DE3629272A1

DE3629272A1 - Mikrotiterplatte

Info

Publication number: DE3629272A1
Application number: DE19863629272
Authority: DE
Inventors: Nobuo Maruyama; Yoichi Shibata; Teruaki Sekine
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1985-08-28
Filing date: 1986-08-28
Publication date: 1987-03-05
Also published as: GB8620702D0; GB2181843B; GB2181843A; DE3629272C2; US4735778A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Mikrotiterplatte, beispielsweise zum Umsetzen von Flüssigkeitsteilen, die jeweils eine sehr geringe Menge aufweisen.

Es ist bekannt, den Nachweis oder die Messung einer in einer Flüssigkeitsprobe oder einem Reagenz enthaltenen Komponente sehr geringer Menge durch ein Einbringen der Flüssigkeitsprobe oder des Reagenz in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte zu führen, indem eine chemische Reaktion, biologische Reaktion oder dergleichen hervorgerufen wird, welche von einer Farbentwicklung oder Entfärbung in der Flüssigkeitsprobe oder dem Reagenz begleitet ist und schließlich die Ergebnisse der Reaktion durch optische Mittel, nämlich durch Projizieren eines Lichtstrahls auf die resultierende Reaktionsmischung in der Vertiefung und die Ermittlung der Intensität des hindurchgelassenen Lichts zu bestimmen. Da diese Methode eine Probe oder ein Reagenz nur in einer sehr geringen Menge (normalerweise kleiner als 1 cc) erfordert, wird sie für die Überwachung der Wasserqualität, die Diagnosen von auf Blutproben basierenden Krankheiten und andere Zwecke vielfach angewendet.

Bei einer Methode der oben erwähnten Art ist es im allgemeinen erforderlich, jede Probe in viele Teile zu unterteilen und dann die sich ergebenden Probenteile mit vielen Reagenzien unterschiedlicher Arten jeweils so reagieren zu lassen, daß dieselbe Probe im Hinblick auf viele Gesichtspunkte untersucht werden kann. Bei einer Alternative ist es ferner erforderlich, viele Proben mit dem gleichen Reagenz reagieren zu lassen, so daß der gleiche Test bei diesen vielen Proben durchgeführt werden kann. Um solche Reaktionen effizient zu gestalten, werden Mikrotiterplatten, wie die in Fig. 3 gezeigte, üblicherweise verwendet. Eine Mikrotiterplatte 20 in Fig. 3 ist aus einem transparenten Material hergestellt und legt eine Anzahl von Reaktionsvertiefungen mit rundem Boden, versehen mit Öffnungen 11 fest. Jede der Reaktionsvertiefungen 10 kann als ein Reaktionsbehälter angesehen werden. Eine Flüssigkeitsprobe oder ein Reagenz wird aus einer automatischen Bürette in jede Reaktionsvertiefung 10 fallengelassen. Nach Beendigung einer vorbeschriebenen Reaktion oder Behandlung werden die Ergebnisse der Reaktion oder Behandlung durch optische Mittel festgestellt.

Die Verfahren für die Reaktion einer Flüssigkeit in sehr geringer Menge und die nachfolgende Ermittlung der Reaktionsergebnisse, welche von einer solchen Mikrotiterplatte wie zuvor beschrieben, Gebrauch machen, sind jedoch in der Praxis von einer Vielzahl ernster Probleme begleitet. Zum Beispiel wird normalerweise ein Lichtstrahl in dem Verfahren für den Nachweis der Reaktionsergebnisse verwendet, dessen Lichtdurchmesser etwa 2 mm beträgt. Die erhaltenen Ermittlungsergebnisse schwanken jedoch stark und haben keine ausreichend hohe Zuverlässigkeit. Aus diesen Gründen hat eine durch eine solche, zuvor beschriebene Methode erhaltene Information nur einen geringen Wert. Ihr Wert kann deshalb nicht voll genutzt werden, obwohl die Methode als solche vortrefflich ist.

Es ist in der Praxis unbekannt, warum die durch eine solche zuvor beschriebene Methode erhaltenen Ermittlungsergebnisse in einem bedeutenden Ausmaß schwanken. Als ein Ergebnis verschiedener Untersuchungen wurden die folgenden Gründe mit einigen wichtigen Ursachen gefunden:

(a) Eine Flüssigkeit, die sich einer Reaktion unterzieht, ist nicht immer zentral auf der Bodenwand einer Reaktionsvertiefung angeordnet.

(b) Obwohl für ein optisches Meßinstrument ein hoher Grad an Positionsgenauigkeit erforderlich ist, ist dieses Erfordernis aufgrund der Gestaltungen der Reaktionsvertiefung nicht erfüllt.

(c) Miktrotiterplatten, in denen jede Reaktionsvertiefung zylindrisch mit einer flachen Bodenwand ist und in denen die Bodenwand und die zylindrische Wand einen rechten Winekl bilden, werden ebenfalls zur Zeit verwendet. In einem Reinigungsvorgang, welcher in jedem Reaktionsschritt erforderlich ist, erleichtern diese Mikrotiterplatten ihre Reinigung in den Ecken zwischen den Bodenwänden und den zylindrischen Wänden ihrer Reaktionsvertiefungen nicht, so daß hier eine unzureichende Reinigung vorliegt.

