JPS60500057A - ＧｎＲＨ作働薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は魚類の下垂体によるゴナドトロピンの放出を左右するはプチドに関する 。更に詳細には、本発明は魚類に投与した場合、ゴナドトロピンの放出量を高め 、また、産卵をおこさせるのに有効なＲプチドに関する。

発明の背景 下垂体は視床下部として知られる脳の基部における領域の茎に結合している。下 垂体は前葉および後葉の二種類の基本的葉を有している。下垂体後葉は視床下部 で生成された二種のホルモン、すなわちバンプレシンおよびオキシトシンを貯蔵 し汎循環系に移行させる。下垂体前葉は多数のホルモンを分泌し、これらのホル モンは、複合蛋白質重たは糖蛋白質の分子であって血清を経ているいろな、器官 へ移動し、そして末梢器官からの他のホルモンの血流中への分泌を刺激する。特 に卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）（これらは往々 にしてゴナドトロピン類またはゴナトロピンホルモンと呼ばれる）は下垂体から 放出される。これらのホルモンは種々に組合って生殖腺の機能を調整して精巣中 にテストステロンを、そして卵巣中にプロゲステロンとエストロゲンを生成させ 、更に配偶子の生成と熟成を調整する。

下垂体前葉からホルモンが放出されるためには通常視床下部で生成された別の種 類のホルモンが前もって放出されることが必要である。前記の様な視床下部ホル モンはゴナドトロピン性ホルモン（特に黄体形成ホルモン、ＬＨ）の放出を起こ す因子として作用する。ＬＨおよびＦＳＨの様なゴナドトロピンの放出因子とし て作用する特別な視床下部ホルモンを本書では”ＧｎＲＨ’”と呼ぶことにする 。ここで’ＲＨ’”は゛放出因子“。

を表わし　ｌ＝　Ｇｎ＝Ｉ　はゴナドトロピンホルモンが放出されていることを 意味する。ＧｎＲＨは別名ＬＲＦおよびＬＨＲＨともいう。ＣｎＲＨはすでにヒ ト、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラット、などの哺乳動物から単離され、同定および合 成もされている。

哺乳動物のＧｎＲＨは次式で示される構造を有するデカ投プチドである。

ｐＧｌｕ　−Ｈｉｓ　−Ｔｒｐ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ　− Ａｒｇ　−Ｐｒ。

−ＧＩＹ　−ＮＨ２ はプチドはアミノ酸を２個以上含有し、そのうちの１つの酸のカルボキシル基は 別のアミノ酸のアミノ基に連結している様な化合物である。前記のＧｚＲＨの構 造式はアミン基が左側にあり、カルボキシル基が右側・である様なはプチドの伝 統的な表示に従ったものである。アミノ基の位置は左側から右側に向ってアミン 基に番号をつけることによって特定される。ＧｎＲＨの場合、右側末端部のカル ボキシル基のヒドロキシ部分はアミノ基（ＮＨ２）で置換されており、これによ ってアミド作用かもたらされる。前記の個々のアミノ酸基の略号は伝統的なもの であり、アミノ酸の慣用名にもとづく。ｐ−Ｇｌｕはピログルタミン酸である。

Ｈｉｓはヒスチジンである。Ｔｒｐはトリプトファンである。Ｓｅｒはセリンで ある。Ｔｙｒはチロシンである。ＧＩＹはグリシンである。Ｌｅｎはロイシンで ある。Ａｒｇはアルギニンである。Ｐｒｏはプロリンである。グリシンを除いて 、本発明のペプチド中のアミノ酸残基、は特にことわらない限りＬ−配置のもの である。

常用のα−アミノ酸類の俗称に関する慣用略の池に、本明細書では下記の略号を 使用する。

Ａ’ｏｕ＝２−アミノ酪酸 Ｇｂｇ　＝２−シクロヘキシルグリシンＯＭ、３　−メチルエステル ＢＯＣ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル 発明の要約 本発明は魚類中でゴナドトロピンの放出をおこさせるのに高い効力を有する硬プ チドを提供する。本発明は魚類の生殖作用に対して有効な作用を及ぼす投プチド を提供する。これらはデカ投プチドおよびノナ啄フチドであり、魚類の産卵をう ながすのに高い効力を有し、また、哺乳類の生殖系に対して特に有効なＧｎＲＨ の類似体である。

