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Patentanspräche und Beschreibung zur Patentanmeldung Verfahren zur
Herstellung von A-Ristomycinsalzen und/oder A-Ristomycin und/oder Derivaten derselben
beziehungsweise desselben hoher Reinheit sowie diese Verbindung( en) enthaltende
Reagenzien zur Anwendung in Thrombozytenaggregationsversuchen und Verfahren zur
Herstellung der letzteren
Beschreibung Die Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Herstellung von A-Ristomycinsalzen und/oder A-Ristomycin und/oder
Derivaten derselben der allgemeinen Formel
worin R1 für einen {[O-α-D-Arabinofuranosyl]1 # 2[-O-α-D-mannopyranosyl]1
# 2[-O-α-L-rhamnopyranosyl]1 # 6[-O-ß-D-glucopyranosyl]}-Rest <{O-α-D-Araf]1
# 2[-O-α-D-Manp]1 # 2[-O--α-L-Rhap]1 # 6[-O-ß-D-Glop]}-Rest > steht,
R2 einen 2,3,6-Tridesoxy-3-amino
-ribo-hexapyranosylrest bedeutet, R3 einen α-D-Mannopyranosylrest darstellt,
R4 für einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) steht, X einen Mineralsäurerest
bedeutet und Y ein Wasserstoffatom oder einen Rest der allgemeinen Formel
in welchletzterer Z für ein Wasserstoff- oder Halogenatom steht und n eine ganze
Zahl von 0 bis 5 ist, darstellt,
sowie biologische Reagenzien zur
Anwendung in Thrombozytenaggregationsversuchen, insbesondere zur Diagnostizierung
der Willebrand-Krankheit, und ein Verfahren zur Herstellung der letzteren.
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Es ist bekannt, daß bei der Reihenuntersuchung von hämophilen Kranken
in der Beurteilung der Blutplättchenfunktionen die wertvollsten Angaben durch die
Thrombozytenaggregationsversuche geliefert werden. Neben den routinemäßig verwendeten
Aggregationsmitteln (zum Beispiel Adenosindiphosphorsäure [ADP], Adrenalin und Kollagen)
spielt seit 1971 die als Ristocetin genannte, vorher als Antibioticum verwendete
Substanz eine wichtige Rolle. Auf Grund-der Versuche von Howard und Firkin ermöglichte
das Ristocetin die schnelle und einfache Erkennung der angeborenen beziehungsweise
mitgebrachten Hämophilie, der Willebrand-Krankheit (Thrombosis und Diathesis Haemorrhagica
26 [1971], 362).
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Das Wesen der Willebrand-Krankheit ist der Ausfall beziehungsweise
Defekt des VIII. Faktorkomplexes der Blutgerinnung. Die wichtigste biologische Rqlle
des Willebrand-~Faktors besteht in der Förderung der Thrombozytenhaftung beziehungsweise
Thrombozytenadhäsion an die subendothelialen Formeln. Der Mangel am oder die. qualitative
Störung [des] Willebrand-Faktor[s] ruft das als Willebrand-Krankheit genannte Erankheitsbild
hervor, welches die am meisten verbreitete Form der angeborenen Hämophilie darstellt.
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Es ist sehr wichtig, den an Willebrand-Krankheit leidenden Kranken
auszusondern (Vererbung, Familienversuche, Therapie). Besonders die Aufklärung und
Absonderung eines derartigen Krankheitsbildes vor dem operativen Eingriff ist von
grundlegender Bedeutung.
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Von sowaetischen Forschern wurde das Ristomycin-Antibioticum aus
Kulturen von Proactinomyces fructiferi var.
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ristomycin durch Adsorption, vorteilhaft an einer SzDSz-3- oder SzDV-3-Kationenaustauschersäule,
und Eluieren mit einer acetonischen Ammoniaklösung oder einer Ammoniumacetatpufferlösung
mit einem pH-Wert von 9 bis 10 isoliert. Das Ristomycin wurde in Form der Base isoliert.
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Später wurde Ristomycin ähnlich wie Ristocetin in 2 biologisch aktive
Bestandteile, in das. A- und B-Ristomycin, getrennt. Die Erzeugung des Antibioticums
im Betriebsmaßstab wurde ebenfalls offenbart. Zur Bestimmung.des Wirkstoffgehaltes,
der Gärbrühe und der Zwischenpro.dukte wurde neben der biologischen- Wertbestimmung
auch ein polarimetrisches Verfahren und ein UV-spektrophotometrisches Verfahren
ausgearbeitet (sowjetische Patentschrift 180 754; Antibiotiki 8 [1962], 392; Antibiotiki
9 [1964], 884; Antibiotiki 10 [1965], 217; Antibiotiki 12 [196?], 129; Antibiotiki
16 [1971], 786).
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Auch die genaue Struktur des A-Ristomycines wurde bereits bestimmt
(J. Org. Chem. 39 [1974], 2 971; J. Antibiot. 32 [19791, 446; Tetrahedron Letters
21 {1980], 2 983; JACS 102 [1980], 7 093).
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Ferner ist es bekannt, daß in der Kulturbrühe der Mikroorganismen
Nocardia lurida NRRL 2430 und Proactinomyces fructiferi var. ristomycini je 2 biologisch
aktive Bestandteile erzeugt werden. Wenn das erhaltene Antibioticum als antibakterielles
Heilmittel verwendet wird, stört die Gegenwart des B-Bestandteiles im A-Ristomycin
nicht, da gegen pathogene Mikroorganismen beide Wirkstoffe wirksam sind. Der B-Bestandteil
weist sogar eine wesentlich höhere baktericide Wirkung als der A-Bestandteil auf.
