DE3943825C2 - Verfahren zum Einführen von DNS-Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen - Google Patents
Verfahren zum Einführen von DNS-Sequenzen in das Genom von höheren PflanzenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einführen von DNS-Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen für die Expression in Pflanzensamen. DOLLAR A Das Einführen erfolgt mittels einer Expressionskassette, die auf der Basis eines Gens, das für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein USP (unbekanntes Samenprotein) kodiert und aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert wird, instruiert wird.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einführen von beliebigen DNS-Sequenzen,
vorzugsweise von proteinogenen DNS-Sequenzen für die Expression in
Pflanzensamen, in das Genom von höheren Pflanzen nach dem Oberbegriff des
Patentanspruchs 1.
Ein derartiges gattungsgemäßes Verfahren ist aus DD 263 081 A1 bekannt. Dabei
werden in die Expressionskassette die 5'- und 3'-regulativen DNS-Abschnitte eines
Samenprotein-Gens eingebaut. Die 5'-regulativen DNS-Abschnitte steuern die
entwicklungs- und gewebespezifische Expression; die 3'-regulativen DNS-Abschnitte
enthalten die Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen für das Transkript.
In DD 263 081 A1 ist die Benutzung aller oder doch fast aller regulativen DNS-
Abschnitte vorgesehen - also einschließlich der Polyadenylierungs-Signal-
Sequenzen - von dem jeweiligen Gen, das der Expressionskassette zugrunde liegt.
Dadurch kann ein gleichmäßiger Einfluß der Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
auf eine erwünscht hohe Expression einer in der Expressionskassette angeordneten
beliebigen DNS-Sequenz nicht gewährleistet werden.
Darüberhinaus ist bisher die Effektivität der Polyadenylierung noch nicht bekannt,
welche mit den Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen der verschiedenen Gene
verbunden ist. Demzufolge ist von vornherein nicht sicher zu bestimmen, welche
Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen für die durch 5'-regulativen DNS-Abschnitte
der Expressionskassette verursachte Expression einer darin eingebauten DNS-
Sequenz förderlich und welche hinderlich sind.
EP 0 255 378 A2 beschreibt die Herstellung einer samenspezifischen
Expressionskassette in Brassica wobei die regulatorischen DNA-Sequenzen, die die
samenspezifische Expression vermitteln, aus dem Napin-Gen stammen.
Bäumlein, H., Wobus, U. Pustell, J und Kafatos, F. C.: The legumin gene family:
structure of a B type gene of Vicia faba and a possible legumin gene specific
regulatory element. In: Nucleic Acid Research, 1986, 14,6, S. 2707-2720,
beschreiben Gene der Legumin Genfamilie aus Vicia faba, die eine
samenspezifische Expression aufweisen, und charakterisieren die regulatorischen
Sequenzen eines Legumin-Gens, die die samenspezifische Expression vermitteln.
Bassüner, R., Bäumlein, H., Huth, A., Jung, R., Wobus, U., Rapoport, T. A., Saalbach,
G., und Müntz, K.: Abundant embryonic mRNA in field bean (Vicia faba) codes for a
new class of seed proteins: cDNA cloning and characterization of the primary
translation product. In: Plant Molecular Biology, 1988, 13, S. 321-334, beschreiben eine
neue Klasse von samenspezifischen Proteinen, die als USP-Proteine bezeichnet
werden.
Die Erfindung hat das aufgabengemäße Ziel, bei Expressionskassetten der eingangs
näher bezeichneten Art bereits bei ihrer Konstruktion sicherzustellen, dass das
Transkript einer eingebauten beliebigen DNS-Sequenz sicher und mit hoher
Effektivität polyadenyliert wird, und hierfür pflanzenspezifische, in ihrer Effektivität
charakterisierte Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen zu suchen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die im
Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale gelöst und durch die in den
kennzeichnenden Teilen der Unteransprüche benannten Merkmale erweitert und
ausgestaltet.
Da Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen keinen Einfluß auf die entwicklungs- und
gewebespezifische Expression haben, müssen sie nicht notwendig aus Genen für
Samenproteine stammen. Deshalb können die Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen
des angegebenen Gens 7 (g7), die als definierter, 212 Basenpaare langer DNS-
Abschnitt verfügbar sind (Dhaese, P. et a., EMBO J.2, 1983, S. 419-426), ohne
weiteres verwendet werden.
Die Erfindung beseitigt die angegebene Mängel der bekannten Expressionskassette
in einfacher Weise.
