FI75936C - Reagens foer anvaendning vid trombocytaggregationsprov. - Google Patents

Description

75936

Trombosyyttiaggregaatiokokeita varten tarkoitettu reagenssi

Keksinnön kohteena on reagenssi, joka on tarkoitet-5 tu trombosyyttiaggregaatiokokeita varten, etenkin Wille-brand-taudin diagnostisoimiseksi.

On tunnettua, että hemofiilipotilaiden joukkotarkastuksissa verihiutaleiden toimintoiden arvostelussa saadaan arvokkaimmat tiedot trombosyyttiaggregaatioko-10 keillä. Rutiinin mukaisesti käytettyjen aggregaatioai-neiden lisäksi (esim. ADP, adrenaliini, kollageeni) on vuodesta 1971 alkaen ristosetiiniksi nimitetyllä, aikaisemmin antibioottina käytetyllä aineella tärkeä merkitys. Howardin ja Firkinin kokeiden perusteella on ristosetii-15 ni mahdollistanut perityn hemofilian, Willebrand-taudin nopean ja yksinkertaisen havaitsemisen (Thrombosis und Diathesis Haemorhagica 26, 362 (1971)).

V/illebrand-taudissa puuttuu veren hyytymisen VIII tekijäkompleksi. Willebrand-tekijän tärkein biologinen 20 tehtävä on trombosyyttiadheesion edistäminen subendo-teliaalisiin kaavoihin. Willebrand-tekijän puute tai laadullinen häiriö tuottaa VJillebrand-taudiksi nimitetyn taudinkuvan, joka muodostaa synnynnäisen hemofilian le-vinneimmän muodon. On hyvin tärkeää erottaa Willebrand-25 tautia sairastavat potilaat (periytyminen, perhekokeet, terapia). Tällaisen taudinkuvan selvitys ja erottaminen ennen leikkausta on erittäin tärkeää.

Keksintö perustuu siihen tietoon, että laboratorio-käytännössä laajalti käytetty ristosetiini voidaan kor-30 vata täysin vankomysiini-antibioottien eräällä toisella jäsenellä - ristomysiinillä. Ristomysiini voidaan valmistaa yksinkertaisemmin ja halvemmalla ja se käyttäytyy edullisemmin plasmaproteiinisaostuksessa. Yllä m.ainit- 2 75936 tujen ominaisuuksien johdosta on ristomysiini osoittautunut hematologisissa kokeissa edullisemmaksi. Tähän asti antibakteriaalisten infektioiden aiheuttamien sairauksien hoitoon käytettyä ristomysiiniä voidaan käyttää 5 myös tällä uudella käyttöalueella (diagnostisiin tarkoituksiin) .

Neuvostoliittolaiset tutkijat eristivät ristomy-siini-antibiootin Proactinomyces fructiferi var. risto-mycini-viljelyistä adsorboimalla (edullisesti SzDSz-3-10 tai SzDV-3-kationinvaihdinpylväällä) ja eluoimalla ase-tonisella ammoniakkiliuoksella tai ammoniumasetaattipus-kurilla (pH = 9-10). Ristomysiini eristettiin emäksen muodossa. Myöhemmin ristomysiini on erotettu - kuten ristosetiinikin - kahdeksi biologisesti aktiiviseksi 15 komponentiksi - A- ja B-ristomysiiniksi. Myös antibiootin valmistus suurissa mittakaavoissa tapahtuvassa käytössä on julkaistu. Permentaatioliemen ja intermediaaris-ten välituotteiden vaikuttavan aineen pitoisuuden määrittämiseksi valmistettiin biologisen arvonmäärityksen 20 lisäksi myös polarimetrinen ja UV-spektrofotometrinen menetelmä (SU-patenttijulkaisu l80 75**; Antibiotiki 8, 392 (1962); Antibiotiki 9, 88^4 (1964); Antibiotiki 16, 786 (1971)).

A-ristomysiinin tarkan rakenteen määrityksen jäl-25 keen (J.Org.Chem. 39, 2971 (1974); J.Antibiot. 32, 446 (1979); Tetrahedron Letters 21_, 2983 (1980); JACS 102; 7093 (1980) olemme yrittäneet selvittää, missä määrin ja miten pitkälti yhdisteen rakenteen muutos tai yhdisteen puhtausaste vaikuttavat trombosyyttiaggregatioon.

30 Keksinnön päämääränä on biologisissa kokeissa käytetyn rakenteen määritys ja menetelmän aikaansaaminen sopivan ja erittäin puhtaan vaikuttavan aineen valmistamiseksi.

