DE3920034C2 - Verfahren zum Einführen von DNS - Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen - Google Patents
Verfahren zum Einführen von DNS - Sequenzen in das Genom von höheren PflanzenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einführen von beliebigen
DNS-Sequenzen, vorzugsweise von proteinogenen DNS-Sequenzen
für die Expression in Pflanzensamen, in das Genom von
höheren Pflanzen nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.
Ein derartiges gattungsgemäßes Verfahren ist von der Anmelderin bereits vorgeschlagen
worden [1]. Dabei werden in die Expressionskassette
die 5′- und 3′-regulativen DNS-Abschnitte eines Samenprotein-
Gens eingebaut. Die 5′-regulativen DNS-Abschnitte steuern die
entwicklungs- und gewebespezifische Expression; die 3′-regulativen
DNS-Abschnitte enthalten die Polyadenylierungs-Signal-
Sequenzen für das Transkript.
Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen bewirken eine 3′-seitige
Polyadenylierung des primären DNS-Transkripts. Der polyadenylierte
DNS-Abschnitt hat offensichtlich Bedeutung für die
Stabilität der mRNS und/oder für die Häufigkeit der Initiation
der Translation [2]. Seine Bedeutung für das Ausschleusen
der mRNS aus dem Kern in das Zytoplasma - einem Ort, an dem
Translation initiiert wird, - wird diskutiert [3]; [4]; [5].
Voraussetzung ist die korrekte Erkennung der Polyadenylierungs-
Signal-Sequenzen in der Pflanzenzelle. Das System der Polyadenylierung
ist im Verlauf der Evolution entstanden, so
daß mehr oder weniger starke Unterschiede bei Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
der Lebewesen zu beobachten sind. So
ist es bekannt, daß pflanzliche Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
von denen in tierischer mRNS abweichen [6] und für
eine korrekte und effektive Expression prokaryotischer Gene in
Eukaryoten immer eukaryotische Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
vorgesehen werden müssen [7].
In dem älteren Vorschlag der Anmelderin [1] ist die Benutzung
aller oder doch fast aller regulativen DNS-Abschnitte vorgesehen
- also einschließlich der Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
- von dem jeweiligen Gen, das der Expressionskassette
zugrunde liegt. Dadurch kann ein gleichmäßiger Einfluß der
Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen auf eine erwünscht hohe
Expression einer in der Expressionskassette angeordneten beliebigen
DNS-Sequenz nicht gewährleistet werden.
Darüberhinaus ist bisher die Effektivität der Polyadenylierung
noch nicht bekannt, welche mit den Polyadenylierungs-
Signal-Sequenzen der verschiedenen Gene verbunden ist. Demzufolge
ist von vornherein nicht sicher zu bestimmen, welche Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
für die durch die 5′-regulativen
DNS-Abschnitte der Expressionskassette verursachte Expression
einer darin eingebauten DNS-Sequenz förderlich und
welche hinderlich sind.
Die Erfindung hat das aufgabengemäße Ziel, bei Expressionskassetten der eingangs
näher bezeichneten Art bereits bei ihrer Konstruktion
sicherzustellen, daß das Transkript einer eingebauten beliebigen
DNS-Sequenz sicher und mit hoher Effektivität polyadenyliert
wird, und hierfür pflanzenspezifische, in ihrer Effektivität charakterisierte
Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen zu suchen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die im kennzeichnenden
Teil des Patentanspruches 1 aufgeführten Merkmale gelöst
und durch die in den kennzeichnenden Teilen der Unteransprüche
benannten Merkmale erweitert und ausgestaltet.
Da Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen keinen Einfluß auf die
entwicklungs- und gewebespezifische Expression haben, müssen
sie nicht notwendig aus Genen für Samenproteine stammen. Deshalb
können die Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen des angegebenen
Gens 7(g7), die als definierter, 212 Basenpaare langer DNS-Abschnitt
verfügbar sind [11], ohne weiteres verwendet werden.
Die Erfindung beseitigt die angegebenen Mängel der bekannten
Expressionskassette in einfacher Weise. Sie bietet darüberhinaus
den Vorteil, daß eine einfache Lösung für den Ersatz
der originalen 3′-regulativen Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
gefunden werden konnte.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Zeichnung und der
in den Anlagen 1 bis 4 angegebenen Nukleotidsequenzen an einem
Ausführungsbeispiel näher erläutert.
