DE3430708A1

DE3430708A1 - Kultivierung von flechten-zellen

Info

Publication number: DE3430708A1
Application number: DE19843430708
Authority: DE
Inventors: Ryuzo Yawata Kyoto Mizuguchi; Yoshikazu Neyagawa Osaka Yamamoto
Original assignee: Nippon Paint Co Ltd
Current assignee: Nippon Paint Co Ltd
Priority date: 1983-08-24
Filing date: 1984-08-21
Publication date: 1986-02-20
Also published as: GB2195657B; GB8421127D0; GB8718927D0; GB2145733A; CA1256816A; GB2145733B; DE3430708C2; GB2195657A

Description

3430703

Kultivierung von Flechten-Zellen

Die vorliegende Erfindung betrifft die Kultivierung von Flechten-Zellen (lichenösen Zellen). Insbesondere betrifft sie die Kultivierung von Pilz-Zellen und/oder Algen-Zellen von Lichen-Flora.

Flechten (Lichenes) sind Pflanzen, die durch einen aus Pilzen (Fungi) und Algen (Algae) bestehenden Symbionten gekennzeichnet sind, und nehmen infolgedessen eine ungewöhnliche Position in der Botanik ein. Aufgrund der mikroskopischen Beobachtung differenzieren Lichenes eine Mannigfaltigkeit von Geweben, darunter den Cortex (ein Gewebe, das den Thallus bedeckt und schützt und aus einer Ansammlung von anhaftenden Hyphen besteht), die algale Schicht (ein Gewebe, in dem Algen im Thallus von Hyphen umgeben sind und gestützt werden), die Medulla (ein Grundgewebe des Thallus, das aus lose verschlungenen Hyphen besteht) und das Rhizin (ein Gewebe, das aus der unteren Oberfläche herausragt und die Haftung des Thallus an einem Träger bewirkt), die die Strukturmerkmale von Flechten darstellen (in einigen Fällen weist die Oberfläche der Unterseite des Thallus jedoch kein Rhizin auf).

Flechten-Substanzen (lichenöse Substanzen), die Stoffwechselprodukte der Lichenes, unterscheiden sich von den meisten Substanzen der höheren oder niederen Pflanzen und gehören einer speziellen, begrenzten chemischen Abteilung an. Nach Asahina (Asahina und Shibata, "Chemistry of Lichenous Substances", Kawade Shobo, 1948) lassen sich die lichenösen Substanzen in die folgenden Gruppen einteilen:

" ft * ■

A. Aliphatische lichenöse Substanzen Gruppe 1: Säuren

a) Einbasige Lacton-Säuren,

b) Zweibasige Säuren, c) Dreibasige Säuren.

Gruppe 2: Neutrale Verbindungen, die die Liebermann-Reaktion zeigen (Zeorin-Verbindungen). Gruppe 3: Mehrwertige Alkohole.

B. Aromatische lichenöse Substanzen

Gruppe 1: Pulvinsäure-Derivate (Pulvic acid derivs.) Gruppe 2: Depside

a) Orcin-Verbindungen,

b) Orcin-ß-Orcin-Mischverbindungen,

c) ß-Orcin-Verbindungen. Gruppe 3: Depsidone

a) Orcin-Verbindungen,

b) ß-Orcin-Verbindungen. Gruppe 4: Chinone

a) Oxyanthrachinone, b) Phenanthrenchinone. Gruppe 5: Xanthon-Derivate Gruppe 6: Diphenylenoxid-Derivate

Gruppe 7: Stickstoff enthaltende Verbindungen (Diketopiperadin-Verbindungen).

C. Kohlenhydrate

Gruppe 1: Polysaccharide.

Im einzelnen zählen die nachstehenden Verbindungen zu den Vertretern lichenöser Substanzen:

I. Depsidone:

COCX

Verbindung Struktur Variolarsäure CH,

(Variolaric acid)

HO

CH₀ ²X

-O

Norstictinsäure (Norstictic acid) CH₃

OH O

CH.

HO"

CHO HO-CH—0

Pannarin

CH-

Physodalsäure
(Physodalic acid)

HO

Physodsäure
(Physodic acid) CH.

CHO

CH₂OCOCH₃ OH

CH.

,0H

HO

^C5^H11

Verbindung

Struktur

Psoromsäure (Psoromic acid)

CHO

CH.

COOH

Fumaroprotocetrarsäure

(Fumaroprotocetraric acid)

Lobarsäure (Lobaric acid

ot-Collatolsäure (oi-Collatolic acic CH₃O

Salazinsäure (Salazinic acid) COC₄H₉

CH₂OOCCH=CHCOOh

COOH

CH₂COC₅H₁₁

COO^^^^/OH

O^ γ ^COOH

CH₂OH

CHO

Verbindung

Stictinsäure (Stictic acid)

- 8

Struktur

CHO HO-CH₂-O

Alectronsäure (Alectronic acid) COO.

OH

HO^^^O-^ V^COOH

Protocetrarsäure (Protocetraric acid)

CH₂OH

COOH

II. Depside:

COO

Verbindung Struktur Hypotamnolsäure
(Hypotamnolic acid)

Th amno1s äure
(Thamnolic acid) CH.