3 75936

Todettiin, että yleiskaavassa (I) 5 or4

/ ,0R

io o HN

Λ 0 \ X0R3 <öw" \

” «T

20 / nh °\ <K r-c B0

30 NHY

(I) 35 4 75936 jossa kaavassa R on vetyatomi; merkitsee O-alfa-D-Araf(1—> 2)-0-alfa-D-Manp(l—> 2)- 0-(alfa-L-Rhap)-(l—) 6)-O-beta-D-Glop-ryhmää; 5 R^ on 2,3,6-tridesoksi-3-amino-(NHY)-alfa-L-riboheksa-pyranosyyliryhmä; R^ on alfa-D-mannopyranosyyliryhmä; r^ merkitsee 1-4 hiiliatomia sisältävää alkyyliryhmää; X on mineraalihapon jäännös; 10 Y merkitsee vetyatomia tai. yleiskaavan C(Z)^-(CH2)n-C0-mukaista ryhmää, missä Z on vetyatomi tai halogeeniatomi ja n merkitsee kokonaislukua 0-5» esiintyvien R1, R2» Rj ja R^-ryhmien osittainen tai täydellinen poisto tai vastaavasti näiden ryhmien hydroksifunkti-oiden ja R-ryhmän esto (esterin tai eetterin muodossa) aiheuttaa antibiootin ei-toivottuja biologisia vaikutuksia ja useissa tapauksissa myös liukenevuuden epä-suotavan muutoksen. R^-ryhmän vetyatomilla tapahtuvas-20 sa korvauksessa saatu karboksi-A-ristomysiini ei vaikuta ihmisen trombosyyttiplasmaa aggregoivalla tavalla eikä estä ristomysiinillä indusoitua trombosyyttiaggregatio-ta. Fenolisissa hydroksiryhmissä estetyllä tetra-O-me-tyyli-A-ristomysiini-johdannaisella (Ρ=Ρ^=0Η^) on samoin 25 epäsuotuisia ominaisuuksia. Perasetyloitu A-ristomysiini ei liukene kokeissa käytetyissä olosuhteissa eikä se ole sopiva kokeiden tarkoitukseen. Vaikka hiilihydraattien eliminoimisen avulla saatu aglyko-A-ristomysiini (R = R^=R2=R-5=Y=H; R =CH^) saa aikaan agglutinaatiota, tä-30 mä johdannainen ei ole myöskään optimaalinen pH- ja liu-kenevaisuussuhteiden johdosta. Tietojemme mukaan myöskään B-ristomysiini (tämä yhdiste eroaa muista johdannaisista vain siinä, että yleiskaavassa (I) R^cn hete-rotetrasakkaridiketjussa puuttuu 2-0-D-arabinofurano-35 syyli-alfa-D-mannopyranosyyli-osuus), ei sovellu halut tuun diagnostiseen tarkoitukseen.

Yllättävästi havaittiin, että verenhyytymistestis-sä käytetty vaikuttava aine on silloin ja vain silloin 5 75936 optimaalinen, mikäli se on erittäin puhdasta ja sillä on yleiskaavan (I) tarkoin määritelty rakenne. Yleiskaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa Y merkitsee vetyä tai ryhmää CP^-CO-, sopivat edullisesti erittäin puhtaassa 5 muodossa laboratorion diagnostisiin tarkoituksiin.

Yllä olevien tietojen perusteella todettiin, että normaalin ihmisen trombosyyttiaggregation suorittamiseksi tarvittava perustava edellytys on se, että yleiskaavassa I on esiinnyttävä neljä vapaata fenolista hyd-10 roksiryhmää (R=H), C-terminaalinen metoksikarbonyyli- ryhmä (R^=CH^) ja koskematon ristotetrosyyli (=R^) si-vuketj u.

Keksintö perustuu siihen tietoon, että erittäin puhdas A-ristomysiini ja sen yleiskaavaan kuuluvat joh-15 dannaiset sopivat erinomaisesti A-ristosetiinillä indu soitujen trombosyyttiaggregaatiokokeiden suorittamiseksi (kuvio 1) .

Kokeissamme saatiin käytettäessä kuutta erilaista PRP- (trombosyyttirikas plasma)-sitraattia ja 20 EDTA-(etyleenidiamiinitetraetikkahappoa)-PRP:tä ja kes- kiarvokäsittelyä kuviossa 1 esitetyn käyrän pisteet. Käyrät osoittavat samankaltaista kulkua ja ne sisältävät kolme toisistaan hyvin erotettavaa osaa. Vähäisessä kon-sentraatiossa (0,8 mg/ml) ei todeta agglutinaatiota.

25 0,8 - 2,0 mg/ml:n alueella voidaan havaita lineaarinen riippuvuus. Yli 2,0 mg/ml:n konsentraatioissa annoskäy-rät kulkevat ylemmän arvohuipun suuntaan. Annoksen kasvaessa edelleen tulee plasmaproteiinisaostumisesta yhä häiritsevämpi tekijä. Käytettäessä sitraattia ja EDTA-30 PRPrtä substraattina saadaan identtiset tulokset.

