JPS61160058A - 抗血清 - Google Patents
抗血清Info
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- JPS61160058A JPS61160058A JP171885A JP171885A JPS61160058A JP S61160058 A JPS61160058 A JP S61160058A JP 171885 A JP171885 A JP 171885A JP 171885 A JP171885 A JP 171885A JP S61160058 A JPS61160058 A JP S61160058A
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- Japan
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- peptide
- precursor
- rennin
- blood
- warm
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗血清に関する。さらに詳しくは、レニン前
駆体及びそのプロペプチドに特異的に反応する抗血清に
関する。
駆体及びそのプロペプチドに特異的に反応する抗血清に
関する。
〈発明の開示〉
本発明は、生理活性ペプチドに関する研究の一環として
なされたものであり、ヒト・プロレニンペプチドを抗原
とする抗血清に関する。
なされたものであり、ヒト・プロレニンペプチドを抗原
とする抗血清に関する。
レニン・アンジオテンシン・アンドステロン系は、代表
的な血圧調節メカニズムとして古くから注目されている
が、その第一段階を支配するレニンは、存在が微量でか
つ不安定であるため、精製が困難であり、従ってその生
理活性等については、最近の急速な研究発展にもかかわ
らず、未だに必ずしも明らかにはされていない。
的な血圧調節メカニズムとして古くから注目されている
が、その第一段階を支配するレニンは、存在が微量でか
つ不安定であるため、精製が困難であり、従ってその生
理活性等については、最近の急速な研究発展にもかかわ
らず、未だに必ずしも明らかにはされていない。
本発明は、レニンの前駆体であり、不活性型レニンとも
いうべきプロレニン中のプロペプチドの一部アミノ酸配
列に対応するペプチドを取得し、これより抗血清を得る
ことにより達成されたものである。
いうべきプロレニン中のプロペプチドの一部アミノ酸配
列に対応するペプチドを取得し、これより抗血清を得る
ことにより達成されたものである。
この抗血清は、レニン又はその前駆体の組織内又は血中
の分布を明らかにしたり、さらには微量の存在を測定し
たり、検出するにも有効な手段を提供できる。
の分布を明らかにしたり、さらには微量の存在を測定し
たり、検出するにも有効な手段を提供できる。
すなわち、本発明に係る抗血清は
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ二Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＩＩ
ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕで示されるペプチドを抗原として、これ
を温血動物に免疫することによりその血液よシ取得され
、レニン前駆体及びそのプロペプチドに特異的な反応性
を有する。ペプチドを表わす上記式％式％ ニブロリン、ＡＳｐ：アスパラギン酸、Ｌ ｙ ８：リ
ジンｓ Ａｒｇ ：アルギニン、Ｉｌｅ：イソロイシン
、Ｍｅｔ ：メチオニン、Ｓｅｒ ：セリン、Ｇｌｕ
：グルタミン酸、Ｖａｌ ：バリン、Ａｌａ ：アラニ
ン、Ｔｒｐ ： ）リプトファン、Ｇｉｎ：グルタミン
の各残基を表わし、これらアミノ酸は通常り一体である
。
ｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＩＩ
ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕで示されるペプチドを抗原として、これ
を温血動物に免疫することによりその血液よシ取得され
、レニン前駆体及びそのプロペプチドに特異的な反応性
を有する。ペプチドを表わす上記式％式％ ニブロリン、ＡＳｐ：アスパラギン酸、Ｌ ｙ ８：リ
ジンｓ Ａｒｇ ：アルギニン、Ｉｌｅ：イソロイシン
、Ｍｅｔ ：メチオニン、Ｓｅｒ ：セリン、Ｇｌｕ
