DE2635930A1 - Traegergebundene peptide, acth-peptidzwischenprodukte sowie ihre herstellung - Google Patents
Traegergebundene peptide, acth-peptidzwischenprodukte sowie ihre herstellungInfo
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Description
Dr..|ng.R.3EE1 Z Jr.
β München 22, Standort**10 2635930
β München 22, Standort**10 2635930
5^2-25.897P
10. August 1976
Armour Pharmaceutical Company
Greyhound Tower
Phoenix, Arizona 85077 .(V.St.A.)
Trägergebundene Peptide, ACTH-Peptidzwischenprodukte
sowie ihre Herstellung
Die Erfindung bezieht sich auf die Peptidsynthese, insbesondere
auf träger gebundene peptide,, die zur Herstellung
biologisch aktiver Peptide verwendbar sind. Die Erfindung umfaßt
dabei, sowohl die Peptide als neue Verbindungen als auch
ihr Herstellungsverfahren.
Seit langem werden bestimmte natürliche biologisch
aktive Substanzen aus. dem Material tierischer Drüsen gewonnen,
die zur Behandlung von Mangelerseheinungen in der
Humanmedizin Verwendung finden. Eine derartige Substanz
ist das sog. adrenocorticotrope Hormon, üblicherweise kurz
als ACTH bezeichnet, das lange zeit" aus tierischen Hypophysen,
insbesondere von Schweinen und Rindern, gewonnen wurde.
Die große Mühe, die mit der Gewinnung der relativ klei-542-(Case
5622-T-A)-SFBk
^09809/1007
ORiGlNAL INSPECTED
nen Hypophysen von Tieren unmittelbar nach dem Schlachten verbunden ist, die nur begrenzte Menge derart gewonnener
Drüsen sowie das aufwendige Reinigungsverfahren, das zur Herstellung in der Humanmedizin verwendbarer Peptide erforderlich
ist, stellen außerordentlich große Nachteile bei der Herstellung natürlicher Peptidhörmone aus tierischen
Drüsen dar. Obgleich infolgedessen auf diesem Gebiet ein außerordentliches Interesse an der Entwicklung praktischer
Methoden sowie neuer Verbindungen besteht, die eine kommerzielle Synthese von Peptiden wie etwa von ACTH aus
anderen als tierischen Ausgangsmaterialien ermöglichen, wurde
nach Wissen der Erfinder bisher kein verfahrensmäßiger ·
oder stofflicher Zugang zur Lösung dieses Problems gefunden.
Für das menschliche adrenocorticotrope Hormon (ACTH)
wurde folgende Struktur gefunden:
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-1
2-3 4 567 8 9 10 LI 12 13 14
-Lvs-Lys-Are-Arg-Pro-Val-Lvs-VaL-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-15
16 17 18 19 20 - 21 22 23 24 25 26 27 28
-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-ALa-Phe-Pro-Lou-Glu-Phe
29 30 3Γ ?2 33 34 35 36 37 38 39
Die Abkürzungen Phe, GIu, Leu etc. stehen dabei für die
verschiedenen Aminosäuregruppierungen in der Peptidkette, die Zahlen stellen die Positionen der Aminosäuregruppen
in der Kette entsprechend der üblichen Nomenklatur dar (vgl. Rlniker et.al., Nature New Biology 2^5, U1I - 1)5
(1972)).
Zur Synthese gewisser peptide mit relativ kurzer Kettenlänge sind einige Laboratoriumsverfahren vorgeschlagen wordenj
hierzu sind zu nennen: R. B. Merrifield; "Solid Phase Peptide
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Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide", j. Am.
Chem. Soc. Vol. 85 (I963), 214-9" - 2154; J. W. Stewart,
J. D. Young: "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Company, San Francisco, California). In diesen Publikationen
finden sich jedoch keinerlei Angaben über trägergebundene peptide mit Aminosäuren der erfindungsgemäßen
Art und Sequenz.
Der,. Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, intermediäre
trägergebundene peptide anzugeben, aus denen biologisch aktive peptide abgeleitet werden können, insbesondere
Peptide mit ACTH-Aktivität, sowie ein Verfahren für die kommerzielle Herstellung derartiger Peptide·.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Synthese in bzw. an fester Phase gelöst, wobei zunächst ein unlösliches
Polystyrolharz chlormethyliert wird und darauffolgend an das Harz Aminosäuren in vorgegebener Sequenz
unter verwendung eines Systems der Bildung und Wiederabspaltung
von Schutzgruppen der aktiven Amino- und Carboxylgruppen ansynthetisiert werden; im Fall der ACTH-Synthese
wird so entsprechend mit Phenylalanin begonnen, worauf Glutaminsäure sowie die übrigen Aminosäuren der Kette in
der richtigen Sequenz ankondensiert werden; nach dem Ankondensieren
der letzten Aminosäure der Kette werden die Peptidketten vom Harz abgespalten und die verbliebenen
Schutzgruppen entfernt.
Die Erfindung gibt also trägergebundene Peptide (im folgenden kurz als Peptidharze bezeichnet) an, insbesondere
solche mit (S) -CH0-PlIe-GIu an einem Ende der
C-
Aminosäürekette, wobei ® das Harz und Phe bzw. GIu
die Aminosäuren Phenylalanin bzw. Glutaminsäure bedeuten,
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aus denen Peptide mit biologischer Aktivität herstellbar sind, sowie ein Herstellungsverfahren für derartige Peptide.
Die Aminosäureketten der erfindungsgemäßen Peptidharze sind dabei identisch mit den Aminosäureketten natürlicher
Peptide mit biologischer Aktivität, Es werden ferner auch Peptide mit Aminosäureketten angegeben, deren
Aminosäuren hinsichtlich Art und Sequenz von den Aminosäureketten natürlicher biologisch aktiver Peptide
verschieden sind, aus denen jedoch Peptide mit biologischer Aktivität abgeleitet werden können,ferner entsprechende
Zwischenprodukte.
Die Totalsynthese der erfindungsgemäßen Peptide natürlicher oder modifizierter Sequenz umfaßt zahlreiche
Reaktionen, bei denen ebenfalls zahlreiche neue Peptid-Zwischenstufen gebildet werden, die im folgenden
hinsichtlich ihrer Strukturformel anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert werden.
Die Chlormethylierung des Harzes erfolgt nach folgender Formel:
@ + Cl-CH2OCH, » (R)- CH2-Cl + CH5OH
in der Qy das unlösliche Polystyrolharz bedeutet, das
durch katalytlsche Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol in Kugelform hergestellt wird. Das Harz wird dabei
unter Verwendung von Chlormethyl-methyläther und
Zinnchlorid als Katalysator chlormethyliert.
Die Reaktion wird durch das folgende Beispiel erläutert .
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1 kg eines zu 2 % mit Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzes von 0,035 - 0,075 mm (200 - 400 mesh)
Korngröße wurde dreimal mit je 2 1 Methylenchlorid gewaschen. Feine Partikel wurden durch jeweiliges Abziehen
des Methylenchlorids vom Boden entfernt. Das Harz wurde
anschließend durch Suspendieren, 10-minütiges Rühren und Filtrieren durch eine Glasfritte unter Verwendung
von jeweils 2-1-Teilen folgender Lösungsmittel gewaschen: mit 2 Teilen Tetrahydrofuran, mit'1 Teil In NaOH, mit
2 Teilen Wasser, mit 2 Teilen Dimethylformamid, mit 2 Teilen Dioxan sowie mit 3 Teilen Methanol. Das gewaschene
Harz wurde anschließe-nd im Vakuum bei 60 0C getrocknet.