Kuviossa 2 esitetään, että ristomysiiniä voidaan erittäin hyvin käyttää VIII R:Ag-kofaktorin kvantitatiiviseen määritykseen. Niin kutsutut ristosetiini-kofaktori-määritys-kokeet toimivat Willebrand-taudissa 35 muodostuvan plasmatekijäpuutoksen mittaamiseksi (J.Clin.

Invest. 5_2, 2708 ( 1973); Thromb. Diath. Haemorrh. 3^, 306 (1975)). Tuloksemme osoittavat, että ristomysiini 6 75936 soveltuu samoin erinomaisesti kvantitatiivisiin kokeisiin ja ristosetiini-kofaktori ja ristosetiini-kofak-tori-määritys-koe voidaan korvata ristomysiini-kofak-torilla tai vastaavasti ristomysiini-kofaktori-määri-5 tys-kokeella. Ristomysiini-kofaktorin määritys voidaan suorittaa käyttämällä sekä pestyjä (kuvio '2, ylempi käyrä) että myös formaliinilla käsiteltyjä (kuvio 2, alempi käyrä) trombosyyttejä. Ristosetiini ja ristomy-siini saavat korkeammissa konsentraatioissa aikaan plas-10 maproteiinisaostumisen. Arvoissa 1,5 - 3,5 mg/ml saadut tulokset esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1 15 _

Konsentraatio Valon absorptio (mitattu 600 nmrssä) (mg/ml) _

Ristosetiini Ristomysiini 20 1,5 0,01 0,01 2,7 0,07 0,20 3,0 0,15 0,55 3,5 0,66 2,02 25

Yllä olevasta taulukosta nähdään, että keksinnön mukaisesti käytetyllä ristomysiinillä saadaan aina korkeammat absorptioarvot kuin ristosetiinillä.

30 Yllättävästi havaittiin, että keksinnön mukaisen koemenetelmän luotettavuuden perusedellytys on, että kokeeseen käytetyn reagenssin tulee olla erittäin puhdas ja sisältää A-ristomysiiniä tai vastaavasti sen johdannaista vaikuttavan aineen vakiopitoisuudella. Tämän 35 ilmiön voidaan todennäköisesti katsoa johtuvan siitä seikasta, että vaikka ristosetiinillä ja ristomysiinil- 7 75936 lä on samankaltainen antibakteriaalinen vaikutus, mikro-organismeilla, jotka tuottavat näitä yhdisteitä, on hyvin erilaiset ominaisuudet. Aina kasvualustan koostumuksen ja biosynteesin aineenvaihduntatapahtumien mukaan 5 voi muodostua aivan erilaisia epäpuhtauksia, vaikka käsittely on identtinen. Edelleen on tunnettua, että mikro-organismien Nocardia lurida NRRL 2430 ja Proactino-myces fructiferi var. ristomycini viljelyliemessä tuotetaan kulloinkin kaksi biologisesti aktiivista kompo-10 nenttia. Jos käytetään antibioottia antibakteriaalisena lääkeaineena, ei B-komponentin läsnäolo A-ristomysiinis-sä häiritse, koska molemmat vaikuttavat aineet vaikuttavat patogeenisiä mikro-organismeja vastaan. B-komponen-tilla on jopa olennaisesti korkeampi bakterisidinen vai-15 kutus kuin A-komponenteilla.

Vastakohtana edellä esitetylle on kuitenkin vain A-komponentti arvokas käytettäessä molempia antibiootteja hematologisiin kokeisiin. Jenkinsin ja avustajien artikkelissa (Thromb. Res. 7, 531 (1975)) 20 viitataan myös tähän tosiseikkaan. Nämä tekijät ovat todenneet, että B-ristosetiini ei aggregoi normaaleja ihmisen trombosyyttejä.

On tunnettua, että aikalisissä fermentaation ja ioninvaihdinpuhdistuksen olosuhteissa molemmat risto-25 mysiinimolekyylit voivat hajota. Näiden tapahtumien selvittämiseksi valmistetaan malliyhdisteeksi karboksi-A-ristomysiini. Todettiin, että tämä yhdiste ei aggregoi normaalia ihmisen trombosyyttiplasmaa eikä estä A-risto-mysiinillä indusoitua aggregaatiota. Tämä tarkoittaa, 30 että hyvin herkän glykopeptidimolekyylin C-terminaalisen metoksikarbonyyliryhmän alkalin vaikutuksesta tapahtunut hydrolyysi (ja mahdollisesti tätä seuraava retroaldoli-lohkaisu beta-hydroksifenyyliseriini-yksiköissä) voi tehdä A-ristomysiinivalmisteesta täysin arvottoman ja 35 käyttökelvottoman hematologisiin tarkoituksiin. Kokemustemme mukaisesti ei A-ristomysiiniä voida vapauttaa nais- 8 75936 tä ei-toivotuista sivuaineista tunnetuissa menetelmissä käytetyn, vedellä ja alkoholilla suoritetun uudelleen-kiteytyksen avulla.

