DE3910856C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf die Bereitung wäßriger
Pufferlösungen zur Verwendung bei Ionenaustausch-Amino
säure-Analysesystemen und näherhin besonders zur Verwen
dung mit Systemen, bei denen Bauteile aus rostfreiem Stahl
Anwendung finden. Im Fall von zur Durchführung von
Trennungen durch Ionenaustauschchromatographie ausgelegten
Aminosäureanalysesystemen ist es üblich, besondere und
ziemlich teure rostfreie Materialien wie beispielsweise
Carpenter 20 und Inconel zu verwenden, um der korrodie
renden Zusammensetzung der herkömmlichen Pufferlösungen
standzuhalten. Speziell und ausschließlich für Ionenaus
tausch-Aminosäureanalyse bestimmte und ausgelegte
Instrumente sind gewöhnlich sehr kompliziert-aufwendig,
teuer und daher nicht in breitem Umfang verfügbar. HPLC-
Instrumente ("High Performance Liquid Chromatography
instruments", "Instrumente für Hochleistungs-Flüssigchromato
graphie") andererseits sind verhältnismäßig billig, in
breitem Umfang verfügbar und werden auch für Aminosäure
analyse nach sogenannten Umkehrphasenverfahren ("reverse
phase methods") verwendet. Im allgemeinen sind die Umkehr
phasenverfahren nicht ebenso zufriedenstellend wie Ionen
austauschverfahren; die letzteren dienen daher zur Auf
stellung des Standards für alle anderen Verfahren. Da
die Bauteile der HPLC-Systeme, wie beispielsweise Pumpen,
Probeninjektoren, motorisch betätigbare Ventile, Chroma
tographiesäulen usw. ähnlich den in Ionenaustausch-
Chromatographieinstrumenten verwendeten sind, hat es viel
fache Versuche gegeben, eine Ionenaustauschsäule in ein
HPLC-Instrument einzubauen bzw. einzubeziehen, derart
daß dieses zur Durchführung der klassischen Aminosäure-
Analyse nach Moore & Stein verwendet werden könnte. Es
wurde jedoch rasch entdeckt, daß die herkömmlichen Puffer
für Ionenaustausch-Chromatographie die Bauteile aus rost
freiem Stahl von HPLC-Systemen schnell angreifen und so
nicht nur die Lebensdauer dieser Bauteile verkürzen,
sondern auch infolge der resultierenden Metallionen rasch
die Wirkungsweise und Leistung der Ionenaustauschharze
beeinträchtigen. Eine Reihe von Versuchen, dieses Problem
dadurch zu vermeiden, daß man aus den Pufferlösungen
solche Bestandteile, wie beispielsweise Chloridionen, von
denen bekannt ist, daß sie rostfreien Stahl korrodieren,
eliminiert, sind in der Literatur beschrieben und eine
derartige Ausführung ist auch kommerziell verfügbar.
Leider wird zwar die Korrosion dadurch eliminiert, jedoch
ist die Chromatographieleistung dieser Puffer insgesamt
nicht gleich der von chloridhaltigen Puffern, wie sie
in den speziell und ausschließlich für Ionenaustausch-
Aminosäure-Analyse ausgelegten Systemen verwendet werden;
das Bedürfnis der Benutzer nach einer der Leistung eines
speziell und ausschließlich für Ionenaustausch-Aminosäure-
Analyse ausgelegten Analysators äquivalenten Leistung
wird hierdurch somit nicht befriedigt.
Aus der DE-OS 22 00 882 ist es im Zusammenhang eines chromatographischen
Trennverfahrens für Aminosäurengemische unter Verwendung
einer Säule mit einem Kationenaustauschharz bekannt,
als Pufferlösung ein Alkalimetallsalz einer Säure mit einem
pK-Wert kleiner als 5 zu verwenden, wobei das Alkalimetallsalz
aus der Gruppe Natrium, Lithium und Kalium und das Anion aus der
Gruppe Zitrat, Azetat, Phormat und Phosphat gewählt werden kann
und vorzugsweise Natriumzitrat verwendet wird. Die Wahl dieses
Puffers dient hierbei zur qualitativen Verbesserung der Ionen
austausch-Chromatographie, insbesondere zur Verkürzung der
Trenndauer und zur Vermeidung von Basislinienauswanderungen.
Das Problem der Ermöglichung der Durchführung von Ionenaus
tausch-Chromatographietrennung von Aminosäuregemischen in nicht
hierauf spezialisierten HPLC-Geräten ist hierbei nicht berührt.
Ausgehend von dem Stand der Technik betrifft die vorliegende
Erfindung wäßrige Pufferlösungen zur Trennung der Komponenten
einer Aminosäurengemischprobe nach dem Ionenaustauschverfahren,
wobei die Pufferlösung Alkalimetallsalze dreibasischer organischer
Säure enthält.
