DE2635930A1 - Traegergebundene peptide, acth-peptidzwischenprodukte sowie ihre herstellung - Google Patents

Description

_Dr..|ng.R.3EE1 Z Jr.
β München 22, Standort**10 2635930

5^2-25.897P

10. August 1976

Armour Pharmaceutical Company

Greyhound Tower

Phoenix, Arizona 85077 .(V.St.A.)

Trägergebundene Peptide, ACTH-Peptidzwischenprodukte sowie ihre Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf die Peptidsynthese, insbesondere auf träger gebundene peptide,, die zur Herstellung biologisch aktiver Peptide verwendbar sind. Die Erfindung umfaßt dabei, sowohl die Peptide als neue Verbindungen als auch ihr Herstellungsverfahren.

Seit langem werden bestimmte natürliche biologisch aktive Substanzen aus. dem Material tierischer Drüsen gewonnen, die zur Behandlung von Mangelerseheinungen in der Humanmedizin Verwendung finden. Eine derartige Substanz ist das sog. adrenocorticotrope Hormon, üblicherweise kurz als ACTH bezeichnet, das lange zeit" aus tierischen Hypophysen, insbesondere von Schweinen und Rindern, gewonnen wurde.

Die große Mühe, die mit der Gewinnung der relativ klei-542-(Case 5622-T-A)-SFBk

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ORiGlNAL INSPECTED

nen Hypophysen von Tieren unmittelbar nach dem Schlachten verbunden ist, die nur begrenzte Menge derart gewonnener Drüsen sowie das aufwendige Reinigungsverfahren, das zur Herstellung in der Humanmedizin verwendbarer Peptide erforderlich ist, stellen außerordentlich große Nachteile bei der Herstellung natürlicher Peptidhörmone aus tierischen Drüsen dar. Obgleich infolgedessen auf diesem Gebiet ein außerordentliches Interesse an der Entwicklung praktischer Methoden sowie neuer Verbindungen besteht, die eine kommerzielle Synthese von Peptiden wie etwa von ACTH aus anderen als tierischen Ausgangsmaterialien ermöglichen, wurde nach Wissen der Erfinder bisher kein verfahrensmäßiger · oder stofflicher Zugang zur Lösung dieses Problems gefunden.

Für das menschliche adrenocorticotrope Hormon (ACTH) wurde folgende Struktur gefunden:

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-1 2-3 4 567 8 9 10 LI 12 13 14

-Lvs-Lys-Are-Arg-Pro-Val-Lvs-VaL-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-15 16 17 18 19 20 - 21 22 23 24 25 26 27 28

-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-ALa-Phe-Pro-Lou-Glu-Phe 29 30 3Γ ?2 33 34 35 36 37 38 39

Die Abkürzungen Phe, GIu, Leu etc. stehen dabei für die verschiedenen Aminosäuregruppierungen in der Peptidkette, die Zahlen stellen die Positionen der Aminosäuregruppen in der Kette entsprechend der üblichen Nomenklatur dar (vgl. Rlniker et.al., Nature New Biology 2^5, U¹I - 1)5 (1972)).

Zur Synthese gewisser peptide mit relativ kurzer Kettenlänge sind einige Laboratoriumsverfahren vorgeschlagen wordenj hierzu sind zu nennen: R. B. Merrifield; "Solid Phase Peptide

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Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide", j. Am. Chem. Soc. Vol. 85 (I963), 214-9" - 2154; J. W. Stewart, J. D. Young: "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Company, San Francisco, California). In diesen Publikationen finden sich jedoch keinerlei Angaben über trägergebundene peptide mit Aminosäuren der erfindungsgemäßen Art und Sequenz.

Der,. Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, intermediäre trägergebundene peptide anzugeben, aus denen biologisch aktive peptide abgeleitet werden können, insbesondere Peptide mit ACTH-Aktivität, sowie ein Verfahren für die kommerzielle Herstellung derartiger Peptide·.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Synthese in bzw. an fester Phase gelöst, wobei zunächst ein unlösliches Polystyrolharz chlormethyliert wird und darauffolgend an das Harz Aminosäuren in vorgegebener Sequenz unter verwendung eines Systems der Bildung und Wiederabspaltung von Schutzgruppen der aktiven Amino- und Carboxylgruppen ansynthetisiert werden; im Fall der ACTH-Synthese wird so entsprechend mit Phenylalanin begonnen, worauf Glutaminsäure sowie die übrigen Aminosäuren der Kette in der richtigen Sequenz ankondensiert werden; nach dem Ankondensieren der letzten Aminosäure der Kette werden die Peptidketten vom Harz abgespalten und die verbliebenen Schutzgruppen entfernt.

Die Erfindung gibt also trägergebundene Peptide (im folgenden kurz als Peptidharze bezeichnet) an, insbesondere solche mit (S) -CH₀-PlIe-GIu an einem Ende der

C-

Aminosäürekette, wobei ® das Harz und Phe bzw. GIu die Aminosäuren Phenylalanin bzw. Glutaminsäure bedeuten,

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aus denen Peptide mit biologischer Aktivität herstellbar sind, sowie ein Herstellungsverfahren für derartige Peptide.

Die Aminosäureketten der erfindungsgemäßen Peptidharze sind dabei identisch mit den Aminosäureketten natürlicher Peptide mit biologischer Aktivität, Es werden ferner auch Peptide mit Aminosäureketten angegeben, deren Aminosäuren hinsichtlich Art und Sequenz von den Aminosäureketten natürlicher biologisch aktiver Peptide verschieden sind, aus denen jedoch Peptide mit biologischer Aktivität abgeleitet werden können,ferner entsprechende Zwischenprodukte.

Die Totalsynthese der erfindungsgemäßen Peptide natürlicher oder modifizierter Sequenz umfaßt zahlreiche Reaktionen, bei denen ebenfalls zahlreiche neue Peptid-Zwischenstufen gebildet werden, die im folgenden hinsichtlich ihrer Strukturformel anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert werden.

Herstellung eines unlöslichen Harzes

Die Chlormethylierung des Harzes erfolgt nach folgender Formel:

@ + Cl-CH₂OCH, » (R)- CH₂-Cl + CH₅OH

in der Qy das unlösliche Polystyrolharz bedeutet, das durch katalytlsche Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol in Kugelform hergestellt wird. Das Harz wird dabei unter Verwendung von Chlormethyl-methyläther und Zinnchlorid als Katalysator chlormethyliert.

