JPH072744A - カルボカルシトニンの獲得方法 - Google Patents

カルボカルシトニンの獲得方法

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JPH072744A
JPH072744A JP6011104A JP1110494A JPH072744A JP H072744 A JPH072744 A JP H072744A JP 6011104 A JP6011104 A JP 6011104A JP 1110494 A JP1110494 A JP 1110494A JP H072744 A JPH072744 A JP H072744A
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leu
thr
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Obiols Berta Ponsati
ポンサティ オビオルス ベルタ
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ヨダス ファレス ゲンマ
Martinez David Andreu
アンドリュー マルティネッツ ダビッド
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Lipotec SA
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 カルボカルシトニンの精製過程を単純化し、
収率コストを低減する。 【構成】 樹脂上で簡便に保護および固定したカルボカ
ルシトニン配列末端のカルボキサミドに対応するドコサ
ペプチドであるフラグメント１を、Asu残基とSer残基と
の間の回路を容易に形成しながら、サケカルシトニン配
列のアミノ末端に対応する９番目のペプチドであるフラ
グメント２または３を用いて縮合し、完全なペプチド骨
格（フラグメント６または７）を酸処理し、全体を保護
したペプチドを樹脂から遊離する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サケカルボカルシトニ
ンおよびウナギカルシトニンの固相調整方法および酸付
加によって形成される薬学的に許容できるすべての塩ま
たはその錯体に関する。本発明は、さらに本発明に従っ
てカルボカルシトニンの合成において有用な中間体の調
整、特に、これまでに記載されていない２種まアミノス
ベリン酸誘導体、すなわち、アミノスベリン酸のｗ−ア
リルエステルおよびＮ−α−９−フルオレニルメトキシ
カルボニル−アミノスベリン酸のｗ−アリルエステルの
調整方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】カルボカルシトニンは、カルシトニンに
類似する自然には存在しないペプチドであるが、活性は
カルシトニンにくらべて遥かに大きい。カルシトニンの
様に、カルボカルシトニンは、血中のカルシウム濃度を
調整することができるので、カルシウム過剰血症、骨粗
鬆症あるにはパジェット病などの治療薬剤として重要で
ある。これらの化合物は、天然のカルシトニンに比べて
血清、肝臓あるいは腎臓における安定性が高く、精製過
程中の安定度が高く、カルシトニン存在下のジスルフィ
ド架橋不在による貯蔵時の安定度も高い。
【０００３】（ヒト、サケ、ウサギ、ブタなどの）カル
シトニンを獲得する多数の方法が過去に記述されてい
る。例えば、さまざまな種から組織を抽出する方法、Ｄ
ＮＡ組換え技術による方法、化学合成する方法などであ
る。
【０００４】このため、サケカルシトニンはサケの気管
支腺から抽出することができる。しかし、この方法で生
産した活性抽出物の収率が低いので、抽出の代わりとし
て合成する手段を研究するに至っている。
【０００５】化学合成によってカルシトニンを合成する
方法の中で、ペプチド類およびタンパク質類の合成技術
が進歩するのと平行して、溶液および固相に関する化学
的方法論が記述されている。
【０００６】ペプチドを合成する古典的方法を用いてサ
ケカルシトニンを合成する方法が、１９６９年にGuttma
n Sらによって述べられている（helv. Chim. Acta52, 1
789−1795）。ペプチド合成の分野における固相合成方
法の革新や、保護基の新たな直交方法や新たな担体の導
入を、収斂合成方法に加えたことにより、カルシトニン
の獲得方法に新たな道が開けてきた。
【０００７】これまでに、（ヒト、ブタ、ウシ、サケ、
ウサギなどの）カルシトニンを合成するための様々な固
相合成方法が、米国特許第3,926,938号および第3,891,6
14号の他、Kamber. B, Rinker. B,らの論文述べられて
いる。Peptides: Chemistry and Biology, pp.525-6 (S
mith J.A, Rivier J.E.編）1992年、ESCOM Science Pub
lishersは、t-ブトキシカルボニル（Boc）／ベンジル
（Bzl）型保護方法（Barnay G., Merrifield R.B., 198
0）を扱い、The Peptides（Gross E., MeinhoferJ.編,
vol.2, pp.1-284, Academic Press, New York)は、収斂
合成の概要（Pedro et al., Tetrahedron, 1982, 38, 1
183）と（32のアミノ酸を１つずつ接続する）線状合成
方法を扱っている。一般に、Boc/Bzl誘導体では、脱保
護条件が厳しく、その結果の精製過程が複雑なため、合
成過程において収率コストが高くなるという欠点があ
る。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、脱保護条件を緩和し、精製過程を単純にして、
収率コストを低減させることのできるサケカルシトニン
の調整方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明のカルボカルシトニン方法は、式 Ｒ−Ａｓｕ（ＯＡｌ）−ＯＨ （式中、 ＲはＦｍｏｃ基または水素原子、ＡｓｕはＬ
−α−アミノスベリン酸、Ａｌはアリル基、Ｆｍｏｃ基
は９−フルオレニルメトキシカルボニル基を表す））で
示されるアミノスベリン酸誘導体を利用する。
【００１０】本発明では、アリルアルコールと L-Ｏ´
−アミノスベリン酸と反応させてアリル基でＤ−アミノ
スベリン酸またはＬ−Ｏ´アミノスベリン酸のｗ側鎖を
一時的に選択保護し、かつ、９−フルオレニルメトキシ
カルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル
と反応させて、Ｆｍｏｃ基でＯ´アミノ基を、一時的に
選択保護を行なう。
【００１１】本発明では、サケカルボカルシトニン、ウ
ナギカルボカルシトニン、ヒトカルボカルシトニン、ブ
タカルボカルシトニンおよびウシカルボカルシトニン、
ならびに、 Asu側鎖とその他の種との間に形成された回
路を有するその他のタンパク質またはペプチドを合成す
るためにアミノスベリン酸誘導体 Ｆｍｏｃ−Ａｓｕ
（ｗ−アリル基）−ＯＨを使用する。Ａｓｕ（ＯＡｌ）
残基の脱保護段階については、塩基存在下でＰｄ錯体に
よって実行する。
【００１２】本発明は、高分子支持体への固相合成によ
って、かつ、収斂戦略で結合させたFmoc/tBu型保護基を
介入させて、カルボカルシトニンおよび薬学的に許容で
きる酸付加塩またはその錯体を獲得するカルボカルシト
ニンの合成方法において、 （ａ）式 Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln- Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly- Thr-Pro-(R) フラグメント１ （式中、 (R)は次式、
【００１３】
【化９】
【００１４】で示され、樹脂上に簡便に保護し固定し、
カルボカルシトニン配列のカルボキサミド末端に対応す
るドコサペプチドから成るフラグメント１を、 （ i）式
【００１５】