On vielä viitattava siihen, että ristomysiiniemäs 5 on erittäin hygroskooppinen. Tämä yhdiste voi ottaa vastaan yli 15 paino-# kosteutta (suhteessa emäksen painoon), kun se jätetään seisomaan ilmassa muutamiksi minuuteiksi. Tästä syystä on melkein mahdotonta suorittaa tästä valmisteesta tarkkaa mittausta. Samanaikaisesti havaittiin 10 yllättäen, että A-ristomysiini-mallin aggregaatioakti-viteetti vahingoittuu palautumattomasti jokapäiväisessä laboratoriokäytännössä tavanomaisen, fosforipentoksidil-la suoritetun kuivauksen aikana.

On varmaa, että eristettäessä antibioottia mahdol-15 lisen sivuaineen ja epäpuhtauksien (nimittäin B-kompo-nentin ja alkalisen hajoamisen johdosta muodostuneiden erilaisten tuotteiden) toteamiseksi tähän asti käytetyt mittausmenetelmät eivät yksinään riitä (tunnettuja testi-mikro-organismeja käyttävä biologinen menetelmä; vaikut-20 tavan aineen UV-spektrofotometrinen määritys; optisen kiertokyvyn mittaus). Sivuaineilla on nimittäin 280 nmtssä samoin UV-valonabsorptio ja niillä on samansuuntainen optinen kiertokyky.

Keksinnön mukaisessa reagenssissa käytettävä erittäin 25 puhdas yleiskaavan (I) mukainen A-ristcmysiini ja/tai ristomysiini-johdannaiset voidaan valmistaa siten, että raaka-ristomy-siiniemäksestä valmistetaan 30-50#:nen vesiliuos ja tämän liuoksen pH-arvo säädetään mineraalihapolla, edullisesti laimennetulla rikkihapolla, arvoon 6,7 - 7,0 - edul-30 lisesti arvoon 6,8; tai säädetään epäpuhtaan A-risto-mysiini-monosulfaatin vesiliuoksen, joka muutoin on identtinen yllä olevien liuosten kanssa, pH-arvo alkali-liuoksella, edullisesti ammoniumhydroksidilla,arvoon 6,7 - 7. Liuos käsitellään tämän jälkeen huoneenlämpö-35 tilassa veteen sekoittuvan alemman karboksyylihapponit-riilin - sopivimmin asetonitriilin - 20 - 50#:sella 9 75936 (til./til.) määrällä. A-ristomysiini kiteytetään 4°C:ssa, kiteet erotetaan, puhdistetaan ja mahdollisesti liuotetaan orgaaniseen liuottimeen - sopivimmin 1-5 hiili-atomia sisältävään alkanoliin - ja asyloidaan tämän jäl-5 keen 0 - 20°C:ssa happoanhydridityyppisen asylointlai neen - mieluummin trifluorietikkahappoanhydridin - avulla. Saatu tuote - tai saadut tuotteet - eristetään.

Näin saatu A-ristomysiini tai sen johdannainen liuotetaan vesipitoiseen puskuriliuokseen - edullisesti 10 tris-hydroksiaminometaanin vesipitoiseen liuokseen.

Näin valmistettu reagenssi haihdutetaan trombosyytti-aggregaatiokokeita varten - etenkin Willebrand-taudin diagnostisoimiseksi.

Keksinnön mukaisen menetelmän erään edullisen suo-15 ritusmuodon mukaisesti valmistetusta raakaristomysiini- emäksestä valmistetaan 30-50$:nen liuos liuottamalla se tislattuun veteen huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen säädetään tämän liuoksen pH-arvo mineraalihapolla - sopivimmin laimennetulla rikkihapolla - arvoon 6,7 - 7,0.

20 Lähtöaineena voidaan käyttää myös raakaa A-risto- mysiinisulfaattia. Tässä tapauksessa liuottamisen jälkeen säädetään haluttu pH-arvo lisäämällä laimennettua alkaliliuosta - edullisesti ammoniumhydroksidiliuosta. Optimaalisen pH-arvon säätö voidaan suorittaa laitemit-25 tauksella tai bromtymolisini-indikaattorin muuttuessa keltaisesta taivaansiniseksi. Näin valmistettuun liuokseen lisätään veteen sekoittuvan alkyylinitriilin - edullisesti asetonitriilin - 20-50$:nen määrä (til./til.), minkä jälkeen alkaa kiteytyminen.

30 Korkeamman puhtauden omaavan raakatuotteen kiteyt- tämisessä voidaan menetellä myös niin, että lisätään yllä esitetyllä tavalla valmistettuun vesipitoiseen A-ris-tomysiinisulfaatti-liuokseen ensin 15-50$ (til./til.) asetonitriiliä, säädetään tämän jälkeen pH arvoon 6,7 -35 7,0, lämmitetään opaalinhohtoista liuosta liukenemiseen asti ja annetaan sen hitaasti jäähtyä huoneenlämpötilaan .