Außerdem sind diese herkömmlichen Mikrotiterplatten im allgemeinen aus einem Harz, wie z. B. Polyvinylchloridharz, Polystyroloder einem Acrylharz, hergestellt und deshalb sehr empfänglich für eine statische Aufladung. Wegen dieser statischen Aufladung von Mikrotiterplatten können abgetropfte Reagenzien zerstreut werden, neigen mit anderen Worten zu einer statischen Zerstäubung. Unter dem Einfluß einer statischen, durch diese elektrische Aufladung erzeugten Anziehung können die Reaktionen fortschreiten, während die Reaktanten nicht günstig positioniert sind oder durch Adhäsion an den Seitenwänden gehalten werden. Genaue Ermittlungsergebnisse können deshalb in manchen Fällen nicht erhalten werden.

Die Erfinder sind mit einer weiteren Untersuchung dieser nachteiligen Ursachen in verschiedenen Richtungen fortgefahren. Als ein Ergebnis wurde die vorliegende Erfindung nun gemacht. Erfindungsgemäß ist daher eine Mikrotiterplatte vorgesehen, welche sich dadurch auszeichnet, daß die Platte wenigstens eine Vertiefung aufweist, deren Bodenwand einen ebenen Zentralabschnitt umfaßt, welcher einen Durchmesser von wenigstens 1 mm aufweist und wobei die Blatte aus einem lichtdurchlässigen antistatischen Harz gefertigt ist.

Eine solche Mikrotiterplatte erfüllt die Bedingungen, die zum fehlerlosen Durchführen optischer Nachweismethoden in der Praxis und zur Ermittlung der Reaktionsergebnisse erforderlich sind. Es ist damit immer möglich, übereinstimmende und sehr zuverlässige Untersuchungsergebnisse zu erhalten.

Die oben erwähnten und andere Merkmale, Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden deutlich aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen, welche Bezug nehmen auf die beiliegenden Zeichnungen.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1: eine vergrößerte perspektivische Teilansicht einer Miktrotiterplatte gemäß einer Ausführungsform, wobei einige Teile im Querschnitt gezeigt sind;

Fig. 2: einen vergrößerten Teilquerschnitt durch eine Mikrotiterplatte gemäß einer anderen Ausführungsform; und

Fig. 3: eine perspektivische Ansicht einer herkömmlichen Mikrotiterplatte, wobei manche Teile im Querschnitt gezeigt sind.

Die in Fig. 1 dargestellte Mikrotiterplatte 1 besteht aus einem lichtdurchlässigen antistatischen Harz und weist eine Vielzahl von Reaktionsvertiefungen 2 auf. In jeder der Vertiefungen 2 ist ein ebener Zentralabschnitt 4 mit einem Durchmesser von wenigstens 1 mm in einer Bodenwand 3 ausgebildet. Die innere Oberfläche der Bodenwand 3 der Vertiefung 2 und die innere Oberfläche ihrer Umfangswand 7 sind mittels einer gleichmäßig gekrümmten Oberfläche kontinuierlich verbunden, um eine Eckenbildung zu vermeiden. Es ist insbesondere vorteilhaft, die Bodenwand 3 kontinuierlich mit der Umfangswand 7 mittels eines ansteigenden Teils 6 zu verbinden, dessen innere Oberfläche einen Krümmungsradius von wenigstens 0,5 mm aufweist.

In der obigen Ausführungsform werden die folgenden spezifischen Dimensionen beispielhaft angegeben, um die Ausbildungen jeder Vertiefung 2 zu veranschaulichen.

Die Vertiefungen 2 sind in Reihen und Spalten angeordnet. Wie in Fig. 2 dargestellt, welche eine weitere Ausführungsform der Erfindung verdeutlicht, ist jede der in Reihen und Spalten angeordneten Reaktionsvertiefungen 2 aus einer Bodenwand 3 und einer Umfangswand 7 gebildet. Die Bodenwand 3 hat eine ebene plattenartige Gestalt, während die Umfangswand 7 einen konischen Verlauf aufweist, welcher sich nach oben leicht trichterförmig erweitert. Die äußere Kante der Bodenwand 3 ist kontinuierlich mit der Umfangswand 7 mittels eines ansteigenden Teils 6 verbunden. Der Krümmungsradius r der inneren Oberfläche des ansteigenden Teils 6 ist festgelegt auf 0,5 mm oder größer. Die gesamte innere Oberfläche der Vertiefung 2 enthält keinen Teil, dessen Krümmungsradius kleiner ist als 0,5 mm. Der Buchstabe C bezeichnet einen Verbindungsteil zwischen zwei Seite an Seite angeordneten Vertiefungen 2, z. B. in Seitenrichtung. Die Dicke dieses Verbindungsteils C ist z. B. auf 0,7 mm festgelegt, und die obere Außenfläche des Verbindungsteils C legt eine im wesentlichen V-förmige Nut 9 in Längsrichtung der Mikrotiterplatte 1 fest (z. B. in der Richtung senkrecht zur Zeichenebene). Anderenfalls können jeweils zwei benachbarte Vertiefungen, welche Seite an Seite in Längsrichtung angeordnet sind, ebenso miteinander durch einen Verbindungsteil ähnlich zu dem Verbindungsteil oder durch eine zusätzlich vorgesehene verstärkende Rippe verbunden sein.

Mit dem Buchstaben F ist eine äußere Seitenwand der Mikrotiterplatte 1 bezeichnet, die auch als Ständer dient. Buchstabe R bezeichnet die verstärkende Rippe.

Zu dieser Ausführungsform werden die folgenden spezifischen Dimensionen beispielhaft angegeben.