Sie bietet darüberhinaus den Vorteil, dass eine einfache Lösung für den Ersatz der
originalen 3'-regulativen Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen gefunden werden
konnte.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Abbildung und der in den Anlagen 1
und 2 angegebenen Nukleotidsequenzen an einem Ausführungsbeispiel näher
erläutert. Die einzige Figur der Zeichnung zeigt das Fließ-Schema der Konstruktion
von Expressionskassetten, die auf den 5'-flankierenden Bereichen des Gens für ein
unbekanntes Samenprotein (USP) der Ackerbohne sowie auf 3'-flankierenden
Bereichen des Gens 7 (g7) der TL-DNS basieren.
Die Wellenlinie und der offene Pfeil (Le-Pr = Legumin-Promotor) kennzeichnen 5'-
flankierende Bereiche des Gens Legumin B4, der schwarze Balken kennzeichnet das
Gen der bakteriellen Chloramphenikol-Azetyltransferase, nachfolgend einfach CAT-
Gen genannt, weiße Balken der 3'-flankierenden Bereiche des Gens 7 (g7) der TL-
DNS. Der schwarze Pfeil kennzeichnet 5'-flankierende Bereiche des USP-Gens.
Schwarze Quadrate markieren 5'- und 3'-seitige Polylinker, schwarze Punkte unikale
Restriktionsorte zum Einklonieren von beliebigen DNS-Sequenzen (nachfolgend
Fremden genannt). Die Bezeichnungen bedeuten: Ba = BamHI; H = HindIII; RI = EcoRI;
Bg = BgIII; P = PstI; B = BaII; Q = ClaI; X = XbaI; Sm = SmaI; Amp = Gen der Ampizillin-
Resistenz. Die näherungsweise Größe der Kassette ist in kb = Kilobasen angegeben.
Anlage 1 zeigt die USP-Promotor-Kassette USP-Pr-T7-2. Die Darstellung erfolgt als
Insert im Plasmid pUC18. Der unikale BgIII-Ort (720-725) dient zum Einligieren von
Fremd-DNS, der unikale HindIII-Ort im 3'-Polylinker (1261-1266) zum Einklonieren
der Kassette in den Ti-Vektor pGA471.
Anlage 2 zeigt die USP-Promotor-Kassette USP-Pr-T7-1. Die Darstellung erfolgt als
Insert im Plasmid pUC18. Der unikale BgIII-Ort (720-725) dient zum Einligieren von
Fremd-DNS, der unikale HindIII-Ort im 3'-Polylinker (1032-1037) zum Einklonieren
der Kassette in den Ti-Vektor pGA471.
Alle im Folgenden verwendeten molekularbiologischen Techniken sind bereits
bekannt (Maniatis, T. et al., A Laboraty Manual, Cold Spring Harbor 1982). Auch die
Analyse der kodierenden und regulativen Teile der benutzten Gene für
Samenproteine der Ackerbohne ist bereits vorbeschrieben in DD 263 081, ebenso
wie die des Gens 7 (g7) der TL-DNS (Dhaese, P. et al., EMBO J.2, 1983, S. 419-426).
Ausgangspunkt sind die Gene für USP sowie das daraus erzeugte Plasmid
pUC18/USPP, die in der Abbildung als "USP-gene" und als pUSP-Pr. bezeichnet
sind. Aus dem Plasmid pUSP-Pr. wird ein EcoRI-BgIII-DNS-Fragment gewonnen und
in das an den gleichen Stellen geöffnete Plasmid "USP-gene" unter Erhalt eines
Plasmids pP30.1P ligiert. Aus diesem wird das HindIII-EcoRI-DNS-Fragment
gewonnen (der HindIII-Ort wurde aufgefüllt) und in das bei BamHI-EcoRI geöffnete
Plasmid p12LeCATT7 (der BamHI-Ort wurde aufgefüllt) zum Erhalt einer Kassette
USP-Pr.T7-2 ligiert (Abbildung und Anlage 1). Aus dem Plasmid p12LeCATT7 wird
ferner ein BamHI-HindIII-DNS-Fragment gewonnen und in das BamHI-HindII
geöffnete Plasmid pP30.1 P unter Erhalt einer Kassette USP-Pr.T7-1 ligiert
(Abbildung und Anlage 2)
Die Kassetten USP-PrT7-1 und USP-PrT7-2 bestehen demzufolge 5'-seitig aus den
regulativen flankierenden Bereichen des USP-Ges, gefolgt von einem unikalen BgIII-
Ort zum Einklonieren von Fremd-DNS, welcher 3'-seitig von T7-Polyadenylierungs-
Signal-Sequenzen flankiert wird. Diese bereits zur Transformation geeigneten
Kassetten werden am unikalen HindIII-Ort geöffnet und in den unikalen HindIII-Ort
des ti-Vektors pGA471 kloniert, wodurch Expressionskassetten für den durch
Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfer erhalten werden.