CH₃O

Boninsäure
(Boninic acid)

C₃H₇

F^H3

COOH

OH H COOH CHO

OH

Homosekikansäure (Homosekikanic acid)

CH₃O

COO"

OCH₃ CH₃O

'COOH

C₃H₇

Barbatsäure
(Barbatic acid)

CH₃O

COO

OH

COOH

CH.

CH. OH CH₃O

COO

OH

CH₃ CH₃

COOH

Verbindung Struktur

Balbatolsäure (Balbatolic acid) CH.

COOH

COO

HO-" γ \QH

CHO OH

OH

Mikrophyllsäure (Mikrophyllic acid)

C00\ >iT\/ OH

Sphärophorin (Sphaerophorin)

CH₃O" ^ ^0H Ύ ^COOH

CH.

CH₃O

'V'

OH

COOH

C₇H₁₅

Sekikasäure (Sekicaic acid)

Diffractasäure (Diffractaic acid)

Verbindung

Atranorin Struktur

Lecanorsäure (Lecanoric acid)

Anziasäure (Anziaic acid)

Evernsäure (Evernic acid) CH₃ CH₃

HO

OH

COOCH.

CHO

CH₃

'COO

HO' ^ ^N0H

CH.

OH COOH

CH.

HO

xcxx"

COOH

^C5^H11

Obtusatsäure (Obtusatic acid)

CH

CH₃O

COO

OH

CH.

Verbindung Struktur

Olivetorsäure (Olivetoric acid) CH₂COC₅H₁₁

COO

HO'

OH COOH

Baeomycessäure (Baeomycesic acid) CH, CH.

■-y

CH₃O'

OH

CHO CH.

OH

COOH

Perlatolsäure (Perlatolic acid)

CH.

CH₃O

COO-

OH

COOH

Tenniorin

CH.

CH₃O

^C5^H11

COC) ^- / OH

CH

Umbilicarsäure (Umbilicaric acid) CH.

CH. CH.

COO^ /t\ / OH

HO^ ^y ^0CH

COC

COOH OH

CH.

3430703

III. Diphenylenoxide:

Verbindung

Struktur

Strepcilin

Didymsäure (Didymic acid)

Usninsäure (Usnic acid)

COCH

C=O

COOH

COCH.

IV. Vulpinsäuren:

Verbindung

Calycin

Struktur

O=C O

O C=O OH

Pynastolxnsäure (Pynastolinic acid) COOCH.

OCH.

Rhyzocarpxnsäure (Rhyzocarpinic acid) COOCH.

Vulpinsäure (Pulvinsäuremethylester) _/ Vulpinic acid (Pulvic acid methyl ester) 7

COOCH.

343070?

V. Anthrachinone:

Verbindung

Ii

σ;

Il ο

Struktur

Rodocradonsäure (Rodocradonic acid)

HOH₂C

HO O

Il c

c ο

OH

Endcrotin

Pariethin
(Pariethine)

HO O OH

- Il

-CH.

VI. Phenanthrenchinone:

Verbindung

Struktur

Telephorsäure (Telephoric acid)

CH=CH-CH=CH-COOh

0OH

VII. Fettsäuren:

Verbindung

Struktur

Rangiformsäure (Rangiformic acid) CH₀COOH

i ²
CHCOOH

CHCOOH

CH.

Caperatsäure (Caperatic acid) CH₂COOH ^i C(OH)COOH > -CH-

CHCOOH

^(CH2~h.3^CH3

VIII. Triterpene:

Verbindung

Struktur

Zeorin

Ursolsäure
(Ursolic acid)

COOH

IX. Tetronsäuren

Verbindung

Struktur

Protolichesterinsäure

(Protolichesterinic acid) CH^-CH C=O

CH-CH=CH HOOC

X. Xanthone:

Verbindung

Struktur

Thiophansäure
(Thiophanic acid)

CH, OH

Cl

OH

0 Cl

Hinsichtlich der physiologischen Bedeutung der lichenösen Substanzen wird angenommen, daß diese lichenösen Substanzen dazu hilfreich sind, die Flechten vor dem Angriff von Mikroorganismen oder den Bissen kleiner
Tiere zu schützen, da das Wachstum der Flechten sehr langsam erfolgt, oder daß diese lichenösen Substanzen für den Schutz der Flechten vor ultravioletter Strahlung von Nutzen sind, da die Lichenes im Unterschied zu anderen Fungi unter Sonneneinstrahlung wachsen. Aus
diesem Grund werden die lichenösen Substanzen auf der Grundlage der oben genannten Funktionen für verschiedenartige Verwendungszwecke eingesetzt, etwa als Farbstoffe, Antibiotika, Parfüme etc..

Da das Wachstum der Lichenes nur sehr langsam erfolgt
und durch die natürlichen Umweltbedingungen wie Jahreszeit, Klima, Temperatur oder geographische Breite und durch künstliche Bedingungen wie Schwefeldioxid-Gas oder Rauch beeinflußt wird, ist eine natürliche Kultivierung der Lichenes sehr schwierig und bisher nie erfolgreich gewesen. Die Sammlung großer Mengen wilder Lichenes ist ebenfalls schwierig, da es großer Erfahrung in der Identifizierung der Lichenes bedarf aufgrund der Tatsache, daß es zahlreiche Lichenes gibt, die sich in ihrem Erscheinungsbild sehr ähneln, jedoch
durch ihre Inhaltsstoffe unterscheiden.

