DE1927802C2

DE1927802C2 - DHO-Prostadiensäure sowie diese enthaltende pharmazeutische Präparate

Info

Publication number: DE1927802C2
Application number: DE1927802A
Authority: DE
Inventors: Bengt Stockholm Samuelsson
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1968-06-04
Filing date: 1969-05-31
Publication date: 1983-12-22
Also published as: FR2010101A1; GB1204988A; BE734054A; DE1927802A1; BR6909485D0; US3767813A; NL6908506A

Description

Die Erfindung betrifft die DHO-Prostadicnsäuxc (PGD₂) der Formel

HO

\ H

COOH₁

OH

Die erfindungsgemäße Verbindung ist ein Derivat der Prostancarbonsäure, der folgende Strukturformel mit dem angezeigten Bezifferungssystem zugeordnet ist:

COOH

(Π)

Unter Bezug auf Prostancarbonsäure als Stammverbindung kommt der genannten Verbindung folgende systematische Bezeichnung zu:

9λ,Ι5(S)-Dihydroxy-11-oxoprosta-cis-S.trans-13-diensäure (im folgenden abgekürzt als DHOprostadiensäure bezeichnet).

Die erfindungsgemäße Verbindung ähnelt in ihrer Struktur gewissen natürlichen Prostaglandinen, die ebenfalls als Derivate der Prostancarbonsäure, Formel II. anzusehen sind.

Ein Vergleich der Formeln der verschiedenen natürlichen Prostaglandine E mit der Formel I zeigt, daß sich diese hinsichtlich der Stellung des Ring-Oxoatoms und der Ringhydroxylgruppe unterscheiden. Die natürlichen Prostaglandine E sind 9-Oxo-11-hydroxyverbindungen, während die erfindungsgemäße Verbindung eine 9-Hydroxy-11-oxoverbindung ist.

In den Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel I und der natürlichen Prostaglandine E zeigen sich erhebliche und völlig unerwartete Unterschiede. So ist die letztgenannte Verbindung beispielsweise äußerst wirksam in der Stimulierung der glatten Muskulatur, wie sich beispielsweise bei Versuchen an Streifen von Meerschweinchen-Ilcum, Kaninchcn-Duodenum und Rennmaus-Colon gezeigt hat. Vergleiche hierzu Horton.. ExDcrientia 21, 113 (1965). Die erfindungsgemaße Verbindung weist dagegen nur eine sehr viel geringere Wirkung auf die glatte Muskulatur auf als die natürlichen Prostaglandine E. Bezüglich der Meßmethoden vergleiche Pike et al, Proc. Nobel Symposium II, Stockholm (1966); lnteiscience Publishers, New York, S. 161 - 172 (1967).

Die natürlichen Prostaglandine E sind darüber hinaus bei intravenöser Verabreichung außerordentlich wirksame Mittel zur Erniedrigung des arteriellen Bluldnikkes. Vergleiche hierzu ebenfalls Horton. Lc. Die erfindungsgemäße Verbindung bewirkt dagegen nur eine geringe Erniedrigung des systemischen arteriellen Blutdruckes im Vergleich zu den natürlichen Prostancarbonsäurederivaten, was beispielsweise durch Messungen an betäubten (Pentobarbitalnatrium) pentolinium-behandelten Ratten mit in die Aorta und die rechte Herzkammer eingesetzten Kanülen Bezeigt werden konnte. Bezüglich der Meßmethoden wird auf die Arbeit von Pike et af, I. c. verwiesen.

Es ist auch bekannt, daß die natürlichen Prostaglandine E hochwirksarnc Mitte! zur Verhinderung einer Blutplättchen-Aggregation und einer Thrombusbildung sind, wie sie durch verschiedene physikalische Einwirkungen, z. B. arterielle Verletzung, verschiedene biochemische Mittel, z. B. Collagen, ADP und Thrombin, verursacht werden; die natürlichen Prostaglandine bewirken eine Verteilung der Blutgerinnsel, und zwar sowohl in vivo als auch in vitro. In diesem Zusammenhang wird auf die Arbeit von Emmons et al, British Medical Journal, 2, 468 (1967); Interscience Publishers, New York, S. 241-252 (1967) verwiesen. Die erfindungsgemäße Verbindung ist teilweise in derselben Weise wirksam, teilweise jedoch den natürlich vorkommenden Prostaglandinen stark überlegen. Die natürlichen Prostaglandine E sind aber auch, wie weiter vorn bereits gesagt wurde, starke Depressoren und Stimulantien der glatten Muskulatur. Diese letztgenannten biologischen Eigenschaften rufen natürlich unerwünschte physiologische Wirkungen bei einem Patienten