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Im Gegensatz dazu ist jedoch bei der Anwendung der bei den Antibiotica
zu hämatologischen Versuchen nur der A-Bestandteil wertvoll. In den Artikeln von
Jenkins und Mitarbeitern (Thromb. Res. 7 [1975], 531) wird auf diese Tatsache im
Falle des Ristocetinhingewiesen. Von diesen Verfassern wurde festgestellt, daß das
B-Ristocetin in normalen Humanthrombozyten nicht aggregiert.
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Es ist auch bekannt, daß unter den alkalischen Bedin-.
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gungen der Gärung und der Ionenaustauscherreinigung beide Ristomycinmoleküle
einer Zersetzung unterliegen können. Zur Klärung dieser Vorgänge wird als Modellverbindung
das Garboxy-A-ristomycinhergestellt. Es wurde festgestellt, daß diese Verbindung
das.normale Humanthrombozytenplasma nicht aggregiert und die durch A-Ristomycin
induzierte Aggregation nicht hemmt. Dies bedeutet, daß die unter Einwirkung von
Alkali stattgefundene Hydrolyse der C-endständigen, Methoxycarbonylgruppe des sehr
empfindlichen Glykopeptidmoleküles (und die eventuell darauffolgende Retroaldolspaltung
an beiden ß-Hydroxyphenylserineinheiten) das A-Ri-.
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stomycinpräparat zu hämatologischen Zwecken vollständig wertlos und
unanwendbar machen kann. Nach eigenen Erfahrungen kann das A-Ristomycin ton diesen
unerwünschten Begleit-, stoffen mit Hilfe des bei den bekannten Verfahren verwendeten
wäBrig-alkoholischen Umkristallisierens nicht befreit werden.
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Es ist noch darauf hinzuweisen, daß die Ristomycinbase äußerst hygroskopisch
ist. Diese Verbindung kann beim Stehenlassen an der Luft innerhalb einiger Minuten
mehr als 15 Gew.-% Feuchtigkeit, bezogen auf das Gewicht der Base, aufnehmen. Daher
ist es fast unmöglich, an diesem Präparat eine genaue Einwaage vorzunehmen. Gleichzeitig
wurde von der Anmelderin festgestellt, daß die Aggregationsaktivität
der
A-Ristomycinproben während des in alltäglicher Laboratoriumspraxis üblichen mit
Phosphorpentoxyd durchgeführten Trocknens einer irreversibilen Schädigung unterliegt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung
von in biologischen Versuchen gut geeigneten beziehungsweise geeignetem Ristouiycinsalzen
und/oder Ristomycin und/oder Derivaten derselben beziehungsweise desselben in sehr
hoher Reinheit sowie Reagenzien zur Anwendung in Thrombozytenaggregationsversuchen,
insbesondere zur Diagnostizierung der Willebrand-Krankheit, mit einem Gehalt an
1 oder mehr, Verbindung(en) mit in diesen Versuchen verwendbarer Struktur und ein
Verfahren zur Herstellung dieser Reagenzien zu schaffen.
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Das Obige wurde. überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von A-Ristomycinsalzen
und/oder A-Ristomycin und/oder Derivaten derselben beziehungsweise desselben beziehungsweise
von Ristomycinderivaten hoher Reinheit der allgemeinen Formel
worin R1 für einen einen {[O-α-D-Arabinofuranosyl]1 # 2[-O-α-D-mannopyranosyl]1
# 2[-O-α-L-rhamnopyranosyl]1 # 6[-O-ß-D-glucopyranosyl] <{[O-α-D-Araf]1
# 2[O-α-D-Manp] -α-L-Rhap]1 # 6[-O-ß-D-Glop]}-Re steht, R2 einen 2,3,6-Tridesoxy-3-amino
-ribo-hexapyranosylrest bedeutet, R3 einen α-D-Mannopyranosylrest darstellt,
R4 für einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom (en) steht, X einen Mineralsäurerest
bedeutet, und ein' Wasserstoffatom oder einen Rest der allgemeinen Formel
in welchletzterer Z . für ein Wasserstoff- oder Halogenatom steht und n eine ganze
Zahl von 0 bis 5 ist darstellt,
welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß 1) a) der pH-Wert einer 30 bis 50 gew.-%-igen wäßrigen Lösung der rohen
Ristomycinbase durch Behandeln mit einer Mineralsäure auf 6,7 bis 7,0 eingestellt
und die Lösung davor und/od;er danach, gegebenenfalls unter Zwischenschalten eines
Klärens, vorzugsweise mit Aktivkohle, und Filtrierens, mit einem mit Wasser mischbaren
niederen aliphatischen Carbonsäurenitril in einer Menge von 15 bis 50% [Vol./Vol.]
bei Raumtemperatur, gegebenenfalls mehrmals, behandelt wird oder b) der pH-Wert
einer 30 bis 50 gew.-%-igen wäßrigen Lösung eines verunreinigten A-Ristomycinsalzes
oder rohen Ristomycinsalzes mit einer Alkalilösung auf 6,7 bis 7,0 eingestellt und
die Lösung davor und/oder danach, gegebenenfalls unter Zwischenschalten eines Klärens,
vorzugsweise mit Aktivkohle, und Filtrierens, mit einem mit Wasser mischbaren niederen
aliphatischen Carbonsäurenitril in einer Menge von 15 bis 50% [Vol./Vol.] bei Raumtemperatur,
gegebenenfalls mehrmals, behandelt wird und darauffolgend das A-Ristomycinsalz und/oder
A-Ristomycin bei +4°C kristallisiert wird und gegebenenfalls, gegebenenfalls nach
seinem Reinigen, vorzugsweise durch UmEristallisieren, in einem organischen Lösungsmittel
gelöst beziehungsweise suspendiert und danach mit einem Acylierungsmittel vom Säureanhydridtyp
bei einer Temperatur von 0 bis 200C acyliert wird oder II) eine Lösung beziehungsweise
Suspension eines, gegebenenfalls nach I) erhaltenen, rohen A-Ristomycinsalzes oder
von roher Ristomycinba'se oder eines rohen Ristomycinsalzes in einem organischen
Lösung
mittel mit einem Acylierungsmittel, vorzugsweise vom Säureanhydridtyp,
behandelt wird sowie das beziehungsweise die erhaltene(n) Produkt(e) isoliert und
gegebenenfalls (weiter)g3reinigt wird beziehungsweise werden.