：グルタミン酸、Ｖａｌ ：バリン、Ａｌａ ：アラニ
ン、Ｔｒｐ ： ）リプトファン、Ｇｉｎ：グルタミン
の各残基を表わし、これらアミノ酸は通常り一体である
。
本発明において動物の免疫に使用されるペプチドは、Ｎ
端のアミノ基が、ペプチド化学で常用される保護基で保
護されていてもよい。また。
端のアミノ基が、ペプチド化学で常用される保護基で保
護されていてもよい。また。
Ｃ端のカルボキシル基も常用されるエステル類で保護さ
れていてもよく、アミドを形成していてもよい。
れていてもよく、アミドを形成していてもよい。
上記したペプチドは、ペプチド化学において用いられる
方法を適宜選定して製造することができる。すなわち、
液相法、固相法いずれによっても得ることができる。
方法を適宜選定して製造することができる。すなわち、
液相法、固相法いずれによっても得ることができる。
すなわち、反応に関与しないアミノ基及びカルボキシル
基、さらには側鎖反応性基を保護したアミノ酸が反応に
供される。
基、さらには側鎖反応性基を保護したアミノ酸が反応に
供される。
反応に関与しないアミノ基の保護基としては、ｐ−）ル
エンスルホニル基、ベンジルオキシカルボニル（η基、
ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フタロイル基等
が挙げられる。
エンスルホニル基、ベンジルオキシカルボニル（η基、
ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フタロイル基等
が挙げられる。
一方、反応に関与しないカルボキシル基の保護基として
は、通常、ブチルエステル、ベンジルエステル（０Ｂｚ
ｔ ）が挙げられる。
は、通常、ブチルエステル、ベンジルエステル（０Ｂｚ
ｔ ）が挙げられる。
（Ｂｚｌ ）基（イミダゾールの保ａｉｉ）等が挙げら
れる。
れる。
さらに、アミノ基と反応させるカルボキシル基は、塩化
物、ヒドラジド、アジド、有機酸との混合無水物又はチ
オエステル、シアノメチルエステル等に変えて活性化し
ておくことが望ましい。
物、ヒドラジド、アジド、有機酸との混合無水物又はチ
オエステル、シアノメチルエステル等に変えて活性化し
ておくことが望ましい。
上記したペプチドの製造に際しては、固相法により出発
原料のＮ端側に順次所定のペプチド鎖を延長する方法が
好適に採用される。
原料のＮ端側に順次所定のペプチド鎖を延長する方法が
好適に採用される。
この方法による場合、各サイクル（特に二番ｉ以降のサ
イクル）におけるくりかえし工程の反応（遊離のカルボ
キシル基とアミン基との反応）ヲジシクロへキシルカル
ボジイミド等の縮合剤の存在下に行なうのが好ましい。
イクル）におけるくりかえし工程の反応（遊離のカルボ
キシル基とアミン基との反応）ヲジシクロへキシルカル
ボジイミド等の縮合剤の存在下に行なうのが好ましい。
保護基を有するペプチドの保護基脱離は、常法により行
なわれる。たとえば、トリフルオロ酢酸処理、加水分解
、還元等である。
なわれる。たとえば、トリフルオロ酢酸処理、加水分解
、還元等である。
また、得られるペプチドの精製は、イオン交換樹脂、各
種クロマトグラフィー等により行なうことができる。
種クロマトグラフィー等により行なうことができる。
さらに、上記したペプチドは、たとえばクロラミンＴ法
によりヨウ素（１２５１又は１３１工）標識ψ 化することにより、ラジオイムノアセイ（ＲＩＡ）に好
適な標識抗原を提供しうる。
によりヨウ素（１２５１又は１３１工）標識ψ 化することにより、ラジオイムノアセイ（ＲＩＡ）に好
適な標識抗原を提供しうる。
ヨウ素化は、好適には、Ｎ端に、３−ヒドロキシフェニ
ル−プロピオン酸又はその置換体たと、ｔばＮ−ｔクシ
ニミジルーＪ−（弘−ヒドロキシフェニル）グロピオネ
ートを結合するか、あるいはアシル化されていてもよい
’ｒｙｒを結合し、これをヨウ素化する方法が採用され
る。
ル−プロピオン酸又はその置換体たと、ｔばＮ−ｔクシ
ニミジルーＪ−（弘−ヒドロキシフェニル）グロピオネ
ートを結合するか、あるいはアシル化されていてもよい
’ｒｙｒを結合し、これをヨウ素化する方法が採用され
る。
本発明の抗血清は、たとえば次のような方法により得ら
れる。
れる。
まず、上記ペプチドを常法（たとえば液相法）により合
成し、常法（たとえば薄層クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー、ｐ紙電気泳動等）によって精製
する。
