DE3851502T2

DE3851502T2 - Fluoreszierende Indikator-Farbstoffe für Kalzium, die bei langen Wellenlängen arbeiten.

Info

Publication number: DE3851502T2
Application number: DE3851502T
Authority: DE
Inventors: Akwasi Minta; Roger Yonchien Tsien
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-27
Publication date: 1995-02-09
Anticipated expiration: 2008-10-28
Also published as: ATE111498T1; JPH01161062A; EP0314480A2; JP2678199B2; GR890300185T1; DE314480T1; DE3851502D1; US5049673A; EP0314480B1; CA1332416C; EP0314480A3

Description

Die Erfindung ist mit Förderung der Regierung unter den Unterstützungsnummern GM-31004 und EY-04372 bei den Nationalen Instituten für Gesundheit und der Universität von Kalifornien entstanden. Die Regierung der Vereinigten Staaten von Nordamerika verfügt über bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Die Erfindung betrifft eine neue Klasse von kalziumspezifischen Fluoreszenzindikatorfarbstoffen mit sichtbaren Exzitations- und Emissionswellenlängen.
Wegen der Bedeutung von Kalzium als intrazellulärem Messenger und Regulator ist eine breite Vielfalt von Methoden entwickelt worden, um die intrazellulären Konzentrationen an freiem Kalzium (Ca²&spplus;)i zu bestimmen. Die erfolgreichste dieser Methoden verwendet Farbstoffe oder Proteine, die bei der Bindung von Ca²&spplus;-Ionen die Absorption oder Lumineszenz ändern. Die gegenwärtig bekannteste dieser Methoden besteht darin, daß man die Fluoreszenz von BAPTA-ähnlichen Indikatorfarbstoffverbindungen bestimmt, die als Quin-2, Fura-2 und Indo-1 bekannt sind (vgl. Veröffentlichungen 1-3 und US-Patent 4 603 209). Die Popularität von Verbindungen wie Quin-2, Fura-2 und Indo-1 rührt von dem Folgenden her: (1) die Leichtigkeit, mit der diese Verbindungen in Zellen durch Hydrolyse von membranpermeablen Estern eingeführt werden können, und (2) die Empfindlichkeit und Anpassungsfähigkeit der Fluoreszenz, z. B. ein Ablesemodus, der an mengenartig große Suspensionen, die Strömungszytometrie und die mikroskopische Abbildung von einzelnen Zellen angepaßt werden kann. Unglücklicherweise erfordern Farbstoffe wie Quin-2, Fura-2 und Indo-1 sämtlich eine Excitation bei ultravioletten Wellenlängen in der Nähe des Cutoffpunktes für die Transmission durch Glas. Zusätzlich sind diese Wellenlängen potentiell zellschädigend und neigen zu der Exzitation einer Autofluoreszenz, z. B. von den Pyridinnucleo-tiden. Weiterhin fällt der UV-Bereich mit den Wellenlängen zusammen, die zur Photolyse von Chelatoren wie Nitr-5 und Nitr-7 benötigt werden, um das an ihnen gebundene Ca²&spplus; freizusetzen (vgl. Veröffentlichungen 4-6 und US-A-Patentanmeldung No. 049 658, eingereicht am 3. Mai 1987 und US-Patent 4 689 432, erteilt am 25. August 1987). Als Ergebnis können die existierenden Indikatoren nicht ohne weiteres verwendet werden, um die Freisetzung von "gefangenem" Ca²&spplus; zu messen, da die Exzitation der Fluoreszenz mit der Photolyse des Puffers beginnt. Weiterhin kann die Absorption von Nitr-5 oder Nitr-7 und der photolytischen Reaktionsprodukte derselben ein internes Filtern verursachen, das tatsächlich die Fluoreszenzexzitation stören kann.
Die in dem vorhergehenden Abschnitt diskutierten Probleme könnten mit Ca²&spplus;-Indikatorfarbstoffen vermieden werden, deren Exzitationswellenlängen im sichtbaren oder Infrarotbereich liegen. Es besteht schon lange ein Bedürfnis an derartigen Farbstoffen; frühere Versuche zur Herstellung derartiger Produkte haben jedoch zu enttäuschenden Quantenausbeuten der Fluoreszenz oder Ca²&spplus;-Affinitäten geführt (vgl. Veröffentlichung 7).
Fluoreszein und Rhodamin sind in der Biologie in breitem Umfang eingesetzte Fluorophore. Wegen ihrer Häufigkeit als Marker bei der Immunofluoreszenz- und fluoreszenzanalogen Zytochemie (vgl. Veröffentlichung 8) sind die meisten Fluoreszenzmikroskope und Strömungszytometer so ausgerüstet, daß sie bei diesen Wellenlängen arbeiten. Als Ergebnis wäre es sehr nützlich, wenn diese hochfluoreszierenden, delokalisierten Xanthene mit bewährten Ca²&spplus;-spezifischen Bindungsstellen von BAPTA oder BAPTA-ähnlichen Verbindungen kombiniert werden könnten. Wegen ihrer Ahnlichkeit mit Fluoreszeinen und Rhodaminen wären solche neuen Verbindungen optisch kompatibel mit fast jedem Fluorometer oder Fluoreszenzmikroskop oder Strömungszytometer, die gegenwärtig in Immunofluoreszenzmessungen verwendet werden. Wegen der leichten Verfügbarkeit solcher Ausrüstungen für die Immunofluoreszenzmessung würden diese neuen Farbstoffe von einer Anzahl von biologischen Forschern begrüßt werden.

Liste der Veröffentlichungen

In der vorliegenden Beschreibung wird auf die folgenden Veröffentlichungen Bezug genommen, wobei auf den Inhalt einer jeden einzelnen Bezug zu nehmen ist.

Veröffentlichungen

1. Adams, S.R., Kao, J.P.Y., Grynkiewicz, G., Minta, A. und Tsien, R.Y., Manuskript in Vorbereitung.
2. Adams, S.R., Kao, J.P.Y., und Tsien, R.Y., J. Gen. Physiol., 88 : 9a-10a (1986).
3. Bridges, J.W., Standards in Fluorescense Spectrometry, S.
68-78, J.N. Miller, Ed., Chapman and Hall, London (1981).
4. Drexhage, K.H., Dye Lasers, S. 144-193, E.P. Schaefer, Ed., Springer, New York (1973).
5. Ehrlich, P. und Benda, L., Berichte der Deutsch. Chem. Gesell., 46 : 1931-1943 (1913).
6. Geisow, M.J., Exp. Cell Res., 150 : 2-35 (1984).
7. Griffiths, J., Colour and Constitution of Organic Molecules, S. 250-265, Academic Press, London (1976).
8. Grover, P.K., Shah, G.D. und Shah, R.C., J. Chem. Soc. Lond., S. 3982-3985 (1955).
9. Grynkiewicz, G., Poenie, M. und Tsien, R.Y., J. Biol. Chem., 260 : 3440-3450 (1985).
10. Gurney, A.M., Tsien, R.Y. und Lester, H.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 3496-3500 (1987).
11. Kao, J.P.Y. und Tsien, R.Y., unveröffentlichte Ergebnisse.
12. Kurduker, R. und Subba Rao, N.V., Proc. Indian Acad. Sci., A57 : 280-287 (1963).
13. Martell, A.E. und Smith, R.M., Critical Stability Constants, Vol. I, Plenum Press, New York (1974).
14. Martin, M.M. und Lindqvist, L., J. Luminescence, 10 : 381-390 (1975).
15. Parham, W.E. und Bradsher, C.K., Acc. Chem. Res., 15 : 300-305 (1982).
16. Rink, T.J. und Pozzan, T., Cell Calcium, 6 : 133-144 (1985).
17. Taylor, D.L. und Wang, Y.-L., Nature (Lond.), 284 : 405-410 (1980).
18. Tsien, R.Y., Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 12 : 91-116 (1983).
19. Tsien, R.Y. und Poenie, M., Biochemistry, 19 : 2396-2404 (1980).
20. Tsien, R.Y. und Zucker, R.S., Trends Biochem. Sci., 11 : 450-455 (1986).
21. Tsien, R.Y. und Zucker, R.S., Biophys. J., 50 : 843-853 (1986).
22. von Braun, J. und Aust, E., Berichte der Deutsch. Chem. Gesell., 49 : 989-999 (1913).
23. Weber, G. und Teale, F.W.J., Trans. Faraday Soc., 53 : 646-655 (1957).