Um eine Kennzeichnung der Vertiefungen 2 sicherzustellen, ist es vorteilhaft, gewisse Kennzeichnungsmarken in Verbindung mit den einzelnen Vertiefungen 2 vorzusehen. Für solche Kennzeichnungsmarken könnte es z. B. vorteilhaft sein, Buchstaben des römischen Alphabetes in der Folge A, B, C, . . ., welche Spalten bezeichnen, und Zahlen in der Folge 1, 2, 3, . . ., welche Reihen bezeichnen, zu kombinieren, so daß die Adressen der Vertiefungen mit "A1" für die Vertiefung in der ersten Spalte und ersten Reihe und "C5" für die Vertiefung in der dritten Spalte und fünften Reihe angegeben werden können.

Als lichtdurchlässiges antistatisches Harz für erfindungsgemäße Mikrotiterplatten wird vorteilhaft ein Pfropfcopolymer verwendet, welches durch Pfropf-Polymerisieren wenigstens eines ethylenisch-ungesättigten Monomers eines kautschukähnlichen Hauptpolymers erhalten ist, welches als eine Komponente davon ein Monomer mit einer Alkenoxidgruppe und einer ethylenisch-ungesättigten Bindung enthält. Es könnte insbesondere wichtig sein, daß das antistatische Harz eine antistatische Eigenschaft von 30 Sekunden oder kürzer, vorzugsweise 10 Sekunden oder kürzer, in Abhängigkeit von der Halbwertszeit der statischen Oberflächenaufladung aufweist, wie sie durch ein statisches Aufladungsmeßgerät, z. B. "Static Honest Meter" (Warenzeichen; hergestellt durch Shishido Shokai K.K.) gemessen wird und eine hohe Lichtdurchlässigkeit von 80% oder höher, vorzugsweise 87% oder höher, in Abhängigkeit von der Durchlässigkeit des gesamten Lichtes aufweist. Im übrigen kann die Durchlässigkeit des gesamten Lichtes z. B. durch eine in JIS K6717 beschriebenen Methode gemessen werden.

Die Mikrotiterplatte dieser Erfindung kann beliebige Konfigurationen annehmen, solange die oben beschriebenen Bedingungen eingehalten werden. Es wird vorausgesetzt, wenigstens eine Reaktionsvertiefung zur Aufnahme einer Flüssigkeit vorzusehen. Wo zwei oder mehr Vertiefungen 2 vorgesehen sind, kann die Größe jeder der Vertiefungen 2 normalerweise etwa 3 bis 30 mm im Durchmesser und etwa 2 bis 15 mm in der Tiefe betragen. In der Miktrotiterplatte dieser Erfindung können deren Wände eine vielschichtige Struktur aufweisen, vorausgesetzt, daß die Oberflächenschicht aus einem antistatischen Harz hergestellt ist.

Bei der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte wird als antistatisches Harz vorzugsweise ein Harz verwendet, welches aus einem spezifischen Pfropfcopolymer besteht. Das Harz kann lediglich aus dem Pfropfcopolymer oder aus einer Mischung aus dem Propfcopolymer und einem thermoplastischen Harz bestehen. Der Ausdruck "spezifisches Propfcopolymer", wie er hier benutzt wird, beinhaltet ein Propfcopolymer, das durch Pfropf-Polymerisieren wenigstens eines ethylenisch-ungesättigten Monomers auf ein kautschukähnliches Hauptpolymer erhalten wird, welches als Komponente davon ein Monomer mit einer Alkylenoxidgruppe und einer ethylenisch-ungesättigten Bindung aufweist.

Insbesondere kann das kautschukähnliche Hauptpolymer vorzugsweise ein kautschukähnliches Copolymer sein, das erhalten wird aus 50 bis 90 Gew.-% wenigstens eines Monomers, welches aus konjugierten Dienen und Acrylestern ausgewählt wird und aus 10 bis 50 Gew.-% eines Monomers, welches 4 bis 500 Alkylenoxidgruppen und ethylenisch-ungesättigte Bindungen (hier mit "Polyalkylenoxidmonomer" bezeichnet) enthält und falls nötig 0 bis 50 Gew.-% wenigstens eines ethylenisch-ungesättigten copolymerisierbaren Monomers.

Das oben beschriebene kautschukähnliche Hauptpolymer kann prinzipiell wenigstens aus einem Monomer bestehen, welches aus den konjugierten Dienen und Acrylestern ausgewählt ist. Als konjugierte Diene können 1,3-Butadien, Isopren, Chloropren und 1,3-Pentadien verwendet werden. Als vorteilhafte Acrylester können Ethylacrylat, Propylacrylat, Butylacrylat, Hexylacrylat, Octylacrylat, Nonylacrylat und so weiter genannt werden.

Durch Verwendung eines konjugierten Diens und eines Acrylesters entweder einzeln oder in Kombination in einer gesamten Menge von wenigstens 50 Gew.-% basierend auf dem kautschukähnlichen Hauptpolymer kann die Glasumwandlungstemperatur des kautschukähnlichen Hauptpolymers bedeutend verringert werden, und bemerkenswerte antistatische Effekte können herbeigeführt werden. Falls dieses Verhältnis nicht 90 Gew.-% oder weniger beträgt, ist der Anteil des Polyalkylenoxidmonomers vermindert, und die gewünschten antistatischen Effekte können deshalb nicht erhalten werden.