Die Reaktion wird durch das folgende Beispiel erläutert .

f09809/1007

BEISPIEL 1

1 kg eines zu 2 % mit Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzes von 0,035 - 0,075 mm (200 - 400 mesh) Korngröße wurde dreimal mit je 2 1 Methylenchlorid gewaschen. Feine Partikel wurden durch jeweiliges Abziehen des Methylenchlorids vom Boden entfernt. Das Harz wurde anschließend durch Suspendieren, 10-minütiges Rühren und Filtrieren durch eine Glasfritte unter Verwendung von jeweils 2-1-Teilen folgender Lösungsmittel gewaschen: mit 2 Teilen Tetrahydrofuran, mit'1 Teil In NaOH, mit 2 Teilen Wasser, mit 2 Teilen Dimethylformamid, mit 2 Teilen Dioxan sowie mit 3 Teilen Methanol. Das gewaschene Harz wurde anschließe-nd im Vakuum bei 60 ⁰C getrocknet.

500 g des gewaschenen Polystyrolharzes wurden mit 5 1 Chlormethyl-methyläther oei Raumtemperatur gerührt; die Temperatur wurde anschließend in einem Eis-Wasser-Bad auf 0 - 5 °C erniedrigt. Anschließend wurden 75 g wasserfreies Zinnchlorid in 925 ml eiskaltem Chlormethylmethyläther zugesetzt und das Gemisch 2 h im Eisbad gerührt. Das Harz wurde durch eine Glasfritte abfiltriert und mit jeweils 2 1 der folgenden Lösungsmittel gewaschen: 25 % Wasser in Dioxan, 25 % 2n HCl in Dioxan, Wasser sowie zweimal mit Methanol. Das gewaschene Harz wurde bei 45 - 50 ⁰C im Vakuum getrocknet. Nach diesem Verfahren beträgt der übliche Chloridgehalt 0,7 - ],0 mäq/g (mäq = Milliäquivalent). - -

Phenylalanin-Veresterung an das Polystyrolharz

Zunächst wird Phenylalanin an das Polystyrolharz gebunden. Die Reaktion geschieht nach folgender Formel:

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R)-CH₂Cl + HOOC-C-CH₂-

BA

CRJ-CH₀-O-C-C-CH₀- (f v> + BA-HCl

/. ι L.

NH

Kupplungsreaktion I;

in der Formel bedeuten:

(r) das Polystyrolharz,

BA eine geeignete Base wie Triäthylamin, Diisopropylamin, Diisopropyläthylamin oder ein Alkalimetallsalz sowie

P eine Amino-Schutzgruppe wie etwa Amyloxycarbonyl (AMOC), o-Nitrophenylsulfenyl (NPS) oder vorzugsweise tert.-Butyloxycarbonyl (BOC).

Wie aus der obigen Formel hervorgeht, wird das tert.-Butyloxy-L-phenylalanin in Gegenwart eines Säure-Akzeptors mit dem chlorinethylierten Harz verknüpft. Die Reaktion geht aus dem folgenden Ausführungsbeispiel 2 hervor.

BEISPIEL 2

50 g des wie zuvor beschrieben hergestellten chlormethylierten Polystyrolharzes mit einem Chlorgehalt von

£09809/1007

0,7^ mäq/g (57 mäq Chlor) wurden mit 19,6 g BOC-L-Phenylalanin (74 raäq) in 350 ml absolutem Äthanol gerührt und anschließend 9,77 ml Triäthylamin (72 mäq) zugesetzt; das Gemisch wurde unter Rühren 24 h am Rückfluß gehalten. Das Gemisch wurde anschließend abgekühlt, durch einen Büchner-Trichter mit Glasfritte filtriert und auf der Fritte mit 500-ml-Portionen folgender Lb-

denaturiertem

denaturiertem Alkohol, zweimal mit Wasser sowie zweimal mit Methanol. Das Harz wurde anschließend bei 40 - 45 ⁰C im Vakuum getrocknet. Die Stickstoffanalyse ergab Werte zwischen etwa 0,50 - 0,70 mäq./g. Nach der (im folgenden beschriebenen) Abspaltung der BOC-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure wurde der Gehalt des Harzes an freien terminalen Aminogruppen durch Titration zu etwa 0,38 mäq/g bestimmt.

sungsmittel gewaschen: zweimal mit Alkohol, zweimal mit Dioxan, zweimal mit

Abspaltung der Schutzgruppe;

Säure

R)-CH₉-O-C-C-N-P

■2. Base

0 H Il I

(R)-CH₂-O-C-C-NH₂

Das resultierende Peptidharz wird .als Verbindung 1 ' bezeichnet.

Die Abspaltung der Schutzgruppe von der Aminofunktion des Phenylalanin geschieht durch Verwendung einer geeigne.

(mit 5- fo Methanol denaturierter Alkohol)

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ten Säure wie Trifluoressigsäure oder Salzsäure. Das resultierende Aminsalz wird anschließend durch Behandeln mit einer starken organischen Base neutralisiert. Ein Ausführungsbeispiel für dieses Verfahren gibt das folgende Beispiel 3.

BEISPIEL 3

25 g BOC-Phenylalanin-Harz nach Beispiel 2 wurden in das Reaktionsgefäß einer Peptidsyntheseapparatur eingebracht. Die Probe wurde zweimal mit 125 ml Methylenchlorid jeweils 2 min gewaschen. Darauf wurden 125 ml 50 #ige Trifluoressigsäure in Methylenchlorid zugesetzt und .das Gemisch 30 min zur Reaktion gebracht. Nach Filtration wurde das Harz dreimal mit 125 ml Methylenchlorid, zweimal mit 125 ml Methanol und dreimal mit 125 ml Chloroform jeweils 2 min gewaschen. Anschließend wurde mit 125 ml einer ]0 $igen Lösung von Triäthylamin in Chloroform 5 min neutralisiert. Das Harz wurde anschließend dreimal mit 125 ml Chloroform und dreimal mit 125 ml Methylenchlorid gewaschen.

Kupplung von Glutaminsäure

OH H 0

fl I I Il

(R)-CH^-O-C-C-NH₀ + HOOC-C-CH₉-CH₉-C-O-Bz CA y.

<y ζ 1 i- 1 ~~

NH

OHHOH Ο

S-. /I I I Π I Il

[R)-CH₀-O-C-C-N-C-C-CH₉-CH₉-C-O-Bz

NH !

Kupplungsreaktion 2.

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Darin bedeuten:

CA ein Kupplungsagens, das Peptidbindungen zu bilden vsrmag^wie etwa Diimide, Azide, aktive Ester und Anhydride, vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC),

Bz Benzyl oder ein Benzylderivat wie beispielsweise p-Methoxybenzyl, p-Chiorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl.

Die. genannten Symbole (r) , BA, P, CA und Bz haben im folgenden einschließlich der Ansprüche die zuvor definierte Bedeutung.

Da Formelangaben wie die obige zu viel Platz beanspruchen, werden die Reaktionsprodukte nachfolgend in der entsprechenden abgekürzten Schreibweise dargestellt: ■

g) - CH₂-Phe-Glu-P
Bz

in der phe Phenylalanin und GIu Glutaminsäure bedeuten.