•to hervor, wenn diesem die Substanz zur Verhütung und Regulierung einer Thrombose oder zur Entfernung von Blutgerinnseln verabreicht wird. Diese unerwünschten physiologischen Wirkungen treten jedoch überraschenderweise nicht auf. wenn man die erfindungsgemaße Verhinderung zu demselben Zweck verabreicht. Die erfindungsgemaße Verbindung eignet sich daher in hervorragender Weise zur Verhinderung einer Aggregation der Blutplättchen, zur Verminderung des adhäsiven Charakters der Blutplättchen und zur

so Entfernung bereits gebildeter Blutgerinnsel sowie zur Verhinderung der Entstehung von Blutgerinnseln bei Menschen und Säugetieren wie Kaninchen, Ratten und anderen Tieren mit wirtschaftlichem Wert. Die erfindungsgemäße Verbindung ist z. B. zur Behandlung und zur Propylaxe von Myocard-Infarkte und postoperativer Thrombose, zum Offenhalten von Gefäßverbindungen im Anschluß an die Operation, zur Behandlung von Atherosclerose und Arteriosclerose, zur Bekämpfung von Blutzusammenballungsdefekten infolge von Lipämie sowie anderen klinischen Zuständen, bei denen zum Krankheitsbild eine Störung des Fettstoffwechsels oder eine Hyperlipidämie gehört, geeignet.

Zur Bekämpfung der genannten Krankheitszustände wird die erfindungsgemaße Verbindung systemisch, z. B.

intravenös, subkutan, intramuskulär, oral, rektal oder in Form von sterilen Implanten (für länger dauernde Wirkung) verabreicht. Soll, beispielsweise in Notfällen, eine rasche Wirkung erzielt werden, so wird die

intravenöse Art der Verabreichung bevorzugt.

Intravenöse Injektion oder Infusion wird vorzugsweise mit sterilen wäßrigen isotonischen Lösungen oder Suspensionen durchgefühn. Für subkutane oder intramuskuläre Injektionen verwendet man sterile Lösungen der erfindungsgemäßen Verbindung in Form der Säuren, Salze oder Ester in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien. Für die orale Verabreichung eignen sich Tabletten, Kapseln und flüssige Präparate wie Sirape. Elixiere und einfache Lösungen, wobei in diesen ι ο Präparaten die üblichen pharmazeutischen Träger- oder Streckmittel verwendet werden können. Für die rektale Verabreichung eignen sich am besten Suppositorien. die in üblicher und bekannter Weise hergestellt werden. Für Gewebeimplantate verwendet man sterile Tabletten oder Siüconkautschukkapseln oder andere geeignete Objekte, die die zu verabreichende Substanz enthalten oder mit dieser imprägniert sind.

Die Mittel werden in Mengen von etwa 0,002 bis etwa 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag verwendet, wobei die im Einzelfall anzuwendende exakte Dosis vom Alter, vom Gewicht und dem Zustand des Patienten sowie auch von der Häufigkeit und der Art der Verabreichung abhängt.

Zum Nachweis des technischen Fortschritts der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber den natürlich vorkommenden Prostaglandinderivaten der Ε-Reihe sowie dem bekannten PGD_t wurden nachstehende Vergleichsversuche durchgeführt.

Die Verbindungen wurden auf ihre Wirksamkeit bezüglich Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation (IBA), der Stimulierung der glatten Muskulatur (SGM) und als Blutdrucksenker (BDS\getesu:.

Die Stimulierungswirkung arf die glatte Muskulatur wurde am isolierten Rennmaus-Col: τ gemäß der J5 Meßmethode von Pike et al. aaO bestimmt.