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Im Falle von A-Ristomycin fehlt in der allgemeinen Formel I der Teil
Hx.
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Gegebenenfalls kann das A-Ristomycin aus seinen ßalzen in üblicher
Weise freigesetzt werden..
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Vorzugsweise wird bei der Variante I) a) des erfindungsgemäßeal.
Verfahrens als Mineralsäure verdünnte Schwefelsäure verwendet.
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Vorzugsweise wird bei der Variante I) b) des erfindungsgemäß.en Verfahrens
als verunreinigtes A-Ristomycinsalz ein verunreinigtes A-Ristomycinsulfat, insbesondere
A-Ristomycinmonosulfat, verwendet.
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Es ist auch bevorzugt, bei der Variante I) b) des erfindungsgehäßen
Verfahrens als Alkalilösung eine Ammoniumhydroxydlösung zu verwenden.
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Vorzugsweise wird das Einstellen des pH-Wertes auf 6,8 vorgenommen.
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Es ist auch bevorzugt, das aliphatische Carbonsäurenitril in einer
Menge von 20 bis 50% [Vol./Vol.] zu verwenden.
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Ferner ist es bevorzugt, als aliphatisches Carbonsäurenitril Acetonitril
zu verwenden.
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Weiterhin ist es bevorzugt, als organisches Lösung mittel ein Alkanol,
insbesondere mit 1 bis 5 Eohlenstoffatom(en), oder ein Gemisch von Alkanolen zu
verwenden.
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Insbesondere wird als Acylierungsmittel Trifluoressig säureanhydrid
verwendet.
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Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird wie folgt vorgegangen.
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Nach einer vorteilhaften Variante [a)] des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird also der pH-Wert einer aus der nach einem bekannten Gärverfahren hergestellten
rohen Ristomycinbase durch deren Lösen in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur
hergestellten 50 bis 50 gew.-°/O-igen wäßrigen Lösung mit einer Mineralsäure, vorzugsweise
verdünnter Schwefelsäure, auf 6,7 bis 7,0 eingestellt.
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Als Ausgangsstoff kann auch ein rohes A-Ristomycinsalz, vorzugsweise
rohes A-Ristomycinsulfat,, insbesondere A-Ristomycinmonosulfat, eingesetzt, werden.
Nach einer anderen vorteilhaften Variante tb)] des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird also der gewünschte pH-Wert von 6,7 bis 7,0 einer 30 bis 50 gew.-%-igen wäßrigen
Lösung des rohen A-Ristomycinsalzes, wie A-Ristomycinsulfates, durch Zugabe einer
verdünnten Alkalilösung, vorzugsweise Ammniumhydroxydlösung,. eingestellt.
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Das Einstellen des optimalen. pH-Wertes kann mit Hilfe von Instrumentenmessung
oder vorteilhaft des tfmschlagens eines Bromthymolblauindikators von Gelb in Himmelblau
durchgeführt werden.
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Zur nach einer der obigen vorteilhaften Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens vorbereiteten Lösung wird eine Menge von 15 bis 50% [Vol./Vol.], vorzugsweise
20 bis 50% [Vol./Vol.], eines mit Wasser mischbaren niederen aliphatischen Carbonsäurenitriles
(Alkylnitriles)
vorzugsweise von Acetonitril, zugegeben, worauf
die Kristallisation beginnt.
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Wach einer.anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemaßen
Verfahrens kann bei beiden obigen Varianten [a) und b)] des erfindungsgemäßen Verfahrens
beim Kristallisieren eines Rohproduktes höherer Reinheit auch in der Weise vorgegangen
werden, daß der wäßrigen A-Rist'omycinsalzlösung, vorzugsweise A-Riston5ycinsulfatlösung
zunächst 15 bis 50% [Vol./Vol.], vorzugsweise 20 bis 50% [Vol./Vol.], eines mit
Wasser mischbaren niederen aliphatischen Carbonsäurenitriles (Alkylnitriles), vorzugsweise
von Acetonitril, zugesetzt werden danach der pH-Wert auf 6,7 bis 7,0 eingestellt
wird und die opaleszierende Lösung bis zum Lösen erwärmt und langsam auf Rauntemperatur
abkühlen gelassen wird.
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Die Kristalle werden auf dem Filter mit einem Gemisch von Aceton
und Wasser und/oder mit Aceton gewaschen und darauffolgend in einem Vakuumexsikkatqr
über vorher erhitztem Oalciumchlorid und Paraffinspänen bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet.
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So kann das eine ausgezeichnete Aggregationsfähigkeit aufweisende,
nicht hygroskopische, kristalline A-Ristoinycinsulfat hoher Reinheit in einer Ausbeute
von 60 bis 80% (je nach dem Wirkstoffgehalt des Ausgangsstoffes) erhalten, werden.
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Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird das rohe A-Ristomycin salz, wie A-Ristom;ycinsulfat, in einem organischen
Lösungsmittel, vorzugsweise in einem Alkanol, insbesondere einem solchen mit 1 bis
5 Kohlenstoffatom(en), oder einem Gemisch von Alkanolen gelöst beziehungsweise suspendiert,
worauf
ein Acylierungsmittel, insbesondere Trifluoressigsäureanhydrid,
zugetropft wird. Das Rohprodukt kann, falls es erwunscht ist durch Umkristallisieren
gereinigt werden Es ist klar, daß bei der Isolierung des Antibioticums.