Das Polyalkylenoxidmonomer umfaßt ein oder mehrere Alkylenoxidgruppen, die jeweils mit einer ethylenisch- ungesättigten Gruppe verbunden und durch die folgende Formel vertreten ist: worin R₂ und R₃ gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils eine Wasserstoff- oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, und m und n ganze Zahlen gemäß der Bedingung 4m + n500 bedeuten. Besonders vorteilhaft ist ein Polyalkylenoxidmonomer mit Ethylenoxidgruppen, die jeweils 4 oder mehr Ethylenoxidgruppen der obigen Formel (1) enthalten, worin wenigstens eines der R₂ und R₃ H ist.

Als das Polyalkylenoxidmonomer ist auf der anderen Seite wenigstens ein Monomer, vertreten durch die folgende Sturkturformel (2) oder (3), vorteilhaft. worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, X ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe, bedeutet, R₄, R₅ und R₆ jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen bedeuten, Me steht für ein Wasserstoff, Na, Li oder K Atom, und R₂, R₃, m und n weisen dieselbe Bedeutung, wie zuvor in der Formel (1) festgelegt, auf. worin Z ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 40 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe oder bedeutet, p und q ganze Zahlen gemäß der Bedingung 4p + q500 sind, und R₁, R₂, R₃ und X dieselbe Bedeutung wie zuvor in der Formel (2) festgelegt, aufweisen.

Unter den oben beschriebenen Monomeren, vertreten durch die Formel (2) oder (3), sind jene der Formel (2) oder (3) besonders vorteilhaft, in denen wenigstens eines der R₂ und R₃ H ist und 4 oder mehr Ethylenoxidgruppen enthalten sind.

Neben den durch die Formel (2) oder (3) dargestellten Monomeren ist es natürlich möglich, ein Monomer zu verwenden, das den Volumenwiderstand des kautschukähnlichen Hauptpolymers verringern kann, welches ethylenisch-ungesättigte Bindungen und Polyalkylenoxidgruppen enthält, und durch Copolymerisation mit einem konjugierten Dien und/oder einer Acrylsäure erhalten wird.

Das Polyalkylenoxidmonomer sollte vorzugsweise 4-500 Alkylenoxidgruppen mit 6-50, besonders bevorzugt 9-50, Alkylenoxidgruppen enthalten. Wenn die Zahl der Alkylenoxidgruppen kleiner als 4 ist, ist es schwierig, ausreichende antistatische Eigenschaften zu erhalten. Wenn sie auf der anderen Seite größer als 500 ist, hat das Polyalkylenoxidmonomer gegenüber Wasser oder dem assoziierten Monomer nach dessen Polymerisation eine geringe Löslichkeit, und ferner ist dessen Polymerisationsfähigkeit vermindert. Es ist deshalb nicht vorteilhaft, Alkylenoxidgruppen in irgendwelchen Zahlen außerhalb des obigen Bereichs aufzunehmen.

Das kautschukähnliche Hauptpolymer kann vorzugsweise das Polyalkylenoxidmonomer in einer Menge von 10 Gew.-% oder mehr enthalten, wobei ausreichende antistatische Eigenschaften gegeben sind. Es ist vorteilhaft, den Anteil des Polyalkylenoxidmonomers unter 50 Gew.-% zu begrenzen, da ein solcher Anteil dessen Polymerisation in der Pfopfcopolymerisation und der nachfolgenden Behandlung des resultierenden Polymers, wie z. B. seine Entsäuerung, Entsalzung oder dergleichen, erleichtert.

Als ethylenisch-ungesättigtes Monomer, das mit einem konjugierten Dien oder einem Acrylester copolymerisierbar ist und bei der Produktion des benötigten kautschukähnlichen Hauptpolymers verwendet werden kann, können herkömmlich bekannte Monomere eingesetzt werden.

Z. B. könnten ein oder mehrere der folgenden Monomere verwendet werden: Alkylacrylate, Alkylmethacrylate, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Vinylacetat, ungesättigte Nitrile, aromatische Vinylkomponenten, Alkylvinylether, Alkylvinylketone, 2-Hydroxyethylacrylate, 2-Hydroxyethylmethacrylate, Diacetonacrylamid, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Itakonsäure, Alkylitakonate, Isobuten, 2-Säure(acid)phosphoxyethylmethacrylat, 3-Chlor-2-säure(acid)phosphoxypropylmethacrylat, Natriumstyrolsulfonat, etc.

Noch bessere antistatische Eigenschaften können erhalten werden, wenn ein hoch-polarisiertes Monomer, wie z. B. Acrylnitril, oder ein Monomer mit einem oder mehreren anionischen Substituenten, wie z. B. Sulfonsäure-, Phosphorsäure- und/oder Carboxylgruppen, anstelle des oben erwähnten ethylenisch-ungesättigten copolymerisierbaren Monomers gewählt wird.

Diese ethylenisch-ungesättigten copolymerisierbaren Monomere können in einer Menge bis zu 50 Gew.-% in dem kautschukähnlichen Hauptpolymer verwendet werden. Wenn es über dieser oberen Grenze eingesetzt wird, wird die Glasumwandlungstemperatur höher, und die kautschukähnlichen Charakteristika gehen deshalb verloren.

Es ist ebenso vorteilhaft, falls nötig ein polyfunktionales Monomer mit einem oder mehreren ethylenisch-ungesättigten Gruppen, wie z. B. Vinyl-, 1,3-Butadienyl-, Acryl-, Methacryl- und/oder Allylgruppen, als ein Vernetzungsmittel in dem kautschukähnlichem Hauptpolymer zu verwenden. Besonders bevorzugt ist ein polyfunktionales Monomer, das zusätzlich 4-500, vorzugsweise 9-50, Polyalkylenglykolgruppen enthält, da es sich nicht nur als ein Vernetzungsmittel, sondern auch als ein antistatisches Agens verhält.