Die einzige Figur der Zeichnung zeigt das Fließ-Schema der
Konstruktion von Expressionskassetten, die auf den 5′-flankierenden
Bereichen der Gene für Legumin und ein unbekanntes Samenprotein (USP) der Ackerbohne
sowie auf 3′-flankierenden Bereichen des Gens 7(g7) der TL-DNS
basieren.
Die Wellenlinie und der offene Pfeil (Le-Pr = Legumin-Promotor)
kennzeichnen 5′-flankierende Bereiche des Gens Legumin B4, der
schwarze Balken kennzeichnet das Gen der bakteriellen Chloramphenikol-Azetyltransferase,
nachfolgend einfach CAT-Gen genannt,
weiße Balken die 3′-flankierenden Bereiche des Gens 7(g7) der
TL-DNS. Der schwarze Pfeil kennzeichnet 5′-flankierende Bereiche
des USP-Gens. Kodierende Bereiche sind geschrafft (für
Legumin) oder punktiert (für USP) dargestellt. Schwarze Quadrate
markieren 5′- und 3′-seitige Polylinker, schwarze Punkte
unikale Restriktionsorte zum Einklonieren von beliebigen DNS-
Sequenzen (nachfolgend Fremdgen genannt). Die Bezeichnungen
bedeuten: Ba = BamHI; H = HindIII; RI = EcoRI; Bg = BglII;
P = PstI; B = BalI; C = ClaI; X = XbaI; Sm = SmaI; Amp = Gen
der Ampizillin-Resistenz. Die näherungsweise Größe der Kassette
ist in kb = Kilobasen angegeben.
Anlage 1 zeigt die Legumin-Signalpeptid-Kassette Le-Sig.T7.
Die Darstellung der Basenfolge erfolgt als Insert im Plasmid
pUC18. Der translatierte Bereich der Kassette ist im Einbuchstaben-Kode
ausgewiesen. Der unikale BamHI-Ort (815-820)
dient zum Einligieren von Fremd-DNS, der unikale HindIII-Ort
im 3′-Polylinker (1080-1085) zum Einklonieren der Kassette
in den Ti-Vektor pGA471.
Anlage 2 zeigt die USP-Promotor-Kassette USP-Pr.T7-2. Die Darstellung
erfolgt als Insert im Plasmid pUC18. Der unikale
BglII-Ort (720-725) dient zum Einligieren von Fremd-DNS,
der unikale HindIII-Ort im 3′-Polylinker (1261-1266) zum
Einklonieren der Kassette in den Ti-Vektor pGA471.
Anlage 3 zeigt die USP-Promotor-Kassette USP-Pr.T7-1. Die Darstellung
erfolgt als Insert im Plasmid pUC18. Der unikale
BglII-Ort (720-725) dient zum Einligieren von Fremd-DNS, der
unikale HindIII-Ort im 3′-Polylinker (1032-1037) zum Einklonieren
der Kassette in den Ti-Vektor pGA471.
Anlage 4 zeigt die USP-Signalpeptid-Kassette USP-Sig.T7. Die
Darstellung erfolgt als Insert im Plasmid pUC18. Der translatierte
Bereich der Kassette ist im Einbuchstaben-Kode ausgewiesen.
Der unikale BamHI-Ort (890-895) dient zum Einligieren
von Fremd-DNS, der unikale HindIII-Ort im 3′-Polylinker
(1155-1160) zum Einklonieren der Kassette in den Ti-Vektor
pGA471.
Alle im folgenden verwendeten molekularbiologischen Techniken
sind bereits bekannt [12]. Auch die Analyse der kodierenden und
regulativen Teile der benutzten Gene für Samenproteine der
Ackerbohne ist bereits vorbeschrieben [1]; [8]; [9]; [10],
ebenso wie die des Gens 7(g7) der TL-DNS [11].
