FI76090C - Foerfarande foer isolering av foer diagnostiska aendamaol laempligt a-ristomycin och dess derivat med hoeg renhetsgrad fraon orent ristomycin eller rao-ristomycin. - Google Patents

Description

76090

Menetelmä diagnostisiin tarkoituksiin soveltuvan, suuren puhtauden omaavan A-ristomysiinin ja sen johdannaisten eristämiseksi epäpuhtaasta ristomysiinistä tai raaka-risto-mysiinistä 5 OR 4

/ >OR

0=\ >—/ 10 Γ~β) V^0R5

15 O o<. A

/—' )— o o/" / N—f j—l HO U \ Λ

H /—\(Jr0R

NHY

(i) 35 2 76090 mukaisten ristomysiinin ja/tai ristomysiinijohdannaisten valmistamiseksi, jossa kaavassa R on vetyatomi; 5 merkitsee O-alfa-D-Araf(1—) 2)-0-alfa-D-Manp(1—)2)- 0-(alfa-L-Rhap)-(1—) 6)-0-beta-D-Glop-ryhmää; R^ on 2,3,6-tridesoksi-3-amino-(NHY)-alfa-L-riboheksa-pyranosyyliryhmä; R^ on alfa-D-mannopyranosyyliryhmä; 10 R^ merkitsee 1-4 hiiliatomia sisältävää alkyyliryhmää; X on mineraalihapon jäännös; Y merkitsee vetyatomia tai yleiskaavan C(Z)^-(CH2)n~C0-mukaista ryhmää, missä Z on vetyatomi tai halogeeniatomi ja 15 n merkitsee kokonaislukua 0-5.

Keksinnön kohteena on edelleen biologinen reagens-si trombosyyttiaggregaatiokokeita varten, etenkin Wille-brand-taudin diagnostisoimiseksi, ja menetelmä sen valmistamiseksi .

20 On tunnettua, että hemofiilipotilaiden joukkotar kastuksissa verihiutaleiden toimintojen arvostelussa saadaan arvokkaimmat tiedot trombosyyttiaggregaatioko-keilla. Rutiinin mukaisesti käytettyjen aggregaatioai-neiden lisäksi (esim. ADP, adrenaliini, kollageeni) on 25 vuodesta 1971 alkaen ristosetiiniksi nimitetyllä, aikaisemmin antibioottina käytetyllä aineella tärkeä merkitys. Howardin ja Firkinin kokeiden perusteella on ristosetii-ni mahdollistanut perityn hemofilian, Willebrand-taudin nopean ja yksinkertaisen havaitsemisen (Thrombosis und 30 Diathesis Haemorhagica 26, 362 (1971))·

Willebrand-taudissa puuttuu veren hyytymisen VIII tekijäkompleksi. Willebrand-tekijän tärkein biologinen tehtävä on trombosyyttiadhees.ion edistäminen subendo-teliaalisiin kaavoihin. Willebrand-tekijän puute tai 35 laadullinen häiriö tuottaa Willebrand-taudiksi nimitetyn 3 76090 taudinkuvan, joka muodostaa synnynnäisen hemofilian le-vinneimmän muodon. On hyvin tärkeää erottaa V/illebrand-tautia sairastavat potilaat (periytyminen, perhekokeet, terapia). Tällaisen taudinkuvan selvitys ja erottaminen 5 ennen leikkausta on erittäin tärkeää.

Keksintö perustuu siihen tietoon, että laboratorio-käytännössä laajalti käytetty ristosetiini voidaan korvata täysin vankomysiini-antibioottien eräällä toisella jäsenellä - ristomysiinillä. Ristomysiini voidaan valio mistaa yksinkertaisemmin ja halvemmalla ja se käyttäytyy edullisemmin plasmaproteiinisaostuksessa. Yllä mainittujen ominaisuuksien johdosta on ristomysiini osoittautunut hematologisissa kokeissa edullisemmaksi. Tähän asti antibakteriaalisten infektioiden aiheuttamien sairauk-15 sien hoitoon käytettyä ristomysiiniä voidaan käyttää myös tällä uudella käyttöalueella (diagnostisiin tarkoituksiin) .

Neuvostoliittolaiset tutkijat eristivät ristomy-siini-antibiootin Proactinomyces fructiferi var. risto-20 mycini-viljelyistä adsorboimalla (edullisesti SzDSz-3- tai SzDV-3-kationinvaihdinpylväällä) ja eluoimalla ase-tonisella ammoniakkiliuoksella tai ammoniumasetaattipus-kurilla (pH = 9-10). Ristomysiini eristettiin emäksen muodossa. Myöhemmin ristomysiini on erotettu - kuten 25 ristosetiinikin - kahdeksi biologisesti aktiiviseksi komponentiksi - A- ja B-ristomysiiniksi. Myös antibiootin valmistus suurissa mittakaavoissa tapahtuvassa käytössä on julkaistu. Fermentaatioliemen ja intermediaaris-ten välituotteiden vaikuttavan aineen pitoisuuden mää-30 rittämiseksi valmistettiin biologisen arvonmäärityksen lisäksi myös polarimetrinen ja UV-spektrofotometrinen menetelmä (SU-patenttijulkaisu l80 754 ; Antibiotiki 8, 392 (1962); Antibiotiki 9, 884 (1964); Antibiotiki 16, 786 (1971)).