Als ein ethylenisch-ungesättigtes Monomer, welches auf solch einem kautschukähnlichem Hauptpolymer pfropfcopolymerisiert wird, können ein oder mehrere herkömmlich bekannte Monomere verwendet werden. Beispielhaft können die folgenden Monomere entweder einzeln oder in Kombination eingesetzt werden: Alkylacrylate, Alkylmethacrylate, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Vinylacetat, ungesättigte Nitrile, aromatische Vinylverbindungen, konjugierte Diene, Alkylvinylether, Alkylvinylketone, 2-Hydroxethyl(meth)acrylate, (Alkoxy)polyethylenglykol(meth)acrylate, Diacetonacrylamid, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Itakonsäure, Alkylitaconate, Isobuten und dergleichen.

Die Anteile des kautschukähnlichen Hauptpolymers und Zweigpolymers in dem Pfropfcopolymer können 5-95 Gew.-%, vorzugsweise 8-80 Gew.-%, für das erstere und 5-95 Gew.-%, vorzugsweise 20-92 Gew.-%, für das letztere betragen. Wenn das kautschukähnliche Hauptpolymer in einer Menge kleiner als 5 Gew.-% eingesetzt wird, ist es schwierig, diesem antistatische Eigenschaften zu verleihen. Auf der anderen Seite resultieren Anteile größer als 95 Gew.-% in einen Steifigkeitsverlust, wenn die erhaltenen Pfropfcopolymere allein oder in geringer Verträglichkeit und schwieriger Mischung verwendet werden, sobald die erhaltenen Pfropfcopolymere als Mischungen mit anderen thermoplastischen Harzen eingesetzt werden.

Wenn das Pfropfcopolymer als eine Mischung in Kombination mit einem thermoplastischen Harz verwendet wird, sollte der Anteil des kautschukähnlichen Hauptpolymers in einem Bereich von 5 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 60 Gew.-%, liegen.

Als beispielhafte thermoplastische Harze, welche zusammen mit dem Pfropfcopolymer verwendet werden, können Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Nitrilharze, Polymethylmethacrylat und deren Copolymere, Acrylnitrilstyrol- butadienharze, Acrylnitril-styrolharze, Polyamidharze, Polyesterharze, Fluorkohlenstoffharze und dergleichen genannt werden. Es ist unnötig zu erwähnen, daß andere thermoplastische Harze ebenso verwendet werden können, solange wie sie eine gute Verträglichkeit mit dem Pfropfcopolymer aufweisen.

Die oben beschriebenen Harze können jeweils in Mikrotiterplatten mit Reaktionsvertiefungen durch ein gewöhnliches Spritzgußverfahren oder ein Vakuumfolienformverfahren geformt werden.

Wie oben beschrieben wurde, nutzt die Mikrotiterplatte dieser Erfindung einen antistatischen Harz als ihr Material und umfaßt eine oder mehrere Vertiefungen, deren Bodenwände jeweils mit einem ebenen Abschnitt ausgestattet sind. Das könnte deshalb die folgenden vorteilhaften Merkmale hervorrufen.

Wenn eine Mikrotiterplatte zur statischen Aufladung neigt, kann ein Tropfen einer Flüssigkeitsprobe oder eines Reagenz, den man in eine gewünschte Vertiefung einfüllen will, dort nicht plaziert werden, und kann deshalb an der Öffnungskante der Vertiefung oder der Umfangswand der Vertiefung anhaften. Daraus folgt, selbst wenn die Bodenwand rund ist, daß der Tropfen nicht im Bodenzentrum der Vertiefung angeordnet werden kann, durch welches ein Lichtstrahl für ein Nachweisverfahren durchgelassen wird. Zusätzlich könnte die beabsichtigte Reaktion infolge einer Ablagerung von Staub verschlechtert werden, der in der Atmosphäre an der Oberfläche der Mikrotiterplatte vorbeiströmt.

Dank der Verwendung eines antistatischen Harzes in der vorliegenden Erfindung, bleibt die Mikrotiterplatte frei von statischen Aufladungen, und als ein Ergebnis, wenn eine zu beschickende oder einzufüllende Flüssigkeitsprobe oder Reagenz in eine gewünschte Vertiefung getröpfelt wird, ist der Tropfen in der Lage, ohne Schwierigkeiten in die gewünschte Vertiefung zu fallen. Es ist deshalb möglich, eine Flüssigkeit sehr geringer Menge einer beabsichtigten Reaktion mit hohem Wirkungsgrad und leichter Handhabung mittel einer automatischen Bürette auszusetzen.

Die Reaktion könnte eine enzymatische Immunreaktion durch eine Festphasentechnik sein. Wenn wohldosierte Teile eingefüllt oder statisch aufgeladen werden, wird der Grad der Wechselwirkung eines zu konjugierenden Antigens oder Antikörpers von einer Vertiefung zur anderen wegen der statischen Aufladung unterschiedlich sein. Die Mikrotiterplatte dieser Erfindung ist frei von solchen Problemen und kann hier wiederum hochzuverlässige Ergebnisse liefern.