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zum Nachweis von etwaigen Begleitstoffen und Vertinreinigungen, nämlich
des B-Bestandteiles und der-durch alkalische Zersetzung gebildeten verschiedenen
Produkte, die bisher verwendeten Meßverfahren (bekannte Testmikroorganismen verwendendes
biologisches Verfahren, tw-spektrophotometrische Wirkstoffbestimmung und Messung
des optischen Drehvermögens) allein nicht ausreichen. Die Begleitstoffe weisen nämlich
bei 280 nin ebenfalls. eine UV-Lichtabsorption auf und haben ein optisches Drehvermögen
ähnlichen Sinnes.
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Es wurden eigene Versuche unternommen, um aufzuklären, in welchem
Maße und inwieweit die Änderung der Struktur der Verbindung beziehungsweise der
Reinheitsgrad des A-Ristomycines die Thrombozytenaggregation beeinflussen.
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Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die partielle oder
vollständige Entfernung der Reste, für die R1 , R2 s R3 und R4 in der allgemeinen
Formel I stehen, beziehungsweise die Blockierung der Hydroxyfunktionen solcher Reste
und der phenolischen Eydroxygruppen (in Form eines Esters oder Äthers) unerwünschte
biologische Wirkungen des Antibioticums und in manchen Fällen auch eine ungünstige
Änderung der Löslichkeit zur Folge haben. Das durch Ersetzen des Alkylrestes, für
den R4 steht, durch ein Wasserstoffatom beziehungsweise eine Carboxylgruppe erhaltene
Carboxy-A-ristomycin übt keine das Humanthrombozyten-.plasma aggregierende Wirkung
aus und hemmt die durch Ristomycin induzierte Thrombozy,tenaggregation. Das an den
phenolischen lIydroxygruppen. blockierte Tetra-0-(methyl) --A-ristomycinderivat
(statt
des Wasserstoffes der phenolischen Hydroxygruppen Methylreste und R4 = Methylrest)
hat ebenfalls ungünstige Eigenschaften. Das peracetylierte A-Ristomycin ist unter
den bei den Versuchen verwendeten Bedingungen unlöslich und zum Zweck der Versuche
ungeeignet. Obwohl das durch Beseitigung der Kohlenhydratreste erhaltene Aglyko--A-ristoinycin
(R1 = R2 = R3 = Y = Wasserstoff und R4 = Meth;yUrest eine Agglutination hervorruft,
ist dieses Derivat wegen der pH- und Löslichkeitsverhältnisse ebenfalls nicht optimal.
Nach eigenen Kenntnissen ist auch das B-Ristomycin (diese Verbindung unterscheidet
sich von den anderen Derivaten nur darin, daß in der allgemeinen Formel I in der
Heterotetrasaccharidkette des Restes, für den R1 steht, der 2-O-α-D-Arabinofuranosyl-O-α-D-mannopyranosylteil
fehlt) zum gewünschten diagnostischen Zweck ungeeignet.
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tEs wurde überraschenderweise festgestellt, daß der im Blutgerinnungsprüfversuch
verwendete Wirkstoff dann und nur dann optimal ist, wenn er eine hohe Reinheit und
eine genau definierte Struktur der allgemeinen Formel I aufweist.
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Es wurde auf Grund des Obigen festgestellt, daß die zur Ausübung
der normalen Humanthrombozytenaggregation erforderliche grundlegende Bedingung darin
besteht, daß in der allgemeinen Formel I 4 freie phenolische Hydroxygruppen, der
C-endständige Alkoxycarbonylrest, wie Methoxycarbonylrest (R4 = Methylrest), und
die unberührte Ristotetrosylseitenkette (R1) vorliegen müssen.
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Die Erfindung beruht also auch auf der überraschenden Feststellung,
daß das in der Laboratoriumspraxis verbreitet verwendete Ristocetin durch ein anderes
Mitglied der
Vancomycin-Antibioticum-Familie, das Ristomycin, vollständig
ersetzt werden kann, wenn es genügend rein ist. Das Risto.mycin kann einXfacher
und mit weniger, Aufwand hergestelle werden und verhält sich bei der Plasmaproteinfällung
günstiger. Auf Grund der obigen Eigenschaften hat sich das Ristomycin in hämatologischen
Versuchen als günstiger erwiesen. Das bisher zur Behandlung von durch bakterielle
Infektionen hervorgerufenen Krankheiten verwendete Ristomycin kann also auch auf
diesem neuen Anwendungsgebiet, das heißt für diagnostische Zwecke, eingesetzt.
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werden.
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Gegenstand der Erfindung sind auch Reagenzien zur Anwendung in Ilhrombozytenaggregationsversuchen,
insbesondere zur Diagnostizierung der Willebrand-Krankheit, welche dadurch gekennzeichnet
sind, daß sie 1 oder mehr, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte[s]
standardisierte[s], hochreine[s] A-Ristom;ycinsalz(e) und/oder Ristonycin A und/oder
1 oder mehr Derivat(e) desselben beziehungsweise derselben enthalten.
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Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäBen Reagenzien, als A-Ristomycinsalz
beziehungsweise Derivat(e) eines solchen [ein] solche[s], in welchem beziehungsweise
welchen der Mineralsäurerest, für den X stehen kann, ein Schwefelsäurerest, insbesondere
Bisulfatrest, ist. Dabei ist A-Ristomycinmonosulfat besonders bevorzugt.
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Es ist auch bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Reagenzien als Derivat(e)
eines A-Ristoinycinsalzes beziehungsweise von A-Ristomycinsalzen [ein] solche[s],
in welchem beziehungsweise welchen der Rest der allgemeinen Formel II, für welchen
Y stehen kann, ein solcher, in welchem Z für ein Fluoratom steht, insbesondere der
Trifluoracetylrest
ist, enthalten.