Diese vereinfachte Nomenklatur wird im folgenden bei allen Reaktionen verwendet.

Zur Durchführung der Reaktion können P, Bz und Glutaminsäure kombiniert vorliegen wie etwa in BOC-L-^-Benzylglutamat das unter Zusatz von DCC als Kupplungspromoter zu dem von der Schutzgruppe befreiten Phenylalaninharz zugegeben werden kann. An die Kupplung schließt sich die Entfernung der Schutzgruppe an, wie bereits beim Phenylalanin-Peptidharz erläutert. Nach der Abspaltung der Schutzgruppe besitzt das Produkt

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die Formel

(R) —CIL-PIie-Glu-NHp (Verbindung 2). Bz

Nach Wissen der Erfinder handelt es sich hierbei um die erstmalige Herstellung dieses Peptldharzes, was einen bedeutenden Schritt bei der ACTH-Synthese darstellt. - ·

Von den Erfindern wurde ferner die bedeutsame Feststellung gemacht, daß die Vollständigkeit der Kupplungsreaktion durch Ninhydrin-Test geprüft werden kann (vgl, E. Kaiser, R. Colescott, C. Bossinger und P. Cook, Anal. Biochem. Jh, 595-98 (197O)). Wenn die Ninhydrin-Reaktion negativ ist, kann die Schutzgruppe vom Harz abgespalten und zur folgenden Kupplungsreaktion übergegangen werden. Bei positivem Ausfall der Ninhydrin-Reaktion wird der Kupplungsschritt wiederholt, bis die Ninhydrin-Reaktion schließlich negativ ist.

Die folgenden Ausführungsbeispiele beziehen sich⁰-auf die Kupplung von Glutaminsäure.

pi; is fiel h

Zu dem von Schutzgruppen befreiten Phenylalaninharz mit 10,7 mäq Aminogruppen wurde eine Lösung von 15 mmol (etwa 50 % Überschuß) D OC-L-"jf -Benzylglutamat in 100 ml Methylenchlorid zugesetzt. "Nach 2 min wurde eine Lösung von 15 mäq Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und das Gemisch 4-5 min gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert und zweimal mit Jeweils 125 ml Chloroform und Methylenchlorid gewaschen. Die Ninhydrin-Reaktion

JT09809/-1007

wurde an einer 3-5 mg-Probe des Peptidharz-Reaktionsprodukts vorgenommen und ergab sich als negativ. Anschließend wurde die Schutzgruppe nach Beispiel 3 abgespalten.

■- ; - BEISPIEL 4A

2 g Phenylalaninharζ wurden von der Schutzgruppe befreit und neutralisiert wie zuvor beschrieben. Anschließend wurden 3 mmol NPS-L-X-Benzylglutamat, die in 25 ml Methylenchlorid gelöst waren, sowie 3 mmol Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben. Das Gemisch wurde Γ h gerührt, filtriert und zweimal mit Methylenchlorid, zweimal mit Methanol sowie dreimal mit Methylenchlorid in Mengen von jeweils 125 ml- gewaschen.

■■■■ , BEISPIEL 4B

Es wurde entsprechend Beispiel 4A verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle von NPS AMOC in gleichen Mengen eingesetzt wurde; es wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.

BEISPIEL 4C

Anstelle von BOC-L-y-Benzylglutamat wurden 15 mmol BOC-L-T-p-Brombenzylglutamat verwendet; die Reaktion wurde in der in Beispiel 4 beschriebenen weise durchgeführt. Es wurde ein Produkt mit p-Brombenzyl als Bz-Gruppe erhalten. Nach dem Abspalten der Schutzgruppe und Neutralisation wurde die gleiche verbindung 2 wie in Beispiel 4 erhalten.

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BEISPIEL 4D

In Beispiel 4 stellte Bz eine Benzylgruppe dar; in gleicher Weise sind p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzylhydryl anstelle der Benzyl-Gruppe in BOC-L-^-Benzylglutamat verwendbar. Nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren werden entsprechend Reaktionsprodukte erhalten, bei denen die Bz-Gruppe p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl ist. Nach dem Abspalten der Schutzgruppe unter Neutralisation wird in jedem Falle dieselbe Verbindung 2 wie in Beispiel 4 erhalten.

In der folgenden Tabelle I sind die entsprechend aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte 2-39 unter Bezeichnung der jeweiligen Verknüpfungsposition unter Nennung der in jedem Schritt ansynthetisierten Aminosäure sowie der bevorzugten Schutzgruppen aufgeführt.

Tabelle I

Reaktion	Position	Ansynthetisierte	Aminosäuregruppe
Nr.	Nr.	Aminosäure	mit bevorzugter
			Schutzgruppe
2	38	Glutaminsäure ·	BOC-L-r-Benzyl- glutamat
3	37	Leucin	BOC-L-Leucin- hydrat
4	36	Prolin	BOC-L-Prolin
5	35	Phenylalanin	BOC-L-Phenylalanin
6	34	Alanin	BOC-L-Alanin

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	Position Nr.	- 13 -	2635930
	33	Tabelle I, Fortsetzung
Reaktion .Nr.	32	Ansynthetisierte Aminosäure	Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe
7	31	Glutaminsäure	BOC-L-T -Benzyl- glutamat
8	30	Alanin	BOC-L-Alanin
.". 9 . '	29	Serin	BOC-0-Benzyl-L- Serin
10	28	Glutaminsäure	BOC-L-y-Benzyl- . glutamat
11	27	Asparaginsäure	DOC-L-ß-Benzy1- aspartat
12	26	Glutaminsäure	BOC-L-^- Benzyl- glutamat
13	25	Alanin	BOC-L-Alanin
14	24	Glycin	BOC-Glycin
15	23	Asparagin	BOC-L-Asparagin- p-Nitrophenyl- ester
16	22	Prolin	BOC-L-Prolin
17	21	Tyrosin	BOC-L-Tyrosln (20 % Dimethyl formamid zur Löslichkeit)
18	Valin	BOC-L-Valin
19	Lysin	BOC-2-Chlorcarbo

20	20	Valin
21	19	Prolin
22	18	Arginin

17

16

Arginin

Lysin f09809/1007

benzyloxy-L-Lysin (10 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)

BOC-L-Valin BOC-L-Proln

BOC-L-Tosylarginiri (20 % Dirnethylforn·. amid zur Löslichkeit)

BOC-L-Tosylarginin (20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)

BOC-2-Chlorcarbobenzyloxy-L-Lysin (10 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)

Tabelle I, Fortsetzung

Reaktion 'Position Ansynthetisierte Aminosäuregruppe Nr. Nr. Aminosäure mit bevorzugter