Wie oben beschrieben wurde, hat es die Verwendung eines antistatischen Harzes als Material für die Mikrotiterplatte möglich gemacht, ihre einzelnen Vertiefungen unter den gleichen Bedingungen zu halten. Außerdem ist sichergestellt, daß jeder eingefüllte Tropfen eine Position auf dem Boden der ausgewählten Vertiefung annimmt. Da dort ein ebener Abschnitt ausgebildet ist, wird die Dicke der Tropfenschicht auf dem ebenen Abschnitt einheitlich sein, vorausgesetzt, daß die Mikrotiterplatte horizontal angeordnet ist. Bei einem Nachweisverfahren ist die Dicke der Flüssigkeitsschicht immer konstant unabhängig von dem Ort, durch welchen ein Lichtstrahl zum Durchstrahlen veranlaßt wird. Es ist deshalb möglich, Schwierigkeiten zu vermeiden, welche bei Verwendung einer halbkugeligen Vertiefung auftreten, nämlich, daß die Nachweisergebnisse in Abhängigkeit von dem Ort der Durchstrahlung eines Lichtstrahls variieren. Indem der ebene Abschnitt einen Durchmesser von wenigstens 1 mm aufweist, ist es möglich, Fehler zu tolerieren, die im allgemeinen bei der Positionierung der Projektion eines Lichtstrahls auftreten und somit den Nachweis von Reaktionsergebnissen beständig und dauerhaft durch optische Einrichtungen zu führen.

Außerdem wird die Mikrotiterplatte freigehalten von Staubablagerungen der Atmosphäre aufgrund ihrer eigenen antistatischen Eigenschaften. Es besteht daher keine Gefahr, daß die beabsichtigte Reaktion durch solche Verunreinigungen beeinträchtigt werden könnte.

Vollständiges Säubern kann sichergestellt werden durch Ausbildung der Mikrotiterplatte dergestalt, daß die innere Oberfläche der Bodenwand jeder Reaktionsvertiefung und die innere Oberfläche ihrer Umfangswand kontinuierlich mittels einer gleichmäßig gekrümmten Oberfläche verbunden sind, so daß die Bildung von Ecken vermieden wird. Damit ist es erreichbar, die Fehlerquelle wegen unvollständiger Reinigung auszuschalten. Dieser Gesichtspunkt wird anschließend genauer beschrieben. Wenn die innere Oberfläche jeder Vertiefung 2 an keiner Stelle einen Krümmungsradius kleiner als 0,5 mm enthält, ist es möglich, eine Flüssigkeit, die in die Vertiefung 2 eingefüllt wurde, gleichmäßig und vollständig in ihrer Gesamtheit, z. B. durch Kopfüberdrehen der gesamten Mikrotiterplatte, zu entleeren. Insbesondere ist die Flüssigkeit nicht länger in der Lage, durch Kapillarkräfte im Grenzbereich zwischen der Bodenwand 3 und der Umfangswand 7 zu verbleiben. Die Reinigung kann deshalb immer vollständig durchgeführt werden. Als ein Ergebnis ist es möglich, die Fehlerquelle wegen unvollständiger Reinigung auszuschalten, sogar dann, wenn die Reaktion eine Reinigung als einen wesentlichen Schritt, wie z. B. bei einer enzymatische Immunreaktion, erfordert.

Wenn ein aus dem zuvor beschriebenen spezifischen Pfropfcopolymer zusammengesetztes Harz als Material für die Mikrotiterplatte in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, weist das Harz im allgemeinen eine ausgezeichnete Ion-Diffusionseigenschaft als eine der chemischen Eigenschaften des Harzes, mit anderen Worten eine hohe Leitfähigkeit für die statische Aufladung, auf. Wenn der Harz in Form einer Wand oder Schicht mit wenigstens einem gewissen Dickenniveau verwendet wird, ist es leicht möglich, eine Mikrotiterplatte mit hohen antistatischen Eigenschaften, nämlich mit einer statischen Oberflächenaufladungshalbwertszeit von 30 Sekunden oder kürzer, zu erhalten.

Wie in Fig. 2 dargestellt, können die V-Nuten 9 oder dergleichen auch als Rißnuten in den Verbindungsteilen C ausgebildet sein. Solche Rißnuten können auch in der Seitenrichtung der Verbindungsteile zwischen längsbenachbarten Vertiefungen 2 ausgebildet sein. Durch Auseinanderreißen der Verbindungsteile entlang der Rißnuten mittels eines Schneidmessers oder dergleichen können die benachbarten Vertiefungen 2 sehr leicht Spalte für Spalte oder Reihe für Reihe abgetrennt werden. Es ist ferner sehr leicht, nur eine gewünschte Gruppe von Vertiefungen abzutrennen. Wenn die Zahl der Proben oder der Testreihen klein ist und die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte nicht alle gleichzeitig genutzt werden, kann ein Teil dieser Mikrotiterplatte, in dem Vertiefungen einer gewünschten Anzahl enthalten sind, ausgeschnitten werden, so daß die Mikrotiterplatte wie herkömmlich ohne Verschmutzen derselben verwendet werden kann. Nebenbei bemerkt kann die minimale Dicke jedes Verbindungsteils an seiner angrenzenden Rißnut vorzugsweise von 0,2 mm bis 0,5 mm schwanken, obgleich sie in Abhängigkeit von dem Material variiert. Solange die Dicke in einen solchen Bereich fällt, ist das Abtrennen erleichtert, und gleichzeitig kann der Verbindungsteil eine ausreichende Verbindungssteifigkeit für die gewöhnliche Anwendung vorweisen.