10 75936

Halutut kiteet pestään suodattimena asetonilla ja kuivataan tämän jälkeen tyhjöeksikkaattorissa kuumennetun kalsiumkloridin ja parafiinilastujen päällä vakiopai-noon. Tämän menetelmän mukaisesti saadaan erinomaisen 5 aggregaatiokyvyn omaavaa, ei-hygroskooppista, kiteistä, erittäin puhdasta A-ristomysiiniä tai sen sulfaattia 60-80¾:n saannolla (aina lähtöaineen vaikuttavan aineen pitoisuuden mukaan).

Keksinnön mukaisen menetelmän erään toisen edulli-10 sen suoritusmuodon mukaisesti raaka A-ristomysiini liuo tetaan tai vastaavasti suspendoidaan orgaaniseen liuot-timeen - edullisesti alkanoliin, - minkä jälkeen asyloin-tiaine (esim. trifluorietikkahappoanhydridi) lisätään tipoittain. Raaka tuote voidaan haluttaessa puhdistaa 15 kiteyttämällä uudelleen.

Keksinnön mukaiselle reagenssille on siten tunnusomaista, että se sisältää yllä olevan menetelmän mukaisesti valmistettua, vakioitua, erittäin puhdasta, vakiopainon omaavaa ja stabiilia ristomysiiniä tai ristomysiinijohdannaista.

p 20 Keksinnön mukainen reagenssi (AGGRISTIN ) sisältää edullisesti 15 mg:n annosyksikköjä. Käyttövalmiissa reagenssis-sa erittäin puhdas A-ristomysiini ja/tai ristomysiinijoh-dannainen on liuotettuna vesipitoiseen puskuriliuokseen -edullisesti tris-hydroksiaminometaanin vesiliuokseen. Yhdis-25 teet tulisi mikäli mahdollista liuottaa vesipitoiseen puskuri-liuokseen välittömästi ennen reagenssin käyttöä.

Reagenssin vapaat fenoliset hydroksiryhmät voivat kuitenkin pitkähkössä varastoinnissa, ilman hapen läsnäollessa ja auringonvalon vaikutuksessa saada trombosyyt-30 tiaggregaatiolle epäsuotuisan kinoidaalisen rakenteen.

Tämä muutos vahvistetaan kiinteän valmisteen pitkään kestävällä (*J0 tuntia) UV-valaisulla. Ottaen yllä oleva huomioon keksinnön mukainen reagenssi tulisi asettaa he-mofilia-diagnostiikkavälineitä varten ruskeasta lasista 35 valmistettuihin ja hermeettisesti suljettuihin ampulleihin .

V

11 75936

Esillä olevan keksinnön tärkeimmät edut voidaan koota yhteen seuraavasti: 1. Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti voidaan valmistaa verenhyytymistesteissä erinomaisen 5 käyttökelpoisia yleiskaavan (I) mukaisia erittäin puhtaita yhdisteitä.

2. Keksinnön mukaista reagenssia voidaan käyttää kvantitatiivisissa veriplasmakokeissa hyvin onnistuneesti ja se varmistaa suotuisamman mittausvälin 10 kuin tunnetut välineet ja menetelmät.

3. Keksinnön mukainen reagenssi on suhteellisen stabiilia, sen paino on vakio, se voidaan steriloida 100°C:ssa ja se on erittäin varastointikelpoi-nen.

15 Stabiiliteettikokeemme ovat osoittaneet epäilykset tä, että kiteisen A-ristomysiini-monosulfaatin liuosta tislatussa vedessä voidaan steriloida 100°C:ssa 0,5 - 1,0 tuntia ilman olennaista vahinkoa. Samoin on todettu, että AGGRISTIN-välineissä olevaa liuosta (TRIS-puskuris- 20 sa, pH = 7skonsentraatio 15 mg/ml) voidaan varastoida +^°C:ssa 3 kuukautta ilman hajaantumista.

Seuraavassa selostetaan lähemmin keksinnön mukaisissa reagensseissa käytettäviksi soveltuvien kaavan (I) mukaisten, erittäin puhtaiden yhdisteiden valmistusta.

25

Työohje 1: A-ristomysiini-sulfaatin valmistus (R, R^, R^ ja R^ on esitetty patenttivaatimuksessa 1; R^ = CH^; X = HSO^; Y = H) 30 2 g tunnetulla tavalla valmistettua raakaa risto- mysiiniemästä liuotetaan huoneenlämpötilassa 5,0 ml:aan tislattua vettä, minkä jälkeen liuoksen pH-arvo säädetään 1 N rikkihapolla arvoon 6,8; tarkka pH-arvo mitataan laitteella. Keltainen, hieman opaalinhohtoinen liu- 35 os kirkastetaan pienellä määrällä luuhiiltä ja suodate- 12 75936 taan. Saatuun kirkkaaseen liuokseen lisätään tipoittain sameutumiseen asti 15-20¾ (til./til.) asetonitriiliä. Seoksen annetaan seistä niin kauan huoneenlämpötilassa, kunnes kiteytyminen tapahtuu. Tämä toimenpide toiste-5 taan tarvittaessa lisäämällä vielä pieni määrä asetonitriiliä 2-3 päivän ajan niin, että kiteytyminen lopetetaan jäähdyttämällä 24 tuntia jääkaapissa +4°C:ssa.