Schutzgruppe

25	15	Lysin	BOC-2-Chlorcarbo- benzyloxy-L-Lysin (10 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
26	14	QIycin	BOC-Glycin
27	13	Valin	BOC-L-Valin
28	12	Prolin	BOC-L-Prolin
29	11	Lysin	BOC-2-Chlorcarbo- benzyloxy-L-Lysin (10 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
30	10	Glycin	BOC-Glycin
31	9	Tryptophan	BOC-L-Tryptophan

Arginin

(5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)

BOC-L-Tosylarginin (20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)

33	7	Phenylalanin	BOC-L-Phenylalanin
34	6	Histidin	BOC-im-Carbobenzyloxy-
			L-Histidin
35	5	Glutamins äure	BOC-L- T'-Benzylglutamat
36	4	Methionin	BOC-L-Methionin
37	3	Serin	BOC-0-Benzyl-L-Serin
38	2	Tyrosin	BOC-L-Tyrosin

Serin

(20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)

BOC-0-Benzyl-L-Serin

jeder folgende Reaktionsschritt der Verknüpfung einer weiteren Aminosäure verläuft dabei in gleicher Welse, wie in Zusammenhang mit der Verknüpfung von Glutaminsäure in Reaktion 2 beschrieben, indem das jeweils zuvor erhaltene

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Peptidharz in geschütztem Zustand mit der folgenden Aminosäure gekuppelt, die Schutzgruppe vom gekuppelten peptid abgespalten und neutralisiert wird. Im einzelnen werden dabei jeweils folgende Reaktionsschritte.· vorgenommen:

Kupplung:

15 mmol der jeweiligen BOC-Aminosäure (0,43 Äquivalent Überschuß in 100 ml Methylenchlorid)

15 mmol Dieyclohexylcarbodiimid (DCC, Kupplungsagens) in 15 ml Methylenchlorid, Reaktionszeit 40 min

zweimaliges Waschen mit je 125 ml Chloroform, jeweils 2 min

zweimaliges Waschen mit je 125 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min

Abspaltung der Schutzgruppe;

zweimaliges Waschen mit je 125 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min

50 % Trifluoressigcäure in Methylenchlorid, 5 min, 125 ml,

50 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, 25 min, 125 ml,

dreimaliges Waschen mit je 125 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

zweimaliges Waschen mit je 125 ml Methanol, jeweils 2 min,

dreimaliges Waschen mit 125 nil Chloroform, jeweils 2 min.

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Neutralisation:

zweimal 125 ml 10 % Triäthylamin in Chloroform, jeweils 5 min,

viermaliges Waschen mit je 125 ml Chloroform, jeweils 2 min.

Die Schritte der Kupplung, Abspaltung der Schutzgruppe sowie der Neutralisation bei den Reaktionen 3-39 entsprechen dabei den bei Reaktion 2 beschriebenen mit Ausnahme folgender Abweichungen.

Verbindung 2 ist als Ergebnis der Reaktion 2 (nach Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisation):

- CH_O-Phe-Glu-NH_O I

Bz

nach Reaktion 3 liegt Verbindung Nr. 3 vor:

® -CEL-Phe-Glu-Leu-NH

^d I i Bz

nach Reaktion 4 liegt verbindung 4 vor:

(S) -CH^-Phe-Glu-Leu-Pro-NHp

Bz

nach Reaktion 5 liegt Verbindung 5 vor:

(r) -CH₀-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-NH₀ Bz

Das Verfahren wird bis zur Verknüpfung von Asn in Position 25 fortgesetzt. In dieser Position kann

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DCC wegen des Auftretens einer' Asparagin verbrauchenden Nebenreaktion nicht als Kupplungsagens,verwendet werden, so daß die Aminosäure in dieser Position als "aktiver Ester" angekuppelt wird.

Das von der Schutzgruppe befreite Peptidharz wird mit einem aktiven Ester des Asparagine wie etwa dem P-Nitrophenylester, dem o-Nitrophenylester oder dem Pentachlorphenylester gerührt.

Der entsprechende Kupplungsschritt wird im folgenden Beispiel 5 näher erläutert.

BEISPIEL 5

■ Das der Verbindung 14 nach der Reaktion 14 entsprechende Peptidharz (nach Abspalten der Schutzgruppe und Neutralisation) wurde dreimal jeweils 2 min mit 125 ml Dimethylformamid gewaschen. 3 mmol in 15 ml Dimethylformamid gelöster BOC-L-Asparagin-p-Nitrophenylester wurden ΐβ h mit dem Harz geschüttelt und anschließend dreimal mit je 125 ml Dimethylformamid, Methanol sowie Methylenchlorid gewaschen.

BEISPIEL 5A . .

Anstelle des p-Nitrophenylesters in Beispiel 5 sind ebenso die o-Nitrophenyl- oder pentachlorphenylester verwendbar; die Kupplungsreaktion des Asparagine wird dabei in gleicher weise wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.

Der Kupplung über den aktiven Ester in Position folgt die übliche Abspaltung der Schutzgruppe und die

f-o'9809/,1 007

Neutralisation, wobei eine Peptidharz-Verbindung 15 folgender Formel entsteht:

-GIu-Leu-Pro-Phe- AIa-GIu- AIa- Ser-Glu-Asp-Glu-I . ' ■ Γ" I I I 1

^Bz Bz Bz Bz Bz Bz

-AIa-GIy-ASn-NH₂

Bei den Reaktionen 17 und 38, d.h. bei den Positionen 23 bzw. 2, bei denen Tyrosin angekuppelt wird, wird vorzugsweise keine Schutzgruppe an der phenolischen Hydroxylgruppe des Tyrosins angebracht^ sondern eine Benzyl- oder Benzylderivat-Schutzgruppe verwendet. Das Symbol Y bedeutet entsprechend das Fehlen einer Schutzgruppe bzw. Benzyl oder ein Benzylderivat.

Zur Erläuterung sei die Formel der nach Reaktion vorliegenden Verbindung 17 angeführt:

^-CH^-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-ALa-Ser-Glu-Asp-Glu-^Z I . I I I I I

Bz Bz Bz Bz Bz Bz

-AIa-Gly-Asn-Pro-Tyr-NH

I Y

Bei Reaktion I9, entsprechend Position 21, bei der Lysin angekuppelt wird, wird vorzugsweise 2-Chlorcarbobenzyloxy (Cl-CBZ) als E-Amino-Schutzgruppe verwendet; Carbobenzyl (CBZ), 2-Bromcarbobenzyloxy, 2,4-Dichlorcarbobenzyloxy oder Trifluoracetyl (TFA) sind jedoch in gleicher Weise verwendbar.