成し、常法（たとえば薄層クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー、ｐ紙電気泳動等）によって精製
する。
ついで、このペプチドを抗原とし、抗血清を調製する。
この場合、１）水溶性カルボジイミド、たとえば／−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩（Ｆ、ＣＤＩ）のような縮合剤の作用でペプ
チドを血清蛋白などの担体に結合させて、これを抗原と
して使用する方法、１１）グルタルアルデヒド、ビス−
ジアゾ化ベンジジン、又はｐ−ジアゾニウムフェニル酢
酸のような二官能性試薬によりペプチドと担体の間に橋
かけを形成して高分子の抗原とする方法、又は１１１）
炭末又はポリビニルピロリドンのような不活性ポリマー
微粒子にペプチドを吸着させて抗原として使用する方法
等が採用される。
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩（Ｆ、ＣＤＩ）のような縮合剤の作用でペプ
チドを血清蛋白などの担体に結合させて、これを抗原と
して使用する方法、１１）グルタルアルデヒド、ビス−
ジアゾ化ベンジジン、又はｐ−ジアゾニウムフェニル酢
酸のような二官能性試薬によりペプチドと担体の間に橋
かけを形成して高分子の抗原とする方法、又は１１１）
炭末又はポリビニルピロリドンのような不活性ポリマー
微粒子にペプチドを吸着させて抗原として使用する方法
等が採用される。
このようにして得られる抗原を用いて、通常、フロイン
トの完全アジュバントとともに温血動物（たとえば、ウ
サギまたはモルモット）に複数回の免疫を行なうことに
より抗血清を産生させ、その血液を採取し、常法により
抗血清を取得する。
トの完全アジュバントとともに温血動物（たとえば、ウ
サギまたはモルモット）に複数回の免疫を行なうことに
より抗血清を産生させ、その血液を採取し、常法により
抗血清を取得する。
このようにして得られる本発明に係る抗血清は、プロレ
ニン等のレニン前駆体及びそのプロペプチドに特異的に
反応するので、Ｒ工Ａ等によるこれらペプチドの高感度
の測定、検出系に有用である。
ニン等のレニン前駆体及びそのプロペプチドに特異的に
反応するので、Ｒ工Ａ等によるこれらペプチドの高感度
の測定、検出系に有用である。
〈実施例〉
以下、参考例及び実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えないかぎり、これら
の実施例に限定されない。
明するが、本発明はその要旨を超えないかぎり、これら
の実施例に限定されない。
なお、参考例中、特に記載のない限り、アミノ酸残基の
立体配量はＬ一体を示す。
立体配量はＬ一体を示す。
また、参考例において、ＢＯＣはプトキシカルホニル基
、０Ｂｚｔハヘンジルエステル、Ｂｚｔハペンジル基、
Ｔ’０８ ｉｊ トシル基及びｚはベンジルオキシカル
ボニル基、Ｍｅｔはメチオニ／残基、参考例／ まずＢＯＣ−Ｍｅｔのエステル化を次のように行なった
。すなわち、Ｂｏｃ −Ｍｅｔ （７，１／ ｍｍｏｔ
。
、０Ｂｚｔハヘンジルエステル、Ｂｚｔハペンジル基、
Ｔ’０８ ｉｊ トシル基及びｚはベンジルオキシカル
ボニル基、Ｍｅｔはメチオニ／残基、参考例／ まずＢＯＣ−Ｍｅｔのエステル化を次のように行なった
。すなわち、Ｂｏｃ −Ｍｅｔ （７，１／ ｍｍｏｔ
。
／９４（ｊ７９）を０，３５ Ｍ ＫＯ−ｔＢｕ／Ｍｅ
２・Ｓ。
２・Ｓ。
（，２０゜２７ａｔ ）に溶解し、クロロメチル北側１
］！ （−２％のジビニルベンゼンで架橋したポリスチ
レン樹脂をクロロメチル化したもの）（！、０？）を添
加し、混合物を強く振とうし、１０℃で２時間保持した
。
］！ （−２％のジビニルベンゼンで架橋したポリスチ
レン樹脂をクロロメチル化したもの）（！、０？）を添
加し、混合物を強く振とうし、１０℃で２時間保持した
。
樹脂を、Ｍｅ２Ｓｏ、エタノール及びＣＨ２Ｃｌ２
で洗浄し、真空中でＰ２Ｏ５で乾燥した。合成は、Ｅｌ
ｏｃ−Ｍｅｔ−〇ＣＨ２樹脂ｒ、７０ ｆをペプチド合
成機（“Ｂｅｃｌｍａｎ ９ Ｙ ＯＢ型）の反応器ニ
入しテ開始され、順次アミノ酸配列を合成した。
で洗浄し、真空中でＰ２Ｏ５で乾燥した。合成は、Ｅｌ
ｏｃ−Ｍｅｔ−〇ＣＨ２樹脂ｒ、７０ ｆをペプチド合
成機（“Ｂｅｃｌｍａｎ ９ Ｙ ＯＢ型）の反応器ニ
入しテ開始され、順次アミノ酸配列を合成した。
保護基の脱離は、ＣＨ２Ｃ６ｚ中の２ｊ％トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）で３０分間処理して行ない、引Ｍ、 キ