35 A-ristomysiinin tarkan rakenteen määrityksen jäi- " 76090 keen (J.Org.Chem. 39, 2971 (197*0; J.Antibiot. 32, 446 (1979); Tetrahedron Letters 21_, 2983 (1980); JACS 102; 7093 (1980) olemme yrittäneet selvittää, missä määrin ja miten pitkälti yhdisteen rakenteen muutos tai yhdis-5 teen puhtausaste vaikuttavat trombosyyttiaggregatioon.

Keksinnön päämääränä on biologisissa kokeissa käytetyn rakenteen määritys ja menetelmän aikaansaaminen sopivan ja erittäin puhtaan vaikuttavan aineen valmistamiseksi.

10 Todettiin, että yleiskaavassa (I) esiintyvien , Rg, Rj ja Rjj-ryhmien osittainen tai täydellinen poisto tai vastaavasti näiden ryhmien hydroksifunkti-oiden ja R-ryhmän esto (esterin tai eetterin muodossa) aiheuttaa antibiootin ei-toivottuja biologisia vaiku-15 tuksia ja useissa tapauksissa myös liukenevuuden epä- suotavan muutoksen. R^-ryhmän vetyatomilla tapahtuvassa korvauksessa saatu karboksi-A-ristomysiini ei vaikuta ihmisen trombosyyttiplasmaa aggregoivalla tavalla eikä estä ristomysiinillä indusoitua trombosyyttiaggregatio-20 ta. Penolisissa hydroksiryhmissä estetyllä tetra-O-me- tyyli-A-ristomysiini-johdannaisella (Ρ=Ρ^=0Η^) on samoin epäsuotuisia ominaisuuksia. Perasetyloitu A-ristomysiini ei liukene kokeissa käytetyissä olosuhteissa eikä se ole sopiva kokeiden tarkoitukseen. Vaikka hiilihydraattien 25 eliminoimisen avulla saatu aglyko-A-ristomysiini (R=R1=R2=R^=Y=H; R =CH^) saa aikaan agglutinaatiota, tämä johdannainen ei ole myöskään optimaalinen pH- ja liu-kenevaisuussuhteiden johdosta. Tietojemme mukaan ei myöskään B-ristomysiini (tämä yhdiste eroaa muista johdan-30 naisista vain siinä, että yleiskaavassa (I) R^:n hete-rotetrasakkaridiketjussa puuttuu 2-0-D-arabinofurano-syyli-alfa-D-mannopyranosyyli-osuus), ei sovellu haluttuun diagnostiseen tarkoitukseen.

Yllättävästi havaittiin, että verenhyytymistestis-35 sä käytetty vaikuttava aine on silloin ja vain silloin n 5 76090 optimaalinen, mikäli se on erittäin puhdasta ja sillä on yleiskaavan (I) tarkoin määritelty rakenne. Yleiskaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa Y merkitsee vetyä tai ryhmää CF^-CO-, sopivat edullisesti erittäin puhtaassa 5 muodossa laboratorion diagnostisiin tarkoituksiin.

Yllä olevien tietojen perusteella todettiin, että normaalin ihmisen trombosyyttiaggregation suorittamiseksi tarvittava perustava edellytys on se, että yleiskaavassa I on esiinnyttävä neljä vapaata fenolista hyd-10 roksiryhmää (R=H), C-terminaalinen metoksikarbonyyli- ryhmä (R^=CH^) ja koskematon ristotetrosyyli (=R^) si-vuketj u.

Keksintö perustuu siihen tietoon, että erittäin puhdas A-ristomysiini ja sen yleiskaavaan kuuluvat joh-15 dannaiset sopivat erinomaisesti A-ristosetiinillä indu soitujen trombosyyttiaggregaatiokokeiden suorittamiseksi (kuvio 1).

Kokeissamme saatiin käytettäessä kuutta erilaista PRP- (trombosyyttirikas plasma)-sitraattia ja 20 EDTA-(etyleenidiamiinitetraetikkahappoa)-PRP:tä ja kes- kiarvokäsittelyä kuviossa 1 esitetyn käyrän pisteet. Käyrät osoittavat samankaltaista kulkua ja ne sisältävät kolme toisistaan hyvin erotettavaa osaa. Vähäisessä kon-sentraatiossa (0,8 mg/ml) ei todeta agglutinaatiota.