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Die Verwendung einer der genannten Gruppen als £-Amino-Schutzgruppe ist durch das Symbol V angedeutet. Die Schutzgruppe V wird ebenfalls bei der Verknüpfung von Lysin bei den Reaktionen 24, 25 und 29 in den entsprechenden Positionen 16, 15 und 11 eingesetzt. Zur Erläuterung wird die Formel der nach Reaktion 19 vorliegenden verbindung 19 angeführt:

(E^-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Glu-Asp-Glu-

w 2 , ι ι ι ι ι

Bz Bz Bz Bz Bz Bz

-Ala-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val-Lys-NH

I '

Y V

, ²

Zur Kupplung der Aminosäure Arginin in Reaktion 22 bzw. Position l8 wird vorzugsweise die Tosylgruppe (p-Toluolsulfonyl) als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe verwendet; die Nitrogruppe ist jedoch in gleicher Weise verwendbar. Das Formelsymbol T bezeichnet entsprechend eine Tosyl- oder Nitrogruppe. Die Schutzgruppe τ wird ferner bei der Verknüpfung von Arginin in Reaktion 2? bzw. Position 17 sowie in Reaktion 32 bei Position 8 verwendet.

Die Strukturformel der in Reaktion 22 gebildeten Verbindung 22 ist:

©-CH^Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Glu-Asp-Glu-

' I I I I I

^ßZ Bz Bz Bz Bz Bz

-Ala-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-NHo

I· I · · I ^l YV T

90880.9/ 1 007

Zur Kupplung des Histidins in Reaktion 34 bzw. Position 6 wird die Verwendung der Carbobenzyloxy-Gruppe (CBZ) als Schutzgruppe für das Imidazol bevorzugt; die Reaktion ist jedoch auch mit Tosyl, Dinitrophenyl, Benzyl, Benzylderivaten sowie ohne Schutzgruppe in gleicher Weise durchführbar. Das Symbol W dient dabei zur Bezeichnung einer fehlenden bzw. einer der genannten Schutzgruppen.

Die Symbole T, Y, V und W besitzen in Beschreibung und Ansprüchen die jeweils genannte Bedeutung.

Zur Erläuterung wird die Strukturformel der in Reaktion 34 gebildeten verbindung 34 angeführt:

-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Glu-Asp-Glu-

I I

Bz

Ala-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-Gly-

' I I I j I I

Y V TTVV'

-Val-Pro-Lys-Gly-Trp-Arg-Phe-His-Ni^

I I I ·. . ·

τ τ w · ' ··■■·

Nach der Verknüpfung des Serins in Reaktion und Position 1 in der zuvor angegebenen Art und Sequenz sowie dem Abspalten der Schutzgruppe und Neutralisation des gekuppelten Peptidharzes gelangt man zu Verbindung mit folgender Formel:

909809/1007

(llY-CH^he-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Glu-Asp-Glu-

^ ²' 1 I" IiII

Bz . Bz Bz Bz Bz Bz

Ala-Gly-Asn-PrO-Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-Gly-

. 1,1 I Il I

Y V TTVV

-Val-Pro-Lys-Gly-Trp-Arg-Phe-His-Glu-Met-Ser-Tyr-Ser-NIi^

1 Il I I I I

V -T W Bz Bz T Bz

Nach jeder Kupplungsreaktion und vor dem Abspalten der Schutzgruppe vom Peptldharz wird vorzugsweise der Ninhydrin-Test durchgeführt; der Test verläuft nicht in allen Fällen negativ, was eine Wiederholung der zuletzt vorgenommenen Kupplungsreaktion erforderlich macht.

Ausbeute

Wenn beispielsweise 25 g BOC-Phenylalanin-Harz den Reaktionen .2 - 39 der Tabelle I unter Bildung der resultierenden Verbindung 39 unterworfen wurden, wurden (nach dem Abspalten der Schutzgruppe, Neutralisation und Vakuumtrocknung) 53/0 g Produkt erhalten.

Nach der Synthese des Peptidharzes' und der Verknüpfung aller erwünschten Aminosäuren in der gewünschten Sequenz kann das peptidharz nach der üblichen Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisationsschritten einer Behandlung zur Entfernung des Harzes und der verbliebenen Schutzgruppen

aller oder unterzogen werden; Zur Abspaltung des Harzes und/nahezu aller verbliebenen Schutzgruppen kann günstigerweise eine Behandlung mit Fluorwasserstoff herangezogen werden. Die Formel für diese Sp.altungsreaktion ist:

809/1007

RJ-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-GLu-Asp-Glu-Ala- ^^ ^z i ι ι ι I f -

Bz Bz Bz Bz Bz Bz

-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-Gly-Val-Y V T T -V V

-Pro-Lys-GIy-Trp-Arg-Phe-His-GIu-Met-Ser-Tyr-Ser-NH₉ ι lit ι ι ι ^z

V T W Bz Bz Y Bz ,

Reaktion wobei V eine andere Gruppe als TPA bedeutet_;

+ HF

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-1 2 3 4 5 6 7-8 9 10 11 12 13 14

-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe 31 32 33 34 35 36 37 38 39

entsprechend verbindung 40.

Wenn V in obiger Reaktion TFA bedeutet, ist das Reaktionsprodukt:

TFA. (

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-12 3 4 5- 6 - 7. 8 9 10 11.12 13 14

TFA TFA TFA

ι ι ι

-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Giu-Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

(Verbindung 41)

09Π00⁷

Ein Ausführungsbeispiel für die Spaltungsreaktion für den genannten Fall, bei dem V keine TFA-Gruppe ist, ist im folgenden Beispiel 6 angeführt.

HEISPIEL 6

2 g der Verbindung 39 wurden in ein Reaktionsgefäß aus synthetischem Material (KeI-F) zusammen mit 2 ml Anisol eingebracht und 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff durch Destillation zugesetzt. Das Gemisch wurde l h bei 0 °C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde durch Vakuumdestillation abgezogen,der Rückstand viermal mit Ä'thylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Der Eisessigextrakt wurde lyophilisiert und ergab 0,86 g eines lockeren weißen Pulvers. Dieses Verfahren entfernt das Peptid vom Harz sowie alle Schutzgruppen auf den Aminosäuren.

Das nachstehende Beispiel 7 erläutert die Spaltungsreaktion für den Fall, daß V TFA ist.

BEISPIEL 7

2 g des obigen gebundenen ACTH-Peptldharzes wurden in ein Gefäß aus synthetischem Material (Kel-F) mit 2 ml Anisol eingebracht und 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff durch Destillation zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 h bei 0 ⁰C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde durch Vakuumdestillation abgezogen, der Rückstand viermal mit Ä'thylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Der Eisessigextrakt wurde lyophilisiert und lieferte 856 mg eines lockeren weißen Pulvers. Dieses Verfahren

^09809/1007

entfernt das Peptid vom Harz sowie alle Schutzgruppen auf den bifunktioneilen Aminosäuren außer der Trifluoracetylgruppe auf den Lysinresten. Dieses Produkt wird entsprechend als TPA-ACTH-Peptid bezeichnet.