Mit dem Ziel einer wirkungsvollen Nutzung lichenöser Substanzen für das menschliche Leben wurden ausgedehnte Untersuchungen darüber durchgeführt, eine effiziente Arbeitstechnik zur künstlichen Kultivierung von Flechten-Zellen zu entwickeln. Als Ergebnis wurde gefunden, daß der Einsatz eines Kulturmediums, das wenigstens

einen der Stoffe Saccharide, Aminosäuren, natürliche Extrakte und Agar in bestimmten oder darüber hinaus gehenden Konzentrationen ein wirtschaftliches Wachstum von Flechten-Zellen innerhalb kurzer Zeiträume ermöglicht. Es wurde auch gefunden, daß die Einarbeitung eines Pflanzenhormons in ein Kulturmedium sich beschleunigend auf das Wachstum lichenöser Zellen auswirkt. Die vorliegende Erfindung beruht auf den eben genannten Befunden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Kulturmedium, das für das Wachstum von Fungus- und/oder Algen-Zellen geeignet ist, verfügbar gemacht, das wenigstens einen der Stoffe Saccharide, Aminosäuren, natürliche Extrakte und Agar in Konzentrationen von nicht weniger als

4 Gew./Vol.-% im Fall der Saccharide, nicht weniger als 0,4 Gew./Vol.-% im Fall der Aminosäuren, nicht weniger als 4 Gew./Vol.-% im Fall der natürlichen Extrakte und nicht weniger als 4 Gew./Vol.-% im Fall von Agar enthält. Neben diesen vorgenannten Substanzen oder an

0 Stelle derselben kann das Kulturmedium ein Pflanzenhormon in ι
halten.

mon in einer Konzentration von 10 bis 10 mol/1 ent-

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Kultivierung von Fungus- und/oder Algen-

Zellen verfügbar gemacht, das dadurch gekennzeichnet ist, daß wenigstens eine Zelle ausgewählt aus Pilz-Zellen oder Algen-Zellen von Lichen-Flora in einem Kulturmedium kultiviert wird, das wenigstens einen der Stoffe Saccharide, Aminosäuren, natürliche Extrakte und 0 Agar in Konzentrationen von nicht weniger als

4 Gew./Vol.-% im Fall der Saccharide, nicht weniger als 0,4 Gew./Vol.-% im Fall der Aminosäuren, nicht weniger

als 4 Gew./Vol.-% im Fall der natürlichen Extrakte und nicht weniger als 4 Gew./Vol.-% im Fall von Agar enthält. Das Kulturmedium kann neben diesen vorgenannten Substanzen oder an Stelle derselben ein Pflanzenhormon
enthalten.

Bisher wurden diejenigen Kulturmedien, die üblicherweise zur Kultivierung von Pilzen (Fungi) verwendet werden, als solche zur Kultivierung lichenöser Zellen verwendet. Spezielle Beispiele für solche Kulturmedien
sind

Lilly & Barnett -Kulturmedium mit

Glucose (20 g/l), Asparagin (2 g/l) , Kaliumdihydrogenphosphat (1 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Eisennitrat (0,2 mg/1), Zinksulfat (0,2 mg/1),
Mangansulfat (0,1 mg/1), Thiamin (100 μg/l), Biotin (5 ug/1) und Agar (20 g/l),
Malz-Hefeextrakt-Kulturmedium mit

Malzextrakt (20 g/l), Hefeextrakt (2 g/l) und Agar (20 g/l),
0 Tolle's Kulturmedium mit

Glucose (20 g/l), Polypepton (10 g/l), Kaliumnitrat (250 mg/1), Magnesiumsulfat (75 mg/1), Kaliummonohydrogenphosphat (75 mg/1), Kaliumdihydrogenphosphat (175 mg/1), Natriumchlorid (25 mg/1),
Calciumchlorid (10 mg/1) und metallische Elemente (Spuren) und ähnliche.

Einer solchen Verwendung konventioneller Kulturmedien für lichenöse Zellen liegt die Tatsache zugrunde, daß die Lichenes den Fungi taxonomisch ähneln. Fungi und Lichenes unterscheiden sich jedoch in bezug auf den Typ ihrer Ernährung: Fungi zeigen nämlich Heterotrophie, während Lichenes sich autotroph ernähren. Aus diesem

Grunde brauchen die durch Fungi nutzbaren Nährstoffquellen nicht notwendigerwexse auch für Lichenes verwertbar zu sein. Tasächlich erfolgt das Wachstum der lichenösen Zellen auf den konventionellen Kulturmedien für Fungi im allgemeinen sehr langsam. Unerwarteterweise erfolgt das Wachstum der Lichenes auf dem Kulturmedium gemäß der vorliegenden Erfindung sehr schnell im Vergleich zu dem auf den konventionellen Kulturmedien. Demgemäß ist das Kulturmedium gemäß der vorliegenden
Erfindung zur Kultivierung lichenöser Zellen sehr geeignet.