４ 本発明により、下記の綬プチドが提供される。このはゾチドは魚類中てゴナドト ロピンを放出させる効力があり、下記の構造式を有する。

ｐＧｌｕ　−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ−Ｒ６−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐ ｒｏ−Ｒｌｏ−ＮＨＲ（式中、Ｒ６はＴｒｐ　、　Ａｌａ　、　Ｐｈｅ　、　Ｌ ｙｓ　、　Ｐｒｏ　、　Ｍｅｔ　、　Ｌｅｕ　、　Ｇｌｕ　１Ａｓｎ　、　Ａｒ ｇ　、　Ｔｙｒ　、　Ｃｙｓ　、　Ｈｉｓ　、　Ｃｈｇ　、　Ｎｖａ　、　Ｏｒ ｎ　、　Ｔｈｒ　、　Ａｂｕ　。

Ｐｈｇ　、　Ｉｌｅ　、　Ｇｌｕ　、　Ａｓｐ　、　Ｎ１６およびＶａｌからな る群から選択さ、れるα−アミノ酸のＤ−異性体である；Ｒ□。はＧｌｙまたは ｄ　ｅ　ｓ　−Ｒ１ｏである；Ｒは水素またはＣｎＹ２ｎＣＹ３（ここで、Ｙは ＨまたばＦであり、そして、ｎは０．１．２または３である）である；ただし、 Ｒｌｏがｄｅｓ−Ｒｌｏである場合、ｎ１ｉｏではない。）前記のＤ−異性体類 はその効力を減することなく、公知の置換基で置換できる。また、ある場合には 、置換体：は効力が若干高まることがある。従って、置換体は本発明の目的にと って、前記の非置換体と同等物であると思われる。置換は例えば、次のようなも のである。Ｈｉｓはそのイミダゾールチッ素をベンジル等で置換できる；　Ｖａ ｌは３−メチ／ｌ／、３−　ｔ　−Ｂｕｔ、　チオ。

３−メチルチオ等で置換できる；　Ｇｌｕは０ｔＢｕ等で置換できる；Ａｓｐは ０１Ｂｕ、アニリド等で置換できる；　Ａｌａはチェニル、１−ナフチル、２− ナフチル、パーヒドロナフチル、２−アンスリル、２−フルオレニル、３−フェ ナンスリル、４−ビフェニリル、パーヒドロナフチル、２．２−）フェニルメチ ル、１−アダマンチル、トリメチルシクロヘキシル、トリブチルシクロヘキシル 等で置換できる；　Ｇｌｕはエチル、シクロヘキシル、ベンジル、アダマンチル 等で置換されたアミノ基を有することができる；　Ｐｈｅはトリメチル、深ンタ メチル、ＮＯ２，Ｃｌ、ＯＣＨ３゜ＣＨ３，ＡｃＮＨ、Ｎｌ２．ジクロロ、にン タフルオロ、トリ（ｎ−メチル）、トリメチルシクロヘキシル等で置換できる； 　Ｏｒｎはラウロイル等で置換できる；　Ｔｈｒは○ｔＢｕで置換できる；　Ｓ ｅｒは７　ｘ　＝ル、０ｔＢｕ　、　０Ｂｚ１等で置換できる；　Ｔｙｒ　Ｉｄ 　ＯＭｅ等で置換できる；　Ｌｙｓはベンゾイル、ＢＯＣ，テレフタロイル、イ ンドメタシニル、ラウロイル、ステアロイル、スクシノイル、イソフタロイル、 アセチルサリチロイル、トリカルバリル酸、トリメソイル、フェニル、クロルア セチル１等でそのニブシロン−炭素ヲ置換でさる；　Ｔｒｐは○−ニトロフェニ ルスルフェニル等で置換できる；また、ＣｙｓはｔＢｕ　、アセトアミドメチル 等で置換できる。

Ｃ−末端用の好ましい置換アミド類は、例えば、エチル、プロピル、２，２．２ −　）　リフルオロエチル、２，２−ジフルオロエチル、シンタフルオロエチル 、トルフルオロメチルオｘ　Ｏ：　３．３，３゜２．２−−Ｓンタフルオロプロ ピルなとである。