【化１０】
【００１６】で示され、簡便に形成された回路を有し、
ＳｅｒおよびＴｈｒの側鎖に対する保護基を欠いてお
り、カルボカルシトニン配列のアミノ基末端に対応する
９−ペプチドから成るフラグメント２で縮合するか、ま
たは選択的に （ii）式
【００１７】
【化１１】
【００１８】で示され、形成された回路を有し、ｔＢｕ
基で保護したＳｅｒ残基およびＴｈｒ残基の側鎖を欠い
ており、アミノ基末端に対応する９−ペプチドから成る
フラグメント３で縮合し、 （ｂ）式
【００１９】
【化１２】
【００２０】で示され、カップリング反応後の環化反応
またはその逆から生じるペプチド−樹脂を、特に、フラ
グメント６またはフラグメント７を側鎖を脱保護化する
酸処理にかけて、樹脂を除去し、精製後化学的に純粋な
カルボカルシトニンを生じるペプチドを獲得する。
【００２１】本発明によれば、前記ステップ（ａ）にお
いて、式 FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-OH フラグメント４ で示されるフラグメント４に対応するフラグメント２の
前駆物質で、選択的に縮合し、式 FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu- Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBt)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)- Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly-Thr-Pro-(R) フラグメント９ で示されるフラグメント９に対応するペプチド−樹脂を
獲得した後、脱保護反応および環化反応にかけて、フラ
グメント６を獲得し、順次脱保護反応にかけて、樹脂か
ら切除し、精製して化学的に純粋なサケカルシトニンを
得る。
【００２２】また、本発明によれば、前記ステップ
（ａ）において、式 FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-OH フラグメント５ で示されるフラグメント５に対応するフラグメント３の
前駆物質で、選択的に縮合し、式 FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly- Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBt)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln- Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly Thr-Pro-(R) フラグメント１０ で示されるフラグメント１０に対応するペプチド−樹脂
を獲得した後、脱保護反応および環化反応にかけて、フ
ラグメント７を獲得し、順次脱保護反応にかけて、樹脂
から切除し、精製して化学的に純粋なサケカルシトニン
を得る。
【００２３】本発明では、内標準（ＩｌｅまたはＡｌ
ａ）および樹脂とアミノ酸配列との間の架橋基すなわち
ハンドル（ＡＭまたはＰＡＬ）を取り込むことによっ
て、フラグメント１をｐＭＢＨＡ樹脂から獲得し、残基
ごとに線状合成を行ない、アミノ酸２２個を取り込む。
【００２４】本発明では、２２個のアミノ酸のフラグメ
ントの線状合成中に、Ｆｍｏｃ基をすべての合成におい
てアミノ基末端として用い、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、ＧｌｎおよびＡｓｐ
の側鎖として前記フラグメント１の式における前記側鎖
として示される保護基を使用する。
【００２５】本発明では、内標準および該樹脂とアミノ
酸配列との間の（リニカー（Ｒｉｎｉｋｅｒ）またはワ
ン（Ｗａｎｇ））架橋基を取り込むことによって、フラ
グメント２、３および５を、ｐＭＢＨＡ樹脂から獲得
し、残基ごとに線状合成を行ない、９個のアミノ酸を取
り込む。
【００２６】本発明の方法では、１０個のアミノ酸のフ
ラグメントの線状合成において、Ｆｍｏｃ基をすべての
合成においてアミノ基末端として用い、Ｌｙｓ、Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ、ＣｙｓおよびＡｓｎの側鎖に、前記フラグ
メント２、３、４、５および６の式における側鎖として
示される保護基を使用する。
【００２７】本発明では、式 Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln- Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly- Thr-Pro-(R) フラグメント１ で示される配列および構造を有し、樹脂上に保護および
固定したことを特徴とするウナギカルボカルシトニンの
合成に使用するペプチドフラグメントが得られる。
【００２８】また、本発明では、式
【００２９】
【化１３】
【００３０】で示される配列および構造を有することを
特徴とするサケカルボカルシトニンまたはウナギカルボ
カルシトニンの合成に使用するペプチドフラグメント。
【００３１】さらに、本発明では、式
【００３２】
【化１４】
【００３３】で示される配列および構造を有し、樹脂上
に保護および固定したことを特徴とするウナギカルボカ
ルシトニンまたはサケカルボカルシトニンの合成に使用
するペプチドフラグメントが得られる。
【００３４】また、さらに本発明では、式
【００３５】
【化１５】
【００３６】で示される配列および構造を有し、樹脂上
に保護および固定したことを特徴とするウナギカルボカ
ルシトニンまたはサケカルボカルシトニンの合成に使用
するペプチドフラグメントが得られる。
【００３７】加えて本発明では、式
【００３８】
【化１６】
【００３９】で示される配列および構造を有し、樹脂上
に保護および固定したことを特徴とするウナギカルボカ
ルシトニンまたはサケカルボカルシトニンの合成に使用
するペプチドフラグメント。
【００４０】また、加えて本発明では、式 FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)-VAl-Leu-Gly-OH フラグメント４ で示される部分的に保護した配列および構造を有するこ
とを特徴とするサケカルボカルシトニンまたはウナギカ
ルシトニンの合成に使用するペプチドフラグメントが得
られる。
【００４１】さらに加えて本発明では、式 FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu- Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBt)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)- Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly-Thr-Pro-(R) フラグメント９ で示される構造および配列を有し、樹脂上に保護および
固定したことを特徴とするサケカルボカルシトニンまた
はウナギカルボカルシトニンの合成に使用するペプチド
フラグメントが得られる。
【００４２】もっと加えて本発明では、式 ＦｍｏｃＳｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢ
ｕ）−Ａｓｕ（ＯＡｌ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ フラグメント５ で示される保護された構造および配列を有することを特
徴とするサケカルボカルシトニンまたはウナギカルボカ
ルシトニンの合成に使用するペプチドフラグメントが得
られる。
【００４３】また、さらに加えて本発明では、式 ＦｍｏｃＳｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢ
ｕ）−Ａｓｕ（ＯＡｌ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ− Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｔ）−
Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ− Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｔｈｒ（ｔ
Ｂｕ）−ＡＡ’２５−ＡＡ’２６−Ｇｌｙ−ＡＡ’２８−Ｇｌｙ− Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−（Ｒ） フラグメント１０ で示される構造および配列を有し、樹脂上に保護および
固定したことを特徴とするサケカルボカルシトニンまた
はウナギカルボカルシトニンの合成に使用するペプチド
フラグメントが得られる。
【００４４】その他、本発明では、サケカルシトニン、
ウナギカルシトニン、ヒトカルシトニン、ブタカルシト
ニンおよびウシカルシトニンを合成するために用いるフ
ラグメント１、２、３、４、５、６、７、９および１０
に対応する上述ののペプチド使用方法も提供する。
【００４５】
【実施例】ウナギ、サケ、ヒトなどで自然に生成される
カルシトニンは、１番目と７番目の残基がＬ−システイ
ンである３２個のアミノ酸から成るポリペプチドであ
り、その側鎖は連結されて、ジスルフィド架橋を形成す
る。カルボカルシトニンは、当該位置にＬ−システイン
を持たず、７番目の位置には代わりに次式で示されるＬ
−α−アミノスベリン酸（Ａｓｕ）が連結しており、ｗ
−カルボキシル基はペプチド末端のアミノ基に連結され
て環状構造を生成する。
【００４６】
【化１７】
【００４７】Ａｓｕ側鎖と端末のアミノ末端との間の回
路を生成する際に、副次的な反応を避ける選択的方法に
おいて、Ａｓｕ側鎖は、残部およびペプチド−樹脂結合
に対して直交する基で保護しなければならない。本発明
は、アリル基で保護した側鎖を有する新規のアミノスベ
リン酸誘導体とＦｍｏｃによって保護したα−アミノ基
とを得るための方法について記載する。
【００４８】
【化１８】
【００４９】この保護基をパラジウム触媒作用によって
除去すると、完全にその他の保護基およびペプチド−樹
脂結合に直交する（Greene T.W., Protective Group in
Organic Synthesis, Willey, New York, 1981, p.16
9）。
【００５０】さらに本発明は、上述のＡｓｕ誘導体を使
用してカルボカルシトニンを得るための方法、特に、サ
ケカルシトニンおよびウナギカルシトニンを得るための
方法を記載する（図１）。その式は次のようになる。
【００５１】
【化１９】
【００５２】上式中、AA25は、 Aspまたは Asn、AA26は
Valまたは Thr、AA28は AlaまたはSerである。
【００５３】より詳しくは、本発明は、収斂戦略を組み
合わせて（簡便に機能化した支持体を用いる）Ｆｍｏｃ
／ｔＢｕ型保護基の方法論を用いた固相合成に基づいて
カルボカルシトニンを得る方法を提供するものであり、
すべて図１に基づく。
【００５４】図１の式中、 (R)は次式で表わされる。
【００５５】
【化２０】
【００５６】図１を参照すると、本発明の方法は、カル
ボカルシトニンのカルボキサミド末端に対応するドコサ
ペプチドであるフラグメント１を縮合することから成
り、カルボカルシトニン配列のアミノ基末端に対応する
９番目のペプチドであるフラグメント２で縮合し、この
際、 Asu残基と Ser残基との間に既に形成した回路を用
いて、フラグメント６を得る。別の選択方法として、環
状であるフラグメント３をフラグメント１にカップリン
グする方法があり、これによってフラグメント７を得る
が、これは図１に示した方法に従うものである。
【００５７】一度完全なペプチド骨格（フラグメント６
または７）が構築されてしまうと、ペプチドは樹脂から
遊離し、酸処理によってすでに環状形になった状態で完
全に脱保護化される。精製後、最終的に化学的に純粋な
カルボカルシトニンが得られる。
【００５８】特に、フラグメント１によってフラグメン
ト２または３を用いてフラグメント６または７を生じさ
せるには、既述の従来の固相合成方法を実行する。一
度、縮合が完了すると、カルボカチオンスカベンジャー
存在下で、樹脂にトリフルオロ酢酸を使用して、ヘプチ
ド樹脂には側鎖の脱保護化処理と樹脂の切除処理とが同
時に課せられる。生成粗原料を高圧液体クロマトグラフ
ィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製
する。均質画分の収集物を結合させて冷凍乾燥させるこ
とによって遊離状態のカルボカルシトニンが得られる。
【００５９】本発明の別の態様によれば、本発明の方法
は、図２に従って実行することができる。
【００６０】図中(R）は上述した通りである。
【００６１】図２によれば、環化は、縮合後にも実行で
きる。これを行なうには、２つの方法が可能である。す
なわち、ドコサペプチドに一致するフラグメント１をフ
ラグメント４で縮合しフラグメント９を得るか、フラグ
メント４で縮合しフラグメント１０を得るかであり、こ
れは図２に示した。選択的に、フラグメント１０を線状
合成すなわち、アミノ残基を１つずつ配列が完了するま
で取り込むことによって得ることができる。これは図３
に示した。
【００６２】フラグメント９または１０に一致する骨格
が得られた後は、樹脂の端末のアミノ基の脱保護化（Ｆ
ｍｏｃ基の除去）およびＡｓｕ残基の側鎖（アリル基の
除去）の脱保護化を実行し、フラグメント６または７を
得る。後にどちらの場合も同様に、ペプチド−樹脂をト
リフルオロ酢酸をカルボカルシトニン捕捉剤の存在下で
処理し、樹脂からペプチドを脱保護し遊離する。精製
後、遊離した状態でのカルボカルシトニンが得られる。
【００６３】本発明の別の態様によれば、上述したよう
に、本発明は、上述のフラグメント１を得る方法を提供
する他、フラグメント３の前駆物質であり、ペプチド−
樹脂であるフラグメント５と、フラグメント２の前駆物
質であり、ペプチド−樹脂であるフラグメント４とを得
る方法も提供する。これらのすべては、図１および図２
における本発明によるカルボカルシトニンの調整に用い
られる。
【００６４】フラグメント１、４および５は、パラメチ
ルベンズヒドリルアミン樹脂（ｐＭＢＨＡ）で開始し、
内標準および樹脂と各配列のアミノ酸との架橋（ハンド
ル）を取り込んで得られる。
【００６５】フラグメント１を得るには、カルボカルシ
トニン末端のカルボキシル基末端がカルボヘキシアミド
であるので、取り込む架橋（ハンドル）は［１−（９Ｈ
−フルオレン−９−ｙｌ）メトキシ−ホルムアミド］メ
トキシ−３，５−ジメトキシフェノキシバレリアン酸
（Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ）である（Albericio et al. J.Or
g. Chem. (1990), 55, 3730）か、または、選択的にｐ
−［（Ｒ，Ｓ）−α−［１−（９Ｈ−フルオレン）−９
−イル）メトキシ−ワルムアミド］−２，４−ジメトキ
シベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｆｍｏｃ−ＡＭ）（At
herton et al., J.AM.Chem. Soc., (1975), 97, 658
4）。架橋基の取込み後、１残基ずつ線状合成を行な
い、すべての場合にアミノ末端への保護基としてＦｍｏ
ｃを使用して、２２個のアミノ酸を取り込む。側鎖 Ｌ
ｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｈｉ
ｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、およびＡｓｐに対する保護基は、
図３に示した。
【００６６】図３中、 (R)は上述したものと同様であ
る。
【００６７】フラグメント４を得るには、末端のカルボ
キシル基末端がカルボン酸すなわち樹脂［４−（ヒドロ
キシメチル）フェノキシメチル−コポリ（スチレン−１
％ジビニルベンゼン］（ワン（Ｗａｎｇ）樹脂）（Lit.