Auf der anderen Seite sind verschiedenartige Substanzen bekannt, die das Wachstum höherer Pflanzen fördern. Sie werden "Pflanzenhormone" genannt. Wie oben angegeben,

ist das Wachstum der Lichenes unter natürlichen Bedingungen ein sehr langsames. Es ist jedoch nie darüber berichtet worden, ob irgendwelche Substanzen eine Pflanzenhormon-ähnliche Aktivität auf Lichenes auszuüben vermögen. Infolgedessen kommt es sehr überra-

sehend, daß Pflanzenhormone, die bisher als wirksam für die Wachstumsförderung höherer Pflanzen bekannt waren, auch in bezug auf die Förderung des Wachstums lichenöser Pflanzen wirksam sind.

Das Kulturmedium gemäß der vorliegenden Erfindung enthält wenigstens einen der Stoffe Saccharide, Aminosäuren, natürliche Extrakte und Agar. Als in deir. Kulturmedium gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Saccharide werden beispielhaft reduzierende Zucker (z.B. Sucrose, Glucose, Maltose), Zuckeralkohole (z.B.
Inosit, Sorbit, Mannit, Adonit) etc. genannt. Von diesen werden Zuckeralkohole bevorzugt. Als Aminosäure

kann eine natürliche oder synthetische Aminosäure (z.B. Glycin, Asparagin, Alanin) oder ein Derivat derselben eingesetzt werden. Normalerweise werden die Aminosäuren selbst, d.h. die freien Aminosäuren, verwendet. Beispiele für die natürlichen Extrakte sind Casein-Hydrolyseprodukt, Kokosnußmilch, Malzextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt etc.. Die Verwendung eines Pflanzenkeim-Extrakts ist besonders günstig.

Wenn irgendein Stoff ausgewählt aus Sacchariden, natürliehen Extrakten und Agar eingesetzt wird, kann er in dem Kulturmedium in einer Konzentration von nicht weniger als 4 Gew./Vol.-% enthalten sein. Wenn irgendein Stoff ausgewählt aus den Aminosäuren eingesetzt wird, kann er in einer Konzentration von nicht weniger als
0,4 Gew./Vol.-% enthalten sein. Wenn die Konzentration die angegebene untere Grenze unterschreitet, tritt der Effekt der Förderung des Wachstums der lichenösen Zellen nicht ein. Wenngleich eine definierte obere Grenze nicht existiert, sollten die betreffenden Konzentrationen der Saccharide, Aminosäuren, natürlichen Extrakte und Agar nicht mehr als 20 Gew./Vol.-%, nicht mehr als 10 Gew./Vol.-%, nicht mehr als 20 Gew./Vol.-% bzw. nicht mehr als 5 Gew./Vol.-% betragen.

Neben diesen vier Bestandteilen kann das Kulturmedium
wahlweise eine oder mehrere beliebige andere Nährstoffquellen enthalten, die beispielsweise ausgewählt sind aus Vitaminen (z.B. Thiaminhydrochlorid, Pyridoxinhydrochlorid, Nicotinsäure), anorganischen Stickstoff-Verbindungen, anorganischen Phosphor-Verbindungen,
Metall-Ionen etc..

Zusätzlich zu oder an Stelle von irgendeiner oder allen der vier genannten Komponenten kann das Kulturmedium auch ein Pflanzenhormon enthalten, das als eine Substanz definiert werden kann, die aufgrund ihrer Verabreichung in kleinen Dosierungen zur Förderung des Wachstums höherer Pflanzen beiträgt. Spezielle Beispiele für solche Pflanzenhormone sind Auxin, Gibberellin, Cytokinin, Abscidin, Ethylen, Indolessigsäure, Indolbuttersäure, alpha-Naphthalin-essigsäure, 4-Chlorophenoxyessigsäure, 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure, 2,4,5-Trichlorophenoxyessigsäure, alpha-Naphthylacetamid, Zeatin, Ribosylzeatin, 6-Benzyladenin, Kinetin, Gibberellinsäure, Abscisinsäure etc.. Von diesen werden Auxin und/oder Cytokinin am häufigsten verwendet. Be-

vorzugte Beispiele für die Pflanzenhormone sind die folgenden:

O(CH₂J_nCOOH

(worin m eine ganze Zahl von 2 bis 5 und η eine ganze Zahl von 1 bis 6 bezeichnen),

(worin η eine ganze Zahl von 1 bis 6 bezeichnet),

₂)_nCOOH

(worin η eine ganze Zahl von 1 bis 6 bezeichnet),

und

NH-R

IO

(worin R eine Alkyl-Gruppe mit einem aromatischen Ring bezeichnet).

Diese Pflanzenhormone können als solche oder in Form
einer Lösung in das Kulturmedium eingearbeitet werden. Gewöhnlich werden ihre wäßrigen Lösungen verwendet. Wenn sie jedoch in Wasser unlöslich oder kaum löslich sind, können ihre Lösungen in geeigneten organischen Lösungsmitteln (z.B. Dimethylsulfoxid, Ethanol) eingesetzt werden. Die Konzentration des Pflanzenhormons kann gewöhnlich 10 bis 10 mol/1 betragen.