500 g des gewaschenen Polystyrolharzes wurden mit 5 1 Chlormethyl-methyläther oei Raumtemperatur gerührt;
die Temperatur wurde anschließend in einem Eis-Wasser-Bad auf 0 - 5 °C erniedrigt. Anschließend wurden 75 g
wasserfreies Zinnchlorid in 925 ml eiskaltem Chlormethylmethyläther
zugesetzt und das Gemisch 2 h im Eisbad gerührt.
Das Harz wurde durch eine Glasfritte abfiltriert und mit jeweils 2 1 der folgenden Lösungsmittel gewaschen:
25 % Wasser in Dioxan, 25 % 2n HCl in Dioxan, Wasser sowie
zweimal mit Methanol. Das gewaschene Harz wurde bei 45 - 50 0C im Vakuum getrocknet. Nach diesem Verfahren
beträgt der übliche Chloridgehalt 0,7 - ],0 mäq/g (mäq = Milliäquivalent). - -
Zunächst wird Phenylalanin an das Polystyrolharz gebunden. Die Reaktion geschieht nach folgender Formel:
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R)-CH2Cl + HOOC-C-CH2-
BA
CRJ-CH0-O-C-C-CH0- (f v>
+ BA-HCl
/. ι L.
NH
Kupplungsreaktion I;
in der Formel bedeuten:
(r) das Polystyrolharz,
BA eine geeignete Base wie Triäthylamin, Diisopropylamin,
Diisopropyläthylamin oder ein Alkalimetallsalz sowie
P eine Amino-Schutzgruppe wie etwa Amyloxycarbonyl (AMOC), o-Nitrophenylsulfenyl (NPS) oder vorzugsweise
tert.-Butyloxycarbonyl (BOC).
Wie aus der obigen Formel hervorgeht, wird das tert.-Butyloxy-L-phenylalanin in Gegenwart eines Säure-Akzeptors
mit dem chlorinethylierten Harz verknüpft. Die Reaktion geht aus dem folgenden Ausführungsbeispiel 2
hervor.
50 g des wie zuvor beschrieben hergestellten chlormethylierten
Polystyrolharzes mit einem Chlorgehalt von
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0,7^ mäq/g (57 mäq Chlor) wurden mit 19,6 g BOC-L-Phenylalanin
(74 raäq) in 350 ml absolutem Äthanol
gerührt und anschließend 9,77 ml Triäthylamin (72 mäq) zugesetzt; das Gemisch wurde unter Rühren 24 h am Rückfluß
gehalten. Das Gemisch wurde anschließend abgekühlt, durch einen Büchner-Trichter mit Glasfritte filtriert
und auf der Fritte mit 500-ml-Portionen folgender Lb-
denaturiertem
denaturiertem Alkohol, zweimal mit Wasser sowie zweimal mit
Methanol. Das Harz wurde anschließend bei 40 - 45 0C
im Vakuum getrocknet. Die Stickstoffanalyse ergab Werte
zwischen etwa 0,50 - 0,70 mäq./g. Nach der (im folgenden beschriebenen) Abspaltung der BOC-Schutzgruppe mit
Trifluoressigsäure wurde der Gehalt des Harzes an freien terminalen Aminogruppen durch Titration zu etwa 0,38 mäq/g
bestimmt.
sungsmittel gewaschen: zweimal mit Alkohol, zweimal mit Dioxan, zweimal mit
Säure
R)-CH9-O-C-C-N-P
■2. Base
0 H Il I
(R)-CH2-O-C-C-NH2
Das resultierende Peptidharz wird .als Verbindung 1 '
bezeichnet.
Die Abspaltung der Schutzgruppe von der Aminofunktion des Phenylalanin geschieht durch Verwendung einer geeigne.
(mit 5- fo Methanol denaturierter Alkohol)
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ten Säure wie Trifluoressigsäure oder Salzsäure. Das resultierende Aminsalz wird anschließend durch Behandeln
mit einer starken organischen Base neutralisiert. Ein Ausführungsbeispiel für dieses Verfahren
gibt das folgende Beispiel 3.
25 g BOC-Phenylalanin-Harz nach Beispiel 2 wurden
in das Reaktionsgefäß einer Peptidsyntheseapparatur eingebracht. Die Probe wurde zweimal mit 125 ml Methylenchlorid
jeweils 2 min gewaschen. Darauf wurden 125 ml 50 #ige Trifluoressigsäure in Methylenchlorid zugesetzt
und .das Gemisch 30 min zur Reaktion gebracht. Nach
Filtration wurde das Harz dreimal mit 125 ml Methylenchlorid, zweimal mit 125 ml Methanol und dreimal mit
125 ml Chloroform jeweils 2 min gewaschen. Anschließend
wurde mit 125 ml einer ]0 $igen Lösung von Triäthylamin in Chloroform 5 min neutralisiert. Das Harz wurde anschließend
dreimal mit 125 ml Chloroform und dreimal mit 125 ml Methylenchlorid gewaschen.
OH H 0
fl I I Il
(R)-CH^-O-C-C-NH0 + HOOC-C-CH9-CH9-C-O-Bz CA y.
<y ζ 1 i-
1 ~~
NH
OHHOH Ο
S-.
/I I I Π I Il
[R)-CH0-O-C-C-N-C-C-CH9-CH9-C-O-Bz
NH !
Kupplungsreaktion 2.
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Darin bedeuten:
CA ein Kupplungsagens, das Peptidbindungen zu bilden
vsrmag^wie etwa Diimide, Azide, aktive Ester und Anhydride,
vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC),
Bz Benzyl oder ein Benzylderivat wie beispielsweise p-Methoxybenzyl, p-Chiorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder
Benzhydryl.
Die. genannten Symbole (r) , BA, P, CA und Bz
haben im folgenden einschließlich der Ansprüche die zuvor definierte Bedeutung.
Da Formelangaben wie die obige zu viel Platz beanspruchen, werden die Reaktionsprodukte nachfolgend
in der entsprechenden abgekürzten Schreibweise dargestellt: ■
g) - CH2-Phe-Glu-P
Bz
Bz
in der phe Phenylalanin und GIu Glutaminsäure bedeuten.
Diese vereinfachte Nomenklatur wird im folgenden bei allen Reaktionen verwendet.
Zur Durchführung der Reaktion können P, Bz und Glutaminsäure kombiniert vorliegen wie etwa in BOC-L-^-Benzylglutamat
das unter Zusatz von DCC als Kupplungspromoter zu dem von der Schutzgruppe
befreiten Phenylalaninharz zugegeben werden kann. An die Kupplung schließt sich die Entfernung der Schutzgruppe
an, wie bereits beim Phenylalanin-Peptidharz erläutert. Nach der Abspaltung der Schutzgruppe besitzt das Produkt
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die Formel
(R) —CIL-PIie-Glu-NHp (Verbindung 2).