Muodostuneet neliömäiset,valkoiset kiteet suodatetaan, pestään ensin kaksi kertaa kulloinkin 1,0 ml:11a 10 jääkylmää asetonitriilin ja veden (1:1) seosta ja tämän jälkeen kaksi kertaa kulloinkin 2 ml :11a kylmää asetonia, kuivataan tyhjöeksikkaattorissa kuumennetun kalsiumkloridin ja parafiinilastujen päällä huoneenlämpötilassa alennetussa paineessa vakiopainoon. Saan-15 to 71%.

Työohje 2: A-ristomysiini-sulfaatin valmistus 1,5 - 2,0 g lähtöaineena käytettyä raakaa A-risto-20 mysiini-sulfaattia liuotetaan ravistelemalla jatkuvasti 4,0 ml:aan tislattua vettä. Vahvasti vaahtoavaan liuokseen lisätään 1,0 ml asetonitriiliä, seos selkeytetään aktiivihiilellä ja suodatetaan. pH-arvo neutraloidaan 2 N ammoniumhydroksidilla bromitymolisini-indikaattorin 25 läsnäollessa (muuttuminen keltaisesta taivaansiniseksi).

Liuottimeen lisätään sameutumiseen asti vielä asetonitriiliä. Seoksen annetaan seistä kiteytymisen alkamiseen asti, liuotetaan erottuneet kiteet jälleen lämmittämällä vesihauteen päällä ja liuoksen annetaan jäähtyä hi-50 taasti huoneenlämpötilaan. Jatkokäsittely suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Saanto 65¾.

Molempien menetelmien mukaisesti eristetyllä A-ristomysiini-monosulfaatilla on erinomaiset trombo-syyttiaggregaatio-ominaisuudet ja se vastaa seuraavia 55 erittäin hyviä kvalitatiivisia määräyksiä: 15 75936 > a) Tuotteen hajaantuminen alkaa l65-170°C:ssa (Mettler FP-5-sulamispistelaitteessa mitattuna - va-lokennorekisteröinti).

b) Suurpainenestekromatografisen laitteen (Hewett-Packard 1082, HPLC) avulla valmistetaan tuotteesta 5 erinomaisen laadun omaava kromatogrammi.

c) Tuote on yhtenäinen kerroskromatografian mukaisesti. Vesipitoisessa liuoksessa 280 nm:ssä mitattu log e arvo on 4,0 - 4,5, sulfaattituhkapi-toisuus ei ole korkeampi kuin 0,255. Vesisuihku- 10 pumpulla (noin 15 mmHg) asetonin kiehumispistees sä, 4 tuntia yhtäjaksoisesti suoritetussa imemisessä on A-ristomysiini-monosulfaatin painohäviö korkeintaan 1 - 2,5%.

Raakatuotteen ja esimerkin 1 ja 2 mukaisesti val-15 mistetun A-ristomysiin4-monosulfaatin ohutkerroskromato-grafinen karakterisointi suoritetaan seuraavasti: Määrityksessä käytetyt aineet ja reagenssit: I. Juuri valmistettu 1 - 2%:nen A-ristomysiini-mallin vesipitoinen liuos.

20 II. 1. DC-alurulla selluloosaa (Merck 0,1 mm) ohut- kerros .

2. Fixion 50x8-levy (Reanal).

III. Liuotinseos eluenttina: a) n-butanoii-pyridiini-etikkahappo-vesi 25 (15:10:3:12) tai b) n-butanoli-pyridiini-n-propanoli-etikkahap-po-vesi (20:10:5:3:32). Ylempi orgaaninen faasi II. 1 ohutkerrokseen.

II. 2-kerroksen tasapainottamiseksi ja käynnis-30 tämiseksi käytetään seuraavaa sitraattipuskuria (pH 6) ionittomassa vedessä: 7.0 g sitruunahappoa 4.0 g natriumhydroksidia 8l,0 g -natriumkloridia ja 35 100 ml metyylisellosolvia liuotetaan 1000 ml:n mittapullossa ja täytetään tislatulla vedellä merkkiin asti.

14 75936 IV. Kehitin: Pauly-reagenssi 0,05 g diatsotoitua sulfanyylihappoa liuotetaan 10 ml:aan 1055 :sta natriumkarbonaattiliuosta ja käytetään juuri valmistettu liuos.