Patente

1. US-Patent 4 603 209, erteilt am 29. Juli 1986 an Tsien et al. für "Fluorescent Indicator Dyes for Calcium Ions".
2. US-Patent 4 689 432, erteilt am 25. August 1987 an Tsien et al. für "Chelators Whose Affinity for Calcium is Decreased by Illumination".
Die Zeichnungen umfassen sechs Figuren, die folgendes zeigen:
Fig. 1A zeigt die Struktur von Rhodaminen, Rhodolen und Fluoresceinen;
Fig. 1B zeigt einen möglichen Entwurf für einen Ca²&spplus;-Indikator, bei dem der Chelatierungsort direkt einen Xanthenchromophor einschließt;
Fig. 2-1 und Fig. 2-2 zeigen einen Syntheseweg, der zu Rhod-1 und zu Fluo-1 führt;
Fig. 3-1 und 3-2 sind Synthesewege, die zu Rhod-2, Fluo-2 und Fluo-3 führen;
Fig. 4A zeigt die Exzitationsspektren für Fluo-3;
Fig. 4B zeigt das Emissionsspektrum für Fluo-3;
Fig. 5 ist eine Grafik mit der Fluoreszenzintensität von Fluo-3 in Abhängigkeit vom pH;
Fig. 6 ist eine Grafik, die das Produkt der Quantenausbeute der Fluoreszenz und des Exzitationskoeffizienten gegen Ca²&spplus; für Quin-2, Fura-2, Indo-1, Rhod-2 und Fluo-3 zeigt.
Es folgt eine eingehende Beschreibung der Zeichnungen:
Fig. 1A. Struktur von üblichen Rhodaminen, Rhodolen und Fluoreszeinen. In einem Rhodamin wäre X eine substituierte Aminogruppe, R¹R²N-, und Y wäre ähnlich, jedoch positiv geladen, =NR¹R². Iν &epsi; ν&epsi;µ Rηοδολ στ Ξ ω &epsi; οβ&epsi;ν δ&epsi;φ ν &epsi;ρτ, ωοη νγ&epsi;γ&epsi;ν &Upsi; = O ω ρδ. Iν &epsi; ν&epsi;µ Φλξορ&epsi;σ &epsi; ν σ νδ Ξ uνδ &Upsi; -O- β ω. = O.
Φ γ. 1B. E ν µ γλ χη&epsi;ρ Eντωξρφ φ ρ &epsi; ν&epsi;ν Xα²&spplus;-Indikator, bei dem der Chelatierungsort direkt den Xanthenchromophor einschließt. X wäre R¹R²N- oder -O-.
Fig. 2. Syntheseweg, der zu Rhod-1 und Fluo-1 führt. Die römischen Zahlen beziehen sich auf die synthetischen Einzelheiten in den Versuchsvorschriften. Strukturen in Klammern wurden in situ ohne Isolierung eingesetzt.
Fig. 3. Syntheseweg, der zu Rhod-2, Fluo-2 und Fluo-3 führt.
Fig. 4. Exzitations(A)- und Emissions(B)-Spektren für Fluo-3 bei 22 ± 2ºC in Puffern mit freien Ca²&spplus;-Werten im Bereich von weniger als 1 nM bis 58 mikroM. Die Titration wurde durchgeführt, indem man mit 3,5 ml 100 mM KCl, 10 mM K-MOPS, 10 mM K&sub2;CaEGTA, 15 mikroM Fluo-3, pH 7,03, begann. Das "O"-Ca-Spektrum wurde aufgezeichnet; anschließend wurden zum Erreichen von n mM CaEGTA, (10-n) mM EGTA, n = 1 - 10, Anteile von 3,5/(11-n) ml iterativ verworfen und durch gleiche Volumina von 100 mM KCl, 10 mM K-MOPS, 10 mM K&sub2;CaEGTA, 15 mikroM Fluo-3, pH 7,0, ersetzt. Nach jeder Iteration wurden der pH (Bereich 6,99 bis 7,05) und die Spektren aufgezeichnet; jedes Spektrum wurde durch das berechnete freie Ca²&spplus; mikromolar markiert. Die Bandenbreiten der Exzitation und Emission betrugen 1,9 nM bzw. 4,6. Sämtliche Spektren wurden in bezug auf den Peak der 58 mikroM (n = 10)-Kurve normalisiert. In A wurde die Emission bei 530 nm bestimmt, und die Exzitation wurde für Lampen- und Monochromator-Charakteristika korrigiert, und zwar unter Verwendung eines Rhodamin B-Quantenzählers. In B lag die Exzitation bei 490 nm, und das Emissionsspektrum ist für die Monochromator- und Detektorempfindlichkeit unkorrigiert. Die leicht niedrige Amplitude der Kurve bei 3,6 mikroM (Ca²&spplus;) liegt vermutlich an einem kleinen Fehler beim Zurückstellen des Exzitationsmonochromators auf 490 nm.
Fig. 5. Die Fluoreszenzintensität von Fluo-3 (vgl. die Log-Achse) gegen pH bei 0,160 nM, 800 nM und 1 mM (Ca²&spplus;), 22 ± 2ºC. Alle Lösungen enthielten 10 mikroM Fluo-3, 100 mM KCl und 10 mM Tris-MOPS und wurden bezüglich des pH mit ausreichend konzentrierter H&sub3;PO&sub4;, HOAc oder KOH eingestellt, so daß sich das Volumen während der Titration nicht signifikant änderte. Die "0 Ca"-Punkte (offene Kreise) wurden mit 5 mM EDTA und ohne zusätzliches Ca erhalten; die "160 nm" (Dreiecke) und "800 nM" (x)-Angaben wurden mit 5,2 mM Dibrom-BAPTA erhalten. Wie im experimentellen Teil erläutert, wurde das gesamte Ca²&spplus; von 0,25 auf 0,47 mM gesteigert, um freies (Ca²&spplus;) bei 160 nM beizubehalten, wenn der pH von 5,6 auf 8,1 gesteigert wurde; für 800 nM freies (Ca2+) betrug das gesamte Ca²&spplus; von 1,04 bis 1,73 mM über den gleichen pH-Bereich. Die "1 mM Ca"-Punkte (+) wurden mit 1 mM CaCl&sub2; und ohne Phosphat erhalten (um eine Ausfällung zu vermeiden). Die Ordinate in willkürlich gewählten Intensitätseinheiten bezieht sich auf das gesamte Exzitationsspektrum von 420 bis 520 nm, wobei die Emission bei 530 nm bestimmt wurde, Bandenbreite 9 nm. Weil die Spektren die gleiche Form während der Titration behielten, war die Integration ein bequemer Weg der Bildung des Durchschnitts und der Reduktion eines jeden Spektrums auf einen einzelnen Intensitätswert.
Fig. 6. Das Produkt der Effizienz der Fluoreszenzquanten und des Extinktionskoeffizienten gegen freies (Ca²&spplus;) (zu beachten sind die log-Achsen für beide) für Quin-2, Fura-2, Indo-1, Rhod-2 und Fluo-3. Sämtliche Daten gelten für die Umgebungstemperatur, 0,1 M KCl, kein zugesetztes Mg²&spplus;. Die Quin-2-Kurve wurde berechnet für die 339 nm-Exzitation (Extinktionskoeffizient = 4,6 · 10³ M&supmin;¹cm&supmin;¹, unabhängig von Ca²&spplus;) und die Quantenausbeute gegenüber einem Bereich von 0,029 bis 0,14 bei einer Ca²&spplus;-Dissoziationskonstante (Kd) von 78 nM (13). Die "Fura-2 ex 340"-Kurve wurde für 340 nm-Exzitation (Extinktionskoeffizient = 1,91 · 10&sup4; bis 3,19 · 10&sup4;) berechnet und die Quantenausbeute von 0,23 bis 0,49 mit einem Kd von 135 nM (2); die "Fura-2 ex 380"-Kurve war die gleiche, mit der Ausnahme, daß sie auf dem Extinktionskoeffizienten = 2,25 · 10&sup4; bis 6,25 · 10² für die 380 nm-Exzitation basierte. Weil Indo-1 gewöhnlich wegen seines Emissions- und nicht seines Exzitationsshifts verwendet wird, wurden seine Kurven für eine feste 356 nm-Exzitation (E = 3,25 · 10&sup4; bis 1,63 · 10&sup4;) und Kd = 250 nM (2) berechnet, wobei jedoch die Quantenausbeute (0,38 bis 0,56) in Emissionskomponenten unter 440 nm (0,033 bis 0,30) und über 440 nm (0,347 bis 0,26) für die beiden separaten Kurven aufgetrennt wurde. Die Kurve für Fluo-3 verwendet die Daten der Tabelle I mit Extinktionskoeffizienten von 7,5 · 10&sup4; bis 8,35 · 10&sup4; bei 506 nm; die Kurve für Rhod-2 ging von einem Ca²&spplus; -unabhängigen Extinktionskoeffizienten von 1 · 10&sup5; M&supmin;¹cm&supmin;¹ aus.