Bz
Nach Wissen der Erfinder handelt es sich hierbei
um die erstmalige Herstellung dieses Peptldharzes, was einen bedeutenden Schritt bei der ACTH-Synthese
darstellt. - ·
Von den Erfindern wurde ferner die bedeutsame Feststellung gemacht, daß die Vollständigkeit der
Kupplungsreaktion durch Ninhydrin-Test geprüft werden
kann (vgl, E. Kaiser, R. Colescott, C. Bossinger
und P. Cook, Anal. Biochem. Jh, 595-98 (197O)). Wenn
die Ninhydrin-Reaktion negativ ist, kann die Schutzgruppe vom Harz abgespalten und zur folgenden Kupplungsreaktion
übergegangen werden. Bei positivem Ausfall der Ninhydrin-Reaktion wird der Kupplungsschritt wiederholt,
bis die Ninhydrin-Reaktion schließlich negativ ist.
Die folgenden Ausführungsbeispiele beziehen sich0-auf
die Kupplung von Glutaminsäure.
pi; is fiel
h
Zu dem von Schutzgruppen befreiten Phenylalaninharz
mit 10,7 mäq Aminogruppen wurde eine Lösung von
15 mmol (etwa 50 % Überschuß) D OC-L-"jf -Benzylglutamat
in 100 ml Methylenchlorid zugesetzt. "Nach 2 min wurde
eine Lösung von 15 mäq Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)
zugegeben und das Gemisch 4-5 min gerührt. Das Produkt
wurde abfiltriert und zweimal mit Jeweils 125 ml Chloroform
und Methylenchlorid gewaschen. Die Ninhydrin-Reaktion
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wurde an einer 3-5 mg-Probe des Peptidharz-Reaktionsprodukts
vorgenommen und ergab sich als negativ. Anschließend wurde die Schutzgruppe nach Beispiel 3
abgespalten.
■- ; - BEISPIEL 4A
2 g Phenylalaninharζ wurden von der Schutzgruppe
befreit und neutralisiert wie zuvor beschrieben. Anschließend wurden 3 mmol NPS-L-X-Benzylglutamat, die
in 25 ml Methylenchlorid gelöst waren, sowie 3 mmol
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben. Das Gemisch wurde Γ h gerührt, filtriert und zweimal mit Methylenchlorid,
zweimal mit Methanol sowie dreimal mit Methylenchlorid in Mengen von jeweils 125 ml- gewaschen.
■■■■ , BEISPIEL 4B
Es wurde entsprechend Beispiel 4A verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle von NPS AMOC in gleichen
Mengen eingesetzt wurde; es wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.
Anstelle von BOC-L-y-Benzylglutamat wurden 15 mmol
BOC-L-T-p-Brombenzylglutamat verwendet; die Reaktion
wurde in der in Beispiel 4 beschriebenen weise durchgeführt.
Es wurde ein Produkt mit p-Brombenzyl als Bz-Gruppe erhalten. Nach dem Abspalten der Schutzgruppe
und Neutralisation wurde die gleiche verbindung 2 wie in Beispiel 4 erhalten.
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In Beispiel 4 stellte Bz eine Benzylgruppe dar; in gleicher Weise sind p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl,
p-Nitrobenzyl oder Benzylhydryl anstelle der Benzyl-Gruppe
in BOC-L-^-Benzylglutamat verwendbar. Nach dem
in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren werden entsprechend Reaktionsprodukte erhalten, bei denen die Bz-Gruppe
p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl
oder Benzhydryl ist. Nach dem Abspalten der Schutzgruppe unter Neutralisation wird in jedem Falle dieselbe
Verbindung 2 wie in Beispiel 4 erhalten.
In der folgenden Tabelle I sind die entsprechend aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte 2-39 unter Bezeichnung
der jeweiligen Verknüpfungsposition unter Nennung der in jedem Schritt ansynthetisierten Aminosäure sowie der bevorzugten Schutzgruppen aufgeführt.
Reaktion | Position | Ansynthetisierte | Aminosäuregruppe |
Nr. | Nr. | Aminosäure | mit bevorzugter |
Schutzgruppe | |||
2 | 38 | Glutaminsäure · | BOC-L-r-Benzyl- glutamat |
3 | 37 | Leucin | BOC-L-Leucin- hydrat |
4 | 36 | Prolin | BOC-L-Prolin |
5 | 35 | Phenylalanin | BOC-L-Phenylalanin |
6 | 34 | Alanin | BOC-L-Alanin |
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Position Nr. |
- 13 - | 2635930 | |
33 | Tabelle I, Fortsetzung | ||
Reaktion .Nr. |
32 | Ansynthetisierte Aminosäure |
Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe |
7 | 31 | Glutaminsäure | BOC-L-T -Benzyl- glutamat |
8 | 30 | Alanin | BOC-L-Alanin |
.". 9 . ' | 29 | Serin | BOC-0-Benzyl-L- Serin |
10 | 28 | Glutaminsäure | BOC-L-y-Benzyl- . glutamat |
11 | 27 | Asparaginsäure | DOC-L-ß-Benzy1- aspartat |
12 | 26 | Glutaminsäure | BOC-L-^- Benzyl- glutamat |
13 | 25 | Alanin | BOC-L-Alanin |
14 | 24 | Glycin | BOC-Glycin |
15 | 23 | Asparagin | BOC-L-Asparagin- p-Nitrophenyl- ester |
16 | 22 | Prolin | BOC-L-Prolin |
17 | 21 | Tyrosin | BOC-L-Tyrosln (20 % Dimethyl formamid zur Löslichkeit) |
18 | Valin | BOC-L-Valin | |
19 | Lysin | BOC-2-Chlorcarbo | |
20 | 20 | Valin |
21 | 19 | Prolin |
22 | 18 | Arginin |
17
16
Arginin
Lysin f09809/1007
benzyloxy-L-Lysin (10 % Dimethylformamid
zur Löslichkeit)
BOC-L-Valin BOC-L-Proln
BOC-L-Tosylarginiri (20 % Dirnethylforn·.