Das Kulturmedium für den praktischen Einsatz kann mittels an sich bekannter Arbeitsweisen hergestellt werden, wobei jedoch zu berücksichtigen ist, daß die Konzentration den oben angegebenen Bedingungen genügen muß.

Die vorliegende Erfindung ist universell anwendbar auf verschiedenartige Lichenes, die einer großen Zahl von Familien angehören, darunter Teloschistaceae, Physcia-

0 ceae, Buelliaceae, Usneaceae, Aziaceae, Parmeliaceae, Candelariaceae, Lecanoraceae, Pertusariaceae, Acaropsoraceae, Imbilicariaceae, Cladoniaceae, Baeomycetaceae, Stereocaulaceae, Lecideaceae, Gyalectaceae, Asterothyriaceae, Stictaceae, Peltigeraceae, Pannariaceae, Coc-

cocarpiaceae, Placynthiaceae, Heppiaceae, Collemataceae, Lichinaceae, Graphidaceae, Thelotremataceae,

Diploschistaceae, Verrucariaceae, Pyrenulaceae, Strigulaceae, Sphaerophoraceae, Calidiaceae, Cypheliaceae, Lecanactidaceae, Opegraphaceae, Arthopyreniaceae, Arthoniaceae, Dictyonemaataceae, Clavariaceae, Agaricaceae und so weiter.

Wie oben angegeben wurde, ist die vorliegende Erfindung allgemein und weit verbreitet zur Kultivierung von Lichen-Flora einsetzbar, insbesondere von Pilz-Zellen und/oder Algen-Zellen lichenöser Pflanzen. Ein typisches Beispiel wird hiernach im Einzelnen mit der Anwendung auf Usnea rubescens (Usneaceae, Lecanorales) beschrieben. Die im wesentlichen gleiche Arbeitsweise kann zur Kultivierung von Zellen beliebiger anderer Arten von Lichen-Flora angewandt werden.

Thallus von Usnea rubescens wird auf eine gewünschte Größe zerschnitten, und die erhaltenen Stücke werden gut mit Wasser gewaschen. Dann werden die gewaschenen Stücke mittels physikalischer und/oder chemischer Methoden soweit wie möglich zerkleinert, wodurch ZeIl-0 blöcke geringer Größe erhalten werden. Für diese Zerkleinerung können beliebige physikalische (d.h. mechanische) Arbeitsweisen unter Benutzung eines Mörsers, eines Homogenisators, eines Messers, eines Mikrotoms oder dergleichen angewandt werden. Die bestmögliche 5 Zerkleinerung kann auch mittels chemischer Arbeitsweisen unter Verwendung eines die interzellulären Bindungen trennenden Reagens wie Cellulase (z.B. "Dricellase", hergestellt von Kyowa Hokko; "Cellulase-Onozuka", hergestellt von Kinki Yakult) erreicht werden.

Das erhaltene Zerkleinerungsprodukt enthält monozelluläre Bakterien oder Fungi, Zellen von Usnea rubescens,

Zellblöcke von Usnea rubescens etc.. Aus einem solchen werden nur die Zellblöcke von Usnea rubescens, die wenigstens 2 Zellen enthalten und eine maximale Größe von nicht mehr als 10 mm besitzen, vorzugsweise wenigstens 10 Zellen enthalten und eine maximale Größe von nicht mehr als 1 mm besitzen, für die Kultivierung eingesetzt. Die Größe des Zellblocks ist zweckmäßig, um einerseits das überleben des Zellblocks sicherzustellen und andererseits andere verunreinigende Zellen in wirksamer Weise auszuschalten.

Zum Sammeln dieser Zellblöcke gibt es die Arbeitsweise unter Benutzung eines Manipulators, die Arbeitsweise unter Benutzung eines Zell-Sorters, die Arbeitsweise unter Zentrifugieren etc., von welchen die Arbeitsweise unter Einsatz wenigstens eines Filters unter dem Gesichtspunkt der Gewinnung einer großen Menge der gewünschten Zellblöcke mittels eines einfachen Arbeitsganges innerhalb kurzer Zeit am stärksten zu empfehlen ist. Das Filter kann aus einem beliebigen Material ge-

0 fertigt sein, das auf die Zellblöcke keinen ungünstigen Einfluß ausübt, wie etwa Nylon oder nichtrostender Stahl.

Gewöhnlich wird das wie oben beschrieben erhaltene Zerkleinerungsprodukt auf ein Filter mit einer Maschengröße von nicht mehr als 1 000 μΐη. gegeben, und das Filtrat wird dann auf ein Filter mit einer Maschengröße von nicht weniger als 10 μΐη gegeben. Die auf dem letzteren Filter zurückgehaltenen Zellblöcke werden gesammelt und anschließend mit sterilem Wasser gewaschen.