Definitionen

In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen wird auf Ausdrücke und Zeichnungen der Fachwelt Bezug genommen, die im einzelnen wie folgt definiert werden:
So wie es hier verwendet wird, bedeutet "(Ca²&spplus;)i" intrazelluläres freies Kalzium.
So wie es hier benutzt wird, bedeutet "EGTA" Tetraessigsäure.
So wie es hier benutzt wird, bedeutet "BAPTA" 1,2-bis(2-Aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure; die chemische Struktur für BAPTA ist:
So wie es hier benutzt wird, bedeutet "BAPTA-artig" substituierte Derivate des BAPTA, die die wesentliche Charakteristik von zwei bis(carboxymethyl)amino-substituierten Phenylringen beibehalten, wobei diese Ringe an den ortho-Positionen an die Amine über eine vieratomige Brücke geknüpft sind, wobei das Atom in Nachbarschaft zu einem jeden Phenylring N oder O ist und die beiden Zentralatome jeweils C sind. Durch diese Definition ist klargestellt, daß "BAPTA-artig" Verbindungen wie Quin-1 und Quin-2 einschließt.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet Quin-1 2-[[2-[bis (Carboxymethyl)amino]-5-methylphenoxy]methyl]-8-[bis(carboxymethyl)amino]-chinolin.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet Quin-2 2-[[2-[bis (Carboxymethyl)amino]-5-methylphenoxy]methyl]-6-methoxy-8- [bis(carboxy-methyl)amino]-chinolin; die chemische Struktur für Quin-2 ist:
So wie es hier verwendet wird, bedeutet "HEEDTA" N-(2-hydroxyethyl)ethylenediamin-N,N',N'-triessigsäure.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet "NTA" Nitrilotriessigsäure.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet "MOPS" 3-(N-morpholino)propansulfonsäure.
So wie sie hier verwendet werden, bedeuten pharmazeutisch verträgliche Ester diejenigen leicht hydrolysierbaren Ester, die bekannt sind und in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, insbesondere alpha-Acyloxyalkylester.
So wie sie hier verwendet werden, bedeuten pharmazeutisch verträgliche, nicht-toxische Salze Carbonsäuresalze, bei denen die Gegenionen oder Ionen sämtlich Na, K, NR&sub4;&spplus; (wobei R=H, C&sub1;-C&sub4; Alkyl oder ein Gemisch derselben ist), Ca oder Mg sind oder eine beliebige Kombination dieser Gegenionen oder eine beliebige Kombination von sauren Salzen dieser Gegenionen zuzüglich freier Säuregruppen.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet mikroM mikromolar.
Hier angegebene Temperaturen sind Grad Celsius.
"Farbstoff" und "Indikator" werden austauschbar verwendet.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet "Xanthen" trizyklisches Dibenzopyran (CH&sub2;(C&sub6;H&sub4;)&sub2;O). Xanthen ist der zentrale heterozyklische Kern von Farbstoffen wie Fluoreszein, Eosin und Rhodamin.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet "Chromophor" eine chemische Gruppe, die bei ihrer Anwesenheit in einer aromatischen Verbindung (dem Chromogen) der Verbindung Farbe verleiht, indem sie eine Verschiebung oder das Erscheinen von Absorptionsbanden im sichtbaren Spektrum verursacht.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet "trizyklischer Chromophor" ein Chromophor mit der trizyklischen Kernstruktur wie folgt:
worin y wie in Formel 1 ist, d. h. y ist -O-, -NMe-, -S-, -CH&sub2;-, -CMe&sub2;-, -CF&sub2;-. Diese trizyklische Struktur ist der Kern von Ringsystemen wie Xanthen, Acridin, Thioxanthen, Anthracen, Anthron oder Fluoren.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet "Fluorophor" einen fluoreszierenden Chromophor oder einen fluoreszierenden trizyklischen Chromophor.
Die chemischen Formeln für in den Fig. 1 und 2 gezeigte Verbindungen werden mit römischen Ziffern markiert. Die römischen Ziffern werden in der gesamten Beschreibung verwendet (vgl. allgemein den mit Synthesemethoden markierten Abschnitt), um Verbindungen zu identifizieren, die denjenigen der in den Figuren gezeigten entsprechen.
Die hier offenbarten neuen Farbstoffe werden mit Bindestrichen bezeichnet, um die Nummer 1 von dem Buchstaben l zu unterscheiden, z. B. Rhod-2, Fluo-2, Fluo-3 usw.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet Rhod-1 (9-(6-Hydroxy- 4-bis(carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5- methylphenoxy)ethoxy)phenyl)-6-dimethylamino-3H-xanthen-3- yliden)dimethylammonium. Die chemische Struktur für Rhod-1 ist in Fig. 2 gezeigt.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet Rhod-2 (9-(4-bis (Carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5- methylphenoxy)ethoxy)phenyl)-6-dimethylamino-3H-xanthen-3- yliden)dimethylammonium. Die chemische Struktur für Rhod-2 ist in Fig. 3 gezeigt.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet Fluo-1 9-(6-Hydroxy- 4-bis(carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5- methylphenoxy)ethoxy)phenyl)-6-hydroxy-3H-xanthen-3-on. Die chemische Struktur für Fluo-1 ist in Fig. 2 gezeigt.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet Fluo-2 9-(4-bis (Carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5- methylphenoxy)ethoxy)phenyl-6-hydroxy-3H-xanthen-3-on. Die chemische Struktur für Fluo-2 ist in Fig. 3 gezeigt.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet Fluo-3 9-(4-bis (Carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5- methylphenoxy)ethoxy)phenyl-2,7-dichlor-6-hydroxy-3H-xanthen- 3-on. Die chemische Struktur für Fluo-3 ist in Fig. 3 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt eine neue Klasse von kalziumspezifischen, fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen mit sichtbaren Exzitations- und Emissionswellenlängen. Die neuen fluoreszierenden Indikatorfarbstoffe enthalten mindestens einen trizyklischen Chromophor, z. B. einen Rhodamin- oder einen Fluoreszein-Fluorophor, verknüpft mit einer Ca²&spplus;-chelatierenden Tetracarboxyl-Stammverbindung mit dem Octakoordinationsmuster von für BAPTA charakteristischen Ligandengruppen. Wie in dem "Stamm"-EGTA oder den BAPTA-artigen Verbindungen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die beiden Hälften des Chelators, verknüpft über eine einfache Bindung, enthalten, wie 1,2-Ethandiyl(-CH&sub2;CH&sub2;-) oder 1,2-Propandiyl oder 2,3-Butandiyl; alternativ kann in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung die stereochemische Konformation dieser einfachen Bindung modifiziert werden, indem man raumfüllende Substituenten zusetzt oder die einfache Bindung in einen carbozyklischen oder heterozyklischen Ring einbaut.
In einer ersten Ausführungsform umfassen die neuen Verbindungen einen einzigen, trizyklischen Chromophor, der an einen BAPTA-artigen Ca²&spplus;-Chelator gekoppelt ist, wobei die zwei Hälften des Chelators durch eine Bindung verknüpft sind, die aus der von den folgenden Substanzen gebildeten Gruppe ausgewählt ist: (a) ein 1,2-Ethandiylrest (-CH&sub2;CH&sub2;-), (b) ein 1,2-Propandiylrest, (c) ein 2,3-Butandiylrest, (d) ein 1,2- Cycloalkandiylrest, (e) zwei benachbarte Kohlenstoffatome in einem heterozyklischen Ring, z. B. ein 3,4-Tetrahydrofurandiyl, und (f) ein 1,2-Ethandiylrest (-CH&sub2;CH&sub2;-) mit raumfüllenden Substituenten wie -C&sub2;H&sub5;, -CH&sub2;OH, -COOH oder -CH&sub2;COOH. In dieser Form umfassen die neuen Verbindungen eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel:
und die pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Salze und Ester derselben, wobei
E¹ und E² unabhängig voneinander H, CH&sub3;, C&sub2;H&sub5;, CH&sub2;OH, COOH oder CH&sub2;COOH oder E und E² zusammen -(CH&sub2;)m-V-(CH&sub2;)n- sind, wobei m und n unabhängig voneinander 1 oder 2 sind und V aus der von -CH&sub2;, -O-, -NH-, -NMe-, -S- und -S-S- gebildeten Gruppe ausgewählt sind;
W H, OH oder COOH ist,
X H, Me, COOH, F, Cl, Br, J oder NO&sub2; ist,
Y -O-, -NMe, -S-, -CH&sub2;, -CMe&sub2;-, -CF&sub2;-, -CO- oder eine direkte Sigmabindung unter Bildung eines 5-gliedrigen mittleren Ringes ist;
Z¹, Z², Z³ und Z&sup4; unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, J oder Me sind und Q¹&sub1; Q² gleich R&sub1;R&sub2;N-,
oder HO-, O= oder R&sub1;R&sub2;N-, O= sind, wobei R¹ und R² unabhängig voneinander aus der von H, Me und Et gebildeten Gruppe ausgewählt sind, oder Z¹, Q¹, Z³ zusammen -(CH&sub2;)&sub3;-N-(CH&sub2;)&sub3;- und Z², Q², Z&sup4; zusammen
sind.
In einer zweiten Ausführungsform umfassen die neuen Verbindungen zwei trizyklische Chromophore, die mit einem BAPTA-artigen Ca²&spplus;-Chelator verknüpft sind, wobei die zwei Hälften des Chelators über eine Bindung verknüpft sind, die aus der aus den folgenden zusammengesetzten Gruppe ausgewählt sind: (a) ein 1,2-Ethandiylrest (-CH&sub2;CH&sub2;-), (b) ein 1,2-Propandiylrest, (c) ein 2,3-Butandiylrest, (d) ein 1,2-Cycloalkandiylrest, (e) zwei benachbarte Kohlenstoffatome in einem heterozyklischen Ring, z. B. ein 3,4-Tetrahydrofurandiyl, und (f) ein 1,2-Ethandiylrest (-CH&sub2;CH&sub2;-) mit raumfüllenden Substituenten wie -C&sub2;H&sub5;, -CH&sub2;OH, -COOH oder -CH&sub2;COOH. In dieser Form umfassen die neuen Verbindungen eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel:
sowie die pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Salze und Ester derselben, wobei
E¹ und E² unabhängig voneinander H, CH&sub3;, C&sub2;H&sub5;, CH&sub2;OH, COOH oder CH&sub2;COOH oder E¹ und E² zusammen (CH&sub2;)m-V-(CH&sub2;)n- sind, wobei m und n unabhängig voneinander 1 oder 2 sind und V aus der von -CH&sub2;, -O-, -NH-, -NMe-, -S- und -S-S- gebildeten Gruppe ausgewählt sind;
W H, OH oder COOH ist,
X H, Me, COOH, F, Cl, Br, J oder NO&sub2; ist,
Y -O-, -NMe, -S-, -CH&sub2;, -CMe&sub2;-, -CF&sub2;-, -CO- oder eine direkte Sigmabindung unter Bildung eines 5-gliedrigen zentralen Ringes ist;
Z¹, Z² Z³ und Z&sup4; unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, J oder
Me sind und Q¹, Q² gleich R&sub1;R&sub2;N-,
oder HO-, O= oder R&sub1;R&sub2;N-,O= sind, wobei R¹ und R² unabhängig voneinander aus der von H, Me und Et gebildeten Gruppe ausgewählt sind, oder Z¹, Q¹, Z³ zusammen
und Z², Q², Z&sup4; zusammen
sind.
Die vorliegende Erfindung umfaßt eine neue Klasse von kalziumspezifischen Fluoreszenzindikatorfarbstoffen mit sichtbaren Exzitations- und Emissionswellenlängen. Allgemeine Formeln für diese kalziumspezifischen Fluoreszenzfarbstoffe werden oben wiedergegeben. Verbindungen der hier offenbarten und beanspruchten Art bestehen aus mindestens einem trizyklischen Chromophor, der an einen Ca²&spplus;-Chelatierungsteil geknüpft ist und zwei 2-bis(Carboxymethyl)aminophenoxy-Gruppen enthält, die durch ein einfaches 1,2-Ethandiyl(-CH&sub2;CH&sub2;-), ein 1,2-Propandiyl, ein 2,3-Butandiyl, ein 1,2-Cycloalkandiyl oder zwei benachbarte Kohlenstoffatome in einem heterozyklischen Ring, z. B. ein 3,4-Tetrahydrofurandiyl, verknüpft sind.
Bei der Herstellung unserer neuen Verbindungen haben wir den Umstand berücksichtigt, daß die am häufigsten in der Biologie verwendeten Fluorophore wahrscheinlich diejenigen von Fluoreszein und Rhodamin sind (vgl. Fig. 1A). Wegen ihrer Häufigkeit als Marker bei der Immunofluoreszenz und der fluoreszenzanalogen Zytochemie (vgl. Veröffentlichung 8) sind praktisch alle Fluoreszenzmikroskope und Strömungszytometer so ausgerüstet, daß sie bei ihren Wellenlängen arbeiten. Es war daher von Interesse zu versuchen, diese hoch fluoreszierenden, delokalisierten Xanthene mit dem bewährten Ca²&spplus;-spezifischen Bindungsort eines Chelators wie BAPTA zu verknüpfen. Das Verknüpfen des BAPTA-Restes mit der zentralen 9-Position des Xanthens hätte die Symmetrie des Fluorophors bewahrt. Eine derartige Symmetrie ist erwünscht, da fast alle Farbstoffe mit großen Wellenlängen, die in Wasser stark fluoreszieren, hochsymmetrische Polymethinchromophore aufweisen, wogegen asymmetrische Chromophore wie Merocyanine und Rhodole im allgemeinen in Wasser schlecht fluoreszieren (vgl. Veröffentlichung 9).
Klassische Rhodamine und Fluoreszeine (vgl. Fig. 1A) werden aus -Dialkylaminophenoen oder Resorcinolen hergestellt, welche mit Phthalsäureanhydrid unter drastischen Bedingungen kondensiert werden. Mischungen von Isomeren, die schwierig abzutrennen sind, werden gebildet, wenn das Phthalsäureanhydrid nicht-äquivalente Substituenten aufweist, wie dies für den BAPTA-Rest, der in der 9-Position verknüpft werden soll, erforderlich wäre. Außerdem würde eine zusätzliche Carboxylgruppe in der Nähe der Verknüpfung der Xanthen- und Phthaleinringe zurückbleiben. Diese Carboxylgruppe könnte für unsere Zwecke unerwünscht sein, da sie sterisch mit der Konjugation zwischen dem Xanthensystem und dem Phthaleinring stört. Wenn diese Konjugation zu sehr verringert wird, könnte der Fluorophor von dem Chelatierungsort isoliert werden und eine Ca²&spplus;-Bindung nicht länger signalisieren. Es wurden daher Synthesewege entworfen, um Phthalsäureanhydride und die Bildung dieses zusätzlichen Carboxyls zu vermeiden.