この投プチドは完全固相重合法、部分同相重合法、断片縮合法、古典的な溶液添 加法、捷たは最近開発された組みかえＤＮＡ技術などのような適当な方法によっ て合成される。例えば、完全固相合成法の技術は゛固相啄プチド合成パ、Ｓｔｅ ｗａｎｔおよびＹｏｕｎｇ著、Ｆｒｅｅｍａｎ社刊（サンフランシクロ）（１９ ’６９）に開示されてをり、この技術はＶａｌｅ　らに１９７８年８月８日付で 与えられた米国特許第４，１０５．６０３号の開示によって実証されている。断 片縮合（・でよる合成方法は、米国特許第３，９７２，８５９号（１９７６年８ 月３日発効）で実証されている。その他の利用しうる合成法は米国特許第３，８ ４２，０６７号（１９７４年１０月１５日発効）。および米国特許第３，８６２ ，９２５号（１９７５年１月２８日発効）などにより実証されている。

これらの合成法に共通なことは、各種アミノ酸部分の不安定な側鎖基を適当な保 護基で保護し、該側鎖基が存在する間は該側鎖基の部分て化学反応がおこらない ようにすることである。

また、別の共通事項は添加されているアミノ酸または断片がそのガルボキシル基 の位置で反応している間該アミノ酸または断片上のα−アミン基を保護しておき 、続いて、α−アミン保護基を選択的に除去し、α−アミン基の部にで次の反応 が行なわれるようにすることである。

公知の種類のα−アミン保護基として例えば、（１１ホルミル。

トリフルオロアセチル ンスルホニル，ニトロフェニルスルフェニル、ト＋）ｆルスルフェニル，Ｏ−ニ トロフェノキシアセチル、アクリルイル、クロルアセチル、アセチルおよびγー クロルブチリルの様なアシル型保護基類；（２）ベンジルオキシカルボニル（Ｚ ）およびｐ−クロルインジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカル ボニル、ｐ−プロモベンジルオキシカルゼニルおよびｐ−メトキシベンジルオ斤 ジカルボニルのようが置換ベンジルオキシカルボニルの様な芳香族ウレタン型保 護基類；（３）ターブチルオキシカルボニル（　Ｂｏｃ　）、　ジイソプロ上０ ルメトキシカルボニル，イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニルお よびアリルオキシカルボニルのような脂肪族ウレタン型保護基類；（４）シス０ 　Ｋ７−１−ルオキシカルボニル，アダマンチルオキシカルボニルおよびシクロ へキシルオキシカルボニルのようなシクロアルキルウレタン型保護基類；　（５ ）フェニルチオカルボニルのようなチオウレタン型保護基類；　（６１　トリフ ェニルメチル（トリチル）およびベンジルのようなアルキル型保護基類；　（７ ）トＩＪメチルシランのようなトリアルキルシラン基類などかある。好捷しいα −アミノ保護基はＢｏｃである。

本発明の投プチドはクロルメチル化樹脂，メチルベンスヒト８リルアミン樹脂（ ＭＢＨＡ）またはベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂を用いて固相重合法によ り合成することが好ましい。ベンジル−ポリアミドポリマーは市販されている。

丑だ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｓ，　３５１　−　３７ ０　（１９７９）に詳細に説明されている。その好ましい説明は第６図で例証さ れた合成に関連して論じられている。はンジルーポリアミドポＩＪマー’Ｉｉ− 使用する場合、フッ化水素（ＨＦ　）処理によって側鎖保護基を最初に開裂させ 、続いて、アンモノリシスによってはプチドをアミドとして樹脂から開裂させる ことができる。非置換アミドヲ所望する場合、Ｂ）ＩＡ　ｔたはＭＢＨＡ樹脂を 使用することが好ましい。なぜなら、開裂により直接アミドが得られるからであ る。

この合成は米国特許第４，２　１　１，６　９　３号に詳細に述べられた方法に より、アミノ酸を鎖中に段階的に添加することによシ行なわれる。前記米国特許 の開示を参考として本明細書に加える。

当分野で周知なように、側鎖保護基をＳｅｒ　、　ＴｙｒおよびＨｉｓに添加し 、その後、これらのアミノ酸を樹脂上に増成されつつある鎖に結合させる。側鎖 保護基はＴｒｐにも添加できる。しかし。

８ 固相重合法を使用する場合、Ｔｒｐはしばしば側鎖を保護しない１−１使用され る。同様に、４１ｕのα−アミド基は保護して、あるいは保護しないま捷で、使 用できる。

固相重合法は完全に保護された中間体ペプチド樹脂をもたらす。完全に保護され たペプチドを、例えば、アンモニア分解、′こよりクロルメチル化樹脂支持体か ら開裂させ、完全に保護さｎたアミド中間体を生成することができる。本発明の 中間体は次式で示される。