25 0,8 - 2,0 mg/ml:n alueella voidaan havaita lineaarinen riippuvuus. Yli 2,0 mg/ml:n konsentraatioissa annoskäy-rät kulkevat ylemmän arvohuipun suuntaan. Annoksen kasvaessa edelleen tulee plasmaproteiinisaostumisesta yhä häiritsevämpi tekijä. Käytettäessä sitraattia ja EDTA-30 PRPrtä substraattina saadaan identtiset tulokset.

Kuviossa 2 esitetään, että ristomysiiniä voidaan erittäin hyvin käyttää VIII R:Ag-kofaktorin kvantitatiiviseen määritykseen. Niin kutsutut ristosetiini-kofaktori-määritys-kokeet toimivat Willebrand-taudissa 35 muodostuvan plasmatekijäpuutoksen mittaamiseksi (J.Clin.

Invest. 52, 2708 (1973); Thromb. Diath. Haemorrh. 2ii> 306 (1975))· Tuloksemme osoittavat, että ristomysiini 6 76090 soveltuu samoin erinomaisesti kvantitatiivisiin kokeisiin ja ristosetiini-kofaktori ja ristosetiini-kofak-tori-määritys-koe voidaan korvata ristomysiini-kofak-torilla tai vastaavasti ristomysiini-kofaktori-määri-5 tys-kokeella. Ristomysiini-kofaktorin määritys voidaan suorittaa käyttämällä sekä pestyjä (kuvio 2, ylempi käyrä) että myös formaliinilla käsiteltyjä (kuvio 2, alempi käyrä) trombosyyttejä. Ristosetiini ja ristomy-siini saavat korkeammissa konsentraatioissa aikaan plas- 10 maproteiinisaostumisen. Arvoissa 1,5 - 3,5 mg/ml saadut tulokset esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1 15 __

Konsentraatio Valon absorptio (mitattu 600 nm:ssä) (mg/ml) _

Ristosetiini Ristomysiini 20 1,5 0,01 0,01 2,7 0,07 0,20 3,0 0,15 0,55 3,5 0,66 2,02 25

Yllä olevasta taulukosta nähdään, että keksinnön mukaisesti käytetyllä ristomysiinillä saadaan aina korkeammat absorptioarvot kuin ristosetiinillä.

30 Yllättävästi havaittiin, että keksinnön mukaisen koemenetelmän luotettavuuden perusedellytys on, että kokeeseen käytetyn reagenssin tulee olla erittäin puhdas ja sisältää A-ristomysiiniä tai vastaavasti sen johdannaista vaikuttavan aineen vakiopitoisuudella. Tämän 35 ilmiön voidaan todennäköisesti katsoa johtuvan siitä seikasta, että vaikka ristosetiinillä ja ristomysiinil- 7 76090 lä on samankaltainen antibakteriaalinen vaikutus, mikro-organismeilla, jotka tuottavat näitä yhdisteitä, on hyvin erilaiset ominaisuudet. Aina kasvualustan koostumuksen ja biosynteesin aineenvaihduntatapahtumien mukaan 5 voi muodostua aivan erilaisia epäpuhtauksia, vaikka käsittely on identtinen. Edelleen on tunnettua, että mikro-organismien Nocardia lurida NRRL 2*130 ja Proactino-myces fructiferi var. ristomycini viljelyliemessä tuotetaan kulloinkin kaksi biologisesti aktiivista kompo-10 nenttia. Jos käytetään antibioottia antibakteriaalisena lääkeaineena, ei B-komponentin läsnäolo A-ristomysiinis-sä häiritse, koska molemmat vaikuttavat aineet vaikuttavat patogeenisiä mikro-organismeja vastaan. B-komponen-tilla on jopa olennaisesti korkeampi bakterisidinen vai-15 kutus kuin A-komponenteilla.

Vastakohtana edellä esitetylle on kuitenkin vain A-komponentti arvokas käytettäessä molempia antibiootteja hematologisiin kokeisiin. Jenkinsin ja avustajien artikkelissa (Thromb. Res. 7, 531 (1975)) 20 viitataan myös tähän tosiseikkaan. Nämä tekijät ovat todenneet, että B-ristosetiini ei aggregoi normaaleja ihmisen trombosyyttejä.

On tunnettua, että aikalisissä fermentaation ja ioninvaihdinpuhdistuksen olosuhteissa molemmat risto-25 mysiinimolekyylit voivat hajota. Näiden tapahtumien selvittämiseksi valmistetaan malliyhdisteeksi karboksi-A-ristomysiini. Todettiin, että tämä yhdiste ei aggregoi normaalia ihmisen trombosyyttiplasmaa eikä estä A-risto-mysiinillä indusoitua aggregaatiota. Tämä tarkoittaa, 30 että hyvin herkän glykopeptidimolekyylin C-terminaalisen metoksikarbonyyliryhmän alkalin vaikutuksesta tapahtunut hydrolyysi (ja mahdollisesti tätä seuraava retroaldoli-lohkaisu beta-hydroksifenyyliseriini-yksiköissä) voi tehdä A-ristomysiinivalmisteesta täysin arvottoman ja 35 käyttökelvottoman hematologisiin tarkoituksiin. Kokemus temme mukaisesti ei A-ristomysiiniä voida vapauttaa näis- 8 76090 tä ei-toivotuista sivuaineista tunnetuissa menetelmissä käytetyn, vedellä ja alkoholilla suoritetun uudelleen-kiteytyksen avulla.