S. :Wang、JACS 1973,95,1328)でなければならない。
【００６８】取り込まれる架橋基（ハンドル）は４（４
−ヒドロキシメチル−３−メトキシ−フェノキシ）−酪
酸（ＨＭＰＢ）であり、リニカーハンドルとしても知ら
れている（Fl rsheimer et al）。どちらの場合も、架
橋の取込み後、すべての合成においてアミノ基末端の保
護基としてのＦｍｏｃ基および側鎖ＳｅｒおよびＴｈｒ
に対するｔＢｕ保護基１残基ずつ線状合成を行ない、９
個のアミノ酸を取り込む。これについては、図４に示し
た。
【００６９】図４と図１、２によれば、２２個のアミノ
酸から成るフラグメント（フラグメント１）で取り込む
前後に、９番目のペプチドの環化を実行することができ
る。これをするために、Ａｓｕ残基の側鎖を脱保護化し
なければならないが、すでに述べたようにＰｄ触媒作用
によって行なえばよい。さらに、末端アミノ基末端も、
ピペリジン／ＤＭＦでＦｍｏｃ基を除去して、脱保護化
しなければならない。環化は、アミド結合、特にＤＩＰ
ＣＤＩを形成する標準方法で実行する。
【００７０】図４によれば、上述と同様のステップが部
分的に脱保護化した９番目のペプチドを用いて、すなわ
ち、図中に示したようにワン（Ｗａｎｇ）樹脂を作用さ
せて、ｔＢｕ基（フラグメント２および４）を用いずに
実行することもできる。
【００７１】本発明の説明に用いる略語は次の通りであ
る。
【００７２】AcOH：酢酸 AcOEt：エチル酢酸 Al：アリル Ala：L-アラニン AM:p-[(R,S)-2,4-ジメトキシベンジル]-フェノキシ酢
酸。
【００７３】Arg：L-アルギニン Asn:L-アスパラギン Asp：L-アスパラギン酸 Asu：L-α-アミノスベリン酸 DCM：ジクロロメタン。
【００７４】DIEA：N,N'-ジイソプロピルエチルアミン DIPCDI：ジイソプロピルカルボジイミド DMF：N,N'-ジメチルホルムアミド EDT：1,2-エタンジチオル Fmoc：9-フルオレニルメトキシカルボニル。
【００７５】Fmoc：9-フルオレニルメトキシカルボニル
-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル Gln：L-グルタミン Glu：L-グルタミン酸 Gly：L-グリシン HBTU：2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-yl)-1,1,3,3-テト
ラメチルウロニオ-ヘキサフルオロホスフェート。
【００７６】His：L-ヒスチジン HMPB：4(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシ)酪
酸 HOBT：N-ヒドロキシベンゾトリアゾール HPLC：高圧液体クロマトグラフィ Ile：L-イソロイシン。
【００７７】Lys：リジン MeOH：メタノール PAL：アミノメチル-3,5-ジメトキシフェノキシバレリア
ン酸 pMBHA：パラメチルベンジドリルアミン Pmc：2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン。
【００７８】Pro：L-プロリン PyBop：ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス−ピ
ロドリン-ホスホニド-ヘキサフルオラホスフェート Ser：L-セリン tBu：tert-ブチル。
【００７９】TFA：トリフルオロ酢酸 THF：テトラヒドロフラン Thr：L-トレオニン TLC：薄膜クロマトグラフィー Tos：トシル。
【００８０】Trt：トリチル Tyr：チロシン Val：バリン。
【００８１】本発明を、以下の無制限の実施例によって
示す。ここで、ＡＡ25はＡｓｐまたは Ａｓｎであり、
ＡＡ26は Ｖａｌまたは Ｔｈｒ、ＡＡ28はＡｌａまた
はＳｅｒ、ＡＡ’25はＡＳＰ（ＯｔＢｕ）またはＡｓ
ｎ、ＡＡ’26はＶａｌまたはＴｈｒ（ｔＢｕ）、ＡＡ’
28はＡｌａまたはＳｅｒ（ｔＢｕ）である。
【００８２】実施例１ アミノスベリン酸（Ａｓｕ）の側鎖の保護。 L-α-アミ
ノスベリン酸のｗ−アリルエステルの獲得 １．１３４ｇ（６ｍｍｏｌ）のＬ−α−アミノスベリン
酸を（予め３Åの篩にかけて乾燥させた）３０ｍｌのア
リルアルコールで懸濁した。窒素雰囲気中で、１．９ｍ
ｌ（１５ｍｍｏｌ）のクロロトリメチルシランを懸濁液
に１滴ずつ添加し、生成溶液を２０時間室温で攪拌し
た。反応の進行は、ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ＡｃＯＨ ９
９／１）でチェックした。２００ｍｌの低温無水ジエチ
ルエーテルを添加し、生じる沈殿物を遠心分離した。分
離したものをエーテルで再懸濁し、同様の操作をさらに
２回繰り返した。９１５ｇの白色固体が得られ、これは
生成物の塩酸物に一致した。母液を（＋４℃に）冷却
し、生じる沈殿物を遠心分離しエーテルで洗浄し、１３
５ｍｇ以上の生成物を得た。総収率は６６％だった。
【００８３】1H RMN(CD3OD,200MHz)δ:5.93(ddt,1H,-CH
=CH2),5.4-5.45(m,2H,-CH=CH2 ),4.58(d,2H,J=5.5Hz,COO
-CH2 ),3.97(t,1H,J=6Hz,CH-COOH),2.33(t,2H,J=7.32Hz,
CH2 -COO),2.05-1.3(m,8H,CH-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 )。
【００８４】実施例２ アミノスベリン酸の α-アミノ基の保護。Fmoc-Asu(OA
l)-OHの獲得 ｐＨ１０を超えないように確認しながら、１．０５ｇ
（３．９ｍｍｏｌ）のＡｓｕ（ＯＡｌ）−ＨＣｌを２５
ｍｌの１０％Ｎａ2ＣＯ3水溶液に溶解する。生成溶液を
０℃まで冷却し、６．５ｍｌのアセトン中に１．３１ｇ
（３．９ｍｍｏｌ）を溶解した懸濁液を１滴ずつ添加し
た。この懸濁液を１時間絶え間なく攪拌し、同温度に保
った。１時間経過後、室温になるまで放置し、反応をＴ
ＬＣ（ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ９０／８／
２）でチェックした。３時間後、懸濁は消失し、透明な
液体が観察された。この溶液を ２００ｍｌの氷水に注
入し、ジエチルエーテルで（４ 回３０ｍｌ）洗浄し
た。水性相を ０℃まで冷却し、稀塩酸溶液でｐＨ５．
５の酸性にしたところ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｕ（ＯＡｌ）−
ＯＨの沈殿が観察された。懸濁液をＡｃＯＥｔで（４回
１００ｍｌ）抽出し、各抽出液が ｐＨ５．５を維持す
るように再酸性化した。有機相の収集物をＭｇＳＯ 4で
乾燥させ、低圧下で溶媒を除去した。得られたオイルを
結晶化して、白色で脆い固体の形態の生成物を得た
（１．３９ｇ／収率 ７９％）。
【００８５】1H RMN(CD3Cl3, 200MHz)δ:8.07(幅),7.82
-7.2(m,8H),5.9(ddt,-1H,-CH=CH2),5.4(d,1H,J=9.7Hz,C
H(Fmoc)),5.35-5.15(m,2H,-CH=CH2),4.58(d,2H,CH2-COO
-CH2),4.43(dd,2H,CH2(Fmoc)),4.21(t,1H,CH-COOH),2.3
4(t,2H,J=7.6Hz,CH2COO-),2-1.2(m,8H,CH2-CH2-CH2-CH2
-COO-)。
【００８６】実施例３ 内標準の取込み。Boc-Ile-pMBHAの獲得 ０．６９ｍｍｏｌ／ｇの樹脂である１．６５８ｇ（６．
９ｍｍｏｌ）のＢｏｃＩｌｅを４ｇのｐ−メチルベンジ
ドリルアミン樹脂に、以下の合成プログラムによって内
標準として取り込む。
【００８７】 ステップ 試薬 繰返し 時間 1 TFA 40％ 1 1' 2 TFA 40％ 1 20' 3 DCM 5 1' 4 DIEA 5％ 3 2' 5 DCM 5 1' 6 Boc aa - + 7 HOBt - + 8 DIPCDI - 40' 9 DCM 5 1' 10 ニンヒドリンでチェックし、＋ならば６へ戻り、−ならば次へ進む。 11 DCM 5 1' 12 TFA 40％ 1 2' 13 TFA 40％ 1 20' 14 DCM 5 1' 15 DIEA 5％ 3 2' 16 DCM 5 1'。実施例４ リニカーハンドルの取込み。 4(4-ヒドロキシ-メチル-3
-メトキシフェノキシ)ブチルアミド-Ile-pMBHA。