α’　）ｐＧｌｕ　−Ｈｉ　ｓ　（Ｘ２）−Ｔｒｐ　（Ｘ３）−８ｅｒ　（χ４ ）−Ｔｙｒ　（χ５）−Ｒ６（χ６）＝Ｔｒｐ（Ｘ”）−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｒ□ 。−Ｘ７（式中、Ｘｌ　は水素またはｈ６１Ｊ　ｄプチドの段階合成において当 分野でｐＧｌｕのα−アミンチッ素の保護に有用であることが知られているタイ プのα−アミノ保護基、例えば、前記の（２）群のうちのいずれかの基（（２） 群のうちのいずれか１つの基を使用する場合、好ましくは２である）である。

Ｘ２はＨｉｓのイミダゾールチッ素用の保護基であり、２．４−ジニトロフェニ ル、Ｂｏｃ、ベンジル、ＺおよびＴｏｓからなる群から選択される。別にｘ２は 水素であることもできる。このことは、側鎖チン素原子上に保護基が存在しない ことを意味する。

Ｘ３は水素原子、またはインドール とえばホルミル基もしくはベンジル基である。しかし多くの合成に際し、Ｔｒｐ を保護する必要はない。

ｘｌはＳｅｒのアルコール性水酸基のための保護基であり、アセチル基、ばンゾ イル基、テトラヒドロ上０ラニル基、ｔｅｒｔ．　−ブチル基、トリチル基、ヘ ンシル基および２，６ージ〕クロルベンジル基よりなる群から選ばれる。ベンジ ル基が好寸しい。別に、Ｘ４は水素であることもできる。

Ｘ５はＴｙｒのフェノール性水酸基のだめの保護基であシ、テトラヒトゝロピラ ニル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、トリチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカル ボニル基、４−ブロム梗ンジルオキシカルボニル基および２，６−ジクロルベン ジル基よりなる群から選ばれる。２．６−ジクロルベンジル基が好ましい。別に 、Ｘ５は水素であることもでさる。

ｘ６は水素または、Ｒ６としてあられれるようなアミノ酸残基の一部である不安 定な側鎖用の適当な保護基である。

Ｘ７はＮＨ２またはＣ−末端カルボキシル基用の保護基（例えば、エステル、置 換アミド″またはヒト゛ラジド）または固体樹脂への固定結合（例えば、−０− ＣＨ２−樹脂支持体，−〇−ＯＨ２−−＜ンジルーポリアミド樹脂支持体，　− ＮＨ−ＢＨＡ樹脂支持体および一ＮＨ−ＭＢＨＡ樹脂支持体）である。）Ｘ２〜 ｘ６のだめの側鎖保護基を選ぶだめの規準は、保護基が合成の各工枳でα−アミ ノ基保護基を除去するために選ばれる反応条件下で試薬に対し安定でなければな らないことである。

保護基は結合反応条件下で離脱してはならず、また保護基は希望するアミノ酸配 列が完了した時点で投プチド鎖を変化させない反応条件下で除去できなければな らない。

基ｘ７が一〇−ＯＨ２−（樹脂支持体〕捷たは−０−ＣＨ２−ベンジル−ポリア ミド樹脂である場合、ポリスチレン樹脂支持体の多数の官能基の１つのエステル 部分が表わされている。

基Ｘ７が一ＮＨ−　（樹脂支持体〕である場合、アミドゝ結合け０ Ｃ−末端アミノ酸残基をＢＨＡ樹脂またはＭＢＨＡ樹脂に結合させる。

ｋンズヒト゛リルアミン樹脂を使用すると、樹脂支持体から開裂させてはゾチド のＣ−末端部分にグリシンアミドを生成させることにより合成中にアミノ酸配列 を完成させた後、Ｃ−末端アミド官能基を直接得ることができる。その他の樹脂 を使用する場合、固定結合は夜ンジルエステル基である。これははゾチドを樹脂 支持体から開裂させた後、Ｃ−末端アミドまたは置換アミドに、転化させ々けれ ばならない。好ましい方法は、Ｐｒ。

Ｃ−末端を有するはプチドの場合、アルキルアミンまたはフルオロアルキルアミ ンでアミツリシスするか、または、ＧｌｙＣ−末端を有するＲプチドの場合、Ｎ Ｈ３／ＭｅＯＨｉたはＥｔ鉗でアミツリシスすることによって樹脂支持体から保 護Ｒプチドを開裂させ、次いで、水添分解またはフッ化水素開裂によって保護基 を除去することである。別法として、メタノール／（Ｅｔ）３Ｎでエステル交換 することによって開裂し、次いで、得られたエステルをアミドに転化し、そして 続いて前記のように脱保護する。これらの方法はｓｔｅｗａｒｔの゛固相Ｒプチ ド合成″のｐ．４２〜ｐ．４６に記載されている。Ｒ６がエステルによって保護 された側鎖カルボキシル基を有する場合、後者の方法は使用しない方が好ましい 。