5 Puhtaalla raakatuotteella on selluloosakerroksessa liuotinseoksissa a) ja b) Rf-arvot 0,59 tai vastaavasti 0,52. Fixion 50x8-levyllä mitataan sitraattipuskurissa (pH = 6) Rf-arvo 0,6l. Reagenssi on erittäin herkkä, se osoittaa käytännöllisesti kaikki hajaantumistuotteet; 10 alin näyttöraja on 0,5 - 1,0 ug.

Suurpainenestekromatografinen mittaus suoritetaan isokraattisesti toimivalla pumpulla varustetun Hewlett-Tackard 1082 HPLC-laitteen avulla. Kokeissamme käytetään laboratorioissamme valmistettua analyyttistä pylvästä 15 (Cg-Lichrosorb, 10 ym). A-ristomysiini-mallien vaikut tavan aineen pitoisuus määritetään 25A nm:ssä toimivalla UV-detektorilla. Malleista valmistetaan 1 milli-molaarisia liuoksia, joiden 20 - 30 yl:n näytteet suihkutetaan pylväälle. Kromatogrammit kehitetään seuraavas-20 ti: (I) 12#:a metyylisellosolvia sisältävässä sitraat tipuskurissa (pH 6,3), nestevirtaus 2,0 ml/min., paperinnopeus 0,1 cm/min.

(II) 10#:a asetonitriiliä sisältävässä (muurahais-25 hapoton) 0,1 molaarisessa ammoniumformiaatis- sa (pH 7 , ^); nestevirtaus 3,0 ml/min.; paperinnopeus 0,3 cm/min.

Yllä olevat olosuhteet ovat osoittautuneet sopi-vimmiksi.

30 Työohjeiden 1 ja 2 mukaisesti valmistetun kiteisen A-ristomysiini-sulfaatin stabiliteetti määritetään kiinteiden mallien UV-säteilytyksen jatkeen ja erilaiset kon-sentraatiot omaavien vesipitoisten liuosten termisen steriloinnin jälkeen tai vastaavasti jättämällä seisomaan 35 +A°C:ssa TRIS-puskurissa.

a) 50 - 100 mg A-ristomysiiniä säteilytetään tulpalla suljetussa pienessä pullossa UV-valolla siten, että etäisyys mallin sisältävän pullon ja lampun välillä on noin 20 cm. Ao-tuntisen is 75936 säteilytyksen jälkeen syvenee valmistetun liuoksen väri hieman; 15 mg/ml:n konsentraa-tiossa on ihmisen trombosyyttien aggregointi melko hidasta.

5 b) A-ristomysiinistä valmistetaan tislatussa ve dessä kaksi samankaltaisen laimennuksen omaavaa liuosta (0,39 mg/ml tai vastaavasti 0,35 mg/ml) ja konsentroidumpi liuos (6,8 mg/ml). Liuoksia pidetään 3 tuntia 100°C:n vesihautees-10 sa. Haihtunut vesi korvataan silloin tällöin.

Liuokset jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja 1% E„ -arvot määritetään 280 nmrssä mitatun va-lcm lonabsorption intensiteetin perusteella. Voidaan todeta, että 100°C:ssa pidettyjen liuosten 15 valonabsorption kohoaminen ei ole lineaarista.

0-1 tunnin alueella lyofilioinnin avulla talteen otetut aineet eivät osoita hajaantumista ohutkerroskromatografiän ja suurpainenestekro-matografian mukaisesti. Aineet aggregoivat ha-20 lutussa konsentraatiossa tyydyttävästi normaa leja ihmisen trombosyyttejä.

c) A-ristomysiinistä valmistetaan TRIS-puskurissa (pH = 7,*0 liuos, jonka konsentraatio on 15 mg/ml ja jota varastoidaan jääkaapissa +4° 25 C:ssa 12 viikkoa. Tästä perusliuoksesta suori tetaan tavanomainen trombosyyttiaggregaatio-koe, joka kahden viikon kuluttua tai vastaavasti määritetään vastaavan puskurilaimennuk- 1% sen jälkeen (0,2 ml—>10ml) Eicm-arvo· Kokeen 30 aikana pysyvät A-ristomysiini-liuoksen aggre- 1% goitava aktiviteetti ja E^^arvo muuttumattomina.

16 75936

Työohje 3: bis-N,Ν1-trifluoriasetyyli-A-ristomysiinin valmistus 206 mg A-ristomysiiniä suspendoidaan 10 ml:aan 5 vedetöntä metanolia, minkä jälkeen lisätään 0,28 ml trifluorietikkahappoanhydridiä jääjäähdytyksessä tipoit-tain. Reaktioseos jätetään seisomaan huoneenlämpötilassa ja haihdutetaan kuivaksi alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan jälleen vedettömään metanoliin ja haihdute-10 taan uudestaan. Tämä tapahtuma toistetaan vielä kolme kertaa, minkä jälkeen tuote kuivataan tyhjöaksikkaatto-rissa, kuumennetun kalsiumkloridin ja parafiinihapon päällä vakiopainoon. Saanto 90%.