0 Die Zellblöcke werden auf ein für das Wachstum geeignetes Medium gegeben und bei einer Temperatur von 0⁰C bis

4O⁰C kultiviert. Nach etwa einem Monat sind die Zellkulturen soweit gewachsen, daß sie mit bloßem Auge sichtbar sind. Die Kultivierung kann unter Schütteln oder Rühren oder auch im Ruhezustand durchgeführt werden.

Sofern die genannten erfindungswesentlichen Bedingungen erfüllt sind, kann das Kulturmedium natürlich oder synthetisch und organisch oder anorganisch sein. Beispielsweise kann das Kulturmedium ein solches sein, das durch Zugabe von Nährstoffquellen, Kohlenstoff-Quellen, natürlichen Extrakten etc. zu einem an sich konventionellen synthetischen organischen oder anorganischen Medium als dem Basalmedium hergestellt ist. Beispiele für konventionelle anorganische Medien sind White-Me-

dium, Hildebrand-Medium, Linsmaier-Skooge-Medium, Murashige-Skooge-Medium, Lilly-Bernet-Medium, Hamada-Medium Nr. 118 etc.. Beispiele für konventionelle organische Medien sind Malz-Hefeextrakt-Medium, Bodenextrakt-Medium etc.. Modifizierte oder verbesserte Medien dersel-0 ben können ebenfalls verwendet werden. In jedem Fall werden diese Medien vor ihrer Verwendung so eingestellt, daß sie die wesentlichen Bedingungen gemäß der Erfindung erfüllen.

Gewünschtenfalls können die Kultivierungsmedien ein

beliebiges antibiotisches Mittel enthalten, um die Selektionswirksamkeit der Zellblöcke der Lichen-Flora zu verstärken oder die allein aus fungösen Zellen oder algalen Zellen bestehenden Zellblöcke zu erhalten. Zum Zweck der Gewinnung der Blöcke fungöser Zellen kann ein solches Anti-Algen-Mittel wie Kanamycin (hergestellt von Meiji Seika) oder Sorcilin (hergestellt von Takeda

Yakuhin) eingearbeitet werden. Zum Zweck der Gewinnung der Blöcke algaler Zellen kann ein solches antifungales Mittel wie Coatside (eine Benzimidazol-Verbindung; hergestellt von Takeda Yakuhin) eingearbeitet werden.

Die vorliegende Erfindung wird hiernach durch die folgenden Beispiele näher erläutert, in denen "%", sofern nichts anderes angegeben ist, "Gew./Vol.-%" bedeutet. Kulturen der reinen Zellblöcke von Lichenes, wie sie in diesen Beispielen verwendet werden, sind hinterlegt bei dem Depository in dem Technical Center, das zu Nippon Paint Co., Ltd., in Neygawa-shi, Osaka-shi, Japan, gehört. Weiterhin ist die Kultur der reinen fungösen Zellblöcke von Usnea rubescens in dem Fermentation Research Institute of Japan unter der Hinterlegungs-Nr.

FRI 6932 und auch bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 20668 hinterlegt. Weiterhin ist die Kultur der reinen algalen Zellblöcke von Usnea rubescens bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 206 67

hinterlegt.

Beispiel 1

Ein Stück mit einer Länge von etwa 1 cm wurde aus dem Thallus von Usnea rubescens (Usneaceae, Lecanorales) (ohne Apothecium), gesammelt in Kyoto-shi, geschnitten, ausreichend mit Wasser gewaschen und in einem Mörser zerkleinert. Das zerstoßene Material wurde durch ein 5 00 μΐΐΐ-Filter filtriert. Das Filtrat wurde nochmals durch ein 150 μΐη-Filter filtriert. Die auf dem Filter zurückgehaltenen Zellblöcke wurden mehrmals in sterilem 0 destillierten Wasser gespült. Hundert davon entnommene

Zellblöcke wurden jeweils auf ein Kulturmedium (5 ml) gegeben, das Malzextrakt (Difco) (4 %), Hefeextrakt (Difco) (0,2 %) und Agar (2 %) in Wasser enthielt und vorher sterilisiert worden war.

Die Inkubation erfolgte an einem dunklen Ort bei einer Temperatur von 2O⁰C. Nach 10 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen (fungale und algale Zellen) 28,7 mg.

Beispiel 2

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, jedoch mit der Abweichung, daß die Konzentrationen von Malzextrakt und Agar auf 2 % bzw. 4 % eingestellt worden waren, wurde die Inkubation durchgeführt. Nach 10 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen 25,6 mg.

Bezugsbeispiel 1

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, jedoch mit der Abweichung, daß die Konzentration von Malzextrakt auf 2 % eingestellt worden war, wurde die Inkubation durchgeführt. Nach 10 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen 13,3 mg.

Bezugsbeispiel 2

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, jedoch unter Verwendung eines Kulturmediums mit Glucose (10 g/l), Asparagin (2 g/l), Agar (2 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Eisennitrat (0,2 mg/1), Zinksulfat (0,2 mg/1), Mangansulfat

(0,1 mg/1), Thiamin (100 μg/l) und Biotin (5 ug/1) wurde die Inkubation durchgeführt. Nach 20 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen 5,2 mg.