後記の実施例に寂いて、α−アミン保護アミノ酸を所望の順序で段階的に結合し 、目的とする構造を有する化合物を生成する。しか１７、各アミノ酸を別々に反 応系中に添加するかわシに、固相反応系に添加する前にこれらのアミノ酸のいく つかを結合１ させておくこともできる。

所望のアミノ酸配列が合成された後、フッ化水素のような試薬で処理することに よって樹脂支持体からペプチドを除去する。

この際、ベンズヒドリノげミン樹脂が使用されていた場合、樹脂からにプチドが 開裂されるばかりでなく、残っている全ての側鎖保護基ならびにグルタミン酸上 のα−アミン保護基（存在すれば）も開裂され、ｋゾチドが直接得られる。クロ ルメチル化樹脂が使用されている場合、ペプチドはメタノール分解によって樹脂 から分離させることができる。その後回収生成物をシリカゲルでクロマトグラフ し、そして、収集画分をアンモニア分解し、メチルエステルをＣ−末端アミドに 転化する。その後側鎖保護基は前記のようにして、または接触還元（例えば、Ｐ ｄ／ｃ）　のようなその他の方法でＴｒｐ部分を損傷しないように維持する条件 を用いて開裂させることもできる。開裂７Ａ］としてフッ化水素を使用する場合 、反応容器中にアニソールを添加し、不安定なアミノ酸側鎖（即ち、トリシトフ ァン）の破壊を防止する。

はプチドの保護基の除去ならびにベンゾヒドリルアミン系樹脂からのはプチドの 離脱は、０°Ｃでフッ１ヒ水素酸（ＨＦ）を用いて行うことが好ましい。ＨＦで 処理する前にアニソ−７・しをにプチドに添加する。真空下でＨＦを除去したの ち、離脱しかつ保護基を除去されたはプチドをエーテルで処理し、テカントし、 希酢酸中に入れ、凍結乾燥する。

Ｒプチドの精製はＣＭＧカラム上でイオン交換クロマトダラフイー処理したのち 溶離系ｎープタノール二０１Ｎ酢酸（容量１２ 比１：１）を用いてセファデックスＧ−２５を充填したカラム上で分配クロマト グラフィー処理する。本発明のＲプチドを魚類に投与する場合、体重１００ｇあ たり約１０μｇ未満の投与量で有効である。魚類およびその他のを椎動物（哺乳 類および両性類を含む）に有効であると思われる。

実　施　例 前記の同相重合法によって下記の式で示される啄プテドを製造する。

ｐＧｌｕ　−Ｈｉｓ　−Ｔ　ｒｐ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅ ｕ−Ｐｒｏ−ＮＨＣＨ２０Ｈ３クロルメチル化樹脂を使用する。また、Ｂｏｃ− 保１７Ｐｒｏのトリエチルアンモニウム塩をエタノール中で還流させることによ って４８時間かけて樹脂上でエステル化させる。プロリン残基はエステル結合に よって樹脂に結合される。

各アミノ酸残基のカップリングにつづいて洗浄、脱保護および次のアミノ酸残基 のカップリングを自動機械を使用して下記の表に示す順序で行なう。樹脂的５９ を用いて開始する。

工程　薬剤および操作　混合時間（分）ＩＣＨ２Ｃ１２洗浄　８０ｍ１（２回） 　３２　メタ／−ル（ＭｅＯＨ）洗浄３０ｍ１（２回）　３３ＣＨ２Ｃ１２洗浄 ８０　ｍｌ　（３回）　３４　５０％ＴＦＡ＋５％　１．２−エタンジチオール のＣＨ２Ｃｌ２溶液７０ｍ１＜２回）　ｔ。