Die Synthese der neuen Klassen von kalziumspezifischen fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen wird anhand der detaillierten Synthesen der Verbindungen Rhod-1, Fluo-1, Rhod-2, Fluo-2 und Fluo-3 erläutert (vgl. den Abschnitt mit dem Titel Synthese von Verbindungen). Bei der Herstellung dieser erläuterten Verbindungen wurde der BAPTA-Rest entweder durch einen zusätzlichen Hydroxysubstituenten, wie in Rhod-1 und Fluo-1, oder durch Bildung eines Organolithiumderivates aktiviert, wie in Rhod-2, Fluo-2 und Fluo-3, und anschließend mit verschiedenen 9-Xanthonen verknüpft.
Die erläuterten Verbindungen haben sämtlich einfache Bindungen und einen einfachen Xanthenfluorophor, der mit dem "Stamm"-Rest für die Ca²&spplus;-Chelatierung verknüpft ist. Der Fachmann erkennt, daß andere Formen dieser neuen kalziumspezifischen Fluoreszenzfarbstoffe, einschließlich solcher, bei denen die zwei 2-bis(Carboxymethyl)aminophenoxygruppen an dem Chelatorrest mittels raumfüllender oder "zyklischer" Bindungen verknüpft sind, zusätzlich zu denen, die zwei angehängte Xanthenfluorophore aufweisen, von der Fachwelt hergestellt werden können, ohne übermäßige Experimente unter Verwendung von verwandten synthetischen Methoden und Ausgangsmaterialien. Es können zum Beispiel Verbindungen mit zwei identischen Fluorophoren ebenso leicht hergestellt werden, wie die in den spezifischen Ausführungsbeispielen. Die Synthese von Farbstoffen mit W = OH in Formel 2 könnte mit einer Reaktion von 2 Mol 2-Nitro-4-benzyloxyphenol mit 1,2-Dibromethan beginnen. Die Reduktion der Nitrogruppen, die Alkylierung der sich ergebenden Aminogruppen mit Ethylbromacetat und die Hydrogenolyse der Benzylgruppen ergibt 1,2-bis(2-bis(Ethoxycarbonylmethyl)amino-4-hydroxyphenoxy)ethan, das symmetrische Analoge der Verbindung I. Dies kann mit 2 Mol 3,6-bis(Dimethylamino)xanthon oder 3,6-di(Benzyloxy)xanthon verknüpft und anschließend entschützt werden, in Analogie zu den Herstellungen von Rhod-1 und Fluo-1, um Farbstoffe der Formel 2 mit W = OH zu ergeben.
Für Farbstoffe der Formel 2 mit W = H könnte 1,2-bis(2-Aminophenoxy)ethan, dessen Synthese in Veröffentlichung 19 erläutert ist, mit t-Butyl-bromacetat alkyliert werden, wie bei der Herstellung der Verbindung VI. Dieser Ester könnte bromiert und anschließend über eine Organolithium-Zwischenverbindung mit 3,6-disubstituierten Xanthonen verknüpft werden, genauso wie bei der Synthese von Rhod-2, Fluo-2 und Fluo-3, mit der Ausnahme, daß doppelte Mengen der anderen Reaktanten verwendet werden müssen, da jedes symmetrische Zwischenprodukt zwei reaktive Zentren anstelle von einem aufweist.
Die Synthese von Verbindungen, in denen E¹ und/oder E² sich von H unterscheiden, kann durchgeführt werden, indem man die Verbindungen 4A-4G verwendet (vgl. den Abschnitt für die Synthese der Verbindungen dieser Beschreibung). Ein jedes dieser Diamine kann mit t-Butylbromacetat alkyliert, bromiert und an 3,6-disubstituierte Xanthone gekoppelt werden, immer in genauer Analogie zu den Synthesen von Rhod-2, Fluo-2 oder Fluo-3, wobei sich Farbstoffe der Formel 1 ergeben, in denen E¹ und E² sich von H unterscheiden. Auch hier lassen sich die symmetrischen Derivate der Formel 2 leicht herstellen, und zwar unter Verwendung von 1,2-Cyclohexandiolen oder 2,3-Butandiol oder 3,4-Tetrahydrofurandiol mit Natriumhydrid und mehr als zwei Mol 2-Fluornitrobenzol unter Bildung der symmetrischen Nitroether, gefolgt von einer Reduktion der Nitrogruppen, Alkylierung der Aminogruppen mit t-Butylbromacetat, Bromierung und Organolithium-Verknüpfung an 3,6-disubstituierte Xanthone, genauso wie es bereits beschrieben wurde.
Modifikationen an dem trizyklischen Chromophor in den Gruppen Q, Z und Y sind aus der Literatur bekannt und können aus den entsprechenden 9-Xanthonen, 9-Thioxanthonen, 9-Acridonen, 9-Anthronen, 9,10-Anthrachinonen und 9-Fluorenonen hergestellt werden.
Der augenfälligste Unterschied zwischen den vorliegenden Chelatoren und den früheren Ca²&spplus;-Tetracarboxylat-Chelatoren besteht in ihren Wellenlängen der Fluoreszenzexzitation und -emission. Die Ähnlichkeit der neuen Indikatoren mit Fluoreszeinen und Rhodaminen machen sie optisch verträglich mit fast jedem Fluorometer, Fluoreszenzmikroskop oder bereits für die Bestimmung der Immunofluoreszenz verwendeten Strömungszytometern. Die Fluoreszeinanaloga Fluo-1, -2 und -3 können durch Beleuchtung mittels Glühlampen oder der wichtigen 488 nm-Linie eines Argon-Ionenlasers angeregt werden. Die Rhodaminanaloga Rhod-1 und Rhod-2 sind für die Beleuchtung mittels Glühlampen, der 533 nm-Linie einen Krypton-Ionenlasers oder der 546 nm-Linie eines Quecksilberbogens geeignet. Demgegenüber werden die früheren Farbstoffe Quin-2 und Fura-2 am besten bei 340-350 oder 380-390 nm von einer Xenonlampe angeregt. Indo-1 arbeitet am besten mit 350-360 nm von einem Xenonbogen oder den niedrigenergetischen UV-Linien von Argon- oder Kryptonlasern. Optische Elemente für diese UV-Wellenlängen sind vorzugsweise reflektierend oder werden aus Glas, Gläsern mit einer verbesserten UV-Durchlässigkeit oder sehr dünnem herkömmlichen Glas hergestellt. Kunststoffe oder dicke (> 1 mm) Elemente aus herkömmlichen Glas ergeben im allgemeinen zu viel Absorption oder Autofluoreszenz oder beides. Demgegenüber sind selbst diese billigen optischen Materialien mit einer Blau- oder Grünexzitation verträglich. Sichtbare Wellenlängen machen die Strahlenausrichtung leichter, erregen weniger leicht eine signifikante Gewebeautofluoreszenz oder beschädigen Zellen, und sie photolysieren nicht "eingesperrte" Nucleotide oder "eingesperrtes" Kalzium. Die neuen Farbstoffe können daher (die Ergebnisse sind hier nicht gezeigt) den (Ca²&spplus;)-Anstieg kalibrieren, der bei der UV-Photolyse von Nitr-5 oder Nitr-7 gebildet wird, während mit Fura-2 die Anregungswellenlängen begannen, das "eingesperrte" Kalzium zu photolysieren, und empfindlich gegenüber innerer Filterung waren, und zwar infolge der hohen UV-Absorption der Endprodukte der Photolyse.
Während Fura-2 und Indo-1 eindeutig viel stärker fluoreszieren als Quin-2 und Messungen mit wesentlich weniger zugesetztem Farbstoff und Ca²&spplus;-Puffer ermöglichen, ist der Vergleich der
Helligkeit der neuen Farbstoffe mit derjenigen von Fura-2 und Indo-1 komplizierter, und zwar wegen der unterschiedlichen Arbeitswellenlängen. Das einfachste Maß für die intrinsische Helligkeit eines Fluorophors ist das Produkt der Quantenausbeute seiner Emission und dessen Extinktionskoeffizient bei der geeigneten Exzitationswellenlänge (vgl. Fig. 6). Gegenwärtig sind die Extinktionskoeffizienten lediglich für Fluo-3 bekannt, obwohl man die Werte für die anderen Indikatoren aus gereinigten Xanthen-Modellfarbstoffen schätzen kann (9-10 · 10&sup4;M&supmin;¹cm&supmin;¹). Für Fluo-3 liegt die Qantenausbeute · Extinktionskoeffizient im Bereich von 3 · 10³ bis 1,5 · 10&sup4;M&supmin;¹cm&supmin;¹ für Ca²&spplus;-Werte von 10&supmin;&sup7; M bis zur Sättigung, etwas niedriger als die entsprechenden Werte für Fura-2, angeregt bei 340 nm, 5 · 10³ bis 1,6 · 10&sup4;M&supmin;¹cm&supmin;¹ (vgl. Fig. 6). Es ist jedoch leichter, höhere Exzitationsintensitäten bei längeren Wellenlängen zu erzeugen, und die Autofluoreszenz liegt niedriger, so daß die tatsächlichen Konzentrationen an benötigtem Farbstoff zur Überwindung des Dunkelstroms und der Autofluoreszenz für die zwei Gruppen recht ähnlich ist. Andererseits stellt die relativ geringe Trennung zwischen den Exzitations- und den Emissionspeaks der neuen Farbstoffe höhere Anforderungen an Monochromatoren und Filter, um Streulicht auszuschließen.
Die Ca²&spplus;-Affinitäten der neuen Farbstoffe sind zwei- bis zehnfach niedriger als diejenigen ihrer UV-angeregten Vorläufer. Diese Abnahme verbessert die Auflösung von mikromolaren und höheren Spiegeln von (Ca²&spplus;)i überraschenderweise ohne Preisgabe der Auflösung von niedrigen (Ca²&spplus;)i-Werten, bei denen die großen Veränderungen der Fluoreszenz bei der Bindung von Ca²&spplus; für die Abnahme des prozentual gebundenen verantwortlich ist. Somit ergeben bei Fluo-3 lediglich 11 nM (Ca²&spplus;) die doppelte Fluoreszenz bei null (Ca²&spplus;), und zwar infolge einer 2,5%-igen Konversion zu einem Ca²&spplus;-Komplex, der 40mal heller als der freie Farbstoff ist. Fig. 6, in der Kurven der normalisierten Intensität gegen log (Ca²&spplus;) für Fluo-3, Rhod-2, Quin-2, Fura-2 und Indo-1 verglichen werden, zeigt deutlich die Fähigkeit von Fluo-3 zur empfindlichen Reaktion auf sowohl niedrige als auch hohe (Ca²&spplus;)-Werte.
Das enttäuschendste Merkmal der neuen Farbstoffe ist der geringe oder vernachlässigbare Shift zu Absorptions-, Exzitations- oder Emissionswellenlängen bei Ca²&spplus;-Bindung. Wir hatten gehofft, daß die Ca²&spplus;-Bindung einen bathochromen Shift durch die Wegnahme der Elektronendichte verursachen würde, welche zuvor in Konjugation mit der 9-Position des Xanthenchromophors stand. Zahlreiche Di- und Triphenylmethan-Farbstoffe und überbrückte heterozyklische Analoga sind dafür bekannt, daß sie blaue bzw. rote Shifts bei der Elektronenlieferung und dem -entzug von den entsprechenden Positionen in ihren Chromophoren aufweisen (vgl. Veröffentlichung 19). Ein offensichtlicher Weg zur Begründung des fehlenden Shifts bei den vorliegenden Farbstoffen liegt darin, daß eine erhebliche sterische Hinderung zwischen dem starr planaren Xanthenchromophor und dem Benzolring von BAPTA vorliegt. Wenn die zwei Systeme aus der gemeinsamen Ebene verdreht werden, wird die Ca²&spplus;-Bindung und die Immobilisierung des einsamen Paars an der Aminogruppe von dem Xanthen isoliert. Wir wissen nicht, warum die Ca²&spplus;-Bindung die Quantenausbeute so dramatisch beeinflußt. Wenn die Aminogruppe frei ist, schließt der angeregte Zustand leicht einen erheblichen Anteil einer Resonanzform mit stärkeren Bindungsanteilen vom Aminstickstoff zum Benzolring und von diesem zu dem Xanthen ein. Ein derartiger Doppelbindungscharakter erfordert eine Koplanarität, die mit der sterischen Hinderung kollidiert und zu einer strahlungslosen Deaktivierung führt.
Da Ca²&spplus; die Wellenlängen der neuen Farbstoffe kaum verschiebt, gibt es keine Wellenlängenpaare, weder bei der Exzitation noch bei der Emission, die für eine Verhältnisbildung bei der Fluoreszenz geeignet sind. Die Quotientenbildung ist außerordentlich wertvoll bei einzelnen Zellen, weil sie Schwankungen der Farbstoffkonzentration und der Weglänge aufhebt. Ohne Quotientenbildung kann man nicht die Intensität in Ca²&spplus;-Spiegel umwandeln, ohne daß die Farbkonzentration, die Weglänge und die Instrumentenempfindlichkeit entweder l) genau bekannt sind oder 2) konstant gehalten werden können, während der Farbstoff gegen bekannte (Ca²&spplus;)-Werte titriert wird. Die erste Bedingung läßt sich im extrazellulären Medium in einer Küvette leicht erreichen oder mit einer etwas größeren Schwierigkeit bei Zellen, die intern mit bekannten Farbstoffkonzentrationen perfundiert und deren Dimensionen mikroskopisch gemessen werden können. Die zweite Option kann bei Suspensionen von disaggregierten Zellen erreicht werden, indem man die Zellen lysiert und den Überstand titriert. Die alternative Verwendung eines Ca-Ionophors zum Vergrößern von (Ca²&spplus;)i in nicht perfundierten einzelnen Zellen ist wahrscheinlich mit den neuen Farbstoffen schwieriger als mit Fura-2 oder Indo-1. Wenn man sich jedoch mit lediglich einem qualitativen, nicht-kalibrierten Index von (Ca²&spplus;)i-Veränderungen zufrieden gibt, sind die neuen Farbstoffe hochempfindlich (vgl. Fig. 6), und zwar ohne die Kompliziertheit wechselnder Wellenlängen.
Für die meisten Anwendungen ist Fluo-3 im allgemeinen gegenüber Fluo-1 und Fluo-2 zu bevorzugen, und zwar infolge seiner geringeren Empfindlichkeit gegenüber dem pH und seiner ausgeprägteren Fluoreszenzverstärkung bei der Bindung von Ca²&spplus;.
Es wird angenommen, daß ohne weitere Erläuterungen der Fachmann unter Hinzuziehung der vorliegenden Beschreibung die Erfindung vollständig umsetzen kann. Der folgende Versuchsabschnitt und die Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Herstellung und des Einsatzes der neuen Farbstoffe der Erfindung. Sie sind lediglich zu Zwecken der Erläuterung wiedergegeben und sollten nicht im Sinne einer Einschränkung der am Schluß aufgeführten Patentansprüche verstanden werden.