On vielä viitattava siihen, että ristomysiiniemäs 5 on erittäin hygroskooppinen. Tämä yhdiste voi ottaa vastaan yli 15 paino-# kosteutta (suhteessa emäksen painoon), kun se jätetään seisomaan ilmassa muutamiksi minuuteiksi. Tästä syystä on melkein mahdotonta suorittaa tästä valmisteesta tarkkaa mittausta. Samanaikaisesti havaittiin 10 yllättäen, että A-ristomysiini-mallin aggregaatioakti-viteetti vahingoittuu palautumattomasta jokapäiväisessä laboratoriokäytännössä tavanomaisen, fosforipentoksidil-la suoritetun kuivauksen aikana.

On varmaa, että eristettäessä antibioottia mahdol-15 lisen sivuaineen ja epäpuhtauksien (nimittäin B-kompo-nentin ja alkalisen hajoamisen johdosta muodostuneiden erilaisten tuotteiden) toteamiseksi tähän asti käytetyt mittausmenetelmät eivät yksinään riitä (tunnettuja testi-mikro-organismeja käyttävä biologinen menetelmä; vaikut-20 tavan aineen UV-spektrofotometrinen määritys; optisen kiertokyvyn mittaus). Sivuaineilla on nimittäin 280 nm:ssä samoin UV-valonabsorptio ja niillä on samansuuntainen optinen kiertokyky.

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti valmiste-25 taan yleiskaavan (I) mukaista A-ristomysiiniä ja/tai ristomysiinijohdannaisia siten, että raaka-ristomysiini-emäksestä valmistetaan 30 - 50#:nen vesiliuos ja tämän liuoksen pH-arvo säädetään mineraalihapolla, edullisesti laimennetulla rikkihapolla, arvoon 6,7 - 7,0 - edul-30 lisesti arvoon 6,8; tai säädetään epäpuhtaan A-risto-mysiini-monosulfaatin vesiliuoksen, joka muutoin on identtinen yllä olevien liuosten kanssa, pH-arvo alkali-liuoksella, edullisesti ammoniumhydroksidilla, arvoon 6,7 - 7· Liuos käsitellään tämän jälkeen huoneenlämpö-35 tilassa veteen sekoittuvan alemman karboksyylihapponit-riilin - sopivimmin asetonitriilin - 20 - 50#:sella 9 76090 (til./til.) määrällä. A-ristomysiini kiteytetään 4°C:ssa, kiteet erotetaan, puhdistetaan ja mahdollisesti liuotetaan orgaaniseen liuottimeen - sopivimmin 1-5 hiili-atomia sisältävään alkanoliin - ja asyloidaan tämän jäl-5 keen 0 - 20°C:ssa happoanhydridityyppisen asylointiai- neen - mieluummin trifluorietikkahappoanhydridin - avulla. Saatu tuote - tai saadut tuotteet - eristetään.

Näin saatu A-ristomysiini tai sen johdannainen liuotetaan vesipitoiseen puskuriliuokseen - edullisesti 10 tris-hydroksiaminometaanin vesipitoiseen liuokseen.

Näin valmistettu reagenssi haihdutetaan trombosyytti-aggregaatiokokeita varten - etenkin Willebrand-taudin diagnostisoimiseksi.

Keksinnön mukaisen menetelmän erään edullisen suo-15 ritusmuodon mukaisesti valmistetusta raakaristomysiini- emäksestä valmistetaan 30-50$:nen liuos liuottamalla se tislattuun veteen huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen säädetään tämän liuoksen pH-arvo mineraalihapolla - sopivimmin laimennetulla rikkihapolla - arvoon 6,7 - 7,0.

20 Lähtöaineena voidaan käyttää myös raakaa A-risto- mysiinisulfaattia. Tässä tapauksessa liuottamisen jälkeen säädetään haluttu pH-arvo lisäämällä laimennettua alkaliliuosta - edullisesti ammoniumhydroksidiliuosta. Optimaalisen pH-arvon säätö voidaan suorittaa laitemit-25 tauksella tai bromtymolisini-indikaattorin muuttuessa keltaisesta taivaansiniseksi. Näin valmistettuun liuokseen lisätään veteen sekoittuvan alkyylinitriilin - edullisesti asetonitriilin - 20-50%:nen määrä (til./til.), minkä jälkeen alkaa kiteytyminen.