５ＣＨ２Ｃ１２洗浄８０ｍ１（２回）　３６　１２５％ＴＥＡのＣＨ２Ｃｌ２溶 液７０　ｍｌ　（２回）　５７　ＭｅＯＨ洗浄４０ｍ１（２回）　２８ＣＨ２Ｃ １２洗浄８０ｍ１（３回）　３９　特定の保護アミノ酸の溶解度に応じてＢＯＣ −アミノ酸（１０ミリモル）のＤＭＦまたはＣＨ２Ｃｌ２溶液３０ｍ１．および （ＤＣＣ）（１０ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（１回）　３０〜３００１０　 ＭｅＯＨ洗浄４０ｍ１（２回）　３１１　１２．５％ＴＥＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液 ７０ｍ１（１回）　３１２　ＭｅＯＨ洗浄３０ｍ１（２回）　３１３ＣＨ２Ｃ１ ２洗浄８０ｍ１（２回）　３工程１３の後、アリコートをニンヒドリン試験用に 採取する。

この試験が陰性であるとき、次のアミノ酸のカップリングの工程１にもどり、こ の試験が陽性ないし多少陽性であるとき、工程９〜１３にもどる。

前記の順序は最初のアミノ酸を結合させた後、本発明のはプチドの各アミノ酸を カップリングするのに使用される。合成の全過程で、残りのアミノ酸の各々につ いてＮｃＩＢＯＣ保護を使用した。Ｈｉｓの側鎖はＴｏｓで保護した。しかし、 Ｔｒｐの側鎖は保護しなかった。Ｓｅｒのヒドロキシル基剤の側鎖保護基として ０Ｂｚｌを使用した。Ｔｙｒのヒドロキシル基剤の側鎖保護基として２−６ジク ロロベンジルを使用した。２で保護されたｐＧｌｕを最終アミノ酸として導入し た。Ｂｏｃ−ＴｒｐはＣＨ２Ｃｌ２に不溶性であり、ＤＭＦを使用して結合した 。

樹脂からのベゾチドの開裂は０℃でエチルアミンで一晩処理することによって行 なわれる。回収および洗浄につづいて、中間体の側鎖の完全な脱保護はＯｏＣで ＨＦによシ容易に行なわれる。ＨＦ処理に先立って、掃去剤としてアニソールを 添加する。

４ 減圧下でＨＦを除去した後、Ｒｉｖｉｅｒ　らが”ペプチド類−構造と生理作用 −°“（１９７９）、ｐｐ、１２５〜１２８に開示したような半予備逆相ＨＰＬ Ｃによりにゾチドを精製する。純度をチェックし、所望の純度に達していなけれ ば、Ｑ、１ｌＴＦＡ中のアセトニトリル勾配溶離剤を使用し、ＲＰ−ＨＰＬＣに より更に精製する。

薄層クロマトグラフおよび数種類の溶剤系を使用し、ならびに、逆相高速液体ク ロマトグラフおよびリン酸トリエ４チルアンモニウム水溶液とアセトニトリルを 使用することによってノナペプチドエチルアミドが均質であると判断する。得ら れた精製はプチドのアミノ酸分析は生成構造に関する式と一致する。このことは 、各アミノ酸鎖について実質的に整数値がなりたつことを示す。光電旋光計で比 旋光度を測定する〔α〕っ＝−３１（Ｃ：＝１．　１多酢酸） このＲプチドを体重が平均的２ｋｇのサケを用いて生体効力検定する。各サケに 約１０μｇ注射する。　別のサケには哺乳類のＧｎＲＨを同量注射する。これら 両魚類を次いで対照群と比較する。注射から２時間経過後、サケを殺し、放血さ せ、ＬＨ量について特別なラジオイムアッセイを行なう。試験の結果は、合成Ｇ ｎＲＨ類似体は、魚類の下垂体前葉によるＬＨの放出をおこさせるのに哺乳類Ｇ ｎＲＨよシも実質的に効力が高いことを示す。

次式、 ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ　−Ｔｒｐ　−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｒ６−Ｔｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　 −Ｐｒｏ　−Ｒｉｏ　−ＮＨＲで示される組成を有する別のノナ４プチドおよび デカ投プチドを前記の方法に従って合成する。これらを下記の表に示す。

表 これらのベゾチドは前記の試験によるＬＨの放出をおこさせるのに哺乳類ＧｎＲ Ｈよりも一層効果的であシ、従って、魚類の産卵をうながすのに有用であると思 われる。

前記のことに基づき、これらのはゾチドは真青上目魚類の繁殖力を調整するのに 使用できるものと思われる。更に詳細には、これらのイプチドは魚類卿化場でた だちに使用した場合にも、様々な種の真青上目魚類の産卵を促進させるのに極め て有効であると思われる。これに関して、投与は、約５μｇ〜１００μＩの投与 量あるいは体重が約１００．９の魚類についてはもっと低い投与量で、魚類に腹 膜内あるいは筋肉内注射することによって行ない得るものと思われる。また、き ゾチドは魚類が遊泳している水中に溶解させること、によって所定の時間にわた り投与する１に ともできるであろう。この間に、はプチドは誌を通して魚類の血流中に吸収され る。