ＣＨ２Ｃｔ、、中の１０％トリエタノールアミン（ｇｔ
３Ｎ）で中和した（ただし、Ｂｏａ−Ｔｒｐ導入後はＣ
Ｈ２Ｃ１ｚ中の２５％Ｔ Ｆ’ Ａ −０，２！チェタ
ンジチ４−ルとした）。
酢酸（ＴＦＡ）で３０分間処理して行ない、引Ｍ、 キ
ＣＨ２Ｃｔ、、中の１０％トリエタノールアミン（ｇｔ
３Ｎ）で中和した（ただし、Ｂｏａ−Ｔｒｐ導入後はＣ
Ｈ２Ｃ１ｚ中の２５％Ｔ Ｆ’ Ａ −０，２！チェタ
ンジチ４−ルとした）。
各アミノ酸（３，／ ｍｍｏｔ）の連続的カップリング
は、ＣＨ２Ｃｌ２中、２時間でジシクロヘキンルカルボ
ジイミド（ＤＣＣ，３，／ ｍｍｏｔ）によって行なっ
た。溶媒量は、ＤＯＯが４，２ ｍｌ （０，！； Ｍ
）である以外は、≠Ｏａｌである。
は、ＣＨ２Ｃｌ２中、２時間でジシクロヘキンルカルボ
ジイミド（ＤＣＣ，３，／ ｍｍｏｔ）によって行なっ
た。溶媒量は、ＤＯＯが４，２ ｍｌ （０，！； Ｍ
）である以外は、≠Ｏａｌである。
合成の一サイクルは、次の操作よりなる。
（１）ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄（／、ｊ分間、３回）、（２
）２ｊ％Ｔ Ｆ Ａ ／ ＯＨ２Ｃ１２で脱保護基（／
、５分間予備洗浄、ついで３０分間処理）、 （３） ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄（／、５分間、６回）、
（４）／（１）チＢｔ３Ｎ ／ ０Ｈ２Ｃ６２で中和（
／、ｊ分間、３回）、 （５） ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄（７，５分間、６回）（
６） Ｂｏａ−アミノ酸（Ｌ／ ｍｍｏｔ％ＣＨ２Ｃ
Ｌ２中、ｊ分間）処理 （７）濾過なしに、ＤＣＣを添加（３，／ ｍｍｏＬ、
ＣＨ２Ｃ２２中）、１２０分間カップリング（８１ＣＨ
２Ｃｌ２で洗浄（／、ｊ分間、６回）（９）各々３．／
ｍｍｏｔの’Ｂｏａ−アミノ酸及びＤＣＣで上記（４
）〜（８）の工程をくりかえす。
）２ｊ％Ｔ Ｆ Ａ ／ ＯＨ２Ｃ１２で脱保護基（／
、５分間予備洗浄、ついで３０分間処理）、 （３） ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄（／、５分間、６回）、
（４）／（１）チＢｔ３Ｎ ／ ０Ｈ２Ｃ６２で中和（
／、ｊ分間、３回）、 （５） ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄（７，５分間、６回）（
６） Ｂｏａ−アミノ酸（Ｌ／ ｍｍｏｔ％ＣＨ２Ｃ
Ｌ２中、ｊ分間）処理 （７）濾過なしに、ＤＣＣを添加（３，／ ｍｍｏＬ、
ＣＨ２Ｃ２２中）、１２０分間カップリング（８１ＣＨ
２Ｃｌ２で洗浄（／、ｊ分間、６回）（９）各々３．／
ｍｍｏｔの’Ｂｏａ−アミノ酸及びＤＣＣで上記（４
）〜（８）の工程をくりかえす。
２番目のサイクル以降において、くりかえしの工程にお
ける反応は、ＨＯＢｔ （３，／ ｒｎｒｎｏｔ、’ｔ
２０■）の存在下で行なわれる。Ｅｌｏｃ−アミノ酸は
ａＨ，、ａｔ２（ｔｘ ｏ ｍｌ ）に溶解させる。た
だし、］］３ｏｃ−Ｌｅｕ−Ｈ２０Ｂｏｃ −Ａｒｇ
（Ｔｏｓ ）及びＢＯＣ−’ｒｒｐはＤＭＦ（ｊｍｌ）
及びＣＨ２Ｃｌ２（３！； ｍｌ ）に溶解させる。Ｂ
ｏｃ−Ｇｌｎ （ｌｒ、２ ｍｍｏｔ）は、ＤＭＦ（２
ｏ ｍｌ ）及びＣＨ２Ｃ６２（２０ｍｌ ）に溶解さ
せ、等モルのＨＯＢｔ （６，２ｍｍｏｔ）の存在下に
カンプリングされる（すなわち、前記−サイクルの（６
）に相当する）。
ける反応は、ＨＯＢｔ （３，／ ｒｎｒｎｏｔ、’ｔ
２０■）の存在下で行なわれる。Ｅｌｏｃ−アミノ酸は
ａＨ，、ａｔ２（ｔｘ ｏ ｍｌ ）に溶解させる。た
だし、］］３ｏｃ−Ｌｅｕ−Ｈ２０Ｂｏｃ −Ａｒｇ
（Ｔｏｓ ）及びＢＯＣ−’ｒｒｐはＤＭＦ（ｊｍｌ）
及びＣＨ２Ｃｌ２（３！； ｍｌ ）に溶解させる。Ｂ
ｏｃ−Ｇｌｎ （ｌｒ、２ ｍｍｏｔ）は、ＤＭＦ（２
ｏ ｍｌ ）及びＣＨ２Ｃ６２（２０ｍｌ ）に溶解さ
せ、等モルのＨＯＢｔ （６，２ｍｍｏｔ）の存在下に
カンプリングされる（すなわち、前記−サイクルの（６
）に相当する）。
各カップリング反応後に、無水酢酸（０，！；ｍｌ）を
加えてｊ分間捷拌することにより、未反応のアミノ基に
よるペプチド鎖の伸長を妨げ、ついでペプチド−樹脂を
ＤＭＦ（≠Ｏｍｌ、２回）、メタノ−／ｌ／ （ＩＩ