30 Korkeamman puhtauden omaavan raakatuotteen kiteyt- tämisessä voidaan menetellä myös niin, että lisätään yllä esitetyllä tavalla valmistettuun vesipitoiseen A-ris-tomysiinisulfaatti-liuokseen ensin 15-50¾ (til./til.) asetonitriiliä, säädetään tämän jälkeen pH arvoon 6,7 -35 7,0, lämmitetään opaalinhohtoista liuosta liukenemiseen asti ja annetaan sen hitaasti jäähtyä huoneenlämpötilaan.

10 76090

Halutut kiteet pestään suodattimena asetonilla ja kuivataan tämän jälkeen tyhjöeksikkaattorissa kuumennetun kalsiumkloridin ja parafiinilastujen päällä vakiopai-noon. Tämän menetelmän mukaisesti saadaan erinomaisen 5 aggregaatiokyvyn omaavaa, ei-hygroskooppista, kiteistä, erittäin puhdasta A-ristomysiiniä tai sen sulfaattia 60-80¾:n saannolla (aina lähtöaineen vaikuttavan aineen pitoisuuden mukaan).

Keksinnön mukaisen menetelmän erään toisen edulli-10 sen suoritusmuodon mukaisesti raaka A-ristomysiini liuotetaan tai vastaavasti suspendoidaan orgaaniseen liuot-timeen - edullisesti alkanoliin, - minkä jälkeen asyloin-tiaine (esim. trifluorietikkahappoanhydridi) lisätään tipoittain. Raaka tuote voidaan haluttaessa puhdistaa 15 kiteyttämällä uudelleen.

Keksinnön mukainen reagenssi sisältää yllä olevan menetelmän mukaisesti valmistettua, vakioitua, erittäin puhdasta, vakiopainon omaavaa ja stabiilia ristomysiiniä tai ristomysiinijohdannaista. Keksinnön mukainen reagens-20 si (AGGRISTINR) sisältää edullisesti 15 mg:n annosyksik- köjä. Reagenssin vapaat fenoliset hydroksiryhmät voivat kuitenkin pitkähkössä varastoinnissa, ilman hapen läsnäollessa ja auringonvalon vaikutuksessa saada trombosyyt-tiaggregaatiolle epäsuotuisan kinoidaalisen rakenteen.

25 Tämä muutos vahvistetaan kiinteän valmisteen pitkään kestävällä (40 tuntia) UV-valaisulla. Ottaen yllä oleva huomioon keksinnön mukainen reagenssi tulisi asettaa he-mofilia-diagnostiikkavälineitä varten ruskeasta lasista valmistettuihin ja hermeettisesti suljettuihin ampullei-30 hin.

Esillä olevan keksinnön tärkeimmät edut voidaan koota yhteen seuraavasti: 1. Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti voidaan valmistaa verenhyytymistesteissä erinomaisen 35 käyttökelpoisia yleiskaavan (I) mukaisia erittäin puhtaita yhdisteitä.

76090 2. Keksinnön mukaista reagenssia voidaan käyttää kvantitatiivisissa veriplasmakokeissa hyvin onnistuneesti ja se varmistaa suotuisamman mittausvälin kuin tunnetut välineet ja menetelmät.

5 3. Keksinnön mukainen reagenssi on suhteellisen stabiilia, sen paino on vakio, se voidaan steriloida 100°C:ssa ja se on erittäin varastointikelpoi-nen.

Stabiiliteettikokeemme ovat osoittaneet epäilykset-10 tä, että kiteisen A-ristomysiini-monosulfaatin liuosta tislatussa vedessä voidaan steriloida 100°C:ssa 0,5 - 1,0 tuntia ilman olennaista vahinkoa. Samoin on todettu, että AGGRISTIN-välineissä olevaa liuosta (TRIS-puskuris-sa, pH = 7,iJ; konsentraatio 15 mg/ml) voidaan varastoida 15 +4°C:ssa 3 kuukautta ilman hajaantumista.

Esillä olevan keksinnön muut yksityiskohdat selviävät seuraavista esimerkeistä rajoittamatta suojan laajuutta näihin esimerkkeihin.

20 Esimerkki 1 A-ristomysiini-sulfaatin valmistus (R, R^, ja R^ on esitetty patenttivaatimuksessa 1; R^ = CH^; X = HSO^; Y = H) 2 g tunnetulla tavalla valmistettua raakaa risto-25 mysiiniemästä liuotetaan huoneenlämpötilassa 5,0 ml:aan tislattua vettä, minkä jälkeen liuoksen pH-arvo säädetään 1 N rikkihapolla arvoon 6,8; tarkka pH-arvo mitataan laitteella. Keltainen, hieman opaalinhohtoinen liuos kirkastetaan pienellä määrällä luuhiiltä ja suodate-30 taan. Saatuun kirkkaaseen liuokseen lisätään tipoittain sameutumiseen asti 15-20¾ (til./til.) asetonitriiliä. Seoksen annetaan seistä niin kauan huoneenlämpötilassa, kunnes kiteytyminen tapahtuu. Tämä toimenpide toistetaan tarvittaessa lisäämällä vielä pieni määrä aseto-35 nitriiliä 2-3 päivän ajan niin, että kiteytyminen lopetetaan jäähdyttämällä 2H tuntia jääkaapissa +i4°C:ssa.