Ausgangspunkt sind unter Verwendung des Gens Legumin B4 gewonnene
Plasmidscharen mit unterschiedlicher Länge der Deletion
[1]. Daraus wird ein Klon pdelta4′4 ausgewählt und das
Ausmaß der Deletion durch Sequenzanalyse in bekannter Weise
bestimmt [13]. Ein weiteres Ausgangsplasmid p12LeCATT7 wird wie
folgt erhalten. Der aus der eingangs genannten Plasmidschar
gewonnene Klon pdelta12 wird im unikalen BamHI-Ort geöffnet,
die Enden werden zu blunt ends aufgefüllt. Das CAT-Gen in
einem Plasmid pSV2CAT [14] wird als HindIII-BamHI-DNS-Fragment
gewonnen, die Enden werden aufgefüllt und in den geöffneten
Klon pdelta12 unter Erhalt eines Plasmids pdelta12CAT ligiert.
Aus diesem Plasmid pdelta12CAT wird das NcoI-SalI-DNS-
Fragment (letzterer Ort aufgefüllt) entfernt und durch das
NcoI-SnaBI-DNS-Fragment eines Plasmids pGV1507, einem Abkömmling
eines Plasmids pGV1500 [15] ersetzt.
Dieses Plasmid p12LeCATT7 enthält somit pflanzen-spezifische
Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen des Transkriptes (T7) des
Gens 7(g7) der oktopin-kodierenden TL-DNS des Ti-Plasmids von
Agrobacterium tumefaciens, welche auf einem 212 Basenpaaren
langem ClaI-EcoRV-DNS-Fragment basieren [11]; [7] und die in
allen nachfolgenden Konstruktionen aus diesem Plasmid p12LeCATT7
gewonnen werden.
Aus dem Plasmid p12LeCATT7 wird das BamHI-HindIII-DNS-Fragment
gewonnen und in das BamHI-HindIII-geöffnete Plasmid pdelta4′4
unter Erhalt einer Kassette Le-Sig.T7 ligiert (Fig.)
In dieser Kassette folgt dem 5′-flankierenden Bereich des Gens
Legumin B4 3′-seitig die für das Signalpeptid [16] kodierende
Region sowie ein unikaler BamHI-Ort zum Einklonieren von
Fremd-DNS, welcher wiederum 3′-seitig gefolgt wird von T7-
Polyadenylierungs-Signalen-Sequenzen. Die Nukleotidfolge der
Kassette ist in Anl. 1 wiedergegeben. Diese bereits zur Transformation
geeignete Kassette wird im unikalen HindIII-Ort geöffnet
und in den unikalen HindIII-Ort eines binären
Ti-Vektors pGA471 [17] kloniert: es entsteht eine Expressionskassette
für den durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten
Gentransfer [18]; [19].
Ausgangspunkt sind die Gene für USP sowie das daraus erzeugte
Plasmid pUC18/USPP [1], die in der Fig. als "USP-gene" und als
pUSP-Pr. bezeichnet sind. Aus dem Plasmid pUSP-Pr. wird ein
EcoRI-BglII-DNS-Fragment gewonnen und in das an den gleichen
Stellen geöffnete Plasmid "USP gene" unter Erhalt eines Plasmids
pP30.1P ligiert. Aus diesem wird das HindIII-EcoRI-DNS-
Fragment gewonnen (der HindIII-Ort wurde aufgefüllt) und in
das bei BamHI-EcoRI geöffnete Plasmid p12LeCATT7 (der BamHI-
Ort wurde aufgefüllt) zum Erhalt einer Kassette USP-Pr. T7-2
ligiert (Fig. und Anl. 2). Aus dem Plasmid p12LeCATT7 wird ferner
ein BamHI-HindIII-DNS-Fragment gewonnen und in das BamHI-
Hind-III-geöffnete Plasmid pP30.1P unter Erhalt einer Kassette
USP-Pr.T7-1 ligiert (Fig. und Anl. 3).
Die Kassetten USP-Pr.T7-1 und USP-Pr.T7-2 bestehen demzufolge
5′-seitig aus den regulativen flankierenden Bereichen des
USP-Gens, gefolgt von einem unikalen BglII-Ort zum Einklonieren
von Fremd-DNS, welcher 3′-seitig von T7-Polyadenylierungs-
Signal-Sequenzen flankiert wird. Diese bereits zur Transformation
geeigneten Kassetten werden am unikalen HindIII-Ort geöffnet
und in den unikalen HindIII-Ort des Ti-Vektors pGA471
kloniert, wodurch Expressionskassetten für den durch Agrobacterium
tumefaciens vermittelten Gentransfer erhalten werden.