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Dabei ist ein Gehalt an 1 oder mehr bis-(N,N1-Trifluoracetyl)-A-ristomycinsalz(en),
vor allem bis-(N,N'-Trifluoracetyl)-A-ristomycinmonosulfat, besonders bevorzugt.
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Ferner ist es bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Reagenzien als
A-Ristomycinsalz(e) beziehungsweise Derivat(e) eines solchen beziehungsweise von
solchen [ein] solche[s], in welchem beziehungsweise welchen der Alkylrest, für den
R4 stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2 Kohlenstoffatom(en) ist, enthalten.
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Weiterhim-ist es bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Reagenzien
als A-Ristomycinsalz(e) beziehungsweise Derivat eines solchen beziehungsweise von
solchen [ein] solche[s], in welchem beziehungsweise welchen n 0 oder 1 ist, enthalt
Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Reagenzien, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das beziehungsweise die erfindungsgemäß
hergestellte(n) auf übliche Weise fertiggestellte(n) A-Ristomycinsalz(e) und/oder
A-Ristomycin und/oder Derivat(e) desselben beziehungsweise derselben unmittelbar
vor der Anwendung in einer bekannten wäßrigen Pufferlösung gelöst wird beziehungsweise
werden.
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In diesem wird als wäßrige Pufferlösung vorteilhaft eine wäßrige
tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanlösung [tris-Hydroxyaminomethanlösung] verwendet.
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Die Erfindung beruht wie bereits erwähnt auf der überraschenden Feststellung,
daß A-Ristoinycinsalze beziehungsweise A-Ristomycin hoher Reinheit und deren Derivate
der allgemeinen Formel I zur Durchführung von bisher durch A-Ristocetin induzierten
Thrombocytenaggregationsversuchen ausgezeichnet geeignet sind.
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Bei den Versuchen, deren Ergebnisse in der beiliegenden Figur 1 veranschaulicht
sind, wurden unter Verwendung von 6 verschiedenen PRP-Citrat [PRP bedeutet an Thrombozyten
reiches Plasma] und Äthylendiamintetraessigsäure-PRP und Dürchschnittswertbehandlung
die Punkte der in der Figur 1 dargestellten Kurven erhalten. Die Kurven zeigen einen
ähnlichen Verlauf und weisen 3 voneinander gut trennbare Abschnitte auf. Bei geringerer
Konzentration (0,8 mg/ml) ist keine Agglutination festzustellen.
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Im Bereich von Konzentrationen von 0,8 bis 2,0 mg/mlz ist ein linearer
Zusammenhang'zu beobachten. Bei Eonzentrationen über 2,0 mg/ml verlaufen die Kurven
in Richtung der oberen Wertspitze. Bei weiterer Erhöhung der Dosis wird die Plasmaproteinfällung
ein immer stärker störender Faktor. Bei Verwendung von Citrat- und Äthylendiamintetraessigsäure-PRP
als Substrat werden identische Ergebnisse erhalten.
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In der beiliegenden Figur 2 ist gezeigt, daß A-Ristomycin zur quantitativen
Bestimmung des Cofaktors VIII R:Ag sehr gut eingesetzt werden kann. Die sogenannten
Ristocetin-Cofaktor-Assay-Versuche dienen der Messung des sich in der Willebrand-Krankheit
ergebenden Plasmafaktordefizites (J. Clin. Invest. 52 [1973], 2 708; Thromb. Diath.
Haemorrh 34 [1975], 306). Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das A-Ristoniycin
zum Zweck der quantitativen Versuche ebenfalls ausgezeichnet geeignet
ist
und der Ristocetin-Cofaktor und Ristocetin-Cofaktor--Assay-Versuch durch den Ristomycin-Cofakt
or beziehungsweise Ristomycin-Cofaktor-Assay-Versuch ersetzt werden können. Die
.Bestimrrtutng -des Ristomycin-Cofaktors kann unter Verwendung von sowohl mit gewaschenen
(Figur 2, obere Kurve) als auch mit 35 bis 40 gew.-%-iger wäßriger Formaldehylösung
(Formalin) behandelten (Figur 2, untere Kurve) Thrombozyten durchgeführt werden.
Das Ristocetin und Ristomycin rufen bei höheren Konzentrationen eine Plasmaproteinfällung
hervor. Die bei den Werten zwischen 1,5 und 3,5 mg/ml erhaltenen Ergebnisse sind
in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
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Tabelle
| Konzentration Lichtabsorption (gemessen bei 600 nm) |
| in Ristomycin Ristocetin |
| mg/ml (als A-Ristomycin- [Vergleichsver- |
| monosulfat) such] |
| 1,5 0,01 0,01 |
| 2,7 0,20 0,07 |
| 3,0 0,55 0,15 |
| 3,5 2,02 0,66 |
Aus der obigen Tabelle geht hervor, daß mit dem erfindungsgemäß verwendeten A-Ristomycinmonosulf
at über Konzentrationen von 1,5 mg/ml stets höhere Absorptionswerte erhalten werden
als mit dem Ristocetin.
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Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Grundbedingung
der Zuverlässigkeit des Versuchsverfahrens mit dem erfindungsgemäß hergestellten
Ristomycin darin liegt, daß das zum Versuch verwendete, Reagens eine hohe Reinheit
aufweist und ein A-Ristomycinsalz beziehungsweise dessen Derivat mit konstantem
Wirkstoffgehalt enthält. Diese Erscheinung läßt sich wahrscheinlich auf die Tatsache
zurückführen, daß, obwohl Ristocetin und Ristomycin eine ähnliche antibakterielle
Wirkung ausüben, die MIkroorganismen, welche diese Verbindungen erzeugen, sehr unterschiedliche
Eigenschaften haben. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Nährbodens und
der'Stoffwechselvorgänge der Biosynthese können ganz verschiedene Verunreinigungen
gebildet werden, auch wenn die Aufarbeitung identisch ist.