０ｒｎｌ、 ２回）及びＣＨ２Ｃｌ２（４４０ｍｌ、１
回）で洗浄する。
加えてｊ分間捷拌することにより、未反応のアミノ基に
よるペプチド鎖の伸長を妨げ、ついでペプチド−樹脂を
ＤＭＦ（≠Ｏｍｌ、２回）、メタノ−／ｌ／ （ＩＩ
０ｒｎｌ、 ２回）及びＣＨ２Ｃｌ２（４４０ｍｌ、１
回）で洗浄する。
Ｂｏｃ−Ｌ７［］（］ε−２−Ｃ１−Ｚ−ＴＢＡは／Ｎ
クエン酸で処理され、Ｂｏｃ −Ｌｙｓ （ε−２＝Ｃ
１−Ｚ）は酢酸エチルで抽出し、蒸留して油状物とナル
。油状生成物（Ｂｏａ −Ｌｙｓ （ε−２−ＣＬ−Ｚ
） ）は真空中でＰ２Ｏ５で乾燥する。
クエン酸で処理され、Ｂｏｃ −Ｌｙｓ （ε−２＝Ｃ
１−Ｚ）は酢酸エチルで抽出し、蒸留して油状物とナル
。油状生成物（Ｂｏａ −Ｌｙｓ （ε−２−ＣＬ−Ｚ
） ）は真空中でＰ２Ｏ５で乾燥する。
アミノ酸としては、次のような保護アミノ酸が使用され
る。
る。
Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、 Ｂｏａ−ＰｈｅＢ
ｏｃ−Ｇｌｙ
Ｂｏｃ＝Ｌｅｕ−Ｈ２Ｏ、Ｂｏａ−Ｐｒｏ
Ｂｏｃ−Ａｓｐ（○ＢＺｔ）、Ｂｏｃ−Ｌｙ
ｅ（ε−，２−ＯＬ−Ｚ）−ＴＢＡ％ Ｂｏａ−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ） 、Ｂｏｃ−１１ｅ−／／／２Ｈ２０、Ｂ
ｏａ−Ｍｅｔ 。
ｏｃ−Ｇｌｙ
Ｂｏｃ＝Ｌｅｕ−Ｈ２Ｏ、Ｂｏａ−Ｐｒｏ
Ｂｏｃ−Ａｓｐ（○ＢＺｔ）、Ｂｏｃ−Ｌｙ
ｅ（ε−，２−ＯＬ−Ｚ）−ＴＢＡ％ Ｂｏａ−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ） 、Ｂｏｃ−１１ｅ−／／／２Ｈ２０、Ｂ
ｏａ−Ｍｅｔ 。
Ｂｏｃ−８ｅｒ（Ｂｚｌ） 、 Ｂｏｃ−
Ｇｌｕ（○Ｂｚｔ）、Ｂｏａ−Ｖａｌ 、
Ｂｏｃ−Ｔｒｐ 。
Ｇｌｕ（○Ｂｚｔ）、Ｂｏａ−Ｖａｌ 、
Ｂｏｃ−Ｔｒｐ 。
Ｂｏｃ−Ｇｌｎ ０
反応容器は、空気による酸化を最小限にするために、合
成時に窒素雰囲気下に保持される。
成時に窒素雰囲気下に保持される。
各カップリング反応後に洗浄工程を行ない、未反応の遊
離アミン基の存在をニンヒドリンテストによりモニター
する。
離アミン基の存在をニンヒドリンテストによりモニター
する。
弘３サイクル終了後上記したペプチドのアミノ酸扁／〜
弘≠を含有する保護ペプチド−樹脂（３，♂♂ｆ）を分
取した。残余の保護ペプチド−樹脂をａｏＢｔ （／、
’ｌｒ ｍｍ０ｔ）及びＤＣＣ（／、ＡｍｍｏＡ）の存
在下で、ＨＰＰ（Ｊ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸
）と結合させて、標識抗原の原料とした（ざｊ、２η）
。
弘≠を含有する保護ペプチド−樹脂（３，♂♂ｆ）を分
取した。残余の保護ペプチド−樹脂をａｏＢｔ （／、
’ｌｒ ｍｍ０ｔ）及びＤＣＣ（／、ＡｍｍｏＡ）の存
在下で、ＨＰＰ（Ｊ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸
）と結合させて、標識抗原の原料とした（ざｊ、２η）
。
（脱保饅・精製）
上記保護ペプチド−樹脂のうち、λ、≠≠ｉを用いて、
アニソール（３ｍｌ）及びエチルメチルスルフィド（０
，３ｍ１）の存在下にＨＦ（３０ｒｎｌ）で０℃、７時
間、常法により処理し、ついでＨＦは真空ポンプにより
０℃で除去される。
アニソール（３ｍｌ）及びエチルメチルスルフィド（０
，３ｍ１）の存在下にＨＦ（３０ｒｎｌ）で０℃、７時
間、常法により処理し、ついでＨＦは真空ポンプにより
０℃で除去される。
ペプチド及び樹脂は酢酸エチルで数回洗浄され、真空中
、Ｐ２Ｏ５で乾燥される。ペプチドは７Ｍ酢酸（／１０
ｉｌ）で抽出し、ついで凍結乾燥される。
、Ｐ２Ｏ５で乾燥される。ペプチドは７Ｍ酢酸（／１０
ｉｌ）で抽出し、ついで凍結乾燥される。
上記したペプチドのアミノ酸Ａ／〜≠≠を主成分として
含む粗ペプチド（／−≠弘）は７３１０ｍｇであった。
含む粗ペプチド（／−≠弘）は７３１０ｍｇであった。
このうち、５００〜を直接に１バ身オゲ／Ｌ／ （Ｂｉ
ｏ Ｇｅｌ ） Ｐ−乙“カラム（２，２Ｘ／２３ｃｍ
）にかけ、７Ｍ酢酸で溶出する。
ｏ Ｇｅｌ ） Ｐ−乙“カラム（２，２Ｘ／２３ｃｍ
）にかけ、７Ｍ酢酸で溶出する。
各フラクション（１０ｔ）は、分光光度計により２７１
ｎｍでモニターされ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）で検出される（溶媒系：／−ＢｕＯＨ：酢酸：Ｈ２