Experimentelle Methoden

Beispiele für die Synthesewege, die zur Herstellung der neuen Farbstoffe der Erfindung eingesetzt werden können, werden in den Fig. 2 und 3 wiedergegeben. Vollständige Beschreibungen der Reaktionsbedingungen werden im folgenden im Abschnitt mit dem Titel "Synthese der Verbindungen" beschrieben. Die optischen Spektren wurden wie von Grynkiewicz et al. (1985) beschrieben gemessen (vgl. Veröffentlichung 9). Quantenausbeuten der Fluoreszenz wurden erhalten (vgl. Veröffentlichung 10), indem das Integral des korrigierten Emissionsspektrums der Versuchsprobe mit demjenigen einer Lösung von Rhodamin B in Ethanol verglichen wurde, wobei die Quantenausbeute mit 0,97 angesetzt wurde (vgl. Veröffentlichung 11) oder mit Fluoreszein in 0,1 M NaOH, Quantenausbeute 0,91 (vgl. Veröffentlichung 10). Die Konzentration des Vergleichsfarbstoffes wurde eingestellt, um die Absorption der Testprobe bei der Exzitationswellenlänge anzupassen.
Zur Bestimmung der Ca²&spplus;-Dissoziationskonstanten bei pH 7,0- 7,5 wurden (Ca²&spplus;)-Spiegel durch Ca²&spplus;/EGTA-, Ca²&spplus;/HEEDTA- und Ca²&spplus;/NTA-Puffer kontrolliert (vgl. Veröffentlichung 12). Die scheinbaren Dissoziationskonstanten für den Ca²&spplus;/EGTA-Komplex wurden bei 327 nM, pH 7,03 in 100 mM KCl, 20ºC, gemessen. Die Logarithmen der scheinbaren Dissoziationskonstanten für den Ca²&spplus;/HEEDTA- und Ca²&spplus;/NTA-Komplex wurden als 1,70 - pH bzw. 3,41 - pH bei Umgebungstemperatur in 0,1 M KCl berechnet. Um die pH-Abhängigkeit der scheinbaren Ca²&spplus;-Dissoziationskonstante von Fluo-3 (vgl. Fig. 4) zu testen, war es erforderlich, den pH von 5,6 auf 8 zu verändern, während das freie Ca²&spplus; konstant gehalten wird. EGTA, HEEDTA und NTA sind zu pH-abhängig, um diesen pH-Bereich abzudecken, so daß statt dessen Dibrom-BAPTA (Chelator 2c der Veröffentlichung 13) verwendet wurde. Da der höchste pKa des Chelators 5,6 ist, ist die effektive Ca²&spplus; -Affinität nur geringfügig pH-abhängig bei pH 5,6 und darüber. Um bezüglich dieser geringen Abhängigkeit zu kompensieren, begann die pH-Titration bei pH 5,6 mit der geeigneten Menge von Ca²&spplus; in dem Puffer. Anschließend erfolgte bei jedem höheren pH eine geeignete geringe Zugabe von CaCl&sub2;, um die Zunahme der wirksamen Ca²&spplus; -Affinität des Dibrom-BAPTA zu kompensieren.
Freies (Mg²&spplus;) wurde durch Mg²&spplus;/EGTA-Puffer kontrolliert, wobei eine scheinbare Dissoziationskonstante für den Mg²&spplus;/EGTA-Komplex (einschließlich seiner monoprotonierten Form) von 6 mM bei pH 7,60, 0,12 M Ionenstärke, 20ºC, angenommen wurde, wie aus den Daten von Martell & Smith berechnet (vgl. Veröffentlichung 12).

Organische Synthesen

Bei der Herstellung der hier erläuterten Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden zwei Schlüssel-Zwischenprodukte und zwei getrennte Wege für die Synthese dieser neuen Verbindungen verwendet. Der erste Weg (vgl. Fig. 2) beruht auf der Verbindung I, einem BAPTA-Derivat mit einer zusätzlichen Hydroxylgruppe meta zu der tertiären Aminogruppe an einem Ring, hergestellt durch Debenzylierung der Verbindung XXIV von Grynkiewicz et al. (vgl. Veröffentlichung 2). Das zusätzliche phenolische -OH aktivierte den Ring in ausreichender Weise, um die elektrophile Substitution durch ein 9-Xanthon (II oder IV), seinerseits aktiviert (vgl. Veröffentlichung 14) durch (COCl)&sub2; oder PCl&sub3;, zu gestatten. 3, 6-Dimethylaminoxanthon (II), hergestellt gemäß Veröffentlichung 15, gab nach der Verseifung ein Rhodaminanalogon, Rhod-1, während 3,6- Dihydroxyxanthon (vgl. Veröffentlichung 16) mit als Benzylether (IV) geschützten Hydroxygruppen ein Fluoreszeinanalogon, Fluo-1, ergab. Versuche zur Kopplung von Xanthonen mit BAPTA, dem das zusätzliche phenolische -OH fehlte, verliefen ergebnislos. Der zweite Weg (vgl. Fig. 3) wurde daher so entworfen, daß er eine Alternative und eine stärkere Form der Aktivierung des BAPTA-Kerns über ein Organolithium-Zwischenprodukt ergab. Obwohl Organolithiumreagentien normalerweise fast alle geschützten Formen von Carboxylaten angreifen, fanden wir in Übereinstimmung mit Parham (Veröffentlichung 17), daß t- Butylester unterhalb von -150ºC widerstandsfähig genug sind, um einen Lithium-Brom-Austausch zu ermöglichen. Die Lithiation erforderte 6 Äquivalente von tertiärem Butyllithium (t-BuLi), um vollständig abzulaufen, wobei vier vermutlich verwendet wurden, um die vier Estercarbonyle zu enolisieren, eines wurde zum Ersatz des an den Arylring gehenden Lithiums benötigt und eines zur Zerstörung des gebildeten t-Butylbromids. Einmal gebildet, wurde das p-Lithio-BAPTA (VIII) in situ mit 3,6-bis(Dimethylamino)xanthon (II) unter Bildung von Rhod-2 behandelt, oder mit 3,6-Dihydroxyxanthon (X, geschützt mit t-Butyldimethylsilylgruppen), wobei das Fluoreszeinanalogon Fluo-2 erhalten wurde, oder mit 2,7-Dichlor-3,6-dihydroxyxanthon (vgl. Veröffentlichung 18) (XII, ebenso geschützt) unter Bildung von Fluo-3. Die freien Farbstoffe wurden erhalten, indem man die Schutzgruppen mit Bortrifluorid in Essigsäure entfernte.

Synthese der Verbindungen

Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde an vorher beschichtetem Silicagel (60F-254, E. Merck) oder an Umkehrphasenplatten (RP-18 F-254s, E. Merck) durchgeführt. Für die Säulenchromatographie wurde Silicagel 60 (230-400 mesh, E. Merck) verwendet. Die Zentrifugalchromatographie wurde an 1 mm Silicagelschichten in einem "Chromatotron" durchgeführt (Harrison Research, Palo Alto, CA).
Proton-NMR-Spektren wurden auf einem Varian EM-390 bei 90 MHz, UCB 200 MHz, und Bruker AM500 MHz Spektrometern aufgezeichnet. Peaks werden weiter unten in dem folgenden Format beschrieben: NMR (Lösemittel, Arbeitsfrequenz): chemischer Shift delta in ppm von Tetramethylsilan, Multiplizität (s = Singlett, d = Doublett, dd = Doublett von Doubletten, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett, br = breit, Spin-Spin-Kopplungskonstante, falls zutreffend, integrierte Anzahl von Protonen; manchmal sind verschiedene benachbarte Peaks zu nahe, als daß ihr Integral getrennt werden könnte, wobei lediglich das Gesamtintegral für einen Cluster angegeben wird.

Verbindungen

Verbindung I.

1-(2-bis(Ethoxycarbonylmethyl)amino-4-benzyloxyphenoxy)-2-(2- bis(ethoxy-carbonylmethyl)amino-5-methylphenoxy)ethan, Verbindung XXIV von Grynkiewicz et al. (vgl. Veröffentlichung 2), 1 g, wurde in Essigsäure (15 ml) gelöst und bei athmosphärischem Druck mit 5% Palladium auf Aktivkohle hydriert. Nach vollständiger Aufnahme von Wasserstoff (erforderlich über Nacht) wurde der Katalysator abfiltriert, und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Die Durcharbeitung des Produkts mit Toluol ergab einen cremefarbenen Feststoff in nahezu quantitativer Ausbeute. Smp. 82-84º. NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz) delta 1,10, t, 12 H; 2,20, s, 3 H; 4,00, s + q, 16 H; 4,85, s, 4 H; 6,45, s, 1 H; 6,60, dd, 3 H; 7,30, m, 3 H.

Verbindung I + II → III.

Das Phenol VI (120 mg, 0,2 mmol) wurde in trockenem Chloroform gelöst (2 ml). 3,6-Dimethylaminoxanthon, hergestellt gemäß Ehrlich und Benda (vgl. Veröffentlichung 15) (60 mg, 0,21 mmol), umgewandelt in das Chlorcarboniumion durch Rühren mit Oxalylchlorid (vgl. Veröffentlichung 14), wurde in trockenem Chloroform zugesetzt. Nach dem Rühren bei Umgebungstemperatur über Nacht wurde das Reaktionsgemisch mit mehr Chloroform verdünnt und mit Natriumbicarbonat gewaschen sowie anschließend getrocknet, wobei ein rosa/purpurfarbenes Gummi erhalten wurde. Dieser Rückstand wurde chromatographisch an Silicagel gereinigt, wobei man einen rosa/purpurfarbenen Feststoff erhielt (56 mg, 32%). NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz) delta 1,20, t, 12 H; 2,05, s, 3 H; 3,15, s, 12 H; 4,00-4,30, 2s + q, 20 H; 6,25, s, br, 1 H; 6,50-6,80, m, 8 H; 7,20, d, 12 Hz, 1 H; 7,60, d, 12 Hz, 1 H.

Verbindung III → Rhod-1.

Der Ester XIV (4 mg) wurde in Methanol (500 Mikroliter) gelöst. Dioxan (200 Mikroliter) und wäßriges KOH (1 M) (200 Mikroliter) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur gerührt und durch Dünnschichtchromatographie überwacht, bis der gesamte Ester hydrolysiert war. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend zur Trockene eingedampft und erneut in Wasser gelöst. Das Ansäuern auf pH 2 ergab einen dunkel-purpurfarbenen Feststoff (Rhod-1).

Verbindung I + IV → V → Fluo-1.

Das Phenol I (40 mg, 0,06 mmol) und 3,6-Di(benzyloxy)xanthon (IV, hergestellt durch Benzylierung von 3,6-Dihydroxy-9- xanthon (vgl. Veröffentlichung 16)) wurden in POCl&sub3; gelöst und auf 100ºC zwei Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch, das V enthielt, wurde im Vakuum eingedampft, in Essigsäure aufgenommen und mit ein wenig Ameisensäure versetzt. Das Gemisch wurde unter Rückfluß über Nacht erhitzt, um die Schutzgruppen zu entfernen, und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in basischen Puffer aufgenommen und dreimal mit Ethylacetat gewaschen. Das Ansäuern mit Salzsäure auf pH 2 ergab Fluo-1 als rötlich-braunen Feststoff.

Verbindung VI.

1-(2-Aminophenoxy)-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethan, Verbindung V von Grynkiewicz et al. (vgl. Veröffentlichung 2) (1,032 g, 4 mmol), 1,8-bis(Dimethylamino)naphthalin (4,4 g, 20 mmol), wasserfreies Natriumjodid (200 mg, 1,2 mmol), tert-Butylbromacetat (4,680 g, 24 mmol) und Acetonitril (10 ml) wurden unter Rückfluß 18 Stunden erhitzt. Das abgekühlte Gemisch wurde mit Toluol verdünnt und filtriert. Das Filtrat wurde mit Phosphatpuffer bei pH 2 extrahiert, bis das 1,8-bis(Dimethylamino)naphthalin entfernt war. Der Rückstand ergab nach der Umkristallisation aus Ethanol weiße Nadeln (2,4 g, 86% Ausbeute). Smp. 118-119, 5º. NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz) delta 1,40, s, 36 H; 2,25, s, 3 H; 4,00, s, 4 H, 4,05, s, 4 H; 4,30, s, 4 H; 6,85, m, 3 H; 6,90, s, 4 H.

Verbindung VI → VII.

Der Ester VI (2,16 g, 3 mmol) wurde in 30 ml Dichlormethan gelöst und auf -78º gekühlt. Pyridin (355 mg, 4,5 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde mit Brom (572 mg, 3,6 mmol) in Dichlormethan (5 ml) versetzt. Man ließ das Gemisch auf Umgebungstemperatur erwärmen und verdampfte es anschließend im Vakuum. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgenommen, mit Natriumbicarbonat und anschließend mit Natronlauge gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet, und der Rückstand wurde mit Ethanol kristallisiert. (2,01 g, 83%). Smp. 129-131ºC. NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz) delta 1,42, s, 36 H; 2,25, s, 3 H; 4,00, s. 8 H; 4,35, s, 4 H; 6,75, d + m, 3 H; 6,85-7,05 (s + m), 3 H.

Verbindung VII → VIII; VIII + II → IX.