Die Wirkung als Blutdrucksenker wurde an betäubten (Pentobarbitalnatrium) pentoliniumbehandelten Ratten, wie vorstehend bereits erwähnt, ermittelt, wobei bezüglich der Meßmethoden ebenfalls auf Pike et al. *o aaO hingewiesen wird.

Beim Test der Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation handelt es sich um die Inhibierung von ADP-induzierler Blutplättchen-Aggregation in blutplättchenreichem menschlichem Plasma. Die Blutplätt- « chen-Aggregation wurde an einem Aggregometer gemessen.

Weitere Daten und insbesondere eine genaue Beschreibung der IBA-Bestimmungsmethoden können aus der Veröffentlichung von Edward E. Nishizawa et al. >° in Prostaglandis, Band 9, Nr. 1 (]anuar 1975) S. 109 f. entnommen werden.

Die Versuchsergebnissc sind aus nachstehender Tabelle zu entnehmen.

Tabelle "

»Konzentration« diejenige Konzentration bezeichnet wird, bei der die zu untersuchende Wirkung zu 50% eintritt (in .ug/ml).

Verbindung

SGM BDS IBA

(Fp. 62,8-63,3° C)

PGD₁
PGE,
PGE₂
PGE₃

60

4 1

7 7

7 6

Vergleich

65

B enotungssystem	Note
Konzentration	0
> 100,000	3
32,000	4
10,000	5
3,200	6
1,000	7
0,320	8
0,100	9
0,032	10
0,010	11
0,0032

Die in der Tabelle angegebenen Werte ergeben sich aus der nachstehenden Bcwertungsskaln, wobei mit Wie aus den Vergleichsdaten ersichtlich ist, ist PGD₂ bezüglich Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation zehnmal wirksamer als PGEi (dem besten Vergieichsmittel), besitzt eine wesentlich günstigere geringere Wirkung auf die glatte Muskulatur und geringere blutdrucksenkende Wirkung.

Die LD50-Werte wurden durch intravenöse Verabreichung der Testverbindung in 95%igem Ethanol in einer Konzentration von 0,5 ml je kg nach der mathematischen Bestimmungsmethode von Spearman-Kärber, Statistical Method in Biological Assay, D. H. Finney. Hafner Publishing Comp. (1964), S. 524-530. bestimmt.

Für die erfindungsgemäße Verbindung wurde bei Mäusen ein LD»-Wert von 264 mg/kg ermittelt, während bei PGEj der LD*)-Wen 70 mg/kg beträgt und PGEi eine so starke gefäßverengende Wirkung aufweist, daß selbst bei Dosen unter ! mg/kg fast alle Versuchstiere starben.

Die getestete Verbindung erwies sich somit den Vergleichsverbindungen überlegen.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann durch aerobe Inkubation von nur-cis-SÄlLH-Eicosatetraencarbonsäure(im folgenden abgekürzt als E-tetraensäure bezeichnet) mit bestimmten wäßrigen Präparaten, die aus Schafsamenblasen erhalten worden sind, gewonnen werden.

Es sind bereits zahlreiche Untersuchungen zur aeroben Inkubation von verschiedenen langkettigen ungesättigten Fettsäuren durchgeführt worden, wobei man auch die drei Säuren mit 20 Kohlenstoffatomen, die oben erwähnt worden sind, zusammen mit verschiedenen aus Schafsamenblasen erhaltenen Präparaten verwendet hat. In diesem Zusammenhang wird auf folgende Arbeit verwiesen:

Proc. Nobel Symposium II. Stockholm (1966): Interscience Publishers. New York. S.31 -56(1967).

Bei der Untersuchung der Inkubation von E-triensäure mit isolierten Mikrosomen von Schafsamenblasen trennten Nugteren et al., Rec. Trav. Cheim. 85, 405 (1966), ein Inkiibationsprodukt ab. das sich als PGD, erwies.