amid zur Löslichkeit)
BOC-L-Tosylarginin (20 % Dimethylformamid
zur Löslichkeit)
BOC-2-Chlorcarbobenzyloxy-L-Lysin
(10 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
Tabelle I, Fortsetzung
Reaktion 'Position Ansynthetisierte Aminosäuregruppe
Nr. Nr. Aminosäure mit bevorzugter
Schutzgruppe
25 | 15 | Lysin | BOC-2-Chlorcarbo- benzyloxy-L-Lysin (10 % Dimethylformamid zur Löslichkeit) |
26 | 14 | QIycin | BOC-Glycin |
27 | 13 | Valin | BOC-L-Valin |
28 | 12 | Prolin | BOC-L-Prolin |
29 | 11 | Lysin | BOC-2-Chlorcarbo- benzyloxy-L-Lysin (10 % Dimethylformamid zur Löslichkeit) |
30 | 10 | Glycin | BOC-Glycin |
31 | 9 | Tryptophan | BOC-L-Tryptophan |
Arginin
(5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
BOC-L-Tosylarginin (20 % Dimethylformamid
zur Löslichkeit)
33 | 7 | Phenylalanin | BOC-L-Phenylalanin |
34 | 6 | Histidin | BOC-im-Carbobenzyloxy- |
L-Histidin | |||
35 | 5 | Glutamins äure | BOC-L- T'-Benzylglutamat |
36 | 4 | Methionin | BOC-L-Methionin |
37 | 3 | Serin | BOC-0-Benzyl-L-Serin |
38 | 2 | Tyrosin | BOC-L-Tyrosin |
Serin
(20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
BOC-0-Benzyl-L-Serin
jeder folgende Reaktionsschritt der Verknüpfung einer
weiteren Aminosäure verläuft dabei in gleicher Welse, wie in Zusammenhang mit der Verknüpfung von Glutaminsäure in
Reaktion 2 beschrieben, indem das jeweils zuvor erhaltene
^09809/1007
Peptidharz in geschütztem Zustand mit der folgenden Aminosäure gekuppelt, die Schutzgruppe vom gekuppelten
peptid abgespalten und neutralisiert wird. Im
einzelnen werden dabei jeweils folgende Reaktionsschritte.· vorgenommen:
Kupplung:
15 mmol der jeweiligen BOC-Aminosäure
(0,43 Äquivalent Überschuß in 100 ml Methylenchlorid)
15 mmol Dieyclohexylcarbodiimid (DCC,
Kupplungsagens) in 15 ml Methylenchlorid, Reaktionszeit 40 min
zweimaliges Waschen mit je 125 ml Chloroform, jeweils 2 min
zweimaliges Waschen mit je 125 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min
Abspaltung der Schutzgruppe;
zweimaliges Waschen mit je 125 ml Methylenchlorid,
jeweils 2 min
50 % Trifluoressigcäure in Methylenchlorid,
5 min, 125 ml,
50 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid,
25 min, 125 ml,
dreimaliges Waschen mit je 125 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,
zweimaliges Waschen mit je 125 ml Methanol, jeweils 2 min,
dreimaliges Waschen mit 125 nil Chloroform,
jeweils 2 min.
$09809/1007
Neutralisation:
zweimal 125 ml 10 % Triäthylamin in Chloroform,
jeweils 5 min,
viermaliges Waschen mit je 125 ml Chloroform,
jeweils 2 min.
Die Schritte der Kupplung, Abspaltung der Schutzgruppe sowie der Neutralisation bei den Reaktionen 3-39
entsprechen dabei den bei Reaktion 2 beschriebenen mit Ausnahme folgender Abweichungen.
Verbindung 2 ist als Ergebnis der Reaktion 2 (nach Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisation):
- CHO-Phe-Glu-NHO
I
Bz
nach Reaktion 3 liegt Verbindung Nr. 3 vor:
® -CEL-Phe-Glu-Leu-NH
d I i Bz
nach Reaktion 4 liegt verbindung 4 vor:
(S) -CH^-Phe-Glu-Leu-Pro-NHp
Bz
nach Reaktion 5 liegt Verbindung 5 vor:
(r) -CH0-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-NH0
Bz
Das Verfahren wird bis zur Verknüpfung von Asn in Position 25 fortgesetzt. In dieser Position kann
^09809/1007
DCC wegen des Auftretens einer' Asparagin verbrauchenden
Nebenreaktion nicht als Kupplungsagens,verwendet
werden, so daß die Aminosäure in dieser Position als "aktiver Ester" angekuppelt wird.
Das von der Schutzgruppe befreite Peptidharz wird
mit einem aktiven Ester des Asparagine wie etwa dem P-Nitrophenylester, dem o-Nitrophenylester oder dem
Pentachlorphenylester gerührt.
Der entsprechende Kupplungsschritt wird im folgenden
Beispiel 5 näher erläutert.
■ Das der Verbindung 14 nach der Reaktion 14 entsprechende
Peptidharz (nach Abspalten der Schutzgruppe und Neutralisation) wurde dreimal jeweils 2 min mit 125 ml Dimethylformamid
gewaschen. 3 mmol in 15 ml Dimethylformamid gelöster
BOC-L-Asparagin-p-Nitrophenylester wurden ΐβ h mit
dem Harz geschüttelt und anschließend dreimal mit je 125 ml Dimethylformamid, Methanol sowie Methylenchlorid gewaschen.
BEISPIEL 5A . .
Anstelle des p-Nitrophenylesters in Beispiel 5 sind ebenso die o-Nitrophenyl- oder pentachlorphenylester
verwendbar; die Kupplungsreaktion des Asparagine wird dabei in gleicher weise wie in Beispiel 5 beschrieben
durchgeführt.
Der Kupplung über den aktiven Ester in Position folgt die übliche Abspaltung der Schutzgruppe und die
f-o'9809/,1 007
Neutralisation, wobei eine Peptidharz-Verbindung 15
folgender Formel entsteht:
-GIu-Leu-Pro-Phe- AIa-GIu- AIa- Ser-Glu-Asp-Glu-I
. ' ■ Γ" I I I 1
Bz Bz Bz Bz Bz Bz
-AIa-GIy-ASn-NH2
Bei den Reaktionen 17 und 38, d.h. bei den Positionen
23 bzw. 2, bei denen Tyrosin angekuppelt wird, wird vorzugsweise keine Schutzgruppe an der phenolischen
Hydroxylgruppe des Tyrosins angebracht^ sondern eine Benzyl- oder Benzylderivat-Schutzgruppe verwendet. Das
Symbol Y bedeutet entsprechend das Fehlen einer Schutzgruppe bzw. Benzyl oder ein Benzylderivat.
Zur Erläuterung sei die Formel der nach Reaktion vorliegenden Verbindung 17 angeführt:
^-CH^-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-ALa-Ser-Glu-Asp-Glu-Z
I . I I I I I
Bz Bz Bz Bz Bz Bz
-AIa-Gly-Asn-Pro-Tyr-NH
I
Y
Bei Reaktion I9, entsprechend Position 21, bei der Lysin angekuppelt wird, wird vorzugsweise 2-Chlorcarbobenzyloxy
(Cl-CBZ) als E-Amino-Schutzgruppe verwendet; Carbobenzyl (CBZ), 2-Bromcarbobenzyloxy, 2,4-Dichlorcarbobenzyloxy
oder Trifluoracetyl (TFA) sind jedoch in gleicher Weise verwendbar.
^09809/1007
Die Verwendung einer der genannten Gruppen als £-Amino-Schutzgruppe ist durch das Symbol V angedeutet.
Die Schutzgruppe V wird ebenfalls bei der Verknüpfung von Lysin bei den Reaktionen 24, 25 und 29
in den entsprechenden Positionen 16, 15 und 11 eingesetzt. Zur Erläuterung wird die Formel der nach Reaktion
19 vorliegenden verbindung 19 angeführt:
(E^-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Glu-Asp-Glu-
w 2 ,
ι ι ι ι ι
Bz Bz Bz Bz Bz Bz
-Ala-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val-Lys-NH
I '
Y V
, 2
Zur Kupplung der Aminosäure Arginin in Reaktion 22 bzw. Position l8 wird vorzugsweise die Tosylgruppe
(p-Toluolsulfonyl) als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe
verwendet; die Nitrogruppe ist jedoch in gleicher Weise verwendbar. Das Formelsymbol T bezeichnet entsprechend
eine Tosyl- oder Nitrogruppe. Die Schutzgruppe τ wird ferner bei der Verknüpfung von Arginin in
Reaktion 2? bzw. Position 17 sowie in Reaktion 32 bei
Position 8 verwendet.