【００８８】続いて、リニカーハンドル（ＨＭＰＢ）と
して知られる４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシ
フェノキシ）酪酸の取込みを行なう。これは、１ｇ
（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）の４（４−ヒドロキ
シメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸、０．６２ｇ
（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）のＨＯＢＴおよびＤ
ＭＦを溶媒として使用する６４１μｌ（４．１４ｍｍｏ
ｌ、１．５当量）を含む内標準で予め機能化させた後、
４ｇの樹脂（樹脂のｆＮＨ２＝０．６９ｍｍｏｌ／ｇ）
を反応させることによって実行する。反応時間は９０時
間である。９０時間後、樹脂をＤＣＭで５回洗浄して、
Ｋａｉｓｅｒ試験で遊離アミンがないことを確認する。
もしあれば、カップリング処理を繰り返さなければなら
ない。
【００８９】実施例５ １番目のアミノ酸の取込み。Fmoc-Gly-リニカーハンド
ル-Ile-pMBHAの獲得 １番目のアミノ酸を取込みは、この場合グリシンであ
り、ハンドルとＦｍｏｃ誘導体とのエステル型結合の生
成も伴う。この種の取込みには、樹脂を１６８ｍｇ
（０．５当量）のＤＭＡＰと２．０４９ｍｌ（５当量）
のＤＩＰＣＤＩの存在下で、ＤＭＣに９０分間、４．１
ｇ（５当量）のＦｍｏｃ Ｇｌｙで反応させる。一度反
応が完了したら、樹脂をＤＭＦで５回洗浄する。樹脂の
酸加水分解に関しアミノ酸を分析することによって、Ｉ
ｌｅアミノ酸（内標準）と１番目のアミノ酸Ｇｌｙとの
比率が分かる。この様にして樹脂の実際の機能化がわか
るが、その範囲は通常０．３５−０．６９ｍｍｏｌ／ｇ
である。
【００９０】実施例６ １番目のアミノ酸のWang樹脂上への取込み。Fmoc-Gly-W
ang樹脂の獲得 アミノ酸分析が内標準不在のために行なわれないこと以
外は、例５のステップと同様である。
【００９１】実施例７ 残留アミノ酸の取込み。FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tB
u)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-リニカーハンドル-
pMBHA、またはFmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tB
u)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-Wang樹脂の獲得 残るアミノ酸の取込みは、以下に記載したような合成プ
ログラムに従って実行する。
【００９２】 ニンヒドリンでチェックし、＋であればステップ５に戻
り、−であればステップ１に進み、次のアミノ酸を取り
込む。
【００９３】脱保護化した１−９ペプチド全体の合成純
度を評価するには、２０ｍｌのH-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser
(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-リニカーハンド
ル-pMBAを、９００μｌのＴＦＡ、５０μｌのチオアニ
ソール、３０μｌのＥＤＴおよび２０μｌのアニソール
で、２時間室温で、濾板を備えた反応器で処理する（こ
の処理では、アリル基に影響はなく、変化は起きな
い）。濾液を低温無水ジエチルエーテルで試験管に集め
る。遊離ペプチドの沈殿が観察され、遠心分離後浮遊物
質をデカントする。ペレットを低温無水エーテルで再懸
濁して、捕捉剤（ＥＤＴ、チオアニソール、アニソー
ル）を除去する。この操作を５回繰り返す。その後、ペ
レットがを乾燥してから、１ｍｌの１０％酢酸溶液に溶
解する。４０μｌのペプチド溶液をＢの勾配が５−８５
％のＨＰＬＣに注入する。ただし、ＶｙｄａｃカラムＣ
１８ ５μｍ、２５×０．４６ｃｍにおいて、ＡはＨ2
Ｏ ０．０４５％ ＴＦＡであり、ＢはＣＨ3ＣＮ
０．０３５％ ＴＦＡである。塩酸／プロピオン酸の混
合物を用いて、１５０℃で３時間ペプチド樹脂の加水分
解に対しアミノ酸分析することで、組成は、Asp 1.01
(1)、Thr 0.8(1)、Ser 1.8(2)、Gly 1.2(1)、Ile 1.5-1(1)、
Leu 1.99(2)、Val 0.89(1)、Asu(OAl) 0.95(1)となる。
【００９４】実施例８ 末端アミノ残基（ Ser）の α-アミノの脱保護および A
su残基側鎖の脱保護。
【００９５】H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-A
su-Val-Leu-Gly-HMPB-Ile-pMBHA、または、H-Ser(tBu)-
Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-Gly-Wang樹脂
の獲得 一度完全に脱保護化したペプチドを合成した後、末端残
基のα−アミノ基を脱保護化する処理を行なう。この脱
保護化は、樹脂で処理し、１分間と５分間の２回、ＤＭ
Ｆ中で２０％のピペリジン／ＤＭＦで洗浄する。樹脂を
ＤＭＦとＤＣＭで洗浄して、低圧で乾燥させる。
【００９６】その後、Ａｓｕ残基の側鎖を脱保護化す
る。２００ｍｇのペプチド−樹脂をヘリウム雰囲気中で
濾板を備えた反応器に導入する。分離溶液もヘリウム雰
囲気中で調整する。この分離溶液には７ｍｇのＰＤ（Ｐ
Ｐｈ2）4、２５０ｍｇのＰＰＨおよび２００μｌのモル
ホリンを含み、これらはすべて３ｍｌのＴＨＦに溶解
し、予めヘリウムによるバブリングによって脱ガスして
おく。この溶液をペプチド−樹脂に添加し、その混合物
を定期的に攪拌しながら６０時間ヘリウム下で保存す
る。６０時間経過後、ペプチド−樹脂を濾過し、ＴＨ
Ｆ、ＤＭＦおよびＤＣＭで完全洗浄する。最後に乾燥さ
せる。アリル基の脱保護化度を評価するには、２０ｍｇ
のペプチド−樹脂を濾板を備えた反応器内において、２
時間室温で、９５０μｌのＴＦＡ、３０μｌのＤＣＭお
よび２０μｌのアニソールで処理する。濾液を低温無水
ジエチルエーテルで試験管内に収集する。遊離ペプチド
の沈殿が観察されるので、遠心分離後、浮遊物質をデカ
ントする。ペレットを低温エーテルで再懸濁する。この
操作を５回繰り返す。後に、ペレットを乾燥させ、１ｍ
ｌの１０％酢酸溶液で溶解する。４０μｌのペプチド溶
液を５−８５％勾配のＢでＨＰＬＣに注入する。ここ
で、Ｖｙｄａｃ カラム Ｃ１８ ５μｍ、２５×０．
４６ｃｍにおいて、Ａは水０．０４５％ ＴＦＡ、Ｂは
ＣＨ3ＣＮ ０．０３５％ＴＦＡである。
【００９７】実施例９ 樹脂上の 1-9ペプチドの環化。
【００９８】
【化２１】
【００９９】または
【０１００】
【化２２】
【０１０１】フラグメント１−９をＡｓｕ側鎖の末端お
よびと酸アミノ基で環化する。これも濾過を備えた反応
器で実行する。６０ｍｇのペプチド−樹脂、１６．２μ
ｌのＤＩＰＣＤＩ（６当量）および１５．６ｍｇのＨＯ
ＢＴ（６当量）をＤＭＦに溶解して導入する。反応をＫ
ａｉｓｅｒ試験で確認する。２１時間後、樹脂を濾過
し、ＤＭＦとＤＣＭで洗浄する。ペプチドの純度を評価
するには、実施例８に述べた脱保護化したペプチドに関
して説明したものと同様の処理を行なう。
【０１０２】実施例１０ 樹脂からの環化フラグメント１−９の遊離
【０１０３】
【化２３】
【０１０４】または
【０１０５】
【化２４】
【０１０６】の獲得。
【０１０７】ペプチド-樹脂 H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(t
Bu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-Gly- リニカーハンドル-Ile
-pMBHAを１５分間隔で４または５回 ＤＣＭ中において
１％のＴＦＡ溶液で処理する。ピリジンを濾液に添加し
て中和させ、ＤＣＭを低圧で除去する。得られた白色固
体を繰返し水で洗浄し、乾燥させる。
【０１０８】選択的にペプチド-樹脂 H-Ser(tBu)-Asn-L
eu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-Gly-Wang樹脂 を濾
板を備えた反応器において２時間、ＴＦＡ／ＤＣＭ／ア
ニソール比が９５／３／２である溶液で処理する。２時
間後、酸性溶液を低温無水エーテルに注入して、生じる