12 760 90

Muodostuneet neliömäiset,valkoiset kiteet suodatetaan, pestään ensin kaksi kertaa kulloinkin 1,0 ml:11a jääkylmää asetonitriilin ja veden (1:1) seosta ja tämän jälkeen kaksi kertaa kulloinkin 2 ml :11a kylmää 5 asetonia, kuivataan tyhjöeksikkaattorissa kuumennetun kalsiumkloridin ja parafiinilastujen päällä huoneenlämpötilassa alennetussa paineessa vakiopainoon. Saanto Ί1%ο.

10 Esimerkki 2 A-ristomysiini-sulfaatin valmistus 1,5 - 2,0 g lähtöaineena käytettyä raakaa A-risto-mysiini-sulfaattia liuotetaan ravistelemalla jatkuvasti 4,0 ml:aan tislattua vettä. Vahvasti vaahtoavaan liuok- 15 seen lisätään 1,0 ml asetonitriiliä, seos selkeytetään aktiivihiilellä ja suodatetaan. pH-arvo neutraloidaan 2 N ammoniumhydroksidilla bromitymolisini-indikaattorin läsnäollessa (muuttuminen keltaisesta taivaansiniseksi). Liuottimeen lisätään sameutumiseen asti vielä asetonit- 20 rilliä. Seoksen annetaan seistä kiteytymisen alkamiseen asti, liuotetaan erottuneet kiteet jälleen lämmittämällä vesihauteen päällä ja liuoksen annetaan jäähtyä hitaasti huoneenlämpötilaan. Jatkokäsittely suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Saanto 65¾.

25 Molempien menetelmien mukaisesti eristetyllä A-ristomysiini-monosulfaatilla on erinomaiset trombo-syyttiaggregaatio-ominaisuudet ja se vastaa seuraavia erittäin hyviä kvalitatiivisia määräyksiä: a) Tuotteen hajaantuminen alkaa l65-170°C:ssa 30 (Mettler FP-5-sulamispistelaitteessa mitattuna - va- lokennorekisteröinti).

b) Suurpainenestekromatografisen laitteen (Hewett-Packard 1082, HPLC) avulla valmistetaan tuotteesta erinomaisen laadun omaava kromatogrammi.

35 c) Tuote on yhtenäinen kerroskromatografiän mukai- ti « 76090 sesti. Vesipitoisessa liuoksessa 280 nm:ssä mitattu log e arvo on 4,0 - 4,5, sulfaattituhkapi-toisuus ei ole korkeampi kuin 0,255· Vesisuihku-pumpulla (noin 15 mmHg) asetonin kiehumispistees-5 sä, 4 tuntia yhtäjaksoisesti suoritetussa imemi sessä on A-ristomysiini-monosulfaatin painohäviö korkeintaan 1 - 2,5¾.

Raakatuotteen ja esimerkin 1 ja 2 mukaisesti valmistetun A-ristomysiin+monosulfaatin ohutkerroskromato-10 grafinen karakterisointi suoritetaan seuraavasti: Määrityksessä käytetyt aineet ja reagenssit: I. Juuri valmistettu 1 - 2%:nen A-ristomysiini-mallin vesipitoinen liuos.

II. 1. DC-alurulla selluloosaa (Merck 0,1 mm) ohut-15 kerros.

2. Pixion 50x8-levy (Reanal).

III. Liuotinseos eluenttina: a) n-butanoli-pyridiini-etikkahappo-vesi (15:10:3:12) tai 20 b) n-butanoli-pyridiini-n-propanoli-etikkahap po-vesi (20:10:5:3:32). Ylempi orgaaninen faasi II. 1 ohutkerrokseen.

II. 2-kerroksen tasapainottamiseksi ja käynnistämiseksi käytetään seuraavaa sitraattipuskuria 25 (pH 6) ionittomassa vedessä: 7.0 g sitruunahappoa 4.0 g natriumhydroksidia 8l,0 g natriumkloridia ja 100 ml metyylisellosolvia 30 liuotetaan 1000 ml:n mittapullossa ja täytetään tislatulla vedellä merkkiin asti.

IV. Kehitin: Pauly-reagenssi 0,05 g diatsotoitua sul 1'anyylihappoa liuotetaan 10 ml:aan 10?:sta natriumkarbonaattiliuosta ja käy-35 tetään juuri valmistettu liuos.

m 76090

Puhtaalla raakatuotteella on selluloosakerroksessa liuotinseoksissa a) ja b) R^-arvot 0,59 tai vastaavasti 0,52. Pixion 50x8-levyllä mitataan sitraattipuskurissa (pH = 6) R^-arvo 0,6l. Reagenssi on erittäin herkkä, 5 se osoittaa käytännöllisesti kaikki hajaantumistuotteet; alin näyttöraja on 0,5 - 1,0 yg.