Die Strukturformel der in Reaktion 22 gebildeten Verbindung 22 ist:
©-CH^Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Glu-Asp-Glu-
' I I I I I
ßZ Bz Bz Bz Bz Bz
-Ala-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-NHo
I· I · · I l
YV T
90880.9/ 1 007
Zur Kupplung des Histidins in Reaktion 34 bzw.
Position 6 wird die Verwendung der Carbobenzyloxy-Gruppe
(CBZ) als Schutzgruppe für das Imidazol bevorzugt; die Reaktion ist jedoch auch mit Tosyl,
Dinitrophenyl, Benzyl, Benzylderivaten sowie ohne Schutzgruppe in gleicher Weise durchführbar. Das
Symbol W dient dabei zur Bezeichnung einer fehlenden bzw. einer der genannten Schutzgruppen.
Die Symbole T, Y, V und W besitzen in Beschreibung
und Ansprüchen die jeweils genannte Bedeutung.
Zur Erläuterung wird die Strukturformel der in Reaktion 34 gebildeten verbindung 34 angeführt:
-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Glu-Asp-Glu-
I I
Bz
Ala-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-Gly-
' I I I j I I
Y V TTVV'
-Val-Pro-Lys-Gly-Trp-Arg-Phe-His-Ni^
I I I ·. . ·
τ τ w · ' ··■■·
Nach der Verknüpfung des Serins in Reaktion und Position 1 in der zuvor angegebenen Art und Sequenz
sowie dem Abspalten der Schutzgruppe und Neutralisation des gekuppelten Peptidharzes gelangt man zu Verbindung
mit folgender Formel:
909809/1007
(llY-CH^he-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Glu-Asp-Glu-
^ 2' 1 I" IiII
Bz . Bz Bz Bz Bz Bz
Ala-Gly-Asn-PrO-Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-Gly-
. 1,1 I Il I
Y V TTVV
-Val-Pro-Lys-Gly-Trp-Arg-Phe-His-Glu-Met-Ser-Tyr-Ser-NIi^
1 Il I I I I
V -T W Bz Bz T Bz
Nach jeder Kupplungsreaktion und vor dem Abspalten der Schutzgruppe vom Peptldharz wird vorzugsweise der
Ninhydrin-Test durchgeführt; der Test verläuft nicht in allen Fällen negativ, was eine Wiederholung der zuletzt
vorgenommenen Kupplungsreaktion erforderlich macht.
Ausbeute
Wenn beispielsweise 25 g BOC-Phenylalanin-Harz den
Reaktionen .2 - 39 der Tabelle I unter Bildung der resultierenden
Verbindung 39 unterworfen wurden, wurden (nach dem
Abspalten der Schutzgruppe, Neutralisation und Vakuumtrocknung)
53/0 g Produkt erhalten.
Nach der Synthese des Peptidharzes' und der Verknüpfung
aller erwünschten Aminosäuren in der gewünschten Sequenz kann das peptidharz nach der üblichen Abspaltung der Schutzgruppen
und Neutralisationsschritten einer Behandlung zur Entfernung des Harzes und der verbliebenen Schutzgruppen
aller oder unterzogen werden; Zur Abspaltung des Harzes und/nahezu
aller verbliebenen Schutzgruppen kann günstigerweise eine
Behandlung mit Fluorwasserstoff herangezogen werden. Die Formel für diese Sp.altungsreaktion ist:
809/1007
RJ-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-GLu-Asp-Glu-Ala-
^^ z i ι ι ι I f -
Bz Bz Bz Bz Bz Bz
-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-Gly-Val-Y
V T T -V V
-Pro-Lys-GIy-Trp-Arg-Phe-His-GIu-Met-Ser-Tyr-Ser-NH9
ι lit ι ι ι z
V T W Bz Bz Y Bz ,
Reaktion wobei V eine andere Gruppe als TPA bedeutet;
+ HF
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-1
2 3 4 5 6 7-8 9 10 11 12 13 14
-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-16
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe
31 32 33 34 35 36 37 38 39
entsprechend verbindung 40.
Wenn V in obiger Reaktion TFA bedeutet, ist das Reaktionsprodukt:
TFA. (
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-12
3 4 5- 6 - 7. 8 9 10 11.12 13 14
TFA TFA TFA
ι ι ι
-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Giu-Phe
29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
(Verbindung 41)
09Π007
Ein Ausführungsbeispiel für die Spaltungsreaktion
für den genannten Fall, bei dem V keine TFA-Gruppe ist,
ist im folgenden Beispiel 6 angeführt.
HEISPIEL 6
2 g der Verbindung 39 wurden in ein Reaktionsgefäß
aus synthetischem Material (KeI-F) zusammen mit 2 ml Anisol eingebracht und 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff
durch Destillation zugesetzt. Das Gemisch wurde l h bei 0 °C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde
durch Vakuumdestillation abgezogen,der Rückstand viermal mit Ä'thylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert.
Der Eisessigextrakt wurde lyophilisiert und ergab 0,86 g eines lockeren weißen Pulvers. Dieses Verfahren
entfernt das Peptid vom Harz sowie alle Schutzgruppen auf den Aminosäuren.
Das nachstehende Beispiel 7 erläutert die Spaltungsreaktion für den Fall, daß V TFA ist.
2 g des obigen gebundenen ACTH-Peptldharzes wurden in ein Gefäß aus synthetischem Material (Kel-F) mit 2 ml
Anisol eingebracht und 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff durch Destillation zugesetzt. Das Gemisch wurde
1 h bei 0 0C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde durch
Vakuumdestillation abgezogen, der Rückstand viermal
mit Ä'thylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Der Eisessigextrakt wurde lyophilisiert und lieferte
856 mg eines lockeren weißen Pulvers. Dieses Verfahren
^09809/1007
entfernt das Peptid vom Harz sowie alle Schutzgruppen auf den bifunktioneilen Aminosäuren außer der Trifluoracetylgruppe
auf den Lysinresten. Dieses Produkt wird entsprechend als TPA-ACTH-Peptid bezeichnet.
Das TPA-ACTH-Peptid wurde zur Entfernung der Trifluoracetyl-Gruppen
vom Lysinrest mit wäßrigem Ammoniumhydroxid behandelt. 38O mg TFA-ACTH wurden mit 100 ml
4n Ammoniumhydroxid mit 0,1$ Mercaptoäthanol l6 h behandelt.
Dieses Verfahren liefert rohes ACTH mit einer ACTH-Aktivität von 40 Einheiten/mg nach der U.S.P.-Methode.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es ferner möglich, ein aktives ACTH-Hormon einer von T.H. Lee,
A.B. Lerner und V. Buettner-Janusch (vgl. J. Biol. Chem.
angegebenen Sequenz
236,2970 (l96l)/(Glutaminsequenz)) zu synthetisieren,
das eine bedeutende Verbesserung gegenüber dem ACTH-Hormon mit Asparagin-Sequenz darstellt, dessen Synthese
zuvor beschrieben wurde. Das Peptid ist leichter zu reinigen und alkalistabiler als das Peptid mit Asparagin-Sequenz.
Die Synthese beruht auf der Kupplung verschiedener Aminosäuren in bestimmten Kupplungsreaktionen.