固体を遠心分離する。この固体をエーテルでさらに２回
洗浄して乾燥させる。
【０１０９】実施例１１ 樹脂からの完全にまたは部分的に保護した９番目のペプ
チドの遊離 FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Va
l-Leu-Gly-OHまたはFmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)
-Val-Leu-Gly-OH 両樹脂に対して先の例と同じ方法を実行する。
【０１１０】実施例１２ Fmoc AM ハンドルのBoc-Ile-pMBHAへの取込み。p-[(R,
S)-A-[1-(9H-フルオレン-9-yl)メトキシ-ホルムアミド]
-2,4-ジメトキシベンジル]-フェノキシアセトアミド−p
MBHA の獲得 次に、ｐ−［（Ｒ，Ｓ）−ａ−［１−（９Ｈ−フルオレ
ン−９−ｙｌ）メトキシ−ホルムアミド］−２，４−ジ
メトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｆｍｏｃ−Ａ
Ｍ）を取り込む。これは、２．２３ｇ（４．１４ｍｍｏ
ｌ、１．５当量）のｐ−［（Ｒ，Ｓ）−ａ−［１−（９
Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシホルムアミド］−
２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸と、
０．６２ｇ（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）のＨＯＢ
Ｔと、溶媒として ＤＭＦを使用する６４１μｌ（４．
１４ｍｍｏｌ、１．５当量）とを含む（例１記載のプロ
トコルに従う）内標準で予め機能化した後、４ｇの樹脂
（０．６９ｍｍｏｌの樹脂）を反応させることによって
実行する。反応時間は９０時間である。９０時間経過
後、樹脂を５回ＤＣＭで洗浄し、Ｋａｉｓｅｒ試験を用
いて遊離アミノがないことを確認する。もしあれば、カ
ップリング処理を繰り返さなければならない。
【０１１１】実施例１３ Fmoc-PALハンドルの Boc-Ile-pMBHAへの取込み。[1-(9H
-フルオレン-9-yl)メトキシ-ホルムアミド]メチル-3,5-
ジメトキシバレリアミド-Ile-pMBHA の獲得 次に［１−（９Ｈ−フルオレン−９−ｙｌ）メトキシ−
ホルムアミド］メチル−３，５−ジメトキシバレリアン
酸（Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ）を取り込む。これは、１．８９
ｇ（４．１４ｍｍｏｌ、 １．５当量）の［１−（９Ｈ
−フルオレン−９−イル）メトキシ−ホルムアミド］メ
チル−３，５−ジメトキシバレリアン酸と、０．６２ｇ
（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）のＨＯＢＴと溶媒と
してＤＭＦを使用する６４１μｌ（４．１４ｍｍｏｌ、
１．５当量）とを含む（例１記載のプロトコルに従う）
内標準で予め機能化させた後、４ｇの樹脂（０．６９ｍ
ｍｏｌ／ｇの樹脂）を反応させることによって実行す
る。反応時間は９０時間である。９０時間後、樹脂をＤ
ＣＭで５回洗浄し、Ｋａｉｓｅｒ試験で遊離アミンがな
いことを確認する。もしある場合には、カップリング処
理を繰り返さなければならない。
【０１１２】実施例１４ 残留アミノ酸の取込み。FmocLys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gl
n-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)
-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-Th
r(tBu)-Pro-AM-Ile-pMBHA の獲得 以下に記載したような合成プログラムに従い、残りのア
ミノ酸の取込みを実行する。
【０１１３】 ステップ 試薬 繰返し 時間 1 DMF 5 1' 2 pip/DMF 20％ 1 1' 3 pip/DMF 20％ 1 5' 4 DMF 5 1' 5 Fmoc aa - + 6 HOBT - + 7 DIPCDI - 40' 8 DMF 5 1' ニンヒドリンでチェックし、＋ならばステップ５に戻
り、−であればステップ１に進み次のアミノ酸を取り込
む。
【０１１４】10−31番目の完全に保護したペプチドの合
成純度を評価するには、２０ｍｇのFmocLys(Boc)-Leu-S
er(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gl
n-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-A
A'26-Gly-AA'28-Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pMBHAを９０
０μｌのＴＦＡ、５０μｌのチオアニソールおよび２０
μｌのアニソールで、濾板を備えた反応器内において、
室温で２時間処理する。濾液を低温ジエチルエーテルで
試験管に収集する。遊離ペプチドの沈殿が観察されるの
で、遠心分離後浮遊物質をデカントする。ペレットを低
温無水エーテルで再懸濁し、捕捉剤（ＥＤＴ、チオアニ
ソール、アニソール）を除去する。この操作を５回繰り
返す。その後、ペレットを乾燥させて、１ｍｌの１０％
酢酸溶液に溶解する。４０μｌのペプチド溶液を、Ｂの
勾配が５−８５％で、Ａが水０．０４５％ ＴＦＡであ
り、ＢがＣＨ3ＣＮ ０．０３５％ ＴＦＡである、Ｖ
ｙｄａｃＣ ５μｍ、２５×０．４６ｃｍのＨＰＬＣに
注入する。塩酸／プロピオン酸の混合物で、１５０℃で
３時間ペプチド樹脂の加水分解に対しアミノ酸分析する
と、組成は、Asp 1.06(1)、Thr 2.8または4.0(3または
4)、 Ser 0.96または 2.0(1または 2)、Glu 3.01(3)、G
ly 2.2(2)、Pro 1.98(2)、Ile 0.9(1)、Leu 3.0(3)、Ty
r 0.8(1)、His 0.92(1)、Lys 1.8(2)、Arg 1.03(1)、Al
a1.1または0(1または0)、Val 0.97または0(1または0)と
なる。
【０１１５】実施例１５ 保護化したの10-31番目フラグメント１のペプチド-樹脂
への保護化または脱保護化および環化した９番目のペプ
チドの取込み
【０１１６】
【化２５】
【０１１７】または、
【０１１８】
【化２６】
【０１１９】の獲得。
【０１２０】２．０３ｇのペプチド−樹脂１０−３１番
目を３分間ピペリジン／ＤＭＦで処理する。この操作を
さらに２回繰返し、樹脂をＤＭＦで１分間５回洗浄す
る。ＤＭＦに溶解した３１５ｍｇ（２．５当量）のＨＢ
ＴＵ（または選択的にＰｙＢＯＰ４３１ｍｇを同当量）
および１２４ｍｇ（２．５当量）のＨＯＢＴを樹脂に添
加し、樹脂で可及的に最大の同質物質を形成する。２．
５当量の完全に保護した１−９番目の環状ペプチド１−
９（９２２ｍｇ）または完全に脱保護化した環状ペプチ
ド１−９（７４１ｍｇ）を可及的に最低限量のＤＭＦに
溶解し、樹脂に添加する。最後に２９６μｌ（５当量）
のＤＩＥＡを添加する。この樹脂を十分に攪拌して、同
質化する。この反応は、オレンジ色を呈する。１時間３
０分後、樹脂のアリコートの一部に対するＫａｉｓｅｒ
試験結果は陰性を示し、取込み反応が完全であると見な
すことができる。樹脂をＤＭＦで繰返し濾過洗浄する。
【０１２１】実施例１６ フラグメント１０の線状合成。FmocSer(tBu)-Asn-Leu-S
er(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)
-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-
Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-A
A'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pMBHA
の獲得 続いて、例１２および１３に説明したように、すべての
アミノ酸を得られたペプチド-樹脂に取り込む。すなわ
ち、 AM-Ile-pMBHAまたは PAL-Ile-pMBHAへの取込みを
行なう。この取込みは、例１４に示した方法と同様に実
行し、最終生成物の合成純度を評価する。塩酸／プロピ
オン酸の混合物の加水分解に対するアミノ酸分析を １