Das TPA-ACTH-Peptid wurde zur Entfernung der Trifluoracetyl-Gruppen vom Lysinrest mit wäßrigem Ammoniumhydroxid behandelt. 38O mg TFA-ACTH wurden mit 100 ml 4n Ammoniumhydroxid mit 0,1$ Mercaptoäthanol l6 h behandelt. Dieses Verfahren liefert rohes ACTH mit einer ACTH-Aktivität von 40 Einheiten/mg nach der U.S.P.-Methode.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es ferner möglich, ein aktives ACTH-Hormon einer von T.H. Lee,

A.B. Lerner und V. Buettner-Janusch (vgl. J. Biol. Chem. angegebenen Sequenz

236,2970 (l96l)/(Glutaminsequenz)) zu synthetisieren, das eine bedeutende Verbesserung gegenüber dem ACTH-Hormon mit Asparagin-Sequenz darstellt, dessen Synthese zuvor beschrieben wurde. Das Peptid ist leichter zu reinigen und alkalistabiler als das Peptid mit Asparagin-Sequenz. Die Synthese beruht auf der Kupplung verschiedener Aminosäuren in bestimmten Kupplungsreaktionen. Die Unterschiede gehen aus der nachstehenden Tabelle II deutlich hervor, in der die Kupplungsreaktionen bei der Synthese der Glutaminsequenz und die jeweils bevorzugten Schutzgruppen angeführt sind.

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	Position Nr.	Tabelle II .	Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe
Reaktion Nr,	30	Ansynthetis ierte Aminosäure	BOC-L-Glutamin-p- Nitrophenylester
10	29	Glutamin	BOC-L-P' -Benzyl- aspartat
.11	28	Asparaginsäure	BOC-L-^-Benzyl- glutamat
12	27	Glutaminsäure	BOC-GIycin
13	26	Glycin	BOC-L-Alanin
14	25	Alanin	BOC-L-ß-Benzyl- aspartat
15	24	A s-p ar ag i ns äur e	BOC-L-Prolin
16	23	Prolin	BOC-L-Tyrosin (20 % Dimethylforma mid zur Löslichkeit)
17	22	Tyrosin	BOC-L-Valin
18	21	Valin	BOC-e-Trifluor- acetyl-L-Lysin (5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
19	20	Lysin	BOC-L-Valin
20	19	Valin	BOC-L-Prolin
21	18	Prolin	BOC-L-Tosylarginin (20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
22	17	Arginin	BOC-L-Tosylarginin ' (20 % Dimethylforma mid zur Löslichkeit)
23	16	Arginin	BOC-e-Trifluoracetyl
24	Lysin

Lysin

509809/1007

-L-Lysin (5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)

BOC-e-Trifluoracetyl -L-Lysin (5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)

Tabelle II, Portsetzung

Reaktion Nr.	Position Nr.	Ansynthetisier te Aminosäure	Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe
26	14	Glycin	BQC-Glycin
27	13	Valin	BOC-L-Valin
28	12	Prolin	BOC-L-Prolin
29	11	Lysin	BOC-e-Tri fluor- acetyl-L-Lysin (5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
30	10	Glycin	BOC-Glycin
31	9	Tryptophan	BOC-L-Try pt ophan
32	8	Arginin	BOC-L-Tosylarginin (20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
-			BOC-L-Phenylalanin
33	7	Phenylalanin	BOC-im-Carbobenzyloxy-
34	6	" Histidin	L-Histidin
			BOC-L-^-Benzylglutamat
35	5	Glutaminsäure	BOC-L-Methionin
36	4	Methionin	BOC-0-Benzyl-L-Serin
37	3	Serin	BOC-L-Tyrosin (20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
38	2	Tyrosin

Serin

BOC-0-Benzyl-L-Serin

Die Reaktionen 2 - 9 in den Positionen 59-31 entsprechen genau denen in Tabelle I.

Wie aus der Tabelle II hervorgeht, unterscheidet sich die erfindungsgemäße verbesserte Synthese von der zuvor genannten dadurch, daß unterschiedliche Aminosäure-

£09809/1007

gruppen in den Positionen jjo, 27, 26 und 25 der Aminosäurekette verknüpft sind. Die verbindungen 1-9 dieser Synthese sind dabei dieselben wie die verbindungen 1 - 9 der zuerst beschriebenen Synthese; in Reaktion 10, bei der Gin anstelle von GIu eingesetzt ist, ergibt sich folgende Formel für die als .10A bezeichnete verbindung:

R^-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-NR"? ^z . l · i /

Bz Bz Bz ;

in Reaktion 13, bei der GIy anstelle von AIa eingesetzt ist, ergibt sich folgende Formel für die entsprechende Verbindung

^-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-Asp-Glu-Gly-^ Bz Bz' Bz Bz Bz

in Reaktion 14, bei der AIa anstelle von GIy eingesetzt ist, ergibt sich folgende Formel für das entstandene peptidharz, das als Verbindung l^A bezeichnet ist:

Q-CHj-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-Asp-Glu-Gly-

^Bz Bz Bz Bz Bz

-AIa-NH₂ ; · '

in Reaktion 15, bei der Asp anstelle von Asn eingesetzt ist, besitzt das als Verbindung 15A bezeichnete peptidharz folgende Formel:

$09809/1007

Jy-C^-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-Asp-Glu-Gly- ¹ . ^l t Ii Bz Bz Bz Bz Bz

-As ρ-NIl₀
l ² I

l
Bz

die abschließende Kupplungsreaktion 39 liefert ein als Verbindung 39A bezeichnetes Peptidharz folgender Formel:

Rj-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-Asp-Glu-Gly-Bz Bz Bz Bz Bz

-AIa-Asρ-Prο-Tyr-VaI-Lys-VaI-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-GIy-VaI-Prοι ι ί [ill Bz Y V TTVV

-Lys-Gly-Trp-Arg-Phe-His-GIu-Met-Ser-Tyr-Ser-NHo I . 1 11 1 1 1 ^z V ' T W Bz Bz Y Bz ·

Bei der Behandlung der Verbindung 39A (wobei ν = TFA ist) ergibt sich:

TFA 1

Ser-Tyr-Ser-Met-GlU-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

• TFA TFA TFA

II 1
-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

-Asp-Gln-Ser-Ala-GlU-Ala-Phe-Pfo-Leu-GlU-Phe -^;

29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

(Verbindung 4lA);

die Behandlung mit einer geeigneten wäßrigen Base wie piperidin oder Ammoniumhydroxid zur Entfernung der TFA-Gruppen liefert:

JO9809/1007

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe
32 33 34 35 36 37 38 39

(Verbindung 42). .