Aus dem Plasmid "USP gene" wird ein XbaI-BalI-DNS-Fragment (der
XbaI-Ort ist ausgefüllt) gewonnen und in das SmaI-geöffnete
Plasmid pUC18 unter Erhalt eines Plasmids pUSP-Sig. ligiert.
In dieses BamI-HindIII-geöffnete Plasmid wird das BamHI-
HindIII-DNS-Fragment des Plasmids p12LeCATT7 unter Erhalt
einer Kassette USP-Sig.T7 ligiert (Fig. und Anl. 4).
In der Kassette USP-Sig.T7 folgt dem 5′-flankierenden Bereich
des USP-Gens die für das Signalpeptid [16] und die ersten
etwa 5 N-terminalen Aminosäuren des USP kodierende Region, gefolgt
von einem unikalen BamHI-Ort zum Einklonieren von Fremd-
DNS, welcher wiederum 3′-seitig von T7-Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
gefolgt wird. Diese bereits zur Transformation
geeignete Kassette wird am unikalen HindIII-Ort geöffnet und
in den unikalen HindIII-Ort des Ti-Vektors kloniert, womit
eine Expressionskassette für den durch Agrobacterium tumefaciens
vermittelten Gentransfer erhalten wird.
Aus dem CAT-Gen im Plasmid pSV2CAT wird das 785 Basenpaare
große HindIII-SauIIIA-DNS-Fragment gewonnen (beide Orte werden
aufgefüllt) und in die bei BglII geöffnete (Orte werden
aufgefüllt) Expressionskassette USP-Pr.T7-1 ligiert. Das
HindIII-SauIIIA-DNS-Fragment trägt den gesamten kodierenden
Bereich der CAT-Gene, der somit 5′-seitig unter der Regulationskontrolle
des USP-Promotors steht und 3′-seitig von
pflanzen-spezifischen Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen des
Gens 7(g7) der TL-DNS flankiert wird.
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16. Blobel, G., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 (1980), S. 1496- 1500
17. An, G. et al., EMBO J. 4 (1985), S. 277-284
18. Horsch, R.B. et al., Science 223 (1984), S. 496-498
19. Schell, J.S., Science 237 (1987), S. 1176-1183
20. Paezkowski, J. et al., EMBO J. 3 (1984), S. 2717-2722
Claims (18)
1. Verfahren zum Einführen von beliebigen DNS-Sequenzen, vorzugsweise
von proteinogenen DNS-Sequenzen für die Expression
in Pflanzensamen, in das Genom von höheren Pflanzen,
wobei
- - zunächst ein vollständiges, beispielsweise pflanzensamenprotein-spezifisches Gen isoliert wird, dessen proteinkodierende und regulative DNS-Abschnitte danach durch Sequenzanalyse ermittelt werden,
- - die proteinkodierenden DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig aus dem in einem Vektorplasmid befindlichen Gen herausgeschnitten werden,
- - die regulativen DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig erhalten bleiben und unter Herbeiführung eines unikalen Restriktionsortes, der im Wirkungsbereich der regulativen DNS-Abschnitte liegt, zu einer Deletionsmutante vereinigt werden,
- - die Deletionsmutante aus dem Vektorplasmid isoliert und in einen Pflanzen-Transformations-Vektor so ligiert wird, daß der unikale Restriktionsort erhalten bleibt und eine Expressionskassette entsteht, in welcher der Pflanzen- Transformations-Vektor die Transformation dieser gesamten Expressionskassette übernimmt,
- - in den unikalen Restriktionsort der Expressionskassette eine beliebige DNS-Sequenz ligiert und
- - die DNS-Sequenz in dem Genom von höheren Pflanzen exprimiert wird,
dadurch gekennzeichnet, daß
- - ein weiteres vollständiges Gen sich auf einem weiteren Vektorplasmid befindet, wie das erste flankiert von DNS- Abschnitten mit Polylinkern,
- - die 5′-regulativen und die proteinkodierenden DNS-Abschnitte des ersten und die 3′-regulativen des zweiten Gens aus ihrem jeweiligen Vektorplasmid gewonnen und unter Bildung des unikalen Restriktionsortes so in ein Vektorplasmid ligiert werden, daß eine für die Transformation von Pflanzen geeignete Kassette mit den Abschnitten 5′-Polylinker - 5′-regulativer DNS-Abschnitt - proteinkodierender DNS-Abschnitt - unikaler Restriktionsort - 3′-regulativer DNS-Abschnitt - 3′-Polylinker in dieser Reihenfolge entsteht und
- - die Kassette unter Benutzung der 3′- und/oder 5′-Polylinker isoliert und in den Pflanzen-Transformations-Vektor ligiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in
der Kassette kein proteinkodierender DNS-Abschnitt angeordnet
ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Expressionskassette auf der Basis von Genen für ein