５０℃で３時間行なった結果、組成は、Asp 2.08 (2)、
Thr 3.76または4.2(4または5)、Ser 2.84または 3.62(3
または4)、Glu 3.01 (3)、Gly 3.3(3)、Pro 1.98 (2)、
Ile 0.9 (1)、Leu 4.95(5)、Tyr 0.8 (1)、His 0.92
(1)、Lys 1.8 (2)、Arg 1.03 (1)、 Ala 1.1または 0
(1または0)、Val 1.95または0.9 (2または1）、Asu(OA
l) 0.96 (1)である。
【０１２２】実施例１７ 保護化または脱保護化した９番目のペプチドの、保護化
したフラグメント１の10−31番目のペプチド-樹脂に対
する、環化反応を用いない取込み FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(Oal)-Va
l-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-
His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Ar
g(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly-Thr(tBu)
-Pro-AM-Ile-pMBHA、または、FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr
-Asu-(OAl)Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Gl
u(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr
(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-
Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pMBHA の獲得 前述の例に記載した方法と同様である。
【０１２３】実施例１８ Ｏ′-アミノおよびＡｓｕ残基の側鎖の脱保護化と、そ
れに続く１−３１番目のペプチド環化。
【０１２４】
【化２７】
【０１２５】、または、
【０１２６】
【化２８】
【０１２７】の獲得。
【０１２８】脱保護化の際には例８と同様の方法を実行
し、環化には例９と同様の方法を実行する。
【０１２９】実施例１９ 樹脂の切除とあらゆる形態における1-31番目のペプチド
の脱保護化
【０１３０】
【化２９】
【０１３１】無水ペプチド−樹脂の１−３１番目を室温
で２時間、ＴＦＡ／ＤＣＭ／アニソール（９５：３２：
２）で処理する。それを１００ｍｌの低温無水エーテル
に注入する。得られた白色沈殿を遠心分離する。固体を
ジエチルエーテルで再懸濁し再び遠心分離する。この操
作をさらに５回繰り返す。最後に得られた固体を乾燥さ
せて１０％酢酸に溶解したものを、勾配５−６５％のＢ
で、Ａは水０．０５％ＴＦＡ、Ｂは ＣＨ3ＣＮ ０．
０３５％ ＴＦＡであるＶｙｄａｃ Ｃ１８１５−２０
μｍ、２５×１ｃｍでＨＰＬＡ調整して精製する。
【０１３２】
【発明の効果】したがって、本発明によるカルボカルシ
トニンは、樹脂上で簡便に保護および固定したカルボカ
ルシトニン配列末端のカルボキサミドに対応するドコサ
ペプチドであるフラグメント１を、２システイン間に予
め形成したジスルフィドを用いて簡便に保護したカルボ
カルシトニン配列のアミノ基末端に対応するデカペプチ
ドであるフラグメント２で凝縮し、完全なペプチド骨格
であるフラグメント６を酸を用いて完全に脱保護したペ
プチドを樹脂から遊離させることにより、脱保護の条件
が緩やかになり、精製過程が単純になるので、収率コス
トを低減できるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカルボカルシトニンの調整過程を示す
流れ図である。
【図２】本発明のカルボカルシトニンの調整過程を示す
別の流れ図である。
【図３】フラグメント１および１０の調整過程を示す流
れ図である。
【図４】フラグメント２、３、４および５の調整過程を
示す流れ図である。
フロントページの続き (72)発明者 ゲンマ ヨダス ファレス スペイン国 08003 バルセロナ アルミ ランテ セルベラ 19 (72)発明者 ダビッド アンドリュー マルティネッツ スペイン国 バルセロナ 08226 マンレ サ ラ サレ 12

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 Ｒ−Ａｓｕ（ＯＡｌ）−ＯＨ （式中、 ＲはＦｍｏｃ基または水素原子、ＡｓｕはＬ
    −α−アミノスベリン酸、Ａｌはアリル基、Ｆｍｏｃ基
    は９−フルオレニルメトキシカルボニル基を表す）で示
    されるアミノスベリン酸誘導体。
  2. 【請求項２】 アリルアルコールと L-Ｏ´−アミノス
    ベリン酸と反応させてアリル基でＤ−アミノスベリン酸
    またはＬ−Ｏ´アミノスベリン酸のｗ側鎖を一時的に選
    択保護し、かつ、９−フルオレニルメトキシカルボニル
    −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステルと反応させ
    て、Ｆｍｏｃ基でＯ´アミノ基を、一時的に選択保護す
    ることを特徴とするカルボカルシトニンの獲得方法。
  3. 【請求項３】 サケカルボカルシトニン、ウナギカルボ
    カルシトニン、ヒトカルボカルシトニン、ブタカルボカ
    ルシトニンおよびウシカルボカルシトニン、ならびに、
    Ａｓｕ側鎖とその他の種との間に形成された回路を有
    するその他のタンパク質またはペプチドを合成するため
    にアミノスベリン酸誘導体Ｆｍｏｃ−Ａｓｕ（ｗ−アリ
    ル基）−ＯＨを使用することを特徴とするカルボカルシ
    トニンの獲得方法。
  4. 【請求項４】 Ａｓｕ（ＯＡｌ）残基の脱保護段階を塩
    基存在下でＰｄ錯体によって実行することを特徴とする
    請求項２記載のカルボカルシトニンの獲得方法。
  5. 【請求項５】 高分子支持体への固相合成によって、か
    つ、収斂戦略で結合させたＦｍｏｃ／ｔＢｕ型保護基を
    介入させて、カルボカルシトニンおよび薬学的に許容で
    きる酸付加塩またはその錯体を獲得するカルボカルシト
    ニンの合成方法において、 （ａ）式 Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln- Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly- Thr-Pro-(R) フラグメント１ （式中、 (R)は次式、 【化１】 で示され、樹脂上に簡便に保護し固定し、カルボカルシ
    トニン配列のカルボキサミド末端に対応するドコサペプ
    チドから成るフラグメント１を、 （i）式 【化２】 で示され、簡便に形成された回路を有し、 Ｓｅｒおよ
    びＴｈｒの側鎖に対する保護基を欠いており、カルボカ
    ルシトニン配列のアミノ基末端に対応する９−ペプチド
    から成るフラグメント２で縮合するか、または選択的に （ii）式 【化３】 で示され、形成された回路を有し、ｔＢｕ基で保護した
    Ｓｅｒ残基およびＴｈｒ残基の側鎖を欠いており、アミ
    ノ基末端に対応する９−ペプチドから成るフラグメント
    ３で縮合し、 （ｂ）式 【化４】 で示され、カップリング反応後の環化反応またはその逆
    から生じるペプチド−樹脂を、特に、フラグメント６ま
    たはフラグメント７を側鎖を脱保護化する酸処理にかけ
    て、樹脂を除去し、精製後化学的に純粋なカルボカルシ
    トニンを生じるペプチドを獲得することを特徴とするカ
    ルボカルシトニンの獲得方法。
  6. 【請求項６】 請求項５記載のステップ（ａ）におい
    て、式 FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-OH フラグメント４ で示されるフラグメント４に対応するフラグメント２の