０＝弘：／：ｊ）。
ｎｍでモニターされ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）で検出される（溶媒系：／−ＢｕＯＨ：酢酸：Ｈ２
０＝弘：／：ｊ）。
６つのペプチド含有フラクション、すなわちフラクショ
ン■（チューブ４ ／ ２− ／ ４’ ） 、１１（
チューブ扁／ｒ−，２３）、■（チューブ扁２μ、３７
）、■（チューブＪｆ６コｊ−３２，３６）、■（チュ
ーブＡＪＪ−Ｊｊ）及びグ（チューブＡ ３１− Ａ
ｊ ）を凍結乾燥する。フラクションＩ、■、■、■、
■及び■は物質をそれぞれλ３，１．ｌＮｉ１７７．２
ｍ９、’／−２，４Ｌｍｑ、／ｊ♂ｍ７、／２２■及び
７７．６■含有する。これらのフラクションは高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で検定し、さらにフラ
クション■をＨＰＬＯにより精製した（目的物）。
ン■（チューブ４ ／ ２− ／ ４’ ） 、１１（
チューブ扁／ｒ−，２３）、■（チューブ扁２μ、３７
）、■（チューブＪｆ６コｊ−３２，３６）、■（チュ
ーブＡＪＪ−Ｊｊ）及びグ（チューブＡ ３１− Ａ
ｊ ）を凍結乾燥する。フラクションＩ、■、■、■、
■及び■は物質をそれぞれλ３，１．ｌＮｉ１７７．２
ｍ９、’／−２，４Ｌｍｑ、／ｊ♂ｍ７、／２２■及び
７７．６■含有する。これらのフラクションは高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で検定し、さらにフラ
クション■をＨＰＬＯにより精製した（目的物）。
カラム：隻ＴＳＫ ＧＥＬＩ／ ０ＤＳ−／λＯＴＡｒ
ｇ （ｊ） ！、ＯＡ （標識抗原の作成） 前記のＨＰＰ−保護ペプチド−樹脂１’！２■をアニソ
ール（／ ｒｎｌ ）及びエチルメチルスルフィド（０
，３ｍ１）の存在下にＨＰ（１０ｒｎｌ）テ、０℃、７
時間２０分間、常法により処理し、ついでＨＦは真空ポ
ンプにより０℃で除去される。
ｇ （ｊ） ！、ＯＡ （標識抗原の作成） 前記のＨＰＰ−保護ペプチド−樹脂１’！２■をアニソ
ール（／ ｒｎｌ ）及びエチルメチルスルフィド（０
，３ｍ１）の存在下にＨＰ（１０ｒｎｌ）テ、０℃、７
時間２０分間、常法により処理し、ついでＨＦは真空ポ
ンプにより０℃で除去される。
ペプチド及び樹脂は、酢酸エチルで数回洗浄され、真空
中、Ｐ２Ｏ５で乾燥される。ペプチドは３Ｍ酢酸（！ｒ
Ｏｍｌ）で抽出し、凍結乾燥される。粗ペプチドは＜ｚ
ｊｓ ｍｙであった。
中、Ｐ２Ｏ５で乾燥される。ペプチドは３Ｍ酢酸（！ｒ
Ｏｍｌ）で抽出し、凍結乾燥される。粗ペプチドは＜ｚ
ｊｓ ｍｙであった。
この粗ペプチド（ＨＰＰ−ペプチド）１６０ｍ７を直接
にゝバイオゲル（Ｂｉｏ Ｇｅｌ ） Ｐ−６“カラム
（２，ＯＸり２σ）にかけ、７Ｍ酢酸で溶出する。
にゝバイオゲル（Ｂｉｏ Ｇｅｌ ） Ｐ−６“カラム
（２，ＯＸり２σ）にかけ、７Ｍ酢酸で溶出する。
各フラクション（７？）は、分光光度計により２７♂ｎ
ｍでモニターされ、ＴＬＣで検出される（溶媒系： ／
−ＢｕＯＨ：酢酸： Ｈ２Ｏ： ａ ： ｔ ：ｊ）
。
ｍでモニターされ、ＴＬＣで検出される（溶媒系： ／
−ＢｕＯＨ：酢酸： Ｈ２Ｏ： ａ ： ｔ ：ｊ）
。
ψつのペプチド含有フラクション、すなわちフラクショ
ンＩ（チューブ扁ター／♂）、■（チューブＡｉ、 ／
り、２２−２≠）、■（チューブＡコ０−．２／）及び
■（チューブＡ２！−５０）を凍結乾燥する。
ンＩ（チューブ扁ター／♂）、■（チューブＡｉ、 ／
り、２２−２≠）、■（チューブＡコ０−．２／）及び
■（チューブＡ２！−５０）を凍結乾燥する。
フラクションＩ、■、■及び■は物質をそれぞれｔｒ、
ａｍｇ、ｌＡ７，０ｍ９、／Ａ、Ｇｑ及びり、ｏｍｙ含
有する。これらのフラクショ／はＨＰＬＯで検定し、さ
らにフラクション■をＨＰＬＣで精製した（ＨＰＬＣの
実施条件は前記に同じ。）。
ａｍｇ、ｌＡ７，０ｍ９、／Ａ、Ｇｑ及びり、ｏｍｙ含
有する。これらのフラクショ／はＨＰＬＯで検定し、さ
らにフラクション■をＨＰＬＣで精製した（ＨＰＬＣの
実施条件は前記に同じ。）。
アミノ酸分析 （１ＮＨｃｔ、 ／ ／ ０℃、２
≠時間） Ａｓｐ （２）λ、０３ 、 Ｔｈｒ （ｊ）
ＩＩ、３ ／ 、Ｓｅｒ （ｊ） 、２．７７ 、
Ｇｌｕ （ｐ） ３．メタ 、Ｇｌｙ （Ｊ）３
．２ ／ 、 Ａｌａ （１）／、０３ 、
Ｖａｌ（１）／、／ ７ 、 Ｍｅｔ （Ｊ）３
，２４ 、工Ｉｓ （２）／、７ｇ 、 Ｌｅｕ