Das Bromid VII (80 mg, 0,1 mmol) wurde in 2-Methyl-tetrahydrofuran (2 ml) gelöst und bei -150ºC in einem Flüssigstickstoff/Isopentan-Bad gerührt. Tertiäres Buthyllithium (6 Äquivalente) in Hexan (1,7 M, Aldrich Chemical Co.) wurde zugesetzt, und die Metallierung wurde durch Dünnschichtchromatographie von kleinen, in Wasser gequenchten Proben verfolgt. Als die Metallierung vollständig war, zeigten die Proben lediglich den dehalogenierten Ester VI anstelle der Bromverbindung VII. 3,6 bis(Dimethylamino)xanth-9-on (II), (43 mg, 0,15 mmol) (vgl. Veröffentlichung 15), gelöst in Tetrahydrofuran, wurde tropfenweise in das Reaktionsgemisch gegeben. Das Rühren wurde weitere 30 Minuten fortgesetzt; man ließ die Badtemperatur nicht über -130ºC ansteigen. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser in Tetrahydrofuran gequencht, und man ließ anschließend bis auf Umgebungstemperatur erwärmen. Es wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde anschließend mit Essigsäure gerührt, um sämtliche Leukobase in den Farbstoff zu überführen. Das Eindampfen der Essigsäure im Vakuum ließ einen gummiartigen Rückstand zurück, der durch Säulenchromatographie an Silicagel (25 mg, 25% Ausbeute) gereinigt wurde. NMR (CDCl&sub3;, 500 MHz): delta 1,38, s, 18 H; 1,50, s, 18 H; 2,30, s, 3 H; 3,35, s, 12 H; 3,90, s, 4 H; 4,20, s, 4 H; 4,40, s, 4 H, 6,70-6,90, m, 9 H; 7,55, d, 1 H; 8,15, d, 1 H.

Verbindung IX → Rhod-2.

Der Ester IX (4 mg) wurde in Essigsäure (500 Mikroliter) gelöst und mit BF&sub3;-Etherat (50 Mikroliter) versetzt. Die erhaltene Lösung wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde anschließend im Vakuum bei 35ºC eingedampft und anschließend mit Puffer basisch gemacht. Die basische Lösung wurde dreimal mit Ethylacetat gewaschen und dann mit Salzsäure auf pH 2 angesäuert, wobei Rhod-2 als dunkel-purpurfarbener Feststoff erhalten wurde.

Verbindung X.

3,6-Dihydroxyxanth-9-on (vgl. Veröffentlichung 16), 115 mg, 0,5 mmol, wurde in trockenem Dimethylformamid gelöst. Imidazol (340 mg, 5 mmol) und t-Butylmethylchlorsilan (450 mg, 3 mmol) wurden zugesetzt. Nach dem Rühren bei Umgebungstemperatur für 2 Stunden wurde das Gemisch mit Toluol verdünnt, gründlich mit Wasser gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Eindampfen im Vakuum ergab einen weißen Feststoff, der aus Ethanol umkristallisiert wurde, wobei 185 mg (77%) von weißen Nadeln erhalten wurde, Smp. 151-154º. NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz): delta 0,20, s, 12 H; 0,090, s, 18 H; 6,80, m, 4 H; 8,15, d, 9 Hz, 2 H.

Verbindung VIII + X → XI.

Das Bromid VII (80 mg, 0,1 mmol) wurde in das Organolithium- Zwischenprodukt VIII umgewandelt und mit X, 3,6-bis(t-Butyldimethylsilyloxy)xanthon (100 mg, 0,20 mmol) umgesetzt, und zwar in Analogie zu der Herstellung von IX, die weiter oben beschrieben wurde. Der Ester XI wurde als rötlich-brauner Feststoff (45 mg, 48%) erhalten. NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz): delta 1,40, s, 18 H; 1,50, s, 18 H; 2,30, s, 3 H, 3,98, s, 4 H; 4,20, s, 4 H; 4,37, s, 4 H; 6,70, d + s, 2 H; 6,95, m, 9 H; 7,40, d, 1 H.

Verbindung XI → Fluo-2.

Die t-Butylgruppen in IX (5 mg) wurden mit BF&sub3;-Etherat in Essigsäure wie bei der obigen Herstellung von Rhod-2 entfernt, wobei man Fluo-2 als rötlich-braunen Feststoff erhielt.

Verbindung XII.

2,7-Dichlor-3,6-dihydroxyxanth-9-on (450 mg, 1,5 mmol), erhalten gemäß Kurduker und Subba Rao (vgl. Veröffentlichung 18) wurde mit Imidazol (1,02 g, 15 mmol) und t-Butyldimethylchlorsilan (1,35 g, 9 mmol) in Dimethylformamid derivatisiert, wie für X weiter oben beschrieben. Der bis(t-Butyldimethylsilyl)ether XIII wurde aus Ethanol umkristallisiert, wobei man 660 mg (78%) weiße Nadeln erhielt, Smp. 161-164º. NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz) delta 0,15, s, 12 H; 0,95, s, 18 H; 6,20, s, 2 H; 7,35, s, 2 H.

Verbindung VIII + XII → XIII.

Das Bromid II (80 mg, 0,1 mmol) wurde in das Organolithiumderivatgemisch VIII umgewandelt, mit XII (90 mg, 0,17 mmol) umgesetzt und wie bei der Herstellung für IX beschrieben aufgearbeitet. XIII wurde als roter Feststoff erhalten (55 mg, 55% Ausbeute). Es wurde durch Zentrifugalchromatographie weiter gereinigt, und zwar in Silicagel, eluiert mit Hexan- Ethylacetat-Essigsäure 50 : 50 : 1 (v/v), gefolgt von einer Kristallisation aus Diisopropylether. Smp. 188-192º unter Zersetzung. NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) delta 1,40, s, 18 H; 1,50, s, 18 H; 2,30, s, 3 H; 3,85, s, 4 H; 4,05, s, 4 H; 4,42, s, 4 H; 7,35, s, 1 H; 6,75-7,20, m, 9 H. Das sichtbare Spektrum in Ethanollösung, enthaltend eine Spur von Triethylamin, zeigte einen Hauptpeak bei 520 nm (Extinktionskoeffizient = 1,02 · 10&sup5; M&supmin;¹cm&supmin;¹) mit einer Schulter bei 486 nm (Extinktionskoeffizient = 2,91 · 10&sup4;).

Verbindung XIII → Fluo-3.

Die t-Butylgruppen im Ester XIII (2 mg) wurden mit BF&sub3;-Etherat in Essigsäure wie bereits für Rhod-2 beschrieben entfernt. Fluo-3 wurde als rötlich-brauner Feststoff erhalten. Für die Bestimmung des Extinktionskoeffizienten basierte die Anzahl von Mikromolen des Farbstoffs auf dem Gewicht des Ausgangsesters XIII und nicht auf dem der freien Säure, welche einige inerte Reste der Deesterifizierungsreagentien enthielt.

Andere Verbindungen

In dem folgenden Abschnitt wird die Synthese von zusätzlichen Verbindungen erläutert, die bei der Herstellung der neuen Fluoreszenzfarbstoffe der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.

Verbindung 1A.

2A (5,86 g, 25 mmol), gelöst in trockenem THF (25 ml) bei -10ºC, wurde tropfenweise unter Rühren zu einer Lösung von Lithium-trisiamylborhydrid (Reagens 6) (30 mmol) in THF (30 ml) bei -78ºC unter einer N&sub2; -Atmosphäre gegeben. Nach 2 h ließ man das rote Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur (1 h) erwärmen, quenchte mit H&sub2;O (4 ml) und EtOH (15 ml), machte mit wäßrigem KOH alkalisch (6 ml, 10 M) und oxidierte durch vorsichtige Zugabe von 30% wäßrigem H&sub2;O&sub2; (15 ml) unter Kühlung. Nach dem Sättigen mit K&sub2;CO&sub3; wurde die wäßrige Schicht abgetrennt und mit Et&sub2;O:THF gewaschen (1 : 1, 2 · 10 ml). Die kombinierten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO&sub4;), zur Trockene eingedampft, und das Produkt wurde Kolben-zu-Kolben bei 180-200ºC bei 0,1 mm Hg destilliert, wobei man 1a als orangefarbenes Öl erhielt (4,55 g, 77%).
¹H NMR delta 1,9 (br m, 6 H, -(CH&sub2;)&sub3;-) 2,40 (s, 3 H, CH&sub3;) 3,05 (br s, 1H, OH), 4,20, 4,66 (2 m, 2 H, CH) 6,82 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-4), 6,90 (s, 1 H, H-6) 7,76 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-3).

Verbindung 1B.

Trans-2'(5-Methyl-2-nitrophenoxy)cyclopentanol wurde wie folgt hergestellt. Cyclopentenoxid (Reagens 2) (8,73 ml, 0,1 mol), 5-Methyl-2-nitrophenol (15,3 g, 0,1 mol) (Reagens 1) und Kalium-5-methyl-2-nitrophenoxid (1,91 g, 0,01 mol) wurden in trockenem DMF (5 ml) gelöst und 20 h unter Argon am Rückfluß erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde mit wäßriger NaOH-Lösung verdünnt (100 ml, 1 M) und mit Toluol extrahiert (drei 50 ml Portionen). Die kombinierten Extrakte wurden mit H&sub2;O gewaschen (3 · 50 ml), getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), das Toluol wurde durch Verdampfen entfernt und das Produkt (Verbindung 1B) wurde gesammelt, wobei man 17,0 g (72%) eines orangefarbenen Öls erhielt, welches beim Abkühlen kristallisierte. Smp. 42-44º.
¹H NMR delta 1,9 (br m, 6 H, Cyclopentyl-CH&sub2;-), 2,40 (s, 3 H, CH&sub3;), 4,40 (br m, 1 H, ) 4,65 (m, 1 H, ) 6,80 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-64) 6,93 (s, 1 H, H-6) 7,67 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-3).
TLC in einem System, das cis und die trans-Isomere 1A und 1B trennte, zeigte eine vollständige Umwandlung in das cis-Isomer.

Verbindung 1C.

In Analogie zu der obigen Herstellung von 1A wurde 2C zu 1C, einem dunkel-orangefarbenen Öl, reduziert (54% Ausbeute) nach der Chromatographie an SiO&sub2; in Ethylacetat-Hexan.
¹H NMR delta 1,68 (br m's, 8 H, -(CH&sub2;)&sub4;-), 2,40 (s, 3 H, CH&sub3;), 2,70 (br d, 1 H, OH), 3,83 (br m, 1 H, CH-), 4,53 (m, 1H, CH-OAr), 6,80 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-4), 6,90 (s, 1 H, H-6) 7,76 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-3).

Verbindung 1D.

Verbindung 1D wurde mittels des gleichen Verfahrens wie IB synthetisiert, jedoch unter Verwendung von Cyclohexenoxid (Reagens 3) anstelle von Cyclopentenoxid. Die Umkristallisation aus Hexan ergab gelbe Kristalle, Ausbeute 56%. Smp. 55-57º.
¹H NMR delta 1,50, 1,78, 2,1 (br m, 8 H, Cyclohexyl), 2,40 (s, 3 H, CH&sub3;), 3,30 (s, br, 1 H, OH), 3,73 (m, 1 H, -CH-OH), 4,05 (m, 1H, CH-OAr), 6,78 (d, 1 H, J = 8 z, H-4), 6,90 (s, 1 H, H-6) 7,67 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-3).

Verbindung 1E.

Verbindung 1E wurde mittels des gleichen Verfahrens wie 1B hergestellt, jedoch unter Verwendung von trans-2,3-Epoxybutan (Reagens 4) anstelle von Cyclopentenoxid. Das erhaltene Öl (16% Ausbeute an 1E) wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
¹H NMR delta 1,20, 1,30 (2d, 6 H, J = 5 Hz, ButylCH&sub3;) 2,40 (s, 3 H, Ar-CH&sub3;), 2,72 (s, 1 H, -OH), 4,00, 4,53 (2m, 2 H, J = 3 Hz, -CH-), 6,85 (d, 2 H, J = 8 Hz, H-4) 6,95 (s, 1 H, H-6) 7,80 (d, 2 H, J = 8 Hz, H-3).

Verbindung 1F.