    前駆物質で、選択的に縮合し、式 FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu- Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBt)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)- Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly-Thr-Pro-(R) フラグメント９ で示されるフラグメント９に対応するペプチド−樹脂を
    獲得した後、脱保護反応および環化反応にかけて、フラ
    グメント６を獲得し、順次脱保護反応にかけて、樹脂か
    ら切除し、精製して化学的に純粋なサケカルシトニンを
    得ることを特徴とする請求項５記載のカルボカルシトニ
    ンの獲得方法。
  7. 【請求項７】 請求項５記載のステップ（ａ）におい
    て、式 FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-OH フラグメント５ で示されるフラグメント５に対応するフラグメント３の
    前駆物質で、選択的に縮合し、式 FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly- Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBt)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln- Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly Thr-Pro-(R) フラグメント１０ で示されるフラグメント１０に対応するペプチド−樹脂
    を獲得した後、脱保護反応および環化反応にかけて、フ
    ラグメント７を獲得し、順次脱保護反応にかけて、樹脂
    から切除し、精製して化学的に純粋なサケカルシトニン
    を得ることを特徴とする請求項５記載のカルボカルシト
    ニンの獲得方法。
  8. 【請求項８】 内標準（ＩｌｅまたはＡｌａ）および
    樹脂とアミノ酸配列との間の架橋基すなわちハンドル
    （ＡＭまたはＰＡＬ）を取り込むことによって、フラグ
    メント１をｐＭＢＨＡ樹脂から獲得し、残基ごとに線状
    合成を行ない、アミノ酸２２個を取り込むことを特徴と
    する請求項５、６または７記載のカルボカルシトニンの
    獲得方法。
  9. 【請求項９】 ２２個のアミノ酸のフラグメントの線状
    合成中に、Ｆｍｏｃ基をすべての合成においてアミノ基
    末端として用い、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａ
    ｒｇ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、ＧｌｎおよびＡｓｐの側鎖とし
    て前記フラグメント１の式における前記側鎖として示さ
    れる保護基を使用することを特徴とする請求項８記載の
    カルボカルシトニンの獲得方法。
  10. 【請求項１０】 内標準および該樹脂とアミノ酸配列
    との間の（リニカーまたはワン）架橋基を取り込むこと
    によって、フラグメント２、３および５を、ｐＭＢＨＡ
    樹脂から獲得し、残基ごとに線状合成を行ない、９個の
    アミノ酸を取り込むことを特徴とする請求項５、６およ
    び７記載のカルボカルシトニンの獲得方法。
  11. 【請求項１１】 １０個のアミノ酸のフラグメントの線
    状合成において、Ｆｍｏｃ基をすべての合成においてア
    ミノ基末端として用い、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙ
    ｓおよびＡｓｎの側鎖に、前記フラグメント２、３、
    ４、５および６の式における側鎖として示される保護基
    を使用することを特徴とする請求項１０記載のカルボカ
    ルシトニンの獲得方法。
  12. 【請求項１２】 式 Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln- Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly- Thr-Pro-(R) フラグメント１ で示される配列および構造を有し、樹脂上に保護および
    固定したことを特徴とするウナギカルボカルシトニンの
    合成に使用するペプチドフラグメント。
  13. 【請求項１３】 式 【化５】 で示される配列および構造を有することを特徴とするサ
    ケカルボカルシトニンまたはウナギカルボカルシトニン
    の合成に使用するペプチドフラグメント。
  14. 【請求項１４】 式 【化６】 で示される配列および構造を有し、樹脂上に保護および
    固定したことを特徴とするウナギカルボカルシトニンま
    たはサケカルボカルシトニンの合成に使用するペプチド
    フラグメント。
  15. 【請求項１５】 式 【化７】 で示される配列および構造を有し、樹脂上に保護および
    固定したことを特徴とするウナギカルボカルシトニンま
    たはサケカルボカルシトニンの合成に使用するペプチド
    フラグメント。
  16. 【請求項１６】 式 【化８】 で示される配列および構造を有し、樹脂上に保護および
    固定したことを特徴とするウナギカルボカルシトニンま
    たはサケカルボカルシトニンの合成に使用するペプチド
    フラグメント。
  17. 【請求項１７】 式 FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)-VAl-Leu-Gly-OH フラグメント４ で示される部分的に保護した配列および構造を有するこ
    とを特徴とするサケカルボカルシトニンまたはウナギカ
    ルシトニンの合成に使用するペプチドフラグメント。
  18. 【請求項１８】 式 FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu- Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBt)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)- Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly-Thr-Pro-(R) フラグメント９ で示される構造および配列を有し、樹脂上に保護および
    固定したことを特徴とするサケカルボカルシトニンまた
    はウナギカルボカルシトニンの合成に使用するペプチド
    フラグメント。
  19. 【請求項１９】 式 FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly-OH フラグメント５ で示される保護された構造および配列を有することを特
    徴とするサケカルボカルシトニンまたはウナギカルボカ
    ルシトニンの合成に使用するペプチドフラグメント。
  20. 【請求項２０】 式 FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAl)-Val-Leu-Gly- Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBt)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln- Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'25-AA'26-Gly-AA'28-Gly- Thr-Pro-(R) フラグメント１０ で示される構造および配列を有し、樹脂上に保護および
    固定したことを特徴とするサケカルボカルシトニンまた
    はウナギカルボカルシトニンの合成に使用するペプチド
    フラグメント。
  21. 【請求項２１】 サケカルシトニン、ウナギカルシトニ
    ン、ヒトカルシトニン、ブタカルシトニンおよびウシカ
    ルシトニンを合成するために用いるフラグメント１、
    ２、３、４、５、６、７、９および１０に対応する請求
    項５乃至２０記載のペプチド使用方法。
JP6011104A 1993-02-03 1994-02-02 カルボカルシトニンの獲得方法 Pending JPH072744A (ja)

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