Der Erfindung liegt als Aufgabe die Schaffung derartiger Pufferlösungen
zugrunde, welche die Durchführung der Ionenaustausch-
Chromatographie zur Trennung von Aminosäuregemischen in herkömmlichen,
nicht auf die Ionenaustausch-Chromatographie zur
Trennung von Aminosäuregemischen spezialisierten HPLC-Chromatographiesystemen
ermöglicht und hierbei gute, mit den auf die
Ionenaustausch-Chromatographie spezialisierten teuren Systemen
vergleichbare Chromatographieleistungen ergibt.
Zu diesem Zweck ist bei einer Pufferlösung der genannten Art
gemäß der Erfindung vorgesehen, daß die Pufferlösung im wesentlichen
halogenfrei ist und zusätzlich Alkalimetallnitrate, Salpetersäure
sowie ein Schimmelbildungsinhibitormittel enthält.
Mit derartigen erfindungsgemäß ausgebildeten Pufferlösungen
wird bei der Verwendung herkömmlicher HPLC-Chromatographie-Systeme
zur Trennung von Aminosäuregemischen mittels Ionenaustausch-Chromatographie
eine unerwünschte Verringerung der
Lebensdauer der Geräte durch übermäßige Korrosion der in derartigen
HPLC-Systemen verwendeten Bauteile aus rostfreiem Stahl
vermieden und es werden vergleichbar gute Chromatographie-Trennleistungen
wie mit herkömmlichen korrodierenden Pufferlösungen
in speziell und ausschließlich für Ionenaustausch-Chromatographie
ausgelegten Instrumenten erreichbar.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist
das Alkalimetall aus der Gruppe Natrium, Lithium und Kalium
gewählt und dient als dreibasische organische Säure
Zitronensäure.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der
Erfindung lassen sich die oben genannten Ziele durch eine
oder mehrere Pufferlösungen erzielen, die im wesentlichen
aus destilliertem oder entionisiertem Wasser bestehen und:
- (a) 0,5 bis 5 Gew.-% Natriumcitrat;
- (b) 0 bis 6 Gew.-% Natriumnitrat;
- (c) 0,01 bis 4 Vol.-% konzentrierte Salpetersäure;
- (d) 0 bis 0,1 Gew.-% Benzoesäure sowie
- (e) 0 bis 0,003 Gew.-% Äthylmercurithiosalicylsäure
enthalten, wobei diese Pufferlösungen so zusammengesetzt
und zubereitet sind, daß die Natriumionenkonzentration
im Bereich von 0,12 N bis 1,2 N beträgt. Je nach dem jewei
ligen Anwendungsfall wird die Pufferlösung so eingestellt,
daß sie einen pH-Wert im Bereich von 1,0 bis 6,9 besitzt.
Für den Fachmann ist ersichtlich, daß sich brauchbare Ionen
austausch-Pufferlösungen herstellen lassen, indem man
Natrium ganz oder teilweise (unter entsprechender Anpassung
im Hinblick auf die unterschiedlichen Molekulargewichte)
durch Lithium, Kalium, Rubidium oder Cäsium ersetzt. Des
gleichen, wenngleich dies weniger geläufig ist, ist es
auch möglich, das Citratsalz ganz oder zum Teil durch
Salze anderer dreibasischer Säuren zu ersetzen. Die Benzoe
säure und die Äthylmercurithiosalizylsäure dienen beide
als Schimmelbildungsinhibitor und können durch zahlreiche
andere bekannte Ersatzstoffe wie beispielsweise Phenol,
Toluol und Oktanolsäure ersetzt werden.
In vielen Fällen ist es im Zusammenhang der Trennung
komplexer Aminosäuregemische durch Ionenaustausch-Chromato
graphie üblich, zwei oder mehr Pufferlösungen mit unterschied
lichen pH-Werten zu verwenden, wobei man im Verlauf eines
einzigen Analysevorgangs von der einen zur anderen Puffer
lösung übergeht. Ein bevorzugter Satz derartiger, nach Maß
gabe der vorstehenden Leitlinien zusammengesetzter Puffer
lösungen ist in der nachstehenden Tabelle 1 zusammenge
stellt:
Die mit diesen chloridfreien Puffern durchgeführte Trennung
komplexer Gemische ist vollständig mit der unter Verwendung
herkömmlicher chloridhaltiger Puffer vergleichbar. Die
Auflösung eng benachbarter Eluier-Dubletten (Sattel-zu-
Scheitelwert-Verhältnis, "valley-to-peak ratios") liegt
in der Größenordnung von 75%. Mit chloridfreien Puffern
nach dem bekannten Stand der Technik zeigen diese Dubletten
(typischerweise Threonin/Serin) allgemein eine Auflösung
von weniger als 50%. In der nachstehenden Tabelle 2 werden
zum Vergleich die aus identischen Proben mit den
chloridhaltigen und den chloridfreien Puffersystemen
getrennten Aminosäuremengen zusammengestellt.