In den Fällen, in denen V eine andere Gruppe als TFA ist und die Verbindung 59A der Behandlung mit HF unterzogen wird, resultiert die Verbindung 42 mit obiger Struktur. Verbindung 42 kann dabei gereinigt werden, wie in Zusammenhang mit Verbindung 40 beschrieben; es wurde festgestellt, daß Verbindung 42 biologische ACTH-Hormonaktivität aufweist,

BEISPIEL 8

Das Beispiel bezieht sich auf die Synthese der Verbindung 42 in einem mittleren Maßstab sowie deren Reinigung zur Herstellung eines biologisch wirksamen ACTH-Hormonprodukts.

25 g BOC-Phenylalanin-Harz, das nach der zuvor beschriebenen Reaktion 1 hergestellt war, wurden in das Reaktionsgefäß einer kommerziellen Peptidsyntheseapparatur eingebracht (Vertrieb: Schwarz-Mann, Inc., Orangeburg, New York). Die Apparatur erlaubt eine automatisierte peptidsynthese durch programmierte Bandsteuerung.Das eingesetzte Harz besaß einen Äquivalenzwert von 0,397 mäq/g und 9*927 mäq gesamt. Die Kupplung, Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation geschehen folgendermaßen:

^09809/1007

Kupplung:

25 mmol der entsprechenden Aminosäure (1,5 Äquivalent Überschuß) gelöst in 25 ml Dimethylformamid, 25 ml Anisol, 25 S Urethan und 75 ml Methylenchlorid, 10 min Rühren;

25 mmol Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Trichloräthylen, Reaktionszeit 45 min unter Rühren; dreimal I50 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min, dreimal I50 ml Methanol, jeweils 2 min,

zweimal 15O ml Trichlorethylen, jeweils 2 min. Abspaltung der Schutzgruppe:

zweimal 15O ml Trichloräthylen, jeweils 2 min,

75 ml 20 % Phenol in 4n HCl-Dioxan + 75 ml 50 % Trichloressigsäure in Trichloräthylen mit 4 % Mercaptoäthanol, j50 min,

zweimal 150 ml Chloroform, jeweils 2 min, zweimal I50 ml Methanol, jeweils 2 min, dreimal I50 ml Chloroform, jeweils 2 min,

Neutralisation:

einmal 15O ml 10 % Triäthylamin in Chloroform, 10 min,

viermal I50 ml Chloroform, jeweils 2 min.

Die Aminosäuren wurden in der in Tabelle II angegebenen Reihenfolge gekuppelt, wobei dieselben in Tabelle II angegebenen Kombinationen von Aminosäuren

90 9809/1007

und Schutzgruppen verwendet wurden.

In Reaktion 10 bzw. Position >0 wurde das Harz dreimal mit Dimethylformamid gewaschen; nach dem Neutralisationsschritt wurden 25 mmol in 150 ml Dimethylformamid mit 1 % Essigsäure gelöster BOC-L-Glutamin-p-Nitrophenylester zugesetzt und 16 h zur Reaktion gebracht. Das Harz wurde anschließend jeweils 2 min mit 3 Teilen Dimethylformamid, je 2 min mit 2 Teilen Methanol und je 2 min mit 3 Teilen Trichloräthylen gewaschen.

Nach jedem Kupplungsschritt wurde das Harz durch Ninhydrin-Test geprüft; bei Reaktion 17 ergab sich ein positives Ergebnis, nach Wiederholung der Reaktion fiel die Probe jedoch negativ aus. Nach Vervollständigung der 39 Kupplungsreaktionen und abschließender Abspaltung der Schutzgruppen sowie Neutralisation und Vakuumtrocknung betrug die Ausbeute 40,5 6·

2 g des geschützten Peptidharzes wurden mit Fluorwasserstoff und Anisol wie zuvor beschrieben zur Reaktion gebracht. Die Ausbeute betrug 822 mg Peptid mit noch vorhandenen TFA-Schutzgruppen. Eine ähnliche Spaltung mit 4 g ergab 1,685 ?·

Zur Reinigung der Peptidverbindung wurden 1,35 g des vom Harz getrennten Peptids, das noch die TFÄ-Gruppen besaß, mit I35 ml 0,2 molarem Piperidin mit 0,1 % Mercaptoäthanol 2 h gerührt. Das Gemisch wurde lyophilisiert und ergab eine weißliche Festsubstanz. Das Gemisch wurde in 100 ml Wasser gelöst und der pH auf 4,5 eingestellt; das Gemisch wurde anschließend an einer Carboxy-

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methylcellulose-Säule von 750 ml Bettvolumen chromatographiert. Die Verunreinigungen wurden mit l8 Bettvolumina 8 raraho (1 mho — lXl" -cm" ) Ammoniumacetatpuffer bei pH 6,7 eluiert. Der aktive ACTH-Peak wurde darauf mit 11,5 tnmho

Puffer bei pH 6,7 eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden lyophilisiert und auf einer G-25-Sephadex-Säule entsalzt. Die Ausbeute betrug 361 mg eines lockeren, weißen Pulvers. Es besaß eine ACTH-Aktivität von 92 - 11 Einheiten/mg und wies die richtige Aminosäurezusammensetzung auf.

BEISPIEL 9

Das Beispiel bezieht sich auf die in großem Maßstab vorgenommene Synthese der Verbindung 4lA sowie ihre Reinigung zur Herstellung eines biologisch wirksamen ACTH-Hormönprodukts.

Il6,5 g BOC-Phenylalaninharζ wurden in ein speziell für das erwähnte peptidsynthesegerät gebautes Reaktionsgefäß eingebracht. Das Harz besaß einen Titer von 0,57 mäq/g oder 66,4 mäq gesamt. Die Schritte der Kupplung, Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation wurden bei dieser Synthese folgendermaßen vorgenommen:

Kupplung:

133 mmol der entsprechenden BOC-Aminosäure (1 Äquivalent Überschuß) gelöst in 600 ml Methylenchlorid, 10 min Rühren,

mmol Dicyclohexylcarbodiimid in 133 ml Methylenchlorid, Reaktionszeit 4-5 min,

zweimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

|09809/ 1007

zweimal 750 ml Methanol, jeweils 2 min, dreimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min.

Abspaltung der Schutzgruppen:

zweimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

50:50-Gemisch von Trifluoressigsäure und Methylenchlorid, 750 ml, 30 min,

dreimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min, dreimal 750 ml Methanol, jeweils 2 min.

Neutralisation:

zweimal 750 ml 10 % Triäthylamin in Chloroform, jeweils 5 min,

zweimal 750 ml Chloroform, jeweils 2 min, zweimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min.

Die Sequenz der Aminosäuren, die Kombinationen von Aminogruppen und Schutzgruppen sowie die anschließenden Verfahrensschritte waren die gleichen wie in Beispiel 8.

Jede Kupplungsr ealcti on wurde mit dem Ninhydrin-Test überprüft; der Test war bei den Reaktionen 2, 22 und 2j5 jeweils positiv, fiel jedoch nach der Wiederholung der entsprechenden Kupplungsschritte jeweils negativ aus.