Suurpainenestekromatografinen mittaus suoritetaan isokraattisesti toimivalla pumpulla varustetun Hewlett-Packard 1082 HPLC-laitteen avulla. Kokeissamme käytetään 10 laboratorioissamme valmistettua analyyttistä pylvästä (Cg-Lichrosorb, 10 ym). A-ristomysiini-mallien vaikuttavan aineen pitoisuus määritetään 254 nm:ssä toimivalla UV-detektorilla. Malleista valmistetaan 1 milli-molaarisia liuoksia, joiden 20 - 30 yl:n näytteet suih-15 kutetaan pylväälle. Kromatogrammit kehitetään seuraavas ti: (I) 12%:a metyylisellosolvia sisältävässä sitraat tipuskurissa (pH 6,3), nestevirtaus 2,0 ml/min., paperinnopeus 0,1 cm/min.

20 (II) 10$:a asetonitriiliä sisältävässä (muurahais- hapoton) 0,1 molaarisessa ammoniumformiaatis-sa (pH 7,4); nestevirtaus 3,0 ml/min.; paperinnopeus 0,3 cm/min.

Yllä olevat olosuhteet ovat osoittautuneet sopi-25 vimmiksi.

Esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti valmistetun kiteisen A-ristomysiini-sulfaatin stabiliteetti määritetään kiinteiden mallien UV-säteilytyksen jatkeen ja erilaiset kon-sentraatiot omaavien vesipitoisten liuosten termisen ste-30 riloinnin jälkeen tai vastaavasti jättämällä seisomaan +4°C:ssa TRIS-puskurissa.

a) 50 - 100 mg A-ristomysiiniä säteilytetään tulpalla suljetussa pienessä pullossa UV-valolla siten, että etäisyys mallin sisältävän pullon 35 ja lampun välillä on noin 20 cm. 40-tuntisen

II

15 76090 säteilytyksen jälkeen syvenee valmistetun liuoksen väri hieman; 15 mg/ml:n konsentraa-tiossa on ihmisen trombosyyttien aggregointi melko hidasta.

5 b) A-ristomysiinistä valmistetaan tislatussa ve dessä kaksi samankaltaisen laimennuksen omaavaa liuosta (0,39 mg/ml tai vastaavasti 0,35 mg/ml) ja konsentroidumpi liuos (6,8 mg/ml). Liuoksia pidetään 3 tuntia 100°C:n vesihautees-10 sa. Haihtunut vesi korvataan silloin tällöin.

Liuokset jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja l %

Elcm _arv°k määritetään 280 nm:ssä mitatun va-lonabsorption intensiteetin perusteella. Voidaan todeta, että 100°C:ssa pidettyjen liuosten 15 valonabsorption kohoaminen ei ole lineaarista.

0-1 tunnin alueella lyofilioinnin avulla talteen otetut aineet eivät osoita hajaantumista ohutkerroskromatografiän ja suurpainenestekro-matografian mukaisesti. Aineet aggregoivat ha-20 lutussa konsentraatiossa tyydyttävästi normaa leja ihmisen trombosyyttejä.

c) A-ristomysiinistä valmistetaan TRIS-puskurissa (pH = 7,4) liuos, jonka konsentraatio on 15 mg/ml ja jota varastoidaan jääkaapissa +4° 25 C:ssa 12 viikkoa. Tästä perusliuoksesta suori tetaan tavanomainen trombosyyttiaggregaatio-koe, joka kahden viikon kuluttua tai vastaavasti määritetään vastaavan puskurilaimennuk-sen jälkeen (0,2 ml—)10ml) E^m~arvo. Kokeen 30 aikana pysyvät A-ristomysiini-liuoksen aggre- Λ '! goitava aktiviteetti ja E„ -arvo muuttumat- ° lcm tornina.

i6 76090

Esimerkki 3 bis-Ν,Ν*-trifluoriasetyyli-A-ristomysiinin valmistus 206 mg A-ristomysiiniä suspendoidaan 10 ml:aan 5 vedetöntä metanolia, minkä jälkeen lisätään 0,28 ml trifluorietikkahappoanhydridiä jääjäähdytyksessä tipoit-tain. Reaktioseos jätetään seisomaan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan kuivaksi alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan jälleen vedettömään metanoliin ja haihdute-10 taan uudestaan. Tämä tapahtuma toistetaan vielä kolme kertaa, minkä jälkeen tuote kuivataan tyhjöaksikkaatto-rissa, kuumennetun kalsiumkloridin ja parafiinihapon päällä vakiopainoon. Saanto 90%.

Näin saadulla bis-Ν,Ν'-trifluoriasetyyli-A-risto-15 mysiinillä ei ole luonteenomaista sulamispistettä (ha-jaantumispistettä). Vakiointi: selluloosakerroksella liuotinseoksessa lila (ks. esimerkki 2) on Rf-arvo o,45.