Aus dem CAT-Gen im Plasmid pSV2CAT wird das 785 Basenpaare ggroße HindIII-
SauIIIA-DNS-Fragment gewonnen (beide Orte werden aufgefüllt) und in die bei BgIII
geöffnete (Orte werden aufgefüllt) Expressionskassette USP-Pr.T7-1 ligiert. Das
HindIII-SauIIIA-DNS-Fragment trägt den gesamten kodierenden Bereich der CAT-
Gene, der somit 5'-seitig unter der Regulationskontrolle des USP-Promotors steht
und 3'-seitig von pflanzenspezifischen Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen des
Gens 7 (g7) der TL-DNS flankiert wird.
Claims (7)
1. Verfahren zum Einführen von DNS-Sequenzen in das Genom von höheren
Pflanzen für die Expression in Pflanzensamen,
wobei
zunächst ein vollständiges Gen isoliert wird, dessen protein-kodierende und regulative DNS-Abschnitte danach durch Sequenzanalyse ermittelt werden,
die proteinkodierenden DNS-Abschnitte vollständig aus dem in einem Vektorplasmid befindlichen Gen herausgeschnitten werden,
die regulativen DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig erhalten bleiben und unter Herbeiführung eines unikalen Restriktionsortes, der im Wirkungsbreich der regulativen DNS-Abschnitte liegt, zu einer Deletionsmutante vereinigt werden,
die Deletionsmutante aus dem Vektorplasmid isoliert und in einen Pflanzen- Transformations-Vektor so ligiert wird, daß der unikale Restriktionsort erhalten bleibt und eine Expressionskassette entsteht, in welcher der Pflanzen- Transformations-Vektor die Transformation dieser gesamten Expressionskassette übernimmt,
in den unikalen Restriktionsort der Expressionskassette eine beliebige DNS- Sequenz ligiert und
die DNS-Sequenz in dem Genom von Pflanzensamenzellen von höheren Pflanzen exprimiert wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Expressionskassette auf der Basis eines Gens das für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein USP (unbekanntes Samenprotein) kodiert und aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert wird, konstruiert wird,
ein weiteres vollständiges Gen sich auf einem weiteren Vektorplasmid befindet, wie das erste flankiert von DNS-Abschnitten mit Polylinkern,
die 5'-regulativen DNS-Abschnitte des UPS-Gens aus ihrem jeweiligen Vektorplasmid gewonnen und unter Bildung des unikalen Restriktionsortes so in ein Vektorplasmid ligiert werden, daß eine für die Transformation von Pflanzen geeignete Kassette mit den Abschnitten 5'-Polylinker - 5'-regulativer DNS- Abschnitt - unikaler Restriktionsort - 3'-regulativer DNS-Abschnitt - 3'-Polylinker in dieser Reihenfolge entsteht,
die Kassette unter Benutzung der 3'- und/oder 5'-Polylinker isoliert und in den Pflanzen-Transformations-Vektor ligiert wird.