（Ｑ ３．り６ 、ｐｈｅ （３）２Ｊ Ｏ、Ｌｙｓ
（Ｊ）３．／ ２ 、Ａｒｇ （ｊ）弘、ｒｓ 得られたＨＰＰ結合ペプチド（／−≠≠）をハンター（
Ｈｕｎｔｅｒ ）とグリーンウッド（Ｇｒｅｅｎ −の
クロラミンＴ法によりヨード化した。
≠時間） Ａｓｐ （２）λ、０３ 、 Ｔｈｒ （ｊ）
ＩＩ、３ ／ 、Ｓｅｒ （ｊ） 、２．７７ 、
Ｇｌｕ （ｐ） ３．メタ 、Ｇｌｙ （Ｊ）３
．２ ／ 、 Ａｌａ （１）／、０３ 、
Ｖａｌ（１）／、／ ７ 、 Ｍｅｔ （Ｊ）３
，２４ 、工Ｉｓ （２）／、７ｇ 、 Ｌｅｕ
（Ｑ ３．り６ 、ｐｈｅ （３）２Ｊ Ｏ、Ｌｙｓ
（Ｊ）３．／ ２ 、Ａｒｇ （ｊ）弘、ｒｓ 得られたＨＰＰ結合ペプチド（／−≠≠）をハンター（
Ｈｕｎｔｅｒ ）とグリーンウッド（Ｇｒｅｅｎ −の
クロラミンＴ法によりヨード化した。
すなわち、／、ＯＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，≠、２Ｑμ
ｔ）に、精製水（１０μｔ）中のペプチド（Ｊ、ｌ’）
、３００４Ｃｉの（１２５１） Ｎａ及び精製水（１０
μｔ）中のクロラミンＴ（２０μ？）を連続的に添加し
、混合物を３０秒間振とうし、精製水（ｊＯμｔ）中の
メタ重亜硫酸ナトリウム（１００μ？）を加えて反応を
停止した。ついで混合物を、７Ｍ酢酸を溶離液とする１
セフアデツクスＧ ｕ ｊ ”カラム（／、Ｏ×３０ｍ
）に付し、精製し、目的とする標識抗原を得た。
ｔ）に、精製水（１０μｔ）中のペプチド（Ｊ、ｌ’）
、３００４Ｃｉの（１２５１） Ｎａ及び精製水（１０
μｔ）中のクロラミンＴ（２０μ？）を連続的に添加し
、混合物を３０秒間振とうし、精製水（ｊＯμｔ）中の
メタ重亜硫酸ナトリウム（１００μ？）を加えて反応を
停止した。ついで混合物を、７Ｍ酢酸を溶離液とする１
セフアデツクスＧ ｕ ｊ ”カラム（／、Ｏ×３０ｍ
）に付し、精製し、目的とする標識抗原を得た。
実施例／
（免疫抗原の調製及び免疫）
５０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）−生理食塩水溶
液の調製：ＰｖＰｌｏｔを生理食塩水中、室温でガラス
棒で撹拌しながら溶解し、全屈を２０ｍ１とする。
液の調製：ＰｖＰｌｏｔを生理食塩水中、室温でガラス
棒で撹拌しながら溶解し、全屈を２０ｍ１とする。
参考例／で得られたペプチド（≠、０ｍ９）を秤量ビン
中で、生理食塩水０．３ｍｌに溶解し、上記５０％ＰＶ
Ｐ−生理食塩水溶液０．Ａｍｌを加え、氷温で２時間ゆ
るやかに攪拌する。ついで、フロイン）、 （Ｆｒｅｕ
ｎｄ ）の完全アジュバン） （／、／ｍｌ ）を加え
、水冷下ホモゲナイザ＝（ＳＯ，ＯθＯｒｐｍ ）で７
５分間攪拌し乳化する。
中で、生理食塩水０．３ｍｌに溶解し、上記５０％ＰＶ
Ｐ−生理食塩水溶液０．Ａｍｌを加え、氷温で２時間ゆ
るやかに攪拌する。ついで、フロイン）、 （Ｆｒｅｕ
ｎｄ ）の完全アジュバン） （／、／ｍｌ ）を加え
、水冷下ホモゲナイザ＝（ＳＯ，ＯθＯｒｐｍ ）で７
５分間攪拌し乳化する。
この乳化液（／ ｍｌ ）を家ウサギ（２ｊ −３，０
ｋｇ＞に皮肉注射した。注射は最初の注射の乙の量でλ
週間毎にくりかえした。
ｋｇ＞に皮肉注射した。注射は最初の注射の乙の量でλ
週間毎にくりかえした。
ついで常法により全採血し、３７℃で７時間、弘℃で一
夜放置したのち遠沈（３，０００ｒｐｍ ）し、血清を
得る（ Ｒ−００６５，００乙乙及び００６７゜） （ラジオイムノアセイ） 希釈剤として、Ｂ Ｓ Ａ （０３％）、ＥＤＴＡ（０
，０２５Ｍ）及びＮａＣ４（０，／ Ｉｔ Ｍ ）を含
むリン酸緩衝液（０，０／ Ｍ、 ｐＨ７，弘）を使用
した。
夜放置したのち遠沈（３，０００ｒｐｍ ）し、血清を
得る（ Ｒ−００６５，００乙乙及び００６７゜） （ラジオイムノアセイ） 希釈剤として、Ｂ Ｓ Ａ （０３％）、ＥＤＴＡ（０
，０２５Ｍ）及びＮａＣ４（０，／ Ｉｔ Ｍ ）を含
むリン酸緩衝液（０，０／ Ｍ、 ｐＨ７，弘）を使用
した。
希釈剤（０，１Ａｒｎｌ）、標準品又は検体（０，／ｍ
ｌ）、希釈（最終： ｒｔ、ｏｏｏ倍）した本発明に係
る抗血清Ｒ−００１ｒ！； （０，／ｒａｔ）及び標識
抗原（ｒ、ｏｏ。
ｌ）、希釈（最終： ｒｔ、ｏｏｏ倍）した本発明に係
る抗血清Ｒ−００１ｒ！； （０，／ｒａｔ）及び標識
抗原（ｒ、ｏｏ。
−／ ０，０００ ｃｐｍ ） （０，／ ｍｌ ）を
インキュベーションチューブ中で混合した。混合物を弘
℃で≠ｇ時間インキュベートし、デキストラン（０，０