Die Unterschiede gehen aus der nachstehenden Tabelle II deutlich hervor, in der die Kupplungsreaktionen bei der
Synthese der Glutaminsequenz und die jeweils bevorzugten Schutzgruppen angeführt sind.
09809 /1 007
Position Nr. |
Tabelle II . | Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe |
|
Reaktion Nr, |
30 | Ansynthetis ierte Aminosäure |
BOC-L-Glutamin-p- Nitrophenylester |
10 | 29 | Glutamin | BOC-L-P' -Benzyl- aspartat |
.11 | 28 | Asparaginsäure | BOC-L-^-Benzyl- glutamat |
12 | 27 | Glutaminsäure | BOC-GIycin |
13 | 26 | Glycin | BOC-L-Alanin |
14 | 25 | Alanin | BOC-L-ß-Benzyl- aspartat |
15 | 24 | A s-p ar ag i ns äur e | BOC-L-Prolin |
16 | 23 | Prolin | BOC-L-Tyrosin (20 % Dimethylforma mid zur Löslichkeit) |
17 | 22 | Tyrosin | BOC-L-Valin |
18 | 21 | Valin | BOC-e-Trifluor- acetyl-L-Lysin (5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit) |
19 | 20 | Lysin | BOC-L-Valin |
20 | 19 | Valin | BOC-L-Prolin |
21 | 18 | Prolin | BOC-L-Tosylarginin (20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit) |
22 | 17 | Arginin | BOC-L-Tosylarginin ' (20 % Dimethylforma mid zur Löslichkeit) |
23 | 16 | Arginin | BOC-e-Trifluoracetyl |
24 | Lysin | ||
Lysin
509809/1007
-L-Lysin (5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit)
BOC-e-Trifluoracetyl -L-Lysin (5 % Dimethylformamid
zur Löslichkeit)
Reaktion Nr. |
Position Nr. |
Ansynthetisier te Aminosäure |
Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe |
26 | 14 | Glycin | BQC-Glycin |
27 | 13 | Valin | BOC-L-Valin |
28 | 12 | Prolin | BOC-L-Prolin |
29 | 11 | Lysin | BOC-e-Tri fluor- acetyl-L-Lysin (5 % Dimethylformamid zur Löslichkeit) |
30 | 10 | Glycin | BOC-Glycin |
31 | 9 | Tryptophan | BOC-L-Try pt ophan |
32 | 8 | Arginin | BOC-L-Tosylarginin (20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit) |
- | BOC-L-Phenylalanin | ||
33 | 7 | Phenylalanin | BOC-im-Carbobenzyloxy- |
34 | 6 | " Histidin | L-Histidin |
BOC-L-^-Benzylglutamat | |||
35 | 5 | Glutaminsäure | BOC-L-Methionin |
36 | 4 | Methionin | BOC-0-Benzyl-L-Serin |
37 | 3 | Serin | BOC-L-Tyrosin (20 % Dimethylformamid zur Löslichkeit) |
38 | 2 | Tyrosin |
Serin
BOC-0-Benzyl-L-Serin
Die Reaktionen 2 - 9 in den Positionen 59-31 entsprechen
genau denen in Tabelle I.
Wie aus der Tabelle II hervorgeht, unterscheidet sich die erfindungsgemäße verbesserte Synthese von der
zuvor genannten dadurch, daß unterschiedliche Aminosäure-
£09809/1007
gruppen in den Positionen jjo, 27, 26 und 25 der Aminosäurekette
verknüpft sind. Die verbindungen 1-9 dieser Synthese sind dabei dieselben wie die verbindungen
1 - 9 der zuerst beschriebenen Synthese; in Reaktion 10,
bei der Gin anstelle von GIu eingesetzt ist, ergibt sich folgende Formel für die als .10A bezeichnete verbindung:
R^-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-NR"?
z . l · i /
Bz Bz Bz ;
in Reaktion 13, bei der GIy anstelle von AIa eingesetzt
ist, ergibt sich folgende Formel für die entsprechende Verbindung
^-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-Asp-Glu-Gly-^
Bz Bz' Bz Bz Bz
in Reaktion 14, bei der AIa anstelle von GIy eingesetzt
ist, ergibt sich folgende Formel für das entstandene peptidharz, das als Verbindung l^A bezeichnet ist:
Q-CHj-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-Asp-Glu-Gly-
Bz Bz Bz Bz Bz
-AIa-NH2 ; · '
in Reaktion 15, bei der Asp anstelle von Asn eingesetzt
ist, besitzt das als Verbindung 15A bezeichnete peptidharz
folgende Formel:
$09809/1007
Jy-C^-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-Asp-Glu-Gly- 1 . l t Ii
Bz Bz Bz Bz Bz
-As ρ-NIl0
l 2 I
l 2 I
l
Bz
Bz
die abschließende Kupplungsreaktion 39 liefert ein als
Verbindung 39A bezeichnetes Peptidharz folgender Formel:
Rj-CHo-Phe-Glu-Leu-Pro-Phe-Ala-Glu-Ala-Ser-Gln-Asp-Glu-Gly-Bz
Bz Bz Bz Bz
-AIa-Asρ-Prο-Tyr-VaI-Lys-VaI-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-GIy-VaI-Prοι
ι ί [ill Bz Y V TTVV
-Lys-Gly-Trp-Arg-Phe-His-GIu-Met-Ser-Tyr-Ser-NHo
I . 1 11 1 1 1 z
V ' T W Bz Bz Y Bz ·
Bei der Behandlung der Verbindung 39A (wobei ν = TFA ist)
ergibt sich:
TFA 1
Ser-Tyr-Ser-Met-GlU-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
• TFA TFA TFA
II 1
-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-
-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
-Asp-Gln-Ser-Ala-GlU-Ala-Phe-Pfo-Leu-GlU-Phe -;
29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
(Verbindung 4lA);
die Behandlung mit einer geeigneten wäßrigen Base wie piperidin oder Ammoniumhydroxid zur Entfernung der TFA-Gruppen liefert:
JO9809/1007
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-3
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-17
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe
32 33 34 35 36 37 38 39
32 33 34 35 36 37 38 39
(Verbindung 42). .
In den Fällen, in denen V eine andere Gruppe als TFA ist und die Verbindung 59A der Behandlung mit HF unterzogen wird, resultiert die Verbindung 42 mit obiger Struktur.
Verbindung 42 kann dabei gereinigt werden, wie in Zusammenhang
mit Verbindung 40 beschrieben; es wurde festgestellt, daß Verbindung 42 biologische ACTH-Hormonaktivität aufweist,
Das Beispiel bezieht sich auf die Synthese der Verbindung
42 in einem mittleren Maßstab sowie deren Reinigung zur Herstellung eines biologisch wirksamen ACTH-Hormonprodukts.
25 g BOC-Phenylalanin-Harz, das nach der zuvor
beschriebenen Reaktion 1 hergestellt war, wurden in das Reaktionsgefäß einer kommerziellen Peptidsyntheseapparatur
eingebracht (Vertrieb: Schwarz-Mann, Inc., Orangeburg, New York). Die Apparatur erlaubt eine automatisierte peptidsynthese
durch programmierte Bandsteuerung.Das eingesetzte
Harz besaß einen Äquivalenzwert von 0,397 mäq/g und 9*927 mäq
gesamt. Die Kupplung, Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation geschehen folgendermaßen:
^09809/1007
Kupplung:
25 mmol der entsprechenden Aminosäure (1,5 Äquivalent
Überschuß) gelöst in 25 ml Dimethylformamid, 25 ml Anisol, 25 S Urethan und 75 ml Methylenchlorid,
10 min Rühren;
25 mmol Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Trichloräthylen,
Reaktionszeit 45 min unter Rühren; dreimal I50 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,
dreimal I50 ml Methanol, jeweils 2 min,
zweimal 15O ml Trichlorethylen, jeweils 2 min.