Ähnlich zu der Herstellung der Verbindung 1G ergab die Zugabe von NaH (4 mmol) zu einer Lösung von (R,R)-(-)-2,3-Butandiol (Reagens 9) (5 mmol) und 2-Trifluornitrobenzol (Reagens 7) (4 mmol) in trockenem N-Methylpyrrolidinon (2 ml), Quenchen mit H&sub2;O nach 30 min, und Extraktion in Ethylacetat ein Gemisch der mono- und di-substituierten Produkte, die an SiO&sub2; unter Elution mit Ethylacetat-Hexan getrennt wurden, wobei man ein gelbes Öl, 1F (45%) bzw. einen weißen Feststoff (14%) erhielt.

Verbindung 1G.

Cis-3'-(2-Nitrophenoxy)tetrahydrofuran-4'-ol wurde wie folgt hergestellt. NaH (42 mg 57% Suspension in Öl, 1 mmol) wurde portionsweise unter Rühren zu einer Lösung von cis-Tetrahydrofuran-3,4-diol (Reagens 8) (0,21 g, 2 mmol) und 2-Fluornitrobenzol (Reagens 7) (105 Mikroliter, 1 mmol) in trockenem DMF (1 ml) gegeben. 30 Minuten nach der letzten Zugabe wurde das Reaktionsgemisch mit H&sub2;O (15 ml) verdünnt und auf Eis für mindestens 30 min abgekühlt. Der feste Niederschlag des diarylierten Nebenproduktes wurde abfiltriert, das Filtrat mit Toluol (3 · 5 ml) extrahiert und die kombinierten Extrakte getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) sowie zur Trockenen eingedampft, wobei man das Produkt (IG) als gelbes Öl erhielt, das beim Durcharbeiten mit Isopropylether kristallisierte, Ausbeute 111 mg. Smp. 59-61ºC. TLC (5% MeOH-CHCl&sub3;) zeigte weniger als 5% disubstituiertes Nebenprodukt. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
¹H NMR delta 3,13 (d, 1H, OH) 3,4-4,2 (m's, 4H, -CH&sub2;OCH&sub2;-), 4,45, 5,80 (2m, 2H, CH) 6,90-8,0 (m, 4H, aromatisch).

Verbindung 2A.

2'-( 5-Methyl-2-nitrophenoxyl)cyclopentanon wurde wie folgt hergestellt. Die Verbindung 1B (8,3g, 35 mmol), gelöst in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml), wurde in einer Portion zu einer gerührten Suspension von Pyridiniumchlorchromat (Reangens 5) (11,3g, 55 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (70 ml) gegeben und bei Umgebungstemperatur 16 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Et&sub2;O (350 ml) verdünnt und von dem dunklem Teer dekantiert, welcher mit Et&sub2;O (3 · 50 ml) gewaschen wurde. Die kombinierten Extrakte wurden durch Celite abfiltriert und zur Trockenen eingedampft, wobei man ein Öl erhielt, das kristallisierte. Die Umkristallisation aus MeOH ergab 2A als gelbe Kristalle (6,60g, 80%) Smp. 65-66º.
¹H NMR delta 2,10 (m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-, 2,33 (s, 3H, CH&sub3;), 4,63 (t, 1H, CH), 6,80 (d, 1H J=8Hz, H-4) 7,02 (s, 1H, H-6) 7,70 (d, 2H J=8Hz, H-3).

Verbindung 2C.

Die Oxidation des Cyclohexanolderivats 1D erforderte einen sechsfachen Überschuß an Pyridiniumchlorchromat und eine Reaktionszeit von 5 Tagen, wobei man die Verbindung 2C (88% Ausbeute) als gelben Feststoff, umkristallisiert aus Isopropylether, erhielt. Smp. 125-8º.
¹H NMR delta 1,6-2,6 (m's, 8H, -(CH&sub2;)&sub4;-) 2,33 (s, 3H, CH&sub3;) 4,63 (t, 1H, CH) 6,80 (d, 1H, J=8Hz H-4) 7,02 (s, 1H, H-6) 7,73 (d, 2H, J=8Hz, H-3).

Verbindung 3A.

Cis-1-(5'-Methyl-2'-nitrophenoxy)-2-(2''-nitrophenoxy)cyclopentan wurde wie folgt hergestellt. NaH (1,05g, 57% Ölsuspension, 25 mmol) wurde portionsweise unter Rühren und Kühlen zu einer Lösung von 1A (4,27g, 18 mmol) und 2-Fluornitrobenzol (Reagens 7) (2,11 ml, 20 mmol) in trockenem 1,2-Dimethoxyethan (25 ml) gegeben. Nach dein Stehen bei Umgebungstemperatur für 1 h wurde das Reaktionsgemisch mit H&sub2;O (100 ml) verdünnt und mit CHCl&sub3; extrahiert (3 · 50 ml); die Extrakte wurden getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei man das rohe Produkt 3A als Öl erhielt, das beim Abkühlen kristallisierte. Die Umkristallisation aus Acetonmethanol ergab gelbe Kristalle Smp. 109-111º, Ausbeute 4,8 g (74%).
¹H NMR delta 1,7-2,2 (m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-), 2,35 (s, 3H, CH&sub3;) 4,87 (m, 2H, CH), 6,7-7,8 (m's, 7H, aromatisch).

Verbindungen 3B, C, D und E.

Die Verbindungen 3B, 3C, 3D und 3E wurden aus den entsprechenden Alkoholen mittels des gleichen Verfahrens, das zur Synthese der Verbindung 1A verwendet wurde, synthetisiert. Die Ausbeute sowie die physikalischen und spektralen Eigenschaften waren wie folgt:
3B: Orangefarbenes Öl, destilliert Kolben-an-Kolben 230ºC bei 0,25 mm HG (63%)
¹H NMR delta 1,6-2,1 (m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-), 2,40 (s, 3H, CH&sub3;), 4,75 (m, 2H, CH), 6,8-7,8 (m, 7H, aromatisch).
3C: Braunes Öl (SiO&sub2;-Chromatographie, Ethylacetat-Hexan) Ausbeute 74%.
¹H NMR delta 1,3-2,2 (m's, 8H, -(CH&sub2;)&sub4;), 2,37 (s, 3H, CH&sub3;), 4,70 (br d, 2H, CH), 6,8-7,8 (m's, 7H aromatisch).
3D: Gelbe Kristalle, Smp. 86-90º (60%).
¹H NMR delta 1,3-2,2 (m's, 8H, -(CH&sub2;)&sub4;-), 2,40 (s, 3H, CH&sub3;) 4,63 (m, 2H, CH), 6,8-7,8 (m's, 7H, aromatisch).
3E: Fahlgelber Feststoff Smp. 86º (64%), gereinigt durch SiO&sub2;-Chromatographie.
¹H NMR delta 1,47 (d, 6H, J=6,5Hz, Ch&sub3;) 2,42 (s, 3H, Ar-CH&sub3;), 4,75 (q, d, 2H J=6,5, 3Hz, CH) 6,8-8,0 (m, 7H, aromatisch).

Verbindungen 3F und G.

Wie bei der Synthese der Verbindungen 3B, C, D und E, wurden die Verbindungen 3F und 3G ähnlich aus den Alkoholen 1F und 1G hergestellt, jedoch unter Ersatz von 3-Fluor-4-nitrotoluol (Reagens 19) durch 2-Fluornitrobenzol. 3F war ein orangefarbenes Öl, abgetrennt durch SiO&sub2;-Chromatographie (Ethylacetat-Hexan) Ausbeute 45%.
¹H NMR delta 1,33 (d, 6H, J=6,5Hz, CH&sub3;) 2,40 (s, 3H, Ar-CH&sub3;9 4,75 (m, 1H, CH) 6,7-7,8 (m's, 7H, aromatisch).
3G wurde als fahlgelber Niederschlag beim Quenchen des Reaktionsgemisches, gefolgt von einer Umkristallisation aus Ethanol, erhalten. Ausbeute 63%, Smp. 145-148º.
¹H NMR delta 2,37 (s, 3H, CH&sub3;), 4,21 (m, 4H, -CH&sub2;OCH&sub2;-), 5,07 (m, 2H, CH) 6,8-7,8 (m's, 7H, aromatisch).

Verbindung 4A.

Cis-1-(2-Aminophenoxy)-2-(2-amino-5-methylphenoxy)cyclopentan wurde wie folgt hergestellt. LA (2,0g, 5,58 mmol) wurde katalytisch bei Umgebungstemperatur und -druck mit 200 mg 5% Pd/C in Ethylacetat hydriert: 95% wäßrigem EtOH (2 : 1). Die Aufnahme war innerhalb 1h vollständig, und nach einer weiteren Stunde wurde das Reaktionsgemisch filtriert und zur Trockene eingedampft, wobei man das Produkt 4A als fahlgelbes Öl erhielt, das in der folgenden Umsetzung ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
¹H NMR delta 1,6-2,2 (br m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-) 2,18 (s, 3H, CH&sub3;) 3,67 (br s, 4H, NH&sub2;) 4,63 (m, 2H, CH) 6,4-6,8 (m, 7H, aromatisch).

Verbindungen 4B-G.

Ähnlich zu der Herstellung der Verbindung 4A wurden die Nitroether 3B-G über einem Pd/C-Katalysator in Ethylacetat oder Ethanol hydriert. Die Aminprodukte 4B-G waren gewöhnlich Öle, die sich in der Luft dunkel färbten, und ergaben die erwarteten NMR-Spektren; sie wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
Verbindung 4B ist: trans-1-(2-Aminophenoxy)-2-(2-amino-5- methylphenoxy)cyclopentan;
Verbindung 4C ist: cis-1-(2-Aminophenoxy)-2-(2-amino-5-methylphenoxy)cyclohexan;
Verbindung 4D ist: trans-1-(2-Aminophenoxy)-2-(2-amino-5- methylphenoxy)cyclohexan;
Verbindung 4E ist: cis-2-(2-Aminophenoxy)-3-(2-amino-5- methylphenoxy)butan;
Verbindung 4F ist: trans-2-(2-Aminophenoxy)-3-(2-amino-5- methylphenoxy)butan;
Verbindung 4G ist: cis-3-(2-Aminophenoxy)-4-(2-amino-5- methylphenoxy)tetrahydrofuran.

Beispiele

Beispiel 1:

Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften

Die Absorption und Fluoreszenzeigenschaften der neuen Indikatoren in Gegenwart und Abwesenheit von Ca²&spplus; sind in Tabelle I gezeigt. Die Absorptionsspektren waren ziemlich so, wie man sie bei Rhodamin oder Fluoreszein-Chromophoren erwartete, obwohl die Extinktionskoeffizienten (nicht gezeigt) bei den ursprünglich isolierten Farbstoffen häufig niedrig waren. Da Fluo-3 eine sehr nützliche Indikatorverbindung zu sein schien, wurde besondere Mühe für seine Reinigung aufgewendet. Schließlich wurden recht respektable Extinktionskoeffizienten erhalten, 7,9 · 10&sup4; und 8,3 · 10&sup4;M&supmin;¹cm&supmin;¹ bei 503 bzw. 506 nm für freies und Ca²&spplus;-gebundenes Fluo-3. Es wurde erwartet, daß die Ca²&spplus;-Bindung das Absorptionsmaximum auflängere Wellenlängen verschob, da sie verhindert, daß der BAPTA-Aminstickstoff Elektronendichte an die 9-Position des Xanthen abgibt. Es ist bekannt, daß ein Entzug und die Lieferung von Elektronen an das zentrale Kohlenstoffatom von Triphenylmethanfarbstoffen die Absorptionspeaks zu engeren bzw. kürzeren Wellenlängen verschiebt (vgl. Veröffentlichung 19). In der Tat verursacht die Ca²&spplus;-Bindung Rotverschiebungen, jedoch von sehr geringer Größe, 1-3 nm, und mit geringer Änderung der Peakhöhe. Alle untersuchten neuen Indikatorverbindungen zeigten eine Fluoreszenz, die qualitativ, wie erwartet, ähnlich zu Rhodaminen oder Fluoreszinen waren. Zum Beispiel zeigt Fig. 4 die Exzitations- und Emissionsspektren für Fluo-3 als Funktion von freiem (Ca²&spplus;) in EGTA-Puffern. Fluo-3 hat eine sichtbar rosafarbene Färbung, da sein Chloratom sein Spektrum zu Wellenlängen verschiebt, die leicht länger als die von Fluo-2 sind, ebenso wie 2,7-Dichlorfluoreszein bathochrom von Fluoreszein verschoben ist. Die Fluoreszenzintensitäten wurden durch Ca²&spplus;-Bindung sehr ausgeprägt verstärkt. So fluoresziert der Ca²&spplus;-Komplex von Fluo-3 35- bis 40mal heller als der Ca²&spplus;-freie Farbstoff (vgl. Fig. 4). Dieses Ausmaß der Verstärkung ist das größte, das bisher für einen fluoreszierenden Ca²&spplus;-Indikator beschrieben wurde. Die Ca²&spplus;-Bindung verursacht jedoch eine geringere Veränderung in den Wellenlängen der Peakexzitation oder -emission, so daß diese Farbstoffe keine nützliche Veränderung in dem Exzitations- oder Emissionsverhältnis ergaben. Selbst bei Ca²&spplus;-Bindung waren auch die Quantenausbeuten der Fluoreszenz erheblich geringer als diejenigen von echten Rhodaminen oder Fluoreszeinen in Wasser (bis zu 0,9), obwohl vergleichbar mit denjenigen von Modellverbindungen wie 9-Phenylfluoron, Quantenausbeute 0,21 (vgl. Verbindung 20), das in ähnlicher Weise keine zusätzliche Phthaleincarboxylgruppe enthält.
Fluo-3 wurde kurz bezüglich seiner photochemischen Stabilität untersucht. In den luftgesättigten Lösungen, beleuchtet mit einem Xenonbogen, lediglich gefiltert durch Glaslinsen, bleichte Ca²&spplus;-freies Fluo-3 mit etwa der gleichen Geschwindigkeit wie ein übliches Fluoreszeinanion aus, wogegen der Ca²&spplus;-Komplex nur halb so schnell ausbleichte. Da die biologische Verwendbarkeit von Fluoreszein gut dokumentiert ist, scheint die photochemische Widerstandsfähigkeit von Fluo-3 hinreichend, wenn nicht sogar außerordentlich gut zu sein.

Beispiel 2

Ca²&spplus;-Bindungskonstanten:

Die Ca²&spplus;-Dissoziationskonstanten für sämtliche neuen Chelatoren, die bisher getestet wurden (vgl. Tabelle I), liegen in der Größenordnung von 370 nM - 2,3 microM bei Ionenstärken von 0,1-0,15. Diese Werte sind signifikant höher als diejenigen für die Elterverbindungen BAPTA (110 nM, vgl. Veröffentlichung 13) und sein p-Methylderivat "benz4"² (79 nM), was anzeigt, daß die Xanthenchromophore etwas elektronenabziehend sind. Die positiv geladenen Rhodamine sind deutlich niedriger in ihrer Affinität als die negativ geladenen Fluoreszeine, was erwartet wurde. Eine Hydroxygruppe von dem BAPTA-aromatischen Ring, wie in Rhod-1 und Fluo-1, senkt auch die Ca²&spplus;-Affinität mehr als zweimal im Vergleich zu dem umsubstituierten Rhod-2 und Fluo-2 ab, vermutlich, weil eine Hydroxygruppe induktiv elektronenentziehend ist, wenn sie meta zu dem Reaktionszentrum, dem Aminstickstoff, ist. Die in Fluo-3 zugefügten Chloratome haben eine sehr geringe Wirkung, da sie zu weit von dem Chelatierungsort sind.

Beispiel 3

Kationselektivität:

Die Fluoreszeine Fluo-1 und Fluo-2 zeigten wie erwartet etwas pH-Abhängigkeit infolge der Fähigkeit des phenolischen Hydroxyls an dem Xanthenchromophor zur Aufnahme eines Protons. Zum Beispiel wurde die Fluoreszenz von Fluo-2 fast vollständig gequencht, wenn der pH von pH 7,7 auf 4,1 in Abwesenheit von Ca²&spplus; titriert wurde. Die Titrationskurve paßte zu einem pKa von 6,20 ± ,02 und einem Verhältnis von 67 zwischen der Fluorszenzhelligkeit der deprotonierten und der protonierten Vertreter. Da die Protonierung die Fluoreszenz quencht, ist dieser pKa wahrscheinlich auf dem Fluoreszeinchromophor und nicht auf der Chelator-Aminogruppe. Die Protonierung der letzteren sollte wie Ca²&spplus; wirken und die Fluoreszenz verstärken. Ein pKa von 6,2 ist normalerweise recht sicher entfernt von typischen Cytosol-pH-Werten, da die Protonierung jedoch einen ausgeprägten Effekt auf die Fluoreszenz hat und in spektraler Hinsicht nicht zu unterscheiden von einem Absinken in [Ca²&spplus;] ist, ist Fluo-2 zu pH-empfindlich für eine allgemeine Anwendung. Dieses Problem war das Motiv bezüglich der Synthese einer Verbindung Fluo-3, mit Chlorsubstituenten zur Verstärkung der Acidität des Chromophors. Bei Fluo-3 fiel der pKa auf 4,5-4,6, wie dies entweder durch das Absorptionsspektrum bestimmt wurde, das praktisch Ca²&spplus;-unabhängig war, oder durch die Fluoreszenzamplitude des Ca²&spplus;-Komplexes bei Sättigungs(mM)-Ca²&spplus;-Spiegeln (obere Kurve, Fig. 5). Da dieser PKa auf einen so geringen Wert verschoben wurde, wurde es möglich, die Protonierung an einem Aminstickstoff mit einem pKa von etwa 6,2 zu bestimmen. Diese Protonierung zeigte sich durch einen mäßigen Anstieg, maximal 3fach, der Fluoreszenz des Ca²&spplus;-freien Farbstoffes, wenn der pH von pH 8 auf pH 5 tiriert wurde (untere Kurve, Fig. 5). Die Aminprotonierung ist ähnlich zu der Ca²&spplus;-Bindung, da beide einen vernachlässigbaren Effekt auf das Absorptionsspektrum haben, jedoch die Quantenausbeute der Fluoreszenz verstärken. Die Protonierung neigt zur Inhibierung der Ca²&spplus;-Bindung, wie durch die zwei Kurven bei dem Zwischen-(Ca²&spplus;) in Fig. 5 gezeigt wird. Bei einem pH von 6,1-6,2 ist eine gegebene Zwischenkonzentration von Ca²&spplus; etwa halb so wirksam für die Verstärkung der Fluoreszenz wie bei einem pH von etwa 8, eine unabhängige grobe Bestätigung eines Amin-pKa in der Nähe von 6,2.
Die Mg²&spplus;-Dissoziationskonstante für Fluo-3 ergab sich zu 9 mM bei 250, 0,1-0,15 M Ionenstärke. Dieser Wert ist praktisch der gleiche wie der (8,1 mM) der Elterverbindung ²"benz4", der der Xanthenchromophor fehlt. Offensichtlich beeinflußt der elektronenabziehende Effekt des Xanthens die Mg²&spplus;-Affinität in dem Ausmaß, wie es die Ca²&spplus;-Affinität verringert. Dieses Ergebnis kann erklärt werden, wenn das Mg²&spplus; hauptsächlich an die Hälfte des Chelators bindet, der von dem Chromophor entfernt ist. In Bestätigung dieser Hypothese hat die Mg²&spplus;-Bindung auch einen relativ geringen Einfluß auf die Chelatorfluoreszenz, die es lediglich um das 1,4-fache verstärkt, erheblich weniger als die 40-fache Verstärkung durch Ca²&spplus;-Bindung. Tabelle I Farbstoff Fluoreszenzmaxima mit Überschuß Exzitation Emission Quantenausbeute Überschuß Fluoreszenzverhältnis, Überschuß Effektive Dissoziationskonstante für

Legende zu Tabelle I:

Sämtliche Daten wurden bei 22 ± 2ºC in 0,1M KCl, pH 7,0-7,5, mit Luft äquilibriert, erhalten. Die Exzitationskurven der Fluoreszenz wurden mit einem Rhodamin-B-Zähler korrigiert, die Emissionsmaximale beziehen sich jedoch auf nicht korrigierte Spektren. Wegen der Schärfe der Emissionspeaks macht die Korrektur jedoch einen geringen Unterschied bei der Peakposition. Quantenausbeuten und effektive Dissoziationskonstanten wurden wie in dem Abschnitt mit dem Titel Versuchsbeschreibung gemessen; 0 Ca bezieht sich auf Lösungen ohne zugesetztes Ca²&spplus; und 1-10 mM EDTA oder EGTA, während überschüssiges Ca²&spplus;-Lösungen 1-2 mM Ca²&spplus; aufwiesen. Für Fluo-3 bezieht sich das Fluoreszenzverhältnis von 36 auf das Verhältnis der Quantenausbeuten, während ein Verhältnis von bis zu 40 erhalten werden kann, indem man die Exzitations- und Emissionswellenlängen mit den Peaks für den Ca²&spplus;-Komplex in Beziehung setzt, die von dem freien Farbstoff leicht rotverschoben sind.

Claims

1. Calciumspezifischer Indikatorfarbstoff, gekennzeichnet durch eine chemische Verbindung der allgemeinen Formel

oder eine chemische Verbindung der allgemeinen Formel

oder ein pharmazeutisch verträgliches nicht-toxisches Salz bzw. einen ebensolchen Ester einer dieser Verbindungen, wobei

E¹ und E² unabhängig voneinander H, CH&sub3;, C&sub2;H&sub5;, CH&sub2;OH, COOH oder CH&sub2;COOH oder E¹ und E² zusammen -(CH&sub2;)m-V-(CH&sub2;)n sind, wobei m und n unabhängig voneinander 1 oder 2 sind und V aus der von -CH&sub2;, -O-, -NH-, -NMe-, -S- und -S-S- gebildeten Gruppe ausgewählt sind;

W H, OH oder COOH ist,

X H, Me, COOH, F, Cl, Br, J oder NO&sub2; ist,

Y -O-, -NMe, -S-, -CH&sub2;, -CMe&sub2;-, -CF&sub2;-, -CO- oder eine direkte Sigmabindung unter Bildung eines 5-gliedrigen mittleren Ringes ist;

Z¹, Z², Z³ und Z&sup4; unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, J oder Me sind und Q¹, Q² gleich R&sub1;R&sub2;N&sub2;-,

oder HO-, O= oder R&sub1;R&sub2;N-,O= sind, wobei R¹ und R unabhängig voneinander aus der von H, Me und Et gebildeten Gruppe ausgewählt sind,&sub4;oder Z¹, Q¹, Z³ zusammen

und Z², Q², Z&sup4; zusammen

sind.

2. Farbstoff nach Anspruch 1, bei dem der Tetraessigsäureester ein alpha-Acyloxyalkylester ist.

3. Farbstoff nach Anspruch 2, bei dein der alpha-Acyloxyalkylester ein Acetoxymethylester ist.

4. Farbstoff nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch (9-(6- Hydroxy-4-bis(carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5-methylphenoxy)ethoxy)phenyl)-6-dimethylamino-3H-xanthen-3-yliden)dimethylammonium und die pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Salze und Ester desselben.

5. Farbstoff nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch (9-(4- bis(Carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5- methylphenoxy)ethoxy)phenyl)-6-dimethylamino-3H-xanthen-3- yliden)dimethylammonium und die pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Salze und Ester desselben.

6. Farbstoff nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 9-(6- Hydroxy-4-bis(carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5-methylphenoxy)ethoxy)phenyl)-6-hydroxy-3H- xanthen-3-on und die pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen Salze und Ester desselben.

7. Farbstoff nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 9-(4- bis(Carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5- methylphenoxy)ethoxy)phenyl)-6-hydroxy-3H-xanthen-3-on und die pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Salze und Ester desselben.

8. Farbstoff nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 9-(4- bis(Carboxymethyl)amino-3-(2-(2-bis(carboxymethyl)amino-5- methylphenoxy)ethoxy)phenyl)-2,7-dichlor-6-hydroxy-3H- xanthen-3-on und die pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen Salze und Ester desselben.