Mikrotiterplatten nach dieser Erfindung können für verschiedene Reaktionen, insbesondere für Bluttests, unterschiedliche enzymatische Reaktionen, für das Wachstum von Antikörpern, die Kultur von Mikroorganismen, die Kultur von Pflanzenzellen etc., verwendet werden.

Beispiel 1:

(a) In einem 10-Liter Autoklaven aus nicht rostendem Stahl, ausgestattet mit einer Rührschaufel, wurde eine wäßrige Lösung mit den folgenden Substanzen, ihrer Einregulierung auf pH 7 folgend, mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid eingefüllt: Der Autoklav wurde mit Stickstoff durchgespült, und der Inhalt bei 40°C für 20 Stunden gerührt, wodurch ein Kautschuklatex mit einer mittleren Partikelgröße von 0,08 µm mit einer Ausbeute von 99% erhalten wurde.

b) Zu 40 Anteilen des obigen Kautschuklatex (10 Anteile als ein kautschukähnlicher Hauptpolymer) wurden die folgenden Substanzen hinzugefügt: Der Autoklav wurde mit Stickstoff durchspült, und der Inhalt bei 50°C für 20 Stunden verrührt. Das pfropfcopolymerisierte Latex wurde durch eine nachfolgende Zugabe einer wäßrigen Lösung von Aluminiumsulfat aus dem Autoklaven entnommen, um das so gebildete Pfropfcopolymer abzuscheiden. Die resultierende Mischung wurde mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumpyrophosphat auf pH 7 eingestellt. Nachdem das Pfropfcopolymer entwässert und dann gewaschen wurde, wurde es bei 55°C für 24 Stunden getrocknet, um ein weißes Pulver mit einer Ausbeute von 97% zu erhalten.

Bei Verwendung des weißen Pulvers als ein Rohmaterial wurde eine Mikrotiterplatte mit dem gleichen wie nach Fig. 1 gezeigten Aufbau mittels einer gewöhnlichen Spritzgußmaschine hergestellt. Die Mikrotiterplatte war 82 mm lang, 123 mm breit, 14 mm hoch und 0,7 mm dick. Sie enthielt insgesamt 96, in 12 Reihen und 8 Spalten angeordnete Vertiefungen. Jeder der Vertiefungen hatte die folgenden Dimensionen:
Durchmesser: 7 mm
Tiefe: 11 mm
Durchmesser des flachen Teils der Bodenwand: 1,5 mm
Krümmungsradius des ansteigenden Teils zwischen der Bodenwand und der Umfangswand 2,75 mm

In einer Atmosphäre von 23°C und 20% R.H. betrug die Halbwertszeit der statischen Oberflächenaufladung der Mikrotiterplatte 12 Sekunden und die Durchlässigkeit des gesamten Lichts 90,5%. Die folgenden Meßmethoden wurden verwendet.
(1) Halbwertszeit:

Eine Probe wurde auf einem "static Honest Meter" (Warenzeichen; statisches, durch Shishido Shokai Kabushiki Kaisha hergestelltes Ladungsmeßgerät) angesetzt, und negative Elektronen auf seiner Oberfläche unter den folgenden Bedingungen aufgegeben:
Entladungsabstand: 20 mm
angelegte Spannung: 10 KV
Umdrehungsgeschwindigkeit: 1300 Upm

Nach dem Anhalten der Probe wurde die erfoderliche Zeit bis zur statischen, auf die Hälfte des Anfangswertes zurückgefallene Aufladung ihrer Oberfläche gemessen.
(2) Durchlässigkeit des gesamten Lichts:

Die in JIS K 6 717 vorbeschriebene Methode wurde befolgt.

Bei Verwendung der oben erhaltenen Mikrotiterplatte wurde ferner eine enzymatische Immunreaktion durchgeführt. In der folgenden Beschreibung stehen "PBS" und "BSA" jeweils für eine phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung und ein Rinderserumalbumin.

(1) Eine 50 µg/ml·PBS Lösung eines Anti-Maus Immunoglobulin-Kaninchen-Antikörpers wurde in einer Menge von 50µl in jede der Vertiefungen eingefüllt. Die Lösung wurde dann bei 4°C für 24 Stunden stehengelassen, um den Antikörper zu fixieren.

(2) Nach der dreimaligen Spülung jeder Vertiefung mit PBS wurde eine 30 mg/ml·PBS Lösung von BSA in einer Menge von 150 µl zu jeder der Vertiefungen zugegeben. Sie wurden bei 4°C für 24 Stunden zur Reaktion gebracht.

(3) Nach der dreimaligen Spülung jeder Vertiefung mit PBS wurden 50 µl von PBS, welche Maus-Immunoglobin bei einer Konzentration von 25 ng/ml und 1% von BSA enthielt, zu jeder der 84 Vertiefungen in 7 Reihen der insgesamt 96 Vertiefungen zugegeben. Zu jeder der 12 Vertiefungen in der verbleibenden einzigen Spalte wurden 50 µl von 1% BSA enthaltenen PBS als eine Blindprobe zugefügt. Sie wurden bei Raumtemperatur für 2 Stunden zur Reaktion gebracht.

(4) Nach einer fünffachen Spülung jeder Vertiefung mit PBS wurden 50 µl von PBS, das in einer Höhe von 1 µg/ml Anti-Maus-Immunoglobulin-Pferd-Antikörper markiert durch Meerrettich-Peroxidase und 1% von BSA enthält, zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Sie wurden bei Raumtemperatur hinzugefügt. Sie wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde einer Reaktion unterzogen.