Abspaltung der Schutzgruppe:
zweimal 15O ml Trichloräthylen, jeweils 2 min,
75 ml 20 % Phenol in 4n HCl-Dioxan + 75 ml 50 %
Trichloressigsäure in Trichloräthylen mit 4 %
Mercaptoäthanol, j50 min,
zweimal 150 ml Chloroform, jeweils 2 min,
zweimal I50 ml Methanol, jeweils 2 min,
dreimal I50 ml Chloroform, jeweils 2 min,
Neutralisation:
einmal 15O ml 10 % Triäthylamin in Chloroform,
10 min,
viermal I50 ml Chloroform, jeweils 2 min.
Die Aminosäuren wurden in der in Tabelle II angegebenen
Reihenfolge gekuppelt, wobei dieselben in Tabelle II angegebenen Kombinationen von Aminosäuren
90 9809/1007
und Schutzgruppen verwendet wurden.
In Reaktion 10 bzw. Position >0 wurde das Harz dreimal mit Dimethylformamid gewaschen; nach dem
Neutralisationsschritt wurden 25 mmol in 150 ml
Dimethylformamid mit 1 % Essigsäure gelöster BOC-L-Glutamin-p-Nitrophenylester
zugesetzt und 16 h zur Reaktion gebracht. Das Harz wurde anschließend jeweils
2 min mit 3 Teilen Dimethylformamid, je 2 min mit 2 Teilen Methanol und je 2 min mit 3 Teilen Trichloräthylen
gewaschen.
Nach jedem Kupplungsschritt wurde das Harz durch Ninhydrin-Test geprüft; bei Reaktion 17 ergab sich ein
positives Ergebnis, nach Wiederholung der Reaktion fiel die Probe jedoch negativ aus. Nach Vervollständigung
der 39 Kupplungsreaktionen und abschließender Abspaltung
der Schutzgruppen sowie Neutralisation und Vakuumtrocknung betrug die Ausbeute 40,5 6·
2 g des geschützten Peptidharzes wurden mit Fluorwasserstoff
und Anisol wie zuvor beschrieben zur Reaktion gebracht. Die Ausbeute betrug 822 mg Peptid mit noch vorhandenen
TFA-Schutzgruppen. Eine ähnliche Spaltung mit 4 g ergab 1,685 ?·
Zur Reinigung der Peptidverbindung wurden 1,35 g
des vom Harz getrennten Peptids, das noch die TFÄ-Gruppen
besaß, mit I35 ml 0,2 molarem Piperidin mit 0,1 %
Mercaptoäthanol 2 h gerührt. Das Gemisch wurde lyophilisiert
und ergab eine weißliche Festsubstanz. Das Gemisch wurde in 100 ml Wasser gelöst und der pH auf 4,5 eingestellt;
das Gemisch wurde anschließend an einer Carboxy-
9809/1007
methylcellulose-Säule von 750 ml Bettvolumen chromatographiert.
Die Verunreinigungen wurden mit l8 Bettvolumina 8 raraho (1 mho — lXl" -cm" ) Ammoniumacetatpuffer bei pH 6,7
eluiert. Der aktive ACTH-Peak wurde darauf mit 11,5 tnmho
Puffer bei pH 6,7 eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden lyophilisiert und auf einer G-25-Sephadex-Säule
entsalzt. Die Ausbeute betrug 361 mg eines lockeren,
weißen Pulvers. Es besaß eine ACTH-Aktivität von 92 - 11 Einheiten/mg und wies die richtige Aminosäurezusammensetzung
auf.
Das Beispiel bezieht sich auf die in großem Maßstab vorgenommene Synthese der Verbindung 4lA sowie ihre Reinigung
zur Herstellung eines biologisch wirksamen ACTH-Hormönprodukts.
Il6,5 g BOC-Phenylalaninharζ wurden in ein speziell
für das erwähnte peptidsynthesegerät gebautes Reaktionsgefäß eingebracht. Das Harz besaß einen Titer von 0,57 mäq/g
oder 66,4 mäq gesamt. Die Schritte der Kupplung, Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation wurden bei dieser
Synthese folgendermaßen vorgenommen:
Kupplung:
133 mmol der entsprechenden BOC-Aminosäure
(1 Äquivalent Überschuß) gelöst in 600 ml Methylenchlorid, 10 min Rühren,
mmol Dicyclohexylcarbodiimid in 133 ml Methylenchlorid, Reaktionszeit 4-5 min,
zweimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,
|09809/ 1007
zweimal 750 ml Methanol, jeweils 2 min, dreimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min.
Abspaltung der Schutzgruppen:
zweimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,
50:50-Gemisch von Trifluoressigsäure und Methylenchlorid,
750 ml, 30 min,
dreimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min, dreimal 750 ml Methanol, jeweils 2 min.
Neutralisation:
zweimal 750 ml 10 % Triäthylamin in Chloroform,
jeweils 5 min,
zweimal 750 ml Chloroform, jeweils 2 min, zweimal 750 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min.
Die Sequenz der Aminosäuren, die Kombinationen von
Aminogruppen und Schutzgruppen sowie die anschließenden Verfahrensschritte waren die gleichen wie in Beispiel 8.
Jede Kupplungsr ealcti on wurde mit dem Ninhydrin-Test
überprüft; der Test war bei den Reaktionen 2, 22 und 2j5
jeweils positiv, fiel jedoch nach der Wiederholung der entsprechenden Kupplungsschritte jeweils negativ aus.
In Reaktion 10 und Position jJO wurde zur Kupplung
der aktive p-Nitrophenyl-Ester wie in Beispiel 8 verwendet.
809/1007
Die Ausbeute an Peptidharz (verbindung 39A) nach
dem abschließenden oder 39sten Kuppeln sowie nach dem
Abspalten der Schutzgruppen, Neutralisation und Vakuumtrocknung betrug 316 g.
Spaltung:
100 g des obigen Peptidharzes wurden in ein großes Reaktionsgefäß aus synthetischem Material (KeI-F) zusammen mit 5 g Dithioerythrit und 100 ml Anisol eingebracht.
Darauf wurden 35O ml wasserfreier Fluorwasserstoff durch Destillation zugesetzt und das Gemisch bei
0 C 20 min gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde sodann durch Vakuum-Destillation abgezogen. Der Rückstand wurde
viermal mit jeweils 1 1 Äthylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Der Essigsäureextrakt wurde
lyophilisiert und lieferte 47,6 eines lockeren weißen
Pulvers, das aus Verbindung 4lA mit noch vorhandenen
TFA-Gruppen bestand.
47,6 g des TFA-Peptids (Verbindung 4lA) wurden 5 h in 5,5 1 0,2 m Piperidin und 1 m Harnstoff mit
0,15ε Mercaptoäthanol gerührt. Die Lösung wurde anschließend
mit Essigsäure auf pH 4,0 eingestellt und durch ein 0,22-yura-Filter (Millipore-Filter) filtriert.