Analyysi: C99H108°46N8P6 (2258): laskettu: F 5,05%, N 4,96% 20 löydetty: F 4,91%, N 4,86%; 4,88 4,74 Näin saatu yhdiste aggregoi normaaleja trombosyyt-tejä samalla tavalla kuin A-ristomysiini.

25

Esimerkki 4

Reagenssien valmistus 15,00 g yllä esitettyjä kvalitatiivisia määräyksiä vastaavaa A-ristomysiini-monosulfaattia suspendoi-30 daan 1 l:n erlenmeyerpullossa 100 mlraan tislattua vettä (pH 6,8). Pullon seinämään eroava vaikuttava aine saatetaan 400 - 500 ml:lla tislattua vettä jälleen liuokseksi. Näin saatu, homogeenisen vaikuttavan aineen pitoisuuden omaava liuos suodatetaan kuiduttomaksi 100 ml:n 35 mittapullossa, liuottamisessa käytetty pullo ja suodatin pestään kvantitatiivisesti ja mitta-astia täytetään 17 76090 merkkiin asti. Näin saadun liuoksen A-ristomysiini-monosulfaatti-konsentraatio on 15 mg/ml. (Steriilin valmisteen valmistamiseksi liuos pidetään 30 - 60 minuuttia 100°C:ssa ja jäähdytetään tämän jälkeen huoneen-5 lämpötilaan.) Tästä liuoksesta täytetään käyttämällä automaattista täyttölaitetta aseptisissa olosuhteissa tarkoin kulloinkin 1,00 ml:n määrä ruskeisiin, nk. re-päisypulloihin. Pullot lyofilisoidaan pikajäädyttämisen jälkeen ja suljetaan.

10 Tarkan täytön ja lyofilisoinnin täydellisyyden tarkastamiseksi tarkastetaan muutamien pullojen A-ris-tomysiini-pitoisuus (15 mg) annosta kohden HPLC-menetel-män ja painonmäärityksen mukaisesti.

Claims (3)

18 76090 Patenttivaatimus : Menetelmä kaavan I mukaisen, diagnostisiin tarkoituksiin soveltuvan ja suuren puhtauden omaavan A-ristomysiinin 5 ja sen johdannaisten eristämiseksi epäpuhtaasta ristomysii-nistä tai raaka-ristomysiinistä, OR* / .OR HV o V< 0R 3 < nHQ>-0“ ” "--0-p-r0 /- NH O 0^ ^0R K» J

51 K 'r^irm N HY ,s (O II 19 76090 jossa kaavassa R on vetyatomi, merkitsee O-alfa-D-Araf(1—* 2)-0-alfa-D-Manp( 1-* 2)- 0-(alfa-L-Rhap)-(l—* 6)-0-beta-D-Glop-ryhmää;

5 R2 edustaa 2,3>6-tridesoksi-3-amino-(NHY)-alfa-L-ribo- heksapyranosyyli-ryhmää; R^ on alfa-F-mannopyranosyyliryhmä; Rjj merkitsee 1-4 hiiliatomia sisältävää alkyyliryhmää, X edustaa mineraalihappojäännöstä; 10. merkitsee vetyatomia tai yleiskaavan C(Z)3-(CH2)n-CO- mukaista ryhmää, jossa Z on vetyatomi tai halogeeniatomi ja n merkitsee kokonaislukua 0-3, tunnettu siitä, että raa'an ristomysiiniemäksen 30-50 5&:sen vesiliuoksen pH-15 arvo säädetään arvoon 6,7...7,0, sopivimmin 6,8, käsittelemällä sitä mineraalihapolla - edullisesti laimealla rikkihapolla; tai epäpuhtaan A-ristomysiini-sulfaatin 30-50 %:sen vesiliuoksen pH-arvo säädetään alkaliliuoksel-la - edullisesti ammoniumbydroksidilla - arvoon 6,7... 20 7S0, minkä jälkeen sitä käsitellään veteen sekoittuvan alemman alifaattisen karboksyylihapponitriilin - sopivimmin asetonitriilin - 20-50 %:sella määrällä (til./til.) huoneenlämpötilassa, kiteytetään tämän jälkeen +4°C:ssa, haluttaessa liuotetaan orgaaniseen liuottimeen - edulli-25 sesti 1-5 hiiliatomia sisältävään alkanoliin - ja tämän jälkeen asyloidaan happoanhydridityyppisellä asylointi-aineella - edullisesti trifluorietikkahappoanhydridillä - 0-20°C:n lämpötilassa ja tämän jälkeen eristetään saatu tuote tai saadut tuotteet. 76090 20 Förfarande för isolering av för diagnostiskä ändamäl lämpligt A-ristomycin och dess derivat raed hög renhetsgrad 5 frän orent ristoraycin eller rä-ristomycin, raed den allmänna formeln (I), OR δ / .OR 0=( /—( 10 / o or j /?=$. NH \ 15 (o>°<. A y_^n>-0R 20 -\ 'HX ' /NH OR NHY 35 (i)