(5) Nach einer fünffachen Spülung jeder Vertiefung mit PBS wurden 100 µl einer 0,01% Wasserstoffperoxid in einem Zitratpuffer von pH 5,0 enthaltenden Lösung, welche Orthophenylendiamin in Höhe von 1 mg/ml enthält, zugefügt. Sie wurden dann einer Reaktion bei Raumtemperatur für 20 Minuten unterzogen.

(6) Dann wurden 25 µl einer 2-molaren Schwefelsäure zugefügt. In einem automatischen Absorptionsmeter wurde ein Lichtstrahl mit einer Wellenlänge von 490 nm und einem Strahldurchmesser von 1 mm zur Messung des Absorptionsgrades projiziert.

Die im Hinblick auf die 84 Proben in den 7 Reihen erhaltenen Meßergebnisse wurden untersucht. Die folgenden Resultate wurden erhalten.
Mittelwert: 0,561
Standardabweichung: 0,023

Demgemäß war der Variationskoeffizient, der ein Anzeichen für das Variationsmaß ist, sehr klein, d. h. 4,1. Es ist deshalb klar, daß die Mikrotiterplatte in diesem Beispiel eine vorzügliche Stabilität hatte und eine hohe Zuverlässigkeit ergab.

Beispiel 2:

Hergestellt wurde eine Mikrotiterplatte derselben Abmessungen wie die in Beispiel 1 erhaltenen mit der Ausnahme, daß jede Vertiefung die folgenden Dimensionen hatte:
Öffnungsdurchmesser: 7 mm
Tiefe: 11 m
Durchmesser des flachen Teils der Bodenwand: 5 mm
Krümmungsradius des ansteigenden Teils: 1 mm

Bei Verwendung der Mikrotiterplatte wurden die Messungen in derselben Art wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die folgenden Resultate wurden erhalten:
Mittelwert: 0,558
Standardabweichung: 0,021

Demgemäß war der Variationskoeffizent, der ein Index für das Variationsmaß darstellt, extrem klein, d. h. 3,8. Es ist deshalb klar, daß die Mikrotiterplatte dieses Beispiels eine hervorragende Stabilität aufweist und eine hohe Zuverlässigkeit ergibt.

Vergleichsbeispiel 1:

Eine Mikrotiterplatte wurde in der gleichen Art wie in Beispiel 1 hergestellt mit der Ausnahme, daß der Durchmesser des flachen Teils in der Bodenwand jeder Vertiefung 0,8 mm betrug, und ähnliche Messungen wurden durchgeführt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Mittelwert: 0,552
Standardabweichung: 0,045

Demgemäß beträgt der Variationskoeffizient 8,2. Damit tritt deutlich hervor, daß die Meßergebnisse beträchtlich schwanken.

Vergleichsbeispiel 2:

Eine Mikrotiterplatte wurde in der gleichen Art wie in Beispiel 1 hergestellt mit der Ausnahme, daß als Material kommerzielles Polystyrol verwendet wurde. Ähnliche Messungen wurden dann durchgeführt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Mittelwert: 0,596
Standardabweichung: 0,038

Demgemäß betrug der Variationskoeffizient 6,4. Damit tritt deutlich hervor, daß die Meßergebnisse beträchtlich schwankten.

Vergleichsbeispiel 3:

Eine Mikrotiterplatte wurde in derselben Art wie in Beispiel 1 hergestellt mit der Ausnahme, daß als Material kommerzielles Polyvinylchlorid verwendet wurde. Ähnliche Messungen wurden dann durchgeführt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Mittelwert: 0,401
Standardabweichung: 0,053

Demgemäß betrug der Variationskoeffizient 12,5. Damit tritt deutlich hervor, daß die Meßergebnisse extrem schwanken.

Es ist nach der kompletten Beschreibung der Erfindung für einen Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet offenbar, daß viele Modifikationen und Veränderungen darin durchgeführt werden können, ohne den Gedanken oder den Inhalt der zuvor beschriebenen Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Mikrotiterplatte, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte wenigstens eine Vertiefung aufweist, deren Bodenwand einen ebenen Zentralabschnitt mit einem Durchmesser von wenigstens 1 mm umfaßt und die Platte aus einem lichtdurchlässigen antistatischen Harz hergestellt ist.

2. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenwand der Vertiefung kontinuierlich mit der entsprechenden Umfangswand mittels eines ansteigenden Teils verbunden ist und der minimale Krümmungsradius der Innenwand der Vertiefung, wobei die Innenwand den ansteigenden Teil umfaßt, wenigsten 0,5 mm beträgt.

3. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das antistatische Harz aus einem durch Pfropf-Polymerisieren wenigstens eines ethylenisch-ungesättigten Monomers auf ein kautschukähnliches Hauptpolymer erhaltenen Pfropfcopolymer zusammengesetzt ist, welches als ein Bestandteil davon ein Monomer mit einer Alkylenoxidgruppe und einer ethylenisch-ungesättigten Bindung enthält.

4. Mikrotiterplatte nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Halbwertszeit der durch ein statisches Ladungsmeßgerät gemessenen statischen Oberflächenaufladung des antistatischen Harzes 30 Sekunden oder kürzer beträgt und die Durchlässigkeit des gesamten Lichtes durch das antistatische Harz 80% oder höher ist.

5. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von Vertiefungen darin vorgesehen ist und Rißnuten zwischen den benachbarten Vertiefungen ausgebildet sind.