Beispiel 3

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, jedoch unter Verwendung eines Kulturmediums mit Adonit (40 g/l), Asparagin (4 g/l), Agar (2 g/l) , Kaliumdihydrogenphosphat (1 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Eisennitrat
(0,2 mg/1), Zinksulfat (0,2 mg/1), Mangansulfat

(0,1 mg/1), Thiamin (100 \ig/l) und Biotin (5 ug/1) wurde die Inkubation durchgeführt. Nach 20 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen 21,2 mg.

Beispiel 4

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, jedoch unter Verwendung eines Malzextrakt (40 g/l) enthaltenden Kulturmediums wurde die Inkubation durchgeführt. Nach 20
Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen 68,2 mg.

Beispiele 5 bis 34

Unter Einsatz von Zellblöcken der nachstehend aufgeführten lichenösen Pflanzen wurde die Inkubation in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wonach
kultivierte Zellen mit ausgezeichnetem Wachstum erhalten wurden.

Beispiel

Nr.

Name

Ort

Hinterlegungs- Nr.

5 Pertusaria flavicans

6 Parmelia subramigera

7 Parmelia calvulifera

8 Parmelia squarrosa

9 Parmelia caperata

10 Menegazzia terebrata

11 Parmelia tinctorum

12 Parmelia entotheiochroa

13 Usnea dorogawaensis

14 Ramalina subgeniculata

15 Ramalina yasudae 16 Usnea rubicunda

17 Lobaria orientalis

18 Alectoria ochroleuca

19 Usnea aciculifera

20 Anaptychia microphylla

0 21 Pyxine endochrysina

22 Lobaria discolor

23 Parmelia rudecta

2 4 Cladonia rangiferina

25 Peltigera canina

26 Evernia esorediosa

27 Usnea diffracta

2 8 Cetraria juniperina

29 Evernia prunastri

30 Usnea longissima

0 31 Ramalina boninensis

32 Ramalina pacifica

33 Umbilicaria esculenta

3 4 Umbilicaria kisovana

Hirakata-shi

Kyoto-shi

Toyama-ken

Nagano-ken

Kyoto-shi

Hirakata-shi

Shiga-ken

Kyoto-shi

Furano-shi

Tokyo-to

Hiroshima-shi

NP L-19 NP L-20 NP L-I NP L-3 NP L-4 NP L-5 NP L-6 NP L-7 NP L-8 NP L-9 NP L-Il NP L-12 NP L-13 NP L-14 NP L-15 NP L-17 NP L-I8 NP L-22 NP L-23 NP L-24 NP L-25 NP L-45 NP L-42 NP L-53 NP L-4 7 NP L-3S NP L-120 NP L-119 , NP L-110 NP L-lll

- 33 Beispiel 35

Ein Stück mit einer Länge von etwa 1 cm wurde aus dem Thallus von Usnea rubescens (Usneaceae, Lecanorales) (ohne Apothecium), gesammelt in Kyoto-shi, geschnitten, ausreichend mit Wasser gewaschen und in einem Mörser zerkleinert. Das zerstoßene Material wurde durch ein 500 μΐη-Filter filtriert. Das Filtrat wurde nochmals durch ein 150 μΐη-Filter filtriert. Die auf dem Filter zurückgehaltenen Zellblöcke wurden mehrmals in sterilem destillierten Wasser gespült. Hundert davon entnommene Zellblöcke wurden jeweils auf ein Kulturmedium (5 ml) gegeben, das Malzextrakt (Difco) (2 %) , Hefeextrakt (Difco) (0_r2 %) und Agar (2 %), alpha-Naphthalin-essigsäure (10~ mol/1) und Kinetin (1O^-3 mol/1) in Wasser

enthielt und vorher sterilisiert worden war.

Die Inkubation erfolgte an einem dunklen Ort bei einer Temperatur von 20⁰C. Nach 10 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen (fungale und algale Zellen) 36,8 mg.

Bezugsbeispiel 3

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1, jedoch mit der Abweichung, daß das Kulturmedium alpha-Naphthalinessigsäure und Kinetin nicht enthielt, wurde die Inkubation durchgeführt. Nach 10 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen 13,3 mg.

Beispiel 36

Ein Stück mit einer Fläche von etwa 0,5 cm² wurde aus dem Thallus von Parmelia subramigera (Parmelaceae,

Lecanorales) (ohne Apothecium), gesammelt in Hirakatashi, geschnitten, ausreichend mit Wasser gewaschen und in einem Mörser zerkleinert. Das zerstoßene Material wurde durch ein 500 μΐη-Filter filtriert. Das Filtrat wurde nochmals durch ein 150 μΐη-Filter filtriert. Die auf dem Filter zurückgehaltenen Zellblöcke wurden mehrmals in sterilem destillierten Wasser gespült. Hundert davon entnommene Zellblöcke wurden jeweils auf ein Kulturmedium (5 ml) gegeben, das Malzextrakt (Difco) (2 %), Hefeextrakt (Difco) (0,2 %) und Agar (2 %), In-

— 3 —7

dol-essigsäure (10 mol/1) Gibberellin A-, (10 mol/1)

-5
und Kinetin (10 mol/1) in Wasser enthielt und vorher sterilisiert worden war.