zunächst ein vollständiges Gen isoliert wird, dessen protein-kodierende und regulative DNS-Abschnitte danach durch Sequenzanalyse ermittelt werden,
die proteinkodierenden DNS-Abschnitte vollständig aus dem in einem Vektorplasmid befindlichen Gen herausgeschnitten werden,
die regulativen DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig erhalten bleiben und unter Herbeiführung eines unikalen Restriktionsortes, der im Wirkungsbreich der regulativen DNS-Abschnitte liegt, zu einer Deletionsmutante vereinigt werden,
die Deletionsmutante aus dem Vektorplasmid isoliert und in einen Pflanzen- Transformations-Vektor so ligiert wird, daß der unikale Restriktionsort erhalten bleibt und eine Expressionskassette entsteht, in welcher der Pflanzen- Transformations-Vektor die Transformation dieser gesamten Expressionskassette übernimmt,
in den unikalen Restriktionsort der Expressionskassette eine beliebige DNS- Sequenz ligiert und
die DNS-Sequenz in dem Genom von Pflanzensamenzellen von höheren Pflanzen exprimiert wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Expressionskassette auf der Basis eines Gens das für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein USP (unbekanntes Samenprotein) kodiert und aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert wird, konstruiert wird,
ein weiteres vollständiges Gen sich auf einem weiteren Vektorplasmid befindet, wie das erste flankiert von DNS-Abschnitten mit Polylinkern,
die 5'-regulativen DNS-Abschnitte des UPS-Gens aus ihrem jeweiligen Vektorplasmid gewonnen und unter Bildung des unikalen Restriktionsortes so in ein Vektorplasmid ligiert werden, daß eine für die Transformation von Pflanzen geeignete Kassette mit den Abschnitten 5'-Polylinker - 5'-regulativer DNS- Abschnitt - unikaler Restriktionsort - 3'-regulativer DNS-Abschnitt - 3'-Polylinker in dieser Reihenfolge entsteht,
die Kassette unter Benutzung der 3'- und/oder 5'-Polylinker isoliert und in den Pflanzen-Transformations-Vektor ligiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus einer cDNS-
Bank der Ackerbohne Klone mit spezifischen Inserts von USP-
DNS selektiert und durch Sequenzanalyse deren cDNS-Nukleotidsequenzen
ermittelt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
genomische DNS-Sequenz eines Proteins mit der zugehörigen cDNS-
Nukleotidsequenz verglichen und daraus bestimmt wird, wo sich die
proteinkodierenden, die regulativen DNS-Abschnitte und die Intronsequenzen
befinden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 dadurch
gekennzeichnet, daß geeignete unikale Restriktionsorte innerhalb der
5'-regulativen DNS-Abschnitte des ersten Gens dazu
verwendet werden, den 3'-seitig davon gelegenen DNS-Abschnitt bis
ausschließlich 3'-seitigem Polylinker zu entfernen und die Enden durch Linker
unter Bildung des für die Einligierung der beliebigen DNS-Sequenz
vorgesehenen unikalen Restriktionsortes zu einer Deletionsmutante zu re
ligieren.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein in einem
Vektorplasmid befindlicher DNS-Abschnitt eines Gens 7(g7) der oktopin
kodierenden TL-DNS des Ti-Plasmides von Agrobacterium tumefaciens mit
pflanzenspezifischen Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen des Transkripts über
zwei geeignete Restriktionsorte gewonnen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß der DNS-
Abschnitt mit den pflanzenspezifischen Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen in
einem Restriktionsort des 3'-Polylinkers der Deletionsmutante unter
Beibehaltung des nun 5'-seitig von den Poladenylierungs-Signal-Sequenzen
befindlichen unikalen Restriktionsortes ligiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kassette
durch einen Restriktionsort im 5'-Polylinker und/oder 3'-Polylinker linearisiert und
in den kompatibel geöffneten Pflanzen-Transformations-Vektor so ligiert wird,
daß der unikale Restriktionsort zum Einklonieren einer beliebigen DNS-Sequenz
erhalten bleibt.
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0255378A2 (de) * | 1986-07-31 | 1988-02-03 | Calgene, Inc. | Samenspezifische Transkriptionsregulierung |
| DD263081A1 (de) * | 1987-07-20 | 1988-12-21 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zum einfuehren von dns-sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
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| Bassüner, R., Bäumlein, H., Huth, A., Jung, R., Wobus, U., Rapoport, T.A., Saalbach, G. und Müntz,K.: Abundant embryonic mRNA in field bean (Vicia faba L.) codes for a new class of seed proteins: cDNA cloning and characterization of the primary translation product, in: Plant Molecular Biology, 1988, 13, S. 321-334 * |
| Bäumlein, H., Wobus, U., Pustell, J. und Kafatos, F.C.: The legumin gene family: structure of a B type gene of Vicia faba and a possible legumin gene specific regulatory element, in: Nucleic Acid Research, 1986, 14, 6, S. 2707-2720 * |
| Dhaese, P., DeGreve, H., Gielen, J., Seurinck, L.,van Montagn, M. und Schell, J., Identification of sequences involved in the polyadenylation of higher plant nuclear transcripts using Agrobacterium T-DNA genes as models, in: EMBO J. 1983, 2 (3). S. 419-426 * |
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