Große Ausbeuten an erfindungsgcmäßcr Verbindung lassen sich gewinnen, wenn man E-Tctraensäure oder ein wasserlösliches Salz derselben inkubiert, und zwar zusammen mit einer Mischung aus dem Enzymsystem. welches in der Mikrosomfraktion von Schafsamenblasen enthalten ist. und der teilchenfreien überstehenden Fraktion, die man aus wäßrigen Homogcnatcn dieser Drüsen gewinnt. Unter »teilchenfrei« wird in diesem

Zusammenhang der Zustand verstanden, in demsich die Flüssigkeit nach dem Sedimentieren in einer Hochleistungs-Zentrifuge, d. h. nach dem Sedimentieren mit etwa 100 00Ox^ befindet. Die teilchenfreie Fraktion kann auch ohne Hilfe einer Zentrifuge, z. B. durch Filtrieren durch ein Filter oder eine Membran mit entsprechender Porengröße, gewonnen werden.

Kleine, aber annähernd gleiche Mengen an PGEi und DHOprostadiensäure werden gewonnen, wenn man E-tetraensäure mit gewaschenen Mikrosomen von Schafsamenblasen in einem wäßrigen Puffer, pH 7,5. in der von Nugteren et aL beschriebenen Weise inkubiert Wird Glutathion (5χ \0~⁴ Molkonzentration) zu solch einem Inkubationäreaktiensgemisch gegeben, so erhöht sich die Ausbeute an PGEi um den Faktor IZ während die Ausbeute an eifindungsgemäßer Verbindung sich nur um den Faktor 4 erhöht. Wird dagegen E-tetraensäure mit gewaschenen Mikrosomen und gleichzeitig mit der teilchenfreien überstehenden Flüssigkeit, die aus den Schafsamenblasen erhalten worden ist inkubiert, so erhöht sich die Ausbeute an PGEi nur um den Faktor 9, während die Ausbeute an erfindungsjemäßer Verbindung um den Faktor 13 steigt Bei der Inkubation von E-tetraensäure mit Schafsamenblasenpräparaten, die durch Zentrifugation eines wäßrigen Drüsenhomogenates bei etwa 8500 χ g-erhalten worden sind,gewinnt man erhebliche Mengen sowohl von PGEi als auch erfindungsgemäßer Verbindung. Wird dieser Inkubationsmischung zusätzliche teilchenfreie überstehende Flüssigkeit zugegeben, so erhöht sich die Ausbeute an ungesättigter DHOsäure um etwa 30%. während gleichzeitig die Ausbeute an PGE₍ abnimmt. Bei der Inkubation von E-tetraensäure mit teilchenfreier Flüssigkeit allein erhält man etwa dieselben Mengen an PGEi und ungesättigter DHOsäure, die auch bei der Inkubation mit gewaschenen Mikrosomen allein erhalten werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung ist das Hauptprodukt, wenn E-tetraensäure mit dem Enzymsystem aus Scha'iamenblasenmikrosomen in Gegenwart der teilchenfreien Flüssigkeit aus solchen Drüsen inkubiert wird. In der Flüssigkeit ist offenbar ein Faktor vorhanden, der die Bildung von PGDi und der Verbindung der Formel I begünstigt. Dieser Faktor ist wärmeempfindlich, was man daran erkennt, daß ein großer Teil der Wirkung de; teilchenfreien Flüssigkeit zur Bildung der ungesättigten DHOsäure verlorengeht, wenn man diese zum Sieden erhitzt Die Wirkung zur Bildung von PGEi nimmt bei dieser Behandlung dagegen nur geringfügig ab. Es ist daher ratsam, eine native teilchenfreie Flüssigkeit zu verwenden, in der nicht etwa durch une ungünstige Behandlung dieser notwendige Faktor zerstört worden ist.

Die Schafr.amenblasenmikrosomen werden als solche verwendet und wandeln in ihrem Enzymsystem E-Tetraensäure in die gewünschte ungesättigte DHOsäure um. Es ist aber auch möglich, das Enzymsystem aus den Mikrosomen zu isolieren und, falls gewünscht, weiter zu reinigen. Das Enzymsystem ist für die Inkubation sowohl vor der Abtrennung als auch nach der Abtrennung und Reinigung geeignet.

