水（４回、各々、２分間）で洗浄し
た。ｒ液を補集し、Ｉ　Ｎ　ＨＣ／　を使用して−を４
とし、ついで溶液乞真空下、室温で濃縮した。

残渣％ｒ：Ｌｉｅｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ　１８　（ＩＱ
μｍ）のカラム（２５０Ｘ２０關）上でのＨＰＬＣにか
け、水中の０、；％ＴＦＡ及びアセトニトリルＹ溶離剤
として使用して精製した。

収率：５４％（支持体の当初のアミノ基に基づく収庖）
。

アミノ酸分析　：　　Ｌｅｕ　　１．０２（１１，Ａｌ
ａ　０．９９ｆｌｌ、　　Ｇｌｙ、１　（１１，Ｖａｌ
　　１．０　（１１゜上記と同一の方法を使用して下記
のはプチド乞合成したニ ードＡ／　マンＡニア’チド：　　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｙ　ＶａｌＯＨ収藁＝　４６．６係 Ｇｌｙ　＝　０．９３．Ａｌａ　＝　０．９１．Ｖａｌ
　　＝　　１．０１．Ｌｅｕ　＝１゜ 一ラミニン：　Ｔｙｒ　ＩＩｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒ
ｇＮＨ２収率＝　４６．３壬 Ｓｓｒ　＝　０．７９．Ｇｌｙ　＝　　１．０１．ＩＩ
ｓ　＝　０．９６．Ｔｙｒ　＝０．８９．Ａｒｇ　＝　
０．９３゜ “ボンピー”酵母の細胞周期からのＣＤＣ２ｇキナーゼ
蛋白収率：　Ａ８．５チ（粗ペプチド） Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａａｐ　Ｌｅｕ　Ａ
ｒｇ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＯＨＡｓｐ　＝　０．９７．　Ｇ
ｌｙ　＝　１．０２．　Ａｌａ　＝　０．９８．　Ｌｅ
ｕ　＝、０２　Ｘ　２．　Ｔｙｒ　＝　０．９８．　Ａ
ｒｇ　＝　０．９６．　　Ｌｙｓ　＝Ｐｒｏ　＝　０．
９７゜ −チロシンホスファターゼ 収率＝　６１．６係（粗米デチド） Ｃｙ＠　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｓｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　　
Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａ８ｐＳｅｒ　　１１ｅＯＨ Ａｓｐ＝０．９９Ｘ　３，５ｅｒ＝０．６３Ｘ　　３．
Ｇ１ｕ＝０．７３゜ＩＩｓ　＝　　１．０３．Ｌｅｕ　
＝　　ｌ。

−オンコダン：　　Ｐｈａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　
Ｌｅｕ　Ａｒｇ収率＝　４９．２係 Ｐｈｅ　　＝ １゜ Ａｒｇ＝ × 、０４゜ ｃｔｙ　＝ １゜ ｈｒ ０．９６゜ Ｌ、。＝　０．９８゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１のアミノ酸残基をポリアクリル酸系樹脂に結合
   させ、１種又はそれ以上の他のアミノ酸残基をカップリ
   ングさせて所望のペプチドを形成させついでかく形成さ
   れたペプチドを前記樹脂から脱離させることからなるペ
   プチドの固相合成法において、カップリング工程中に、
   前記アクリル酸系樹脂を水及び／又は水性溶液で洗浄す
   る工程を包含させたことを特徴とするペプチドの固相合
   成法。 ２、ポリアクリル酸系樹脂は下記の３種の単量体の共重
   合体、すなわち、 （ｉ）共重合体のマトリックスを提供するかつ１−（メ
   タ）アクリロイルピロリドン １−（メタ）アクリロイルピペリジン １−（メタ）アクリロイルパ−ヒドロアゼピン１−（メ
   タ）アクリロイル−４−メチルピペラジン ４−（メタ）アクリロイルモルホリン Ｎ，Ｎ−ジメチル−（メタ）アクリルアミド及びＮ，Ｎ
   −ジエチル−（メタ）アクリルアミドの１つである第１
   の単量体； （ｉｉ）共重合体を架橋させるかつ Ｎ，Ｎ′−ジ（メタ）アクリロイルジアミノメタン及び Ｎ，Ｎ′−ジ（メタ）アクリロイル−１，２−ジアミノ
   エタン の１つである第２の単量体；及び （ｉｉｉ）共重合体を活性化するかつ下記の酸：２−（
   メタ）アクリルアミド酢酸 ３−（メタ）アクリルアミドプロピオン酸 ４−（メタ）アクリルアミド酢酸 ６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸 Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−アラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−バリン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−ロイシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−フエニルアラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−チロシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−メチオニンＮ−（メタ
   ）アクリロイル−Ｌ−リシン及びＮ−（メタ）アクリロ
   イル−Ｌ−プロリン又はこれらの酸の１つのメチルエス
   テル； の１つである第３の単量体； の共重合体である請求項１記載の方法。 ３、ポリアクリル酸系樹脂はエチレンジアミンによりア
   ミド化されている請求項２記載の共重合体である請求項
   １記載の方法。 ４、アミノ酸カップリングで使用されるＮ−保護基はＢ
   ｏｃでありそしてカップリング工程は、１−洗浄工程：
   蒸留水−２〜４回、各々２分間； ２−脱保護工程：水中のＨＣｌ（６Ｎ）を使用−１回目
   ２分間及び２回目３０分 間； ３−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間； ４−中和工程：１当量硼酸塩緩衝液１２．５ｍＭ、ｐＨ
   ＝８．５−９．０を使用、１回 目、１〜２分間及び２回目１ 〜２分間； ５−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々１〜２分間； ６−洗浄工程：ＤＭＦ−２回、各々１〜２分間；７−カ
   ップリング工程：対称的無水物を使用（２当量：ＤＭＦ
   中で２回）； ８−洗浄工程：ＤＭＦ又はＮＭＰ−２回、各々２分間；
   及び ９−洗浄工程：蒸留水−４回、各々２分間；からなる請
   求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５、アミノ酸カップリングで使用されるＮ−保護基はＦ
   ｍｏｃでありそしてカップリング工程は、１−洗浄工程
   ：蒸留水−４〜６回、各々２分間； ２−脱保護工程：水中のピペリジン又はジエチルアミン
   を使用； ３−洗浄工程：イソプロパノール、２回、各々２分間；
   蒸留水、４〜６回、 各々、２分間； ４−洗浄工程（必要に応じて実施）： ＤＭＦ−１回、２分間； ５−カップリング工程：対称的無水物を使用（３回、Ｄ
   ＭＦ中で過剰に）；及び ６−洗浄工程：ＤＭＦ−２回、各々、２分間；蒸留水−
   ６回、各々、２分間 ； からなる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。