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Die erfindungsgemäßen Reagenzien enthalten 1 oder mehr nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellte[s] standardisierte[s], hochreine[s], Gewichtskonstanz aufweisendeCs]
und stabile[s] A-Ristomycinsalz(e) und/oder A-Ristomycin und/oder Derivat(e) desselben
beziehungsweise derselben. Dle erfindungsgemäßen Reagenzien (wie AGGRISTINR) enthalten
vorzugswei se Doseneinheiten von 15 mg. Die freien phenolischen Hydroxygruppen des
Reagens können jedoch bei längerer Lagerung, in Gegenwart von Luftsauerstoff und
unter Einwirkung von Sonnenlicht eine für die Thrombozytenaggregation ungünstige
chinoidale Struktur annehmen. Diese Änderung wird durch eine langdauernde (40 Stunden)
UV-Belichtung des festen Präparates bestätigt. Auf Grund des vorstehend Gesagten
sollen die erfindungsgemäßen Reagenzien zur Hämophilie-Diagnostik-Ausrüstung [Hämophilie-Diagnostik--Kit]
in aus braunes Glas hergestellten und hermetisch abgeschlossenen Phiolen fertiggestellt
werden.
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Die wichtigsten Vorteile der Erfindung sind zusammengefaßt wie folgt:
A) Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können in -Blutgerinnungsprüfversuchen ausgezeichnet
verwendbare A-Ristomycinsalze und A-Ristomycin sowie Derivate derselben beziehungsweise
desselben der allgemeinen Formel I hoher Reinheit hergestellt werden.
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B) Die erfindungsgemäßen Reagenzien können in quantitativen Blutplasmav.ersuchen
mit großem Erfolg eingesetzt werden und sichern ein günstigeres Messungsintervall
als die bekannten Mittel und Verfahren.
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C) Die erfindungsgemäBen Reagenzien sind verhältnismäßig stabil,
ihr Gewicht ist konstant, sie können bei 1000C sterilisiert werden und sind gut
lagerfähig.
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Eigene Stabilitätsversuche zeigten ohne Zweifel, daß eine Lösung
von kristallinem A-Ristomycinmonosulfat in destilliertem Wasser bei 100°C 0,5 bis
1,0 Stunde lang ohne wesentliche Schädigung sterilisiert werden kann. Ferner wurde
festgestellt, daß die in den Hamophilie-Diagnostik--Ausrüstungen vorliegenden Reagenzien
mit. einem Gehalt an A-Ristomycinmonosulfat enthaltenden Lösungen fin Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer
[TRIS-Puffer], bei einem pH-Wert von 7,4 und einer Konzentration von 15 mg/ml bei
+40C 3 Monate lang ohne Zersetzung gelagert werden können.
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Die Erfindung wird an Rand der folgenden Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1 Herstellung von A-Ristomycinmonosulfat (Formel I-mit'R4
= Methylrest, X = EBisulfatrest [H504]'und = Wasserstoff) Es wurden 2 g auf bekannte
Weise hergestelle rohe Ristomycinbase bei Raumtemperatur in 5,0 ml destilliertem
Wasser gelöst,-worauf der pH-Wert der Lösung mit einer n Schwefelsäure auf 6,8 eingestellt
wurde; der genaue pH-Wert wurde mit einem Instrument gemessen. Die gelbe schwach
opaleszierende Lösung wurde mit ein wenig Knochenkohle geklärt -und filtriert. Der
erhaltenen klaren Lösung wurden bis zur Trübung 15 bis 20%, [Yol./Vol.] Acetonitril
zugetropft. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur so lange stehengelassen, bis die
Kristallisation einsetzte. Diese Maßnahme wurde erforderlichenfalls durch Zugabe
einer geringen weiteren Menge von Acetonitril während 2 bis 3 Tage in der Weise
wiederholt, daß die Kristallisation mit Hilfe einer 24-stündigen Kühlung in einem
Kühlschrank bei +4°C beendet wurde.
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Die gebildeten quadratförmigen weißen Kristalle wurden abfiltriert,
zunächst'2-mal mit Je 1,0 ml einer eiskalten Mischung von Acetonitril und Wasser
(im Volumverhältnis von 1 : 1) und danach 2-mal mit je 2 ml kaltem Aceton gewaschen,
in einem Vakuumexsikkator über vorher erhitztem Calciumchlorid und Paraffinspänen
bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Ausbeute 71% der Theorie.
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Beispiel 2 Herstellung von A-Ristomycinmonosulfat (Formel I mit R4
= Methylrest, X = Bisulfatrest [HSO4] und Y = Wasserstoff) Es wurden 1,5 bis 2,0
g rohes A-Ristomycinmonosulfat als Ausgangsstoff unter ständigem Schütteln in 4,0
ml destilliertem Wasser gelöst. Zur stark schäumenden Lösung wurde 1,0 ml Acetonitril
zugegeben'und das Gemisch wurde mit Aktivkohle geklärt und filtriert. Der pH-Wert
wurde mit einer 2 n Ammoniumhydroxydlösung in Gegenwart eines Brsmthymolblauindikators
(Umschlag von Gelb in Himmelblau) neutralisiert. Zur Lösung wurde bis zur Trübung
eine weitere Menge Acetonitril zugegeben. -Das Gemisch wurde bis zum Einsetzen der
Kristallisation stehengelassen, die ausgeschiedenen Kristalle wurden durch ErWårmen
auf einem Wasserbad wieder gelöst und die Lösung wurde langsam auf Raumtemperatur
kühlengelassen. Das weitere Aufarbeiten wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene
Weise durchgeführt. Ausbeute 65%.