！ｊ％）被覆炭末（０，２≠％）の懸濁液（／ ｒｎｌ
）を加えた。≠℃で３０分間インキュベートした後、
遠心分離（≠℃、３．００Ｏｒｐｍ 、 ／ ６分間）
し、上清を分離し、カウントする。第７図は、このよう
にして得られた標準曲線である。
インキュベーションチューブ中で混合した。混合物を弘
℃で≠ｇ時間インキュベートし、デキストラン（０，０
！ｊ％）被覆炭末（０，２≠％）の懸濁液（／ ｒｎｌ
）を加えた。≠℃で３０分間インキュベートした後、
遠心分離（≠℃、３．００Ｏｒｐｍ 、 ／ ６分間）
し、上清を分離し、カウントする。第７図は、このよう
にして得られた標準曲線である。
〈発明の効果〉
本発明に係る抗血清は、レニン前駆体及びそのプロペプ
チドと特異的に反応するので、これらの検出、測定等に
有用である。
チドと特異的に反応するので、これらの検出、測定等に
有用である。
第７図は、本発明に係る抗血清を用いるＲ工Ａの標準曲
線を示す。矛１１Ｉ１７１侶導渡ｉｔ示し、縦軸＋ Ｆ
巻舌１ （Ｎ；バヅクグラウンド： β４ンフうしｍ
ｌ直、Ｂｏ：コントロール）ｌホ１゜ 出 願 人 三菱化成工業株式会社 代 理 人 弁理士 長谷用 −ほか７名 第 １ 図
線を示す。矛１１Ｉ１７１侶導渡ｉｔ示し、縦軸＋ Ｆ
巻舌１ （Ｎ；バヅクグラウンド： β４ンフうしｍ
ｌ直、Ｂｏ：コントロール）ｌホ１゜ 出 願 人 三菱化成工業株式会社 代 理 人 弁理士 長谷用 −ほか７名 第 １ 図
Claims (1)
- （１）【アミノ酸配列があります】 で示されるペプチドを温血動物に免疫することによりそ
の血液より取得され、レニン前駆体及びそのプロペプチ
ドに特異的な反応性を有する抗血清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP171885A JPS61160058A (ja) | 1985-01-09 | 1985-01-09 | 抗血清 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP171885A JPS61160058A (ja) | 1985-01-09 | 1985-01-09 | 抗血清 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61160058A true JPS61160058A (ja) | 1986-07-19 |
Family
ID=11509342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP171885A Pending JPS61160058A (ja) | 1985-01-09 | 1985-01-09 | 抗血清 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61160058A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0994187A1 (en) * | 1998-10-13 | 2000-04-19 | Tokiwa Chemical Industries Co., Ltd. | Renin-active substance comprising human prorerin and antibodies to the prorerin profragment |
| JP2015031590A (ja) * | 2013-08-02 | 2015-02-16 | 国立大学法人岐阜大学 | 冠動脈疾患の検査キット |
-
1985
- 1985-01-09 JP JP171885A patent/JPS61160058A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0994187A1 (en) * | 1998-10-13 | 2000-04-19 | Tokiwa Chemical Industries Co., Ltd. | Renin-active substance comprising human prorerin and antibodies to the prorerin profragment |
| JP2015031590A (ja) * | 2013-08-02 | 2015-02-16 | 国立大学法人岐阜大学 | 冠動脈疾患の検査キット |
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