カエルは二種類のＧｎＲＨ様はプチドを有する。成人カエルの脳中のはプチドは 、哺乳類のＧｎＲＨと同一であることが確認されている。しかし、新生児の脳中 およびを髄神経節中には異なったはゾチドが存在する。現在、このペゾチドは魚 類ＧｎＲＨと同じ構造を有すると思われている。また、哺乳類の神経系は。

中枢神経系中で性行動を変化させるのに有効な似たような片われを有するものと 思われる。これらの合成Ｒメチド類は吐乳動物種、即ち、ラットにゴナドトロピ ン分泌をおこさせる効力を有する。従って、これらのにプチド類は魚類以外のを 推動物、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類および両生類においてゴナドトロピン分 泌または性行動を調節するのに使用できるであろう。

このタイプのＲプチドはしばしば、獣医薬捷たは人間用医療薬として受容できる 、酸は加塩まだは例えば、亜鉛、鉄、カルシウム、バリウム、マグネシウム、ア ルミニウムとの金属錯体のような、非毒性塩の形で投与される。（本発明の目的 にとっては酸付加塩として投与されるものと思われる。）このような酸付加塩の 代表例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩。

タンニン酸塩、ノξモ酸塩、ンユウ酸塩、フマール酸塩、クルコン酸塩、アルギ ン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩。

安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩２　アスコルビン酸塩、酒石酸塩などであ る。

これらのＲプチドまたはその非毒性塩を医薬的に受容できる担体と混合して調製 した医薬組成物はまた、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、脳を髄内または経口の いずれかの投与経路で哺乳類（ヒトを含む）に投与することもできる。ヒトに投 与する場合、はプチドの純度は少なくとも約９３係でなければならない。好まし くは、少なくとも約９８係の純度を有していなければならない。この純度は、企 図されたＲゾチドが存在する全ての同様な投プチドおよびにプチド断片の表示重 量係を構成することを意味する。投与は医、師または獣医師によって行なわれ、 ゴナドトロピンの分泌を調節し、および／または、排卵をおこさせる。必要な投 与量は達成すべき特定の目的および所望の治療期間により変化する。一般的に、 哺乳類ＧｎＲＨについて使用される投与量と同様な投与量が使用できる。例えば 、体重１ｋｇ時点における主たる用途先は真青上目魚類であろう。この場合、投 プチドは著しく低純度のもの、例えば、純度約５係まだは純度約１係のものであ っても使用可能である。

本発明をその好ましい実施態様について記載してきた。しかし、当業者に自明で あるような変更および改変は、添付の請ヱの範囲に述べた本発明の範囲からはず れることなく為し得るものと理解しなければならない。