Protein in Pflanzensamen konstruiert wird, die aus einer
Genbank selektiert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß Leguminosen oder Getreide verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Gene für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein
Legumin kodieren und aus einer Genbank der Ackerbohne
selektiert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Gene für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein
USP (unbekanntes Samenprotein) kodieren und aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert
werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus
einer cDNS-Bank der Ackerbohne Klone mit spezifischen Inserts
von Legumin- oder USP-DNS selektiert und durch Sequenzanalyse
deren cDNS-Nukleotidsequenzen ermittelt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, einem der Ansprüche 5
und 6 und Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische
DNS-Sequenz eines Proteins mit der zugehörigen
cDNS-Nukleotidsequenz verglichen und daraus bestimmt wird,
wo sich die proteinkodierenden, die regulativen DNS-Abschnitte
und die Intronsequenzen befinden.
9. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 und einem der Ansprüche 5
und 6, dadurch gekennzeichnet, daß geeignete unikale Restriktionsorte
innerhalb der proteinkodierenden oder 5′-
regulativen DNS-Abschnitte des ersten Gens dazu verwendet
werden, den 3′-seitig davon gelegenen DNS-Abschnitt bis
ausschließlich 3′-seitigem Polylinker zu entfernen und
die Enden durch Linker unter Bildung des für die Einligierung
der beliebigen DNS-Sequenz vorgesehenen unikalen
Restriktionsortes zu einer Deletionsmutante zu re-ligieren.
10. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, einem der Ansprüche 5
und 6 und Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der
Deletionsmutante der proteinkodierende DNS-Abschnitt entfernt
wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, einem der Ansprüche 5
und 6 und Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der
Deletionsmutante der proteinkodierende DNS-Abschnitt ausschließlich
der Signal-Peptid-Sequenz und der durch die
Signal-Peptidase erkennbaren Proteinstruktur entfernt
wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, einem der Ansprüche 5
und 6 und Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der
Deletionsmutante die Signal-Sequenzen für den intra- und
extrazellulären Transport der Proteine belassen werden.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
ein in einem Vektorplasmid befindlicher DNS-Abschnitt
eines Gens 7(g7) der oktopin-kodierenden TL-DNS des Ti-
Plasmides von Agrobacterium tumefaciens mit pflanzen-spezifischen
Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen des Transkripts
über zwei geeignete Restriktionsorte gewonnen wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1, einem der Ansprüche 10 bis 12
und Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der DNS-Abschnitt
mit den pflanzen-spezifischen Polyadenylierungs-
Signal-Sequenzen in einen Restriktionsort des 3′-Polylinkers
der Deletionsmutante unter Beibehaltung des nun 5′-
seitig von den Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen befindlichen
unikalen Restriktionsortes ligiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1, einem der Ansprüche 10 bis 12
und Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die
Kassette durch einen Restriktionsort im 5′-Polylinker
und/oder 3′-Polylinker linearisiert und in den kompatibel
geöffneten Pflanzen-Transformations-Vektor so ligiert
wird, daß der unikale Restriktionsort zum Einklonieren
einer beliebigen DNS-Sequenz erhalten bleibt.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der protein-kodierende DNS-Abschnitt oder Teile davon aus
einem auf einem Vektorplasmid befindlichen Gen mittels
Restriktasen gewonnen werden.
17. Verfahren nach Anspruch 1 und 16, dadurch gekennzeichnet,
daß der protein-kodierende DNS-Abschnitt oder Teile
davon in den unikalen Restriktionsort der Expressionskassette
im Pflanzen-Transformations-Vektor ligiert werden.
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-
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