Die Lösung konnte anschließend gereinigt werden.
Reinigung:
Das rohe ACTH-Peptid, von dem das Harz sowie alle
Schutzgruppen entfernt worden waren, wurde an einer Carboxymethylcellulose-Säule mit einem Bettvolumen
von 1800 ml ehromatographiert. Die verunreinigungen wurden mit 44 1 Ammoniumacetatpuffer bei pH.6,7 und
9809/1007
4,0 mmho eluiert. Der ACTH-Peak wurde mit Ammoniumacetatpuffer
bei pH 7,5 und 4,0 mmho eluiert und anschließend lyophilisiert, wonach ein weißes Pulver erhalten
wurde. Das Pulver wurde in 400 ml 0,5 m Essigsäure mit 0,1 % Mercaptoäthanol gelöst und in einer
Sephadex-Säule · (G-25 superfine) von 16 1 Bettvolumen
entsalzt. Der das Peptid enthaltende peak wurde lyophilisiert und lieferte 7,19 g eines lockeren weißen Pulvers
mit der richtigen Aminosäurezusammensetzung und einer ACTH-Aktivität von 82 - 7 Einheiten/mg.
$09809/1007
Claims (20)
1. Trägergebundenes Peptid der Struktur
NH9-LeU-GIu-Phe-CH9-( R
I
Bz
Bz
mit Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl
oder Benzhydryl und
mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrolharz.
2. Trägergebundenes Peptid der Struktur NH2-Phe-Pro-Leu-Glu-Fhe-CH2-( R
Bz
mit Bz und (r) wie in Anspruch 1.
3. Trägergebundenes Peptid der Struktur
NH^-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-
I I 1 I I I
T V VVTT
Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-
Il I I I I I
VY Bz Bz Bz Bz Bz
Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CHo ~(r
I 2
Bz
509809/1007
*- 37 -
mit Bz und (RJ wie in Anspruch 1
und
Y = Bz oder H,
V= 2-Chlorcarbobenzyloxy, Carbobenzyloxy, 2-Bromcarbobenzyloxy,
2.4-Dichlorcarbobenzyloxy oder
Trifluoracetyl
und
T = Tosyl oder Nitro.
4. Trägergebundenes Peptid der Struktur
NHgAsp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Bz
Bz Bz Bz Bz Bz
Phe-Ch
mit Bz und ny wie in Anspruch 1
und
Y und V wie in Anspruch 3β·
5. Trägergebundenes Peptid der Struktur NH^-Gly-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly
VTT V Bz
Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CH2-(R)
Bz Bz Bz Bz Bz
mit Bz und (r) wie in Anspruch 1
und
Y, V und T wie in Anspruch 3.
^09809/1007
6. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit Bz = Benzyl.
7. Trägergebundenes peptid nach Anspruch 2, mit Bz = Benzyl.
8. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit Bz = Benzyl.
9. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit Bz = Benzyl.
10. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit T = Tosyl.
11. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit V = Trifluoracetyl und
Bz = Benzyl.
12. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit V = Trifluoracetyl und
Bz = Benzyl.
13. Trägergebundenes Peptid nach Anspruch mit T = Tosyl.
14. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids,
dadurch gekennzeichnet, daß
- Phe - CIL, - Cn)
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mit einem Anhydrid von
P-GIu ι
Bz
zu dem Peptid
P-GIu- Phe-CH2 - (R,
Bz
mit Bz und Qr)wie in Anspruch 1
und
P = t-Butoxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder
o-Nitrophenylsulfenyl
gekuppelt wird.
15. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids
nach Anspruchs lh, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid
NH2-GIu-Phe-CHg- (RJ
Bz
mit einem Anhydrid von P-L-Leucin zu dem Peptid
P-Leu-Glu-Phe-CHg-'
Bz
mit Bz und Qywie in Anspruch 1 und P wie in Anspruch l4
gekuppelt wird.
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l6. Verfahren nach Anspruch l4 oder I5, dadurch gekennzeichnet,
daß das entsprechende Reaktionsprodukt zur Abspaltung von P mit einer Säure behandelt wird.
17- Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids,
dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid
NHo-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-
2 1 I Il I I
Y Bz Bz W T V
Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-
VVTT VY Bz
Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CH9-(R)
11 1 I
Bz Bz Bz Bz
mit einem Anhydrid von P-Bz-L-Serin zu dem Peptid NHo-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-
2III I I I
Bz Y Bz Bz T V .
Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-
VVTT V Y
Glu-Asp-GIu-Sex-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CH9-Tr)
I I I I I I
Bz Bz Bz Bz Bz Bz
mit Bz und Qy wie in Anspruch 1,
Y und V und T wie in Anspruch 3/ P wie in Anspruch 14
und
VJ = Carbobenzyloxy, Tosyl, Dinitrophenyl, Bz oder H
VJ = Carbobenzyloxy, Tosyl, Dinitrophenyl, Bz oder H
gekuppelt wird.
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18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß
das Reaktionsprodukt von Anspruch 17 zur Abspaltung der
Schutzgruppen Bz, T, Y und VJ sowie zu seiner Abspaltung vom Trägerharz (r) -CHp- mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt
wird.
19. Verfahren nach Anspruch l8, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reaktionsprodukt von Anspruch l8 zur Abspaltung der Trifluoracetyl-Schutzgruppen in einer wäßrigen Base
gelöst wird.
20. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid
-T Gly-Glu-Asp-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu
Bz Bz Bz Bz Bz GIu-Phe-CH,,-Bz
mit einem Anhydrid von P-Bz-L-P-Bz-L-Asp zu dem Peptid
NH^-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu
2I I I i I
ßz Bz Bz Bz Bz
GIu-PKe-CH0-(T)
mit Bz und (r) wie in Anspruch 1
und
und
P wie in Anspruch 14
gekuppelt wird.
gekuppelt wird.
509809/1007
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US05/603,771 US4055524A (en) | 1974-02-12 | 1975-08-11 | Synthesis of peptides |
Publications (1)
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19762635930 Withdrawn DE2635930A1 (de) | 1975-08-11 | 1976-08-10 | Traegergebundene peptide, acth-peptidzwischenprodukte sowie ihre herstellung |
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FR (1) | FR2332259A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002038616A2 (fr) * | 2000-11-13 | 2002-05-16 | Bioracs | Résines de polystyrène fonctionnalisé par des groupements méthyl ester de la l-tyrosine et leurs applications |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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-
1976
- 1976-08-09 FR FR7624253A patent/FR2332259A1/fr not_active Withdrawn
- 1976-08-10 DE DE19762635930 patent/DE2635930A1/de not_active Withdrawn
Cited By (4)
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FR2816621A1 (fr) * | 2000-11-13 | 2002-05-17 | Bioracs | Resines de polystyrene fonctionnalise par des groupements methyl ester de la l-tyrosine et leurs applications |
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US7022775B2 (en) | 2000-11-13 | 2006-04-04 | Bioracs | Resins based on polystyrene-functionalized methyl esters groups of L-tyrosine and their uses |
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Publication number | Publication date |
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FR2332259A1 (fr) | 1977-06-17 |
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