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Das nach den Verfahrensweisen der beiden obigen Beispiele isolierte
A-Ristomycinmonosulfat hatte ausgezeichnete Thrombozytenaggregationseigenschaften
und entsprach den folgenden sehr hohen qualitativen Vorschriften: A) Die Zersetzung
des Produkts begann bei 165 bis 1700C (gemessen in einem Schmelzpunktapparat mit
Photozellenregistrierung [Mettler FP-5]).
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B) Mit Hilfe eines Hochdruckflüssigkeitchromatographierapparates
(Hewlett-Packard 1Q82, UPLC) wurde-vom Produkt ein Chromatogramm ausgezeichneter
Qualität gefertigt.
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C) Das Produkt war nach der Schichtchromatographie einheitlich. Der
in wäßriger Lösung bei 280 nm gemessene Wert log g lag zwischen 4,0 und 4,5 und
der Sulfataschegehalt war nicht höher als 0,25 Gew.-%. Bei einem mit einer Wasserstrahlpumpe
(etwa 15 mm Hg) beim Siedepunkt des Acetones 4 Stunden lang kontinuierlich durchgeführten
Saugen betrug der.Gewichtsverlust des A-Ristomycinmonosulfates höchstens 1 bis 2,5
Gew.-%.
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Die dünnschichtchromatographische Charakterisierung des Rohproduktes
und des nach den obigen Beispielen 1 und 2 hergestellten A-Ristomycinmonosulfates
wurde wie folgt durchgeführt: Die bei der Bestimmung verwendeten Substanzen und
Reagenzien: I) . Eine frisch-hergestellte 1 bis 2 gew.-%-ige -wäßrige Lösung der
A-Ristomycinmonosulfat--Probe.
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II) 1) DC-Alurolle Zellulose (Merck 0,1 mm) Dünnschicht.
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2) Fixion 50 x 8-Platte (Reanal).
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III) Lösungsmittelgemische als Laufmittel: a) n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser
(in Volumverhältnis von 15 : 10 : 3 : 12) oder b) n-Butanol/Pyridin/n-Propanol/Essigsäure/Wasser
(im Volumverhältnis von 20 : 10 : 5 : 3 : 32).
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Obere organische Phase zur II) 1) Dünnschicht.
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Zum Äquilibrieren und Anlaufen der Schicht II) 2) wurde die wie folgt
beschrieben hergestellte Citratpufferlösung (pH-Wert = 6) in ionenfreiem Wasser
verwendet: 7,0 g Citronensäure, 4,0 g Natriumhydroxyd, 81,9 g Natriumchlorid und
100 ml Äthylenglykolmonomethyl äther [Methylcellosolve] wurden in einem 1000 ml
Meßkoben in Wasser gelöst und mit destilliertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt.
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IV) Entwickler: Pauly-Reagens.
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0,05 g diazotierte Sulfanilsäure wurde in 10 ml einer 10 gew.-%-igen
Natriumcarbonatlösung gelöst und die frisch bereitete Lösung wurde verwendet.
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Das reine Rohprodukt zeigte auf der Celluloseschicht in den Lösungsmitteigemischen
a) und b) Rf-Werte von 0,59 beziehungsweise 0,52. Auf einer Fixion 50 x 8-Platte
wurde in der Citratpufferlösung (pH-Wert = 6) ein Rf-Wert von 0,61 gemessen. Das
Reagens war sehr empfindlich, durch es wurden praktisch alle Zersetzungsprodukte
nachgewiesen; die untere Nachweisgrenze betrug 0,5 bis 1,0 µg.
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Die hochdruckflüssigkeitschromatographischen Messungen wurden mit
Hilfe eines Apparates vom Typ.
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Hewlett-Packard 1082 HPLC mit isochratischem Betrieb
durchgeführt.
Bei den Versuchen wurde eine in eigenen Laboratorien hergestellte analytische Säule
verwendet (C8-Lichrosorb, 10 >im). Der Wirkstoffgehalt der A-Ristomycinmonosulfat-Proben
wurde mit einem bei 254 nm wirkenden W-Detektor bestimmt. Von den Proben wurden
1 millimolare Lösungen hergestellt, von denen Aliquote von 20 bis 30 ul auf die
Säule gespritzt wurden. Die Ohromatogramme wurden wie folgt entwickelt: A) In einer
12 Gew.-% Äthylenglykolmonomethyläther [Methylcellosolve] enthaltenden Citratpufferlösung
(pH-Wert = 6,3), Flüssigkeitsströmung: 2,0 ml/Minute und Papiergeschwindigkeit:
0,1 cm/Minute.
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B) In einer 10 Gew.-% Acetonitril enthaltenden (ameisensäurefreien)
0,1 m Ammoniumformiatlösung (pH-Wert = 7,4), Flüssigkeitsströmung: 3,0 ml/Minute
und Papiergeschwindigkeit: 0,3 cm/Minute.
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Die obigen Bedingungen haben sich am günstigsten erwiesen.
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Die Stabilität des nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten kristallinen
A-Ristomycinmonosulfates wurde nach UV-Bestrahlung der festen Proben und nach thermischer
Sterilisation der wäßrigen Lösungen verschiedener Konzentration beziehungsweise
Stehenlassen bei +4°C in einer tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanpuffelösung [TRIS-Puffer]
bestimmt.
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e Es wurden 50 bis 100 mg A-Ristomycinmonosulfat in einer mit einem
Pfropfen verschlossenen kleinen Flasche mit UV-Licht in der'Weise bestrahlt, daß
die Entfernung zwischen der die Probe enthaltenden
Flasche und
der Lampe etwa 20 cm war. Nach 40-stündiger Bestrahlung wurde die Farbe der hergestellten
Lösung etwas tiefer; in einer Konzentration von 15 mg/ml war die Aggregation der
Humanthrombozyten ganz langsam.