Die Inkubation erfolgte an einem dunklen Ort bei einer Temperatur von 2O⁰C. Nach 10 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen 18,2 mg.

Bezugsbeispiel 4

In der gleichen Weise wie in Beispiel 36, jedoch mit der Abweichung, daß das Kulturmedium Indol-essigsäure, Gibberellin A-. und Kinetin nicht enthielt, wurde die Inkubation durchgeführt. Nach 10 Wochen betrug das mittlere Frischgewicht der kultivierten Zellen 6,8 mg.

Beispiele 37 bis 66

In der gleichen Weise wie in Beispiel 35 wurden Stücke der nachstehend aufgeführten lichenösen Pflanzen behandelt, und die erhaltenen Zellblöcke wurden kultiviert. Als Ergebnis wurden kultivierte Zellen mit ausgezeichnetem Wachstum erhalten wurden.

Beispiel
Nr.

Name

Ort

37 Pertusaria flavicans

38 Parmelia subramigera

3 9 Parmelia calvulifera

40 Parmelia squarrosa

41 Parmelia caperata

42 Menegazzia terebrata 43 Parmelia tinctorum

44 Parmelia entotheiochroa

45 Usnea dorogawaensis

4 6 Ramalina subgeniculata 47 Ramalina yasudae

4 8 Usnea rubicunda

4 9 Lobaria orientalis

5 0 Alectoria ochroleuca

51 Usnea aciculifera

52 Anaptychia microphylla 53 Pyxine endochrysina

54 Lobaria discolor

55 Parmelia rudecta

56 Cladonia rangiferina

57 Peltigera canina 58 Evernia esorediosa

59 Usnea diffracta

60 Cetraria juniperina

61 Evernia prunastri

62 Usnea longissima

63 Ramalina boninensis

64 Ramalina pacifica

65 Umbilicaria esculenta

66 Umbilicaria kisovana

Hirakata-shi Hirakata-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Toyama-ken Nagano-ken Kyoto-shi Kyoto-shi Hirakata-shi Shiga-ken Kyoto-shi Kyoto-shi Kyoto-shi Furano-shi Furano-shi Furano-shi Furano-shi Furano-shi Tokyo-to Tokyo-to Hiroshima-ken Hiroshima-ken

Claims

VON KREISLER SCHöNWALÖ "ElStIOLt) FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler 11973 Dr.-Ing. K. W. Eishold 11981 Dr.-Ing. K. Schönwald Dr. J. F. Fues Dipl.-Chem. Alek von Kreisler Dipl.-Chem. Carola Keller Dipl.-Ing. G. Selting Dr. H.-K. Werner Nippon Paint Co., Ltd. Osaka, Japan. DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF D-5000 KÖLN 1 21. August 1984 AvK/GF 922 Patentansprüche

1. Für die Kultivierung von Flechten-Zellen (lichenösen Zellen) geeignetes Kulturmedium, enthaltend wenigstens einen der Stoffe Saccharide, Aminosäuren, natürliche Extrakte und Agar in Konzentrationen von nicht weniger als 4 Gew./Vol.-% im Fall der Saccharide, nicht weniger als 0,4 Gew./Vol.-% im Fall der Aminosäuren, nicht weniger als 4 Gew./Vol.-% im Fall der natürlichen Extrakte und nicht weniger als 4 Gew. /Vol.-% im Fall von Agar.

2. Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Saccharid und wenigstens eine Aminosäure enthält.

3. Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Saccharid, wenigstens eine Aminosäure und wenigstens einen natürlichen Extrakt enthält.

Telefon: (0221) 131041 · Telex: 8882307 dopa d ■ Telegramm: Dompatent Köln

3430703

4. Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Saccharid ein Zuckeralkohol ist.

5. Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure eine freie Aminosäure ist.

6. Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der natürliche Extrakt ein Pflanzenkeim-Extrakt ist.

7. Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin wenigstens ein Pflanzenhormon enthält.

8. Kulturmedium nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Pflanzenhormon eine Substanz mit wachstumsfördernder Wirkung auf höhere Pflanzen ist.

9. Kulturmedium nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Pflanzenhormon Auxin oder Cytokinin ist.

10. Kulturmedium nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Pflanzenhormon in einer Konzentration von 10

_3
bis 10 mol/1 enthalten ist.

11. Für die Kultivierung lichenöser Zellen geeignetes Kulturmedium., enthaltend wenigstens ein Pflanzenhormon in einer Konzentration von 10 bis 10 mol/1.

12. Verfahren zur Kultivierung lichenöser Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Zelle ausgewählt aus Pilz-Zellen oder Algen-Zellen von Lichen-Flora in dem Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 11 kultiviert wird, um ein Wachstum so bald als möglich zu erreichen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichen-Flora augewählt ist aus Usnea, Parmelia, Pertusaria, Cladonia, Pseudocyphellaria, Menegazzia, Ramalina, Lobaria, Alectoria, Anaptychia, Pyxine, PeI-tigera, Cetraria und Evernia.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die lichenösen Zellen Pilz-Zellen und/oder Algen-Zellen von Lichen-Flora sind.