Über eine Periode von sechs Monaten wurden über 700 Proben
analysen mit diesen Puffern auf einem automatischen Amino
säureanalysator durchgeführt, in welchem die Ionenaustausch
harzträger Sinterscheiben aus rostfreiem Stahl waren. Es
trat keine signifikante Verringerung der Auflösung der Säule
und kein Anzeichen, daß das Ionenaustauschharz im Verlauf
dieses Experiments eine Verschlechterung erfuhr, auf. Mit
herkömmlichen chloridhaltigen Puffern hätten sich die
Trägerscheiben aufgelöst und bereits lange vor dem mecha
nischen Ausfall der Apparatur hätten die Metallionen die
Wirkungsweise des Ionenaustauschharzes zerstört.
Zur Bestimmung der Verweilzeit und der Konzentrations
reproduzierbarkeit wurde eine Reihe von Trennvorgängen
mit dem gleichen Satz von Pufferlösungen an einem Proben
gemisch aus 17 Aminosäuren und HN₃ vorgenommen. Die Ver
weildauerkoeffizienten variierten dabei im Bereich von
0,05 bis 0,43%, mit einem Mittelwert von 0,23%. Die
Konzentrationskoeffizienten variierten gemäß Tabelle 3
im Bereich von 0,44 bis 1,70%, mit einem Mittelwert von
0,83%.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Trennleistung dieser Puffer
lösungen in jeder Hinsicht gleich der der herkömmlichen
chloridhaltigen Pufferlösungen ist.
Beim Trennen freier Aminosäuren in physiologischen Flüssig
keiten durch Ionenaustausch-Chromatographie werden Schlüssel-
Trennungen ("key separations") nur mit Lithium- statt mit
Natrium-Pufferlösungen vorgenommen. Ein bevorzugter Satz
derartiger Lithium-Pufferlösungen ist in der nachfolgenden
Tabelle 4 beschrieben:
Die mit diesem Satz Pufferlösungen erhaltenen Trennungen
und Scheitelwert-Auflösungen sind in gleicher Weise zufrie
denstellend wie die unter Verwendung herkömmlicher chlorid
haltiger Lithiumpuffer an physiologischen Flüssigkeiten
erzielten Ergebnisse.
Die vorstehend beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen
dienen selbstverständlich nur der Erläuterung; sie
können in für den Fachmann im Lichte der erfindungsgemäßen
Lehre naheliegender Weise mannigfach abgewandelt und
modifiziert werden, ohne daß hierdurch der Rahmen der Erfindung
verlassen wird.
Claims (7)
1. Wäßrige Pufferlösungen zur Trennung der Komponenten einer
Aminosäurengemischprobe nach dem Ionenaustauschverfahren,
wobei die Pufferlösung Alkalimetallsalze dreibasischer
organischer Säuren enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Pufferlösung im wesentlichen halogenfrei ist und zusätzlich
Alkalimetallnitrate, Salpetersäure sowie ein
Schimmelbildungs-Inhibitormittel enthält.
2. Pufferlösung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Alkalimetall aus der Gruppe Natrium, Lithium und
Kalium gewählt ist.
3. Pufferlösung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
die dreibasische organische Säure Zitronensäure ist.
4. Pufferlösung nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
sie 0,5 bis 5 Gew.-% Natriumcitrat, 0 bis 6 Gew.-%
Natriumnitrat, 0,01 bis 4 Vol.-% konzentrierte
Salpetersäure, 0 bis 0,1 Gew.-% Benzoesäure sowie 0 bis
0,003 Gew.-% Äthylmercurithiosalizylsäure enthält.
5. Pufferlösung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
der pH-Wert 3,28, die Natriumcitratkonzentration
1,721 Gew.-%, die Salpetersäurekonzentration 1,6 Vol.-%
und die Benzoesäurekonzentration 0,025 Gew.-% beträgt.
6. Pufferlösung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
der pH-Wert 6,39, die Natriumcitratkonzentration
1,721 Gew.-%, die Natriumnitratkonzentration 4,68 Gew.-%,
die Salpetersäurekonzentration 0,005 Vol.-% und die
Äthylmercurisalizylsäurekonzentration 0,001 Gew.-%
beträgt.
7. Pufferlösung nach einem oder mehreren der Ansprüche
1 bis 3, gekennzeichnet
durch einen pH-Wert von 3,98, eine Lithiumcitratkonzen
tration von 1,348 Gew.-%, eine Lithiumnitratkonzentration
von 2 Gew.-%, eine Salpetersäurekonzentration
von 1,5 Vol.-% und eine Benzoesäurekonzentration von
0,025 Gew.-%.
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