本発明の様々な特徴は次の請求の範囲に強調されている。

国際調査報告 Ｉｎ１ｅ＋ｎａｌｉｏｎａｌ　Ａ１１ＣｌｉＣａｂａ′ＩＮｏＰＣ’Ｔ八ＪＳ３ ＶＯＬ９２５第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号［Ｆ］発明者　リベール、ジャン ・エドワー　アメル・フレデリック　−ル１ リカ合衆国カリフォルニア州９２０３７．う・ホーラ、ブラックゴド・ロード　 ９６７４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次式で示されるペプチドまたはその非毒性塩。 ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｒ６−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ− Ｒ１，−ＮＨＲ（式中、Ｒ６はＴｒｐ　、　Ａｌａ　、　Ｐｈｅ　、　Ｌｙｓ　 、　Ｐｒｏ　、　Ｍｅｔ　、　Ｌｅｕ　＋　Ｇｌｕ　＋Ａｓｎ　、　Ａｒｇ　、 　Ｔｙｒ　、　Ｃｙｓ　、　Ｈｉｓ　、　Ｃｈｇ　、　Ｎｖａ　、　Ｏｒｎ　、 　Ｔｈｒ　、　Ａｂｕ　。 Ｐｈｇ　、　Ｉｌｅ　、　Ｇｌｕ　、　Ａｓｐ　、　ＮｌｅおよびＶａｌからな る群から選択されるα−アミノ酸のＤ−異性体である；ＲｌｏはＧＩＹまたはｄ ｅｓ　−Ｒｌｏである；Ｒは水素またはＣｎＹ２ｎＣＹ３（ここで、ＹはＨまた はＦであシ、そして、ｎは０．１．２または３である）である；ただし、Ｒｌｏ がｄｅｓ　−Ｒｓ　ｏである場合、ｎは０ではない。）２　Ｒ６がＤ　−Ａｌａ である請求の範囲第１項に記載のペプチド。 ３、Ｒがｄｅｓ　−Ｒ１０であり、ＹがＨであり、そして、ｎが１０ である請求の範囲第１項または第２項に記載のペプチド。 ４　有効量の ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ−Ｒ６−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ　−Ｐｒ ｏ−Ｒｌｏ−Ｎ　ＨＲまたはその非毒性塩からなる魚類の産卵を促進させる組成 物。 （式中、Ｒ６はＴｒｐ　ｒ　Ａｌａ　、　Ｐｈｅ　、　Ｌｙｓ　、　Ｐｒｏ　、 　Ｍｅｔ　、　Ｌｅｕ　、　Ｇｌｕ　＋Ａｓｎ　、　Ａｒｇ　、　Ｔｙｒ　、　 Ｃｙｓ　、　Ｈｉｓ　＋　Ｃｈｇ　、　Ｎｖａ　、　Ｏｒｎ　、　Ｔｈｒ　、　 Ａｂｕ　。 Ｐｈｇ　、　工１ｅ　、　Ｇｌｕ　’、　Ａｓｐ　、　ＮｌｅおよびＶａｌから 々る群から選択されるα−アミノ酸のＤ−異性体である；Ｒｌｏｉｄ　ＧＩＹま たはｄｅｓ−Ｒｌｏである；Ｒは水素またはＣｎＹ２ｎＣＹ３（ここで、ＹはＨ またはＦであり、そして、ｎは０，１．２または３である）である；ただし、Ｒ がｄｅＳ−Ｒｌｏである場合、ｎはＯではない。）０ ９ ５　Ｒ６がＤ　−Ａｌａ　である請求の範囲第４項記載の組成物。 ６、Ｒｌｏがｄｅｓ　−Ｒ２０であり、ＹがＨであり、そして、ｎが１である請 求の範囲第４項または第５項記載の組成物。 ７　次式で示されるにプチド中間体。 （Ｘｌ）ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ　（Ｘ２）　−Ｔｒｐ　（Ｘ３）　−８ｅｒ　（Ｘ４ ）　−Ｔｙｒ　（Ｘ”）−Ｒ６（Ｘ６）−Ｔｒｐ（Ｘ３）−Ｌｅｕ７Ｐｒｏ−Ｒ □。−Ｘ７（式中、Ｒ６はＴｒｐ　、　Ａｌａ　、　Ｐｈｅ　＊　Ｌｙｓ　、　 Ｐｒｏ　、　Ｍｅｔ　、　Ｌｅｕ　、　Ｇｌｕ　。 ＡＳｎ＋　Ａｒｇ　＋　Ｔｙｒ＋　ＣｙＳ　＋　Ｈｌｓ　＋　Ｃｈｇ　＋　Ｎｖ ａ　＋　Ｏｒｎ　＋　Ｔｈｒ　ｌ　Ａｂｕ　ｌ　Ｐｈｇ　ｌ１１ｅ　、　Ｇｌｕ 　、　Ａｓｐ　、　ＮｌｅおよびＶａｌからなる群から選択されるα−アミノ酸 のＤ−異性体である； Ｒ１０はＧｌｙまたはｄ　ｅ’ｓ　−Ｒ１０である；Ｘｌは水素または、α−ア ミノ酸用保護基である；Ｘ２は水素、または、　Ｈｉｓのイミダゾールチッ素用 保護基である； Ｘ３は水素、または、Ｔｒｐのインドールチッ素用保護基である： Ｘ４は水素、または、Ｓｅｒのアルコール性ヒドロキシル基用保護基である； Ｘ５は水素、または、　Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基用保護基である； ｘ６は水素、または、Ｒ６の不安定な側鎖基用保護基である；Ｘ７は０−ＣＨ２ −（樹脂支持体）、ＮＨ−［樹脂支持体］、　エステル類、置換アミド類、ヒド ラジド類およびＮＨ２からなる群から選択される； ただし、Ｘ１〜Ｘ７基のうちの少なくとも１つはＨ，ＮＨ２ま２０ たは置換アミドではない。） ８　Ｒ６がＤ−Ａｌａである請求の範囲第４項に記載の組成物。