Näin saadulla bis-N,N'-trifluoriasetyyli-A-risto-15 mysiinillä ei ole luonteenomaista sulamispistettä (ha-jaantumispistettä). Vakiointi: selluloosakerroksella liuotinseoksessa lila (ks. esimerkki 2) on R^,-arvo o,*<5·

Analyysi: 099Η1ο80„6Ν8Ρ6 (2258): laskettu: F 5,05^, N *<,96/6 20 löydetty: F *<,9156, N *4,86 % ; *4,88 *4,74 Näin saatu yhdiste aggregoi normaaleja trombosyyt-tejä samalla tavalla kuin A-ristomysiini.

25 Esillä olevan keksinnön muut yksityiskohdat selviävät seuraavasta ei-rajoittavasta esimerkistä.

Esimerkki

Reagenssien valmistus 30 15 ,00 g yllä esitettyjä kvalitatiivisia määräyk siä vastaavaa A-ristomysiini-monosulfaattia suspendoidaan 1 l:n erlenmeyerpullossa 100 ml:aan tislattua vettä (pH 6,8). Pullon seinämään eroava vaikuttava aine saatetaan *<00 - 500 ml:11a tislattua vettä jälleen liuok-35 seksi. Näin saatu, homogeenisen vaikuttavan aineen pitoisuuden omaava liuos suodatetaan kuiduttomaksi 100 ml:n mittapullossa, liuottamisessa käytetty pullo ja suodatin pestään kvantitatiivisesti ja mitta-astia täytetään 17 75 9 3 6 merkkiin asti. Näin saadun liuoksen A-ristomysiini-monosulfaatti-konsentraatio on 15 mg/ml. (Steriilin valmisteen valmistamiseksi liuos pidetään 30 - 60 minuuttia 100°C:ssa ja jäähdytetään tämän jälkeen huoneen-5 lämpötilaan.) Tästä liuoksesta täytetään käyttämällä automaattista täyttölaitetta aseptisissa olosuhteissa tarkoin kulloinkin 1,00 ml:n määrä ruskeisiin, nk. re-päisypulloihin. Pullot lyofilisoidaan pikajäädyttämisen jälkeen ja suljetaan.

10 Tarkan täytön ja lyofilisoinnin täydellisyyden tarkastamiseksi tarkastetaan muutamien pullojen A-ris-tomysiini-pitoisuus (15 mg) annosta kohden HPLC-menetel-män ja painonmäärityksen mukaisesti.

Lyofilisaatti liuotetaan vesipitoiseen puskuri-15 liuokseen välittömästi ennen trombosyyttiaggregaatio- koetta.

Claims (4)

1. 75936 18
2. 1. Reagenssi trombosyyttiaggregaatiokokeita varten, etenkin Willebrand-taudin diagnostisoimiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vakioitua, erit-5 täin puhdasta kaavan (I) OR δ / ✓OR 0=( /—{ Hy> \ 0l>i " ρΐΑ. ^ -n* ' /NH 0R N HY „ 0) 19 75936 mukaista A-ristomysiiniä ja/tai erittäin puhdasta risto-mysiinijohdannaista, jossa kaavassa R on vetyatomi, R1 merkitsee O-alfa-D-Araf(1—) 2)-0-alfa-D-Manp(1—)2)~ 5 0-(alfa-L-Rhap)-(l—) 6)-O-beta-D-Glop-ryhmää; R2 edustaa 2,3,6-tridesoksi-3-amino-(NHY)-alfa-L-ribo-heksapyranosyyli-ryhmää; R^ on alfa-D-mannopyranosyyliryhmä; Rjj merkitsee 1 - ^ hiiliatomia sisältävää alkyyliryhmää, 10 X edustaa mineraalihappojäännöstä; Y merkitsee vetyatomia tai yleiskaavan C(Z)(CH2)n~C0- mukaista ryhmää, jossa Z on vetyatomi tai halogeeniatomi ja n merkitsee kokonaislukua 0-5,
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttövalmis reagenssi, tunnettu siitä, että erittäin puhdas A-ristomysiini ja/tai erittäin puhdas ristomysiini-johdannainen on liuotettuna vesipitoiseen puskuriliuokseen, edullisesti tris-hydroksiaminometaanin vesiliuok-20 seen. 20 759 36
4. 1. Reagens för trombocytaggregationsprov, i synnerhet för diagnostisering av Willebrands-sjukdora, k ä n n e -5 tecknad därav, att den innehäller standardiserat A-ristomycin med hög renhetsgrad och/eller ett ristomycin-derivat med hög renhetsgrad med den allmänna formeln (i), OR A 10 / /OR 0=( /— „ HN \—C Ri-0 Λ 0 \ x0R5 »<-°-cyyo / /NH OR 25 0 0=/ ,_S yyy·" uo NHV 35 (»)