Die Abtrennung des Enzymsystems aus den Mikrosomen wird so durchgeführt, daß man die Mikrosomen mit einer waschaktiven Substanz, vorzugsweise einer nichtionischen waschaktiven Substanz, z. B. Isooctylphenoxypolyethylethanol, behandelt. Andere waschaktive Substanzen, z. B. Natriumlaurylsulfat, können ebenfalls verwendet werden. Mit einem bestimmten nichtionischen Waschrohstoff (Cutsum, Fischer Scientific Company, Pittsburgh, Pa.) ergibt sich in einprozentiger Waschrohstoff-Konzentration eine maximale Freisetzung des Enzymsystems; aber auch bei nur 0,l°/oiger-Konzentration werden mehr als 50% der Enzymaktivität unverändert aus den Mikrosomen freigesetzt. Bei Natriumlaurylsulfat liegt die opjvnale Konzentration für die Freisetzung (Solubilisierung) bei 033%.

ίο Nach der Freisetzung wird zentrifugiert, vorzugsweise bei etwa 100 000 χ g. wobei man eine klare überstehende Flüssigkeit gewinnt, die anstellt der Mikrosomensuspension als Quelle für das notwe idige Enzymsystem verwendet wird.

Das Enzymsystem wird durch schrittweise Ausfällung des Proteins aus der nach dem Zentrifugieren vorliegenden teilchenfreien Flüssigkeit gereinigt. Setzt man beispielsweise der zentrinigierten Flüssigkeit Ammoniumsulfat bis zur 30%igen Sättigung zu, so wird das Protein ausgefällt, während das Enzym in der Flüssigkeit bleibt. Auf diese t-Vaise wird alles nicht-enzymatische Protein entfernt Füg. man dann weiteres Ammoniumsulfat bis zur 60%igen Sättigung der Flüssigkeit zu, so tritt eine weitere Proteinfällung ein, in der praktisch die gesamte Enzymaktivität enthalten ist. Die nach 30%iger Ammoniumsulfatsättigung verbleibende überstehende Flüssigkeit und die Proteinausfällung nach 60%iger Ammoniumsulfatsättigung werden anstelle der Mikrosomensuspension als Quelle für das notwendige Enzymsystem verwendet

Das Enzymsystem kann weiterhin gereinigt werden, indem man eine Lösung des Proteins, welches durch 60%ige Ammoniumsulfatsättigung ausgefällt worden ist, in einem verdünnten schwach alkalischen wäßrigen Puffer gegen denselben Puffer dialysiert.

Weitere Reinigung des Enzymsystems ist möglich, indem man die dialysierte Pufferlösung durch einen Ionenaustauscher leitet, vorzugsweise eine Kolonne mit einer dialkylaminoalkylsubstituierten Cellulose. Ein Beispiel für einen derartigen Ionenaustauscher ist Diethylaminoethylcellulose. Praktisch die gesamte enzymatische Aktivität befindet sich während der Chromatographie in der Lösungsmittelfront. Verunreinigungen bleiben in der Kolonne. Das F.luat, welches die

⁴S enzymatische Aktivität cnthäl·. wird anstelle der Mikrosomensuspension als Quelle für das Enzymsystem verwendet.

Alle vorstehend erwähnten alternativen Enzymsystempräparate sollten durch ein Antioxidans, ζ. Β. eine kleine Menge Hydrochinon (5 χ 10~⁴ molar) geschützt werden. D&5 Antioxidans ist nicht notwendig, wenn Mikrosomen als solche verwendet werden.

Die Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung, aus dem Inkubations-Reaktionsgemisch erfolgt mit Hilfe bekannter Methoden. Beispielsweise kann man die enzymatische Reaktion durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels oder eines Lösungsmittelgemisches, welches wenigstens teilweise in Wasser löslich ist, abstoppen. Das Protein, welches sich dabei abscheidet, wird beispielsweise durch Abzentrifugieren entfernt. Das Prostancarbönsäurederivat wird dann durch Ansäuern der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, worauf eine Extraktion mit einem Fettlösungsmittel, z. B. Chloroform, durchgeführt wird. Die Verdampfung des Fettlösu'.gsmittels ergibt die gewünschte Verbindung, die dann in üblicher Weise, z. B. durch präparative Dünnschichtchromatographie an Silicagel, gereinigt werden kann.