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ß) Es wurden von A-Ristomycinmonosulfat in destilliertem Wasser 2
Lösungen ähnlicher Verdünnung (0,399 mg/ml beziehungsweise 0,356 mg/al) und eine
konzentriertere Lösung (6,877 mg/ml) hergestellt.
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Die Lösungen wurden 3 Stunden lang in einem Wasserbad von 1000C gehalten.
Das abgedampfte Wasser wurde gelegentlich ersetzt. Die Lösungen wurden auf Raumtemperatur
gekühlt und die E11%cm-Werte wurden auf Grund der Intensität der bei 280 nm gemessenen
Lichtabsorption bestimmt. Die 3 Kurven derE11%cm-Werte {Ordinate} zu verschiedenen
Zeiten (t [Min.] fAbszisse" der obigen 3 Lösungen sindin der beiliegenden Figur
3 dargestellt. Es war festzustellen, daß die Lichtabsorptionserhöhung der auf 1000C
gehaltenen Lösungen nicht linear war. Im Bereich von 0 bis 1 Stunde zeigten die
durch Lyophilisation rückgewonnenen Substanzen bei der Dünnschichtchromatographie
und Hochdruckflüssigkeitschromatographie keine Zersetzung. Die Substanzen aggregierten
in der gewünschten Konzentration die normalen Humanthrombozyten befriedigend.
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Es Es wurde aus A-Ristomycinmonosulfat in einer tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanlösung
[TRIS-Puffer] (pH-Wert = 7,4) eine Lösung mit einer Konzentration von 15 mg/ml hergestellt,
welche 12 Wochen lang in einem Kühlschrank bei +4°C gelagert wurde. Mit dieser Stammlösung
wurde der übliche Thrombozytenaggregationsversucb 2-wöchentlich durchgeführt beziehungsweise
nach Durchführunz der entsDrechenden Pufferverdünnunz (0,2 ml
10 ml) wurde der E1%cm-Wert bestimmt.
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Während des Versuches blieben die Aggregationsaktivität und der E11%cm-Wert
der A-Ristomycinmono sulfatlösung unverandert.
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Beispiel 3 Herstellung von bis-(N,N'-Trifluoracetyl)-A--ristomycinmonosulfat
(Formel I mit R4 = Methylrest, x = Bisulfatrest [HS04] und Y = Rest der Formel II
mit Z = Fluoratom und n = 0) Es wurden 206 mg A-Ristomycinmonosulfat in 10 ml wasserfreiem
Methanol suspendiert, worauf 0,28 ml Trifluoressigsäureanhydrid unter Eiskühlung
zugetropft wurde.
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Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur stehengelassen und unter
vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in wasserfreiem
Methanol wieder gelöst und erneut eingedampft. Dieser Vorgang wurde noch 3-mal wiederholt,
worauf das Produkt in einem Vakuumexsikkator über vorher erhitztem Calciumchlorid
und Paraffinspänen bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wurde.
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Ausbeute 90%.
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Das so erhaltene bis-(N,N'-Trifluoracetyl)-A-ristomycinmonosulfat
zeigte keinen charakteristischen Schmelzpunkt (Zersetzungspunkt). Standardisierung:
Auf einer Oelluloseschicht im Lösungsmittelgemisch III) a) [im Anschiuß an Beispiel
2] beträgt der Rf-Wert 0,45.
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Analyse: Für C99H108046N8F6 (2258) berechnet: F = 5,05%, N = 4,96%;
gefunden: F » 4,91%, N = 4,86%; F = 4,88%, N = 4,74%.
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Das so erhaltene bis-(N,N'-Trifluoracetyl)-A-ristomycinmonosulfat
aggregierte die normalen Thrombozyten auf dieselbe Weise wie das A-Ristomycinmonosulfat.
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Beispiel 4 Herstellung der Reagenzien Es wurden 15,00 g eines den
obigen qualitativen Vorschriften entsprechenden A-Ristomycinmonosulfates in.
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einem 1 1 Erlenmeyerkolben in 100 ml destilliertem Wasser (pH-Wert
= 6,8) suspendiert. Der an der Kolbenwand ausgeschiedene .Wirkstoff wurde unter
ständigem Schütteln mit einer weiteren Menge von 400 bis 500 ml destilliertem Wasser
wieder in Lösung gebracht. Die so erhaltene einen homogenen Wirkstoffgehalt aufweisende
Lösung wurde in einen 100 ml Neßkolben faserfrei filtriert, der zum Lösen verwendete
Kolben und das Filter wurden quantitativ nachgewaschen und das Meßgefäß wurde bis
zur Marke aufgefüllt. Die A-Ristomycinmonosulfatkonzentration der so erhaltenen
Lösung betrug 15 mg/ml. (Zur Herstellung eines sterilen Präparates wurde die Lösung
30 bis 60 Minuten lang auf 100°C gehalten und danach auf Raumtemperatur gekühlt).
Von dieser Lösung wurden unter Verwendung einer automatischen Füllvorrichtung unter
aseptisoVçn Bedingungen genau je 1,00 ml in braune, sogenannte Zerreißverschlußflaschen
gefüllt. Die Flaschen wurden durch Schnellgefrieren
lyophilisiert
und verschlossen.
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Zur Kontrolle der genauen Füllung und der Vollständigkeit der Lyophilisierung
wurde der A-Ristomycinmonosulfatgehalt (15 mg) einiger Flaschen je Charge nach der
Rochdruckflüssigkeitschromatographierverfahrensweise [HPLC-Verfahrensweise] und
durch Gewichtsbestimmung nach geprüft.
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Zusammenfassung