In Reaktion 10 und Position jJO wurde zur Kupplung der aktive p-Nitrophenyl-Ester wie in Beispiel 8 verwendet.

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Die Ausbeute an Peptidharz (verbindung 39A) nach dem abschließenden oder 39sten Kuppeln sowie nach dem Abspalten der Schutzgruppen, Neutralisation und Vakuumtrocknung betrug 316 g.

Spaltung:

100 g des obigen Peptidharzes wurden in ein großes Reaktionsgefäß aus synthetischem Material (KeI-F) zusammen mit 5 g Dithioerythrit und 100 ml Anisol eingebracht. Darauf wurden 35O ml wasserfreier Fluorwasserstoff durch Destillation zugesetzt und das Gemisch bei 0 C 20 min gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde sodann durch Vakuum-Destillation abgezogen. Der Rückstand wurde viermal mit jeweils 1 1 Äthylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Der Essigsäureextrakt wurde lyophilisiert und lieferte 47,6 eines lockeren weißen Pulvers, das aus Verbindung 4lA mit noch vorhandenen TFA-Gruppen bestand.

47,6 g des TFA-Peptids (Verbindung 4lA) wurden 5 h in 5,5 1 0,2 m Piperidin und 1 m Harnstoff mit 0,15ε Mercaptoäthanol gerührt. Die Lösung wurde anschließend mit Essigsäure auf pH 4,0 eingestellt und durch ein 0,22-yura-Filter (Millipore-Filter) filtriert. Die Lösung konnte anschließend gereinigt werden.

Reinigung:

Das rohe ACTH-Peptid, von dem das Harz sowie alle Schutzgruppen entfernt worden waren, wurde an einer Carboxymethylcellulose-Säule mit einem Bettvolumen von 1800 ml ehromatographiert. Die verunreinigungen wurden mit 44 1 Ammoniumacetatpuffer bei pH.6,7 und

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4,0 mmho eluiert. Der ACTH-Peak wurde mit Ammoniumacetatpuffer bei pH 7,5 und 4,0 mmho eluiert und anschließend lyophilisiert, wonach ein weißes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde in 400 ml 0,5 m Essigsäure mit 0,1 % Mercaptoäthanol gelöst und in einer Sephadex-_Sä_ule · (G-25 superfine) von 16 1 Bettvolumen entsalzt. Der das Peptid enthaltende peak wurde lyophilisiert und lieferte 7,19 g eines lockeren weißen Pulvers mit der richtigen Aminosäurezusammensetzung und einer ACTH-Aktivität von 82 - 7 Einheiten/mg.

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Claims (20)

Ansprüche

1. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH₉-LeU-GIu-Phe-CH₉-( R

I
Bz

mit Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl und

mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrolharz.

2. Trägergebundenes Peptid der Struktur NH₂-Phe-Pro-Leu-Glu-Fhe-CH₂-( R

Bz

mit Bz und (r) wie in Anspruch 1.

3. Trägergebundenes Peptid der Struktur NH^-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-

I I 1 I I I

T V VVTT

Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-

Il I I I I I

VY Bz Bz Bz Bz Bz

Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CHo ~(r

I ²

Bz

509809/1007

*- 37 -

mit Bz und (RJ wie in Anspruch 1 und

Y = Bz oder H,

V= 2-Chlorcarbobenzyloxy, Carbobenzyloxy, 2-Bromcarbobenzyloxy, 2.4-Dichlorcarbobenzyloxy oder Trifluoracetyl

und

T = Tosyl oder Nitro.

4. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NHgAsp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Bz Bz Bz Bz Bz Bz

Phe-Ch

mit Bz und ny wie in Anspruch 1 und

Y und V wie in Anspruch 3^β·

5. Trägergebundenes Peptid der Struktur NH^-Gly-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly

VTT ^{V Bz}

Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CH₂-(R)

Bz Bz Bz Bz Bz

mit Bz und (r) wie in Anspruch 1 und

Y, V und T wie in Anspruch 3.

^09809/1007

6. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit Bz = Benzyl.

7. Trägergebundenes peptid nach Anspruch 2, mit Bz = Benzyl.

8. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit Bz = Benzyl.

9. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit Bz = Benzyl.

10. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit T = Tosyl.

11. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit V = Trifluoracetyl und Bz = Benzyl.

12. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit V = Trifluoracetyl und Bz = Benzyl.

13. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit T = Tosyl.

14. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß

- Phe - CIL, - Cn)

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mit einem Anhydrid von

P-GIu ι

Bz

zu dem Peptid

P-GIu- Phe-CH₂ - (R, Bz

mit Bz und Qr)wie in Anspruch 1

und

P = t-Butoxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder o-Nitrophenylsulfenyl

gekuppelt wird.

15. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids nach Anspruchs lh, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid

NH₂-GIu-Phe-CHg- (RJ Bz

mit einem Anhydrid von P-L-Leucin zu dem Peptid

P-Leu-Glu-Phe-CHg-' Bz

mit Bz und Qywie in Anspruch 1 und P wie in Anspruch l4

gekuppelt wird.

$09809/1007

l6. Verfahren nach Anspruch l4 oder I5, dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende Reaktionsprodukt zur Abspaltung von P mit einer Säure behandelt wird.

17- Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid

NHo-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-

² 1 I Il I I

Y Bz Bz W T V

Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-

VVTT VY Bz

Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CH₉-(R)

11 1 I

Bz Bz Bz Bz

mit einem Anhydrid von P-Bz-L-Serin zu dem Peptid NHo-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-

²III I I I

Bz Y Bz Bz T V .

Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-

VVTT V Y

Glu-Asp-GIu-Sex-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CH₉-Tr)

I I I I I I

Bz Bz Bz Bz Bz Bz

mit Bz und Qy wie in Anspruch 1,

Y und V und T wie in Anspruch 3/ P wie in Anspruch 14

und
VJ = Carbobenzyloxy, Tosyl, Dinitrophenyl, Bz oder H

gekuppelt wird.

$09809/1007

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt von Anspruch 17 zur Abspaltung der Schutzgruppen Bz, T, Y und VJ sowie zu seiner Abspaltung vom Trägerharz (r) -CHp- mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt wird.

19. Verfahren nach Anspruch l8, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt von Anspruch l8 zur Abspaltung der Trifluoracetyl-Schutzgruppen in einer wäßrigen Base gelöst wird.

20. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid

-T Gly-Glu-Asp-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu

Bz Bz Bz Bz Bz GIu-Phe-CH,,-Bz

mit einem Anhydrid von P-Bz-L-P-Bz-L-Asp zu dem Peptid NH^-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu

²I I I i I

ßz Bz Bz Bz Bz

GIu-PKe-CH₀-(T)

mit Bz und (r) wie in Anspruch 1
und

P wie in Anspruch 14
gekuppelt wird.

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