Die erfindungsgcniiißc Verbindung kann in die pharmakologisch verträglichen Salze umgewandelt werden, indem man sie mit ausreichenden Mengen der anorganischen oder organischen Basen neutralisiert, die die gewünschten Kationen oder Amine enthalten. Die > Umwandlung erfolgt mit Hilfe üblicher Methoden, wobei man die Methode im Einzelfall nach den Löslichkeilseigenschaften des herzustellenden Salzes auswählt. Sollen die anorganischen Salze der genannten Säuren hergestellt werden, so löst man die letzteren in ι« Wasser, welches eine stöchiometrische Menge des Hydroxids. Carbonats oder Dicarbonats. welches dem gewünschten anorganischen Salz entspricht, enthalt. Verwendet man Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, so erhält man eine Lösung des is Natriumsalzes des Prostancarbonsäurederivates. Durch Verdampfen des Wassers oder Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels mäßiger Polarität, beispiels- ^■nirA AinAr jjj^dtireri AlksT^!.*· ^/"^w*i'*f Aik-rton^ **rh^U man das feste anorganische Salz. -»

Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel
DHOprostadiensäure

Fett- und Bindegewebe werden von Schafsamenblasen entfernt, die sechs Monate bei -20° C gelagert worden waren. Die Drüsen werden anschließend in ein 30%iges Homogenat (Naßgewicht/Volumen) in 0.25mo-Iarer wäßriger Sucroselösung ungewandelt. Das Homogenat wird bei 8500 χ g zentrifugiert, so daß man eine vorläufige überstehende Flüssigkeit erhält, die frei von Kernen und Mitochondrien ist. Diese vorläufige Flüssigkeit wird dann nochmals I Stunde bei 105 000 χ g >> zentrifugiert, wobei die Mikrosomen aus der teilchenfreien Lösung abgeschieden werden. Die gewonnenen Mikrosomen werden in einer Menge einer 0.25molaren wäßrigen Sucroselösung resuspendiert, die der Hälfte der ursprünglichen wäßrigen Sucrosemenge entspricht. Das Ammoniumsulz der E-Telraensäure (50 mg) wird in der leilchenfrcien Flüssigkeit aus 250 g Drüsen gelöst, worauf eine wäßrige Sucrosesuspension von Mikrosomen aus 500 g Drüsen zugefügt wird. Die Mischung wird dann bei 37°C 30 Minuten inkubiert, und zwar unter Schütteln und Zutritt von Luft. Die enzymatische Reaktion wird dann abgestoppt, indem man 7 I einer Mischung aus gleichen Volumenteilen Chloroform und Methanol zusetzt. Das ausfallende Protein wird ab/entrifugicrt. Zu der klaren überstehenden Flüssigkeit gibt man 3 I Chloroform und 2 I wäßrige Ameisensäure (1%). Die Mischung wird mehrere Male invertiert und dann durch Zentrifugieren geklärt. Die Chloroformsrhirht wird abgetrennt und eingedampft, wobei ein Rückstand verbleibt. Der Rückstand wird der präparativcn Dünnschichtchromatographie an Silicagel G (nach Stahl) unter Verwendung von Benzol : Dioxan : Essigsäure (80 : 20 : 2) unterworfen; daran schließt sich eine Ethanolcluierung des DHO-Prostadiensäure-Fraktion und eine Eindampfung des Eluats an; auf diese Weise erhält man das gewünschte Produkt. Fp. 62,8-63,3° C.

Analyse für CoHuO,

Berechaet: C = 68.14 H = 9.15
gefunden: C = 68.04 H = 9.14

Das NMR-Spektrum ist in Hayashi, M and T. Tanouchi. J. Org. Chem. 38: (H), 2P5 (1973) und Jenny, E. F.. P. Schaublin, H. Fritz und H. Fuhrer. Tetrahedron Leiters 2235 (1974) veröffentlicht.

Claims

Patentansprüche:

1. DHO-prostadiensäure (PGD₂) der Formel
HO

COOH

OH

2. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 in Kombination mit üblichen